Tối ưu hóa quy trình chiết xuất phospho lipid từ lòng đỏ trứng bằng phương pháp sử dụng CO2 ở trạng thái siêu tới hạn

Tối ưu hóa qui trình chiết xuát phospho­
lipid từ lòng đỏ trứng bằng phương pháp
sử dụng co^ ở trạng thái siêu tới hạn
Nguyễn Thị Lập*, Nguyễn Mai cương**, Nguyễn Xuân Bắc*
* Trường Đợi học Dược Hà Nội
* Viện Hóa học công nghiệp Việt Nam

SUMMARY
Our objective was to optimize and improve existing methods to isolate an enriched phospholipid fraction from freeze-dried egg
yolk by selective supercritical carbon dioxide extraction (SCOJ. A phospholipid-rich fraction was successfully extracted with a unique
two-step process, consisting of a first step with CO^ and a second step with ethanol as co-eluent. In an effort to optimize the extraction
conditions of the two steps, pressure, time and temperature effects were investigated. Optimal conditions were jkund to be 316 bar
pressure, 123 minute time, 47°C sample temperature and 368 bar pressure, 2 hour time, 5I°C sample temperature for the first and the
second steps, respectively. Results presented demonstrate that supercritical fluid extraction can lead to the isolation of a value-added
ingredien t from freeze-dried egg yolk with high yield (11.61%) and purity (97%), which may be suitable to make liposomal based drugs.

Đặt vấn đê'
Hiện nay, công nghệ chiết bằng COj ởtrạng thái
siêu tới hạn (SCO j) đã và đang được áp dụng phổ
biến để chiết tách các hoạt chất sử dụng trong nhiều
lĩnh vực như công nghiệp thực phẩm, các hợp chất
thiên nhiên, dược phẩm và mỹ phẩm. Công nghệ này
có nhiều ưu điểm so với các phương pháp chiết xuất
truyền thống bằng dung môi hữu cơ như: giảm bớt
thời gian, giảm lượng dung môi sửdụng và sản phẩm
thu được tinh khiết hơn. Gẩn đây việc sử dụng công
nghệ SCO^ với mục đích chiết xuất phospholipid
(PL) ngày càng được sử dụng rộng rải [2], [3]. Lòng
đỏ trứng là một trong những nguồn nguyên liệu
giàu PL, lượng lipid chứa trong lòng đỏ trứng chứa
khoảng 31% PL (trong đó 74% phosphatidyl cholin

(PC), 15% phosphatidyl ethanolamin (PE) và 11%
thành phẩn khác). PL là nguồn nguyên liệu chính để
chế tạo liposom, được coi là một trong những hệ vận

6

NghlẽncửudiíỌcThõngtlnthuõc Số1/2013

chuyển dược chất đến đích đẩy tri|n vọng, ở Việt
Nam, chưa có nhiều nghiên cứu nhằm áp dụng dạng
thuốc liposom vào điểu trị. Một trong các lý do là giá
thành của các thương phẩm liposom và nguyên liệu
chủ yếu chế tạo liposom là PL nhập ngoại khá cao.
Vì vậy, mục đích của nghiên cứu này là tìm ra các
thông số tối ưu của quá trình chiết xuất nhằm nâng
cao hiệu suất chiết và độ tinh khiết của PL từ lòng đỏ
trứng bằng phương pháp SCOj để thu được PL đáp
ứng được nguyên liệu tạo liposom.

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu
Lòng đỏ trứng vịt đã được đông khô. co^ lỏng
99,99 % được mua tại nhà máy khí hoá lỏng Yên
Viên, Hà Nội. Ethanol, cloroíorm, aceton, methanol
và một số hoá chất khác đạt tiêu chuẩn dùng cho
phân tích. Thiết bị chiết SFE-250 (Mỹ), sắc ký lỏng


------------------------------------------------ ề
hiệu năng cao sử dụng detector tán xạ ánh sáng bay

hơi: HPLC- ELS (Shimadzu, Nhật). Máy cô quay chân
không Yamato (Nhật).
Phương pháp nghiên cứu
Chiết phospholipid bàng phương pháp sco^

G IAI

LỏNd

.

suất (P): 250-400 bar; Thời gian (tg):120 phút; Hàm
lượng dung môi phụ trợ (C): 1-10%.
Tiến hành 17 thí nghiệm tại các điểu kiện nhiệt
độ, áp suất, thời gian và nổng độ dung môi phụ trợ
lựa chọn.
Quy hoạch hoá thực nghiệm
Sử dụng mô hình thực nghiệm quy hoạch trực
giao bậc , ba yếu tố, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng
tới quá trình thực nghiệm, trong đó tất cả các thông
số khảo sát biến thiên. Các bước phương pháp quy
hoạch hoá thực nghiệm được mô tả trong sơ đồ ở
hình .
2

únb

ĐOẠN 1

2

G IAI
ĐOẠN 2

Hinh ĩ. Thiẽt kẽ nghiên cứu

Thịết kế nghiên cứu được xây dựng theo như
mô ta ở hình 1. Trước tiên, sử dụng dung môi co^ ở
trạng thái siêu tới hạn để chiết loại lipid trung tính
có trong lòng đỏ trứng (giai đoạn 1). Cặn thu được
giàu PL sẽ được chiết tách lấy riêng PL bằng dung
môi là CO^ pha trộn dung môi phụ trợ là ethanol ở
trạng thái siêu tới hạn (giai đoạn 2). Quá trình chiết
tách PL được thực hiện trên thiết bị chiết siêu tới hạn
SFT-250 được tóm tắt như sau. Nạp lòng đỏ trứng
đông khô vào bình chiết rổi tiến hành gia nhiệt để
đưa COj vể trạng thái siêu tới hạn. Sau 3 giờ, giảm áp
suất về 45 bar, tháo dịch chiết vào bình tách có áo
gia nhiệt. Tại đây, COj hóa hơi thoát ra ngoài, phẩn
cặn thu được là lipid trung tính (giai đoạn ) hoặc
PL (giai đoạn 2). Trong giai đoạn 2, dung môi phụ
trợ ethanol được bổ sung bằng cách đổ trực tiếp vào
bình chiết hay thông qua bơm với tốc độ bơm
ml/phút. Quá trình nghiên cứu các thông số kỹ thuật
ảnh hưởng tới hiệu suất chiết PL được thực hiện qua
giai đoạn như sau:
Giai đoạn 1: khảo sát các thông số chiết loại lipid
trung tính và cholesterol trong lòng đỏ trứng đông
khô tại điều kiện: Nhiệt độ (T): 30 - 60°C; Áp suất (P):
200-400 bar; Thời gian (tg): 90-120 phút.

Giai đoạn 2: khảo sát các thông số chiết
phospholipid tại điều kiện: Nhiệt độ (T): 30-60“C; Áp
1

0 , 8

2

tfinh 2. Các bước quỵ hoạch hoá thực nghiệm

Phân tích thành phần lipid
Sản phẩm lipid trung tính trong giai đoạn 1, PL ở
giai đoạn 2 của phương pháp SCOj và PL thu được
từ phương pháp chiết bằng dung môi hữu cơ được
phân tích bằng HPLC-ELS có so sánh với chất chuẩn
(Sigma, Mỹ), tiến hành tại phòng thí nghiệm các hợp
chất sinh học, Viện Krict, Hàn Quốc với các điểu kiện
sau: Cột; Agilent Prep SIL Scalar Column, 4.6 Xl50
mm, cỡ hạt 3 |jm; Pha động: n-hexan: isopropanol:
nước = 40: 58 : 2 (v/v); Detector: ELS; Tốc độ dòng:
1,25 ml/phút; Chế độ chạy: gradient nồng độ; Nhiệt
độ:60°c.


xử lý số liệu
Các nghiên cứu được thực hiện trên cơ sở mô
hình thực nghiệm quỵ hoạch trực giao bậc , ba yếu
tố, sử dụng phần mềm MODDE 8.0.2 để xây dựng
phương trình thực nghiệm, mô phỏng kết quả trên
đồ thị, tối ưu hóa các thông số.

2

Kết quả và bàn luận
Tối ưu hóa các yếu tố khảo sát
Trong nghiên cứu này PL được tách chiết từ lòng
đỏ trứng bằng phương pháp sử dụng COj ở trạng
thái siêu tới hạn, đồng thời xây dựng mô hình qui
hoạch hóa thực nghiệm, khảo sát các yếu tố ảnh
hưởng tới hiệu suất, từ đó đưa ra các thông số tối ưu
của quá trình chiết xuất. Các thí nghiệm được tiến
hành theo phương pháp cổ điển (lẩn lượt thay đổi
từng thông số, trong khi giữ nguyên các thông số
còn lại với giả thiết các thông số đó độc lập, không
ảnh hưởng đến nhau) có hạn chế là khi các yếu tố
ảnh hưởng tăng lên thì số lượng thí nghiệm cũng
tăng lên nhiểu lẩn. Mặt khác, trong thực tế các thông
số ảnh hưởng tới một quá trình không thể cho một
biến thay đổi và cố định các thông số còn lại, mà
tất cả các thông số luôn biến thiên. Do đó cẩn phải
xây dựng thực nghiệm một cách chủ động trên cơ
sở phương pháp xử lý số liệu hiện đại, đó là phương
pháp quy hoạch hoá thực nghiệm. Trong phương
pháp quy hoạch hoá thực nghiệm trực giao bậc hai,
ba biến, các thí nghiệm được tiến hành trong điểu
kiện cả ba biến đểu biến thiên và tính hiệu suất thu
được ở cả hai giai đoạn.
ở giai đoại , tiến hành làm 17 thí nghiệm tại các
điểu kiện T, p, tg lựa chọn và thu được số liệu được
nêu trong bảng .
1

1

Bỏng l Mo trận thực nghiệm chiétlipid trung tính, cholesterol
STT
1

1

X,

X,

-1

-1

-1

Hiệu suất (%)

T

p

tg

30

200

90

17
17,5

2

1

1

-1

-1

60

200

90

3

1

-1

1

-1

30

400

90

19,6

4

1

1

1

-1

400

5

1

-1

-1

1

60
30

200

90
120

25,1
17,9

6

1

1

-1

1

60

200

120

19,5

7

1

-1

1

1

30

400

120

20,8

8

1

1

1

1

60

400

120

27,7

9
10

1 -1,215
1 1,215

11
12

1

0

1
1

0
0

13
14

0

0

0
0

-1,215

0
1,215 0
0 -1,215

26,775 300

105
105

63,225 300
45
45
45

178,5 105
421,5 105
300 86,775

27,6
31,2
12
19,7
28,5

30,2

1

0

0

1,215

45

300

15

1

300
300

105
105

1

0

0

0
0
0

30,1

1

0
0

45

16
17

0
0

300

105

30,1

45
45

30,2

Ghi chú: giá trị trên là két quá trung bình cùũ 2 lán thí nghiệm trong cùng điéu kiện.
Trong đó X , X lò các bién má hóa cùa bién thực I p, tg. ĩ: nhiệt độ chiét ( ĩ) , P: áp
suât chiết (borị tg: thời gian chiễt (phút).

Bảng 1 thể hiện kết quả nghiên cứu của quá trình
chiết lipid trung tính từ lòng đỏ trứng đông khô thực
hiện theo phương pháp bố trí ma trận thực nghiệm
kế hoạch bậc 2 trực giao 3 yếu tố. Trong đó, X,, Xj, X
lẩn lượt là các biến mã hóa của T, p, tg, cụ thể như sau:
)
3

tể.

- A r

X

=
^

-

tg

~ A tg

Từ các kết quả thực nghiệm, phương trình hổi
quy biễu diễn hàm mục tiêu H (hiệu suất thu nhận

lipid trung tính) phụ thuộc T, p, tg qua các biến mã
hóa X,, Xj, X3, sau khi so sánh với chuẩn Student để
loại bỏ các hệ số không có nghĩa của phương trình
thu được hàm mục tiêu như sau:
i / = 2 9 ,7 3 8 + 1 , 7 9 2 4 + 2,9112 4 X j + 0 ,8 3 2 4 2 7 JT, - 9 .0 6 3 4 8 X Í + 1 ,3 3 9 1 5

Để kiểm tra tính tương thích của phương trình
hồi quỵ, chuẩn số Fisher được tính có giá trị 18,9, lớn
hơn giá trị chuẩn Fisher F(2,6, 0,95), do vậy phương
trình hồi quy thu được là tương hỢp. Kết quả xử lý số
liệu cho thấy giá trị cực đại của hàm mục tiêu trong
miền khảo sát: H ^= 31,20, tương ứng với hiệu suất
thu nhận lipid trung tính cao nhất trong miền khảo
sát là 31,20 %. Các giá trị thông số tối ưu tương ứng
là: X, = 0,106647 tương ứng với T p, = 46,5997“C;
Xj = 0,15971 tương ứng với p J = 31^971 bar; Xj =
1,21867 tương ứng với t J = 123,223 phút. Mô hình
thực nghiệm quy hoạch trực giao bậc hai, ba yếu tố
có độ tin cậy 95%, mức ý nghĩa 0,05. Để kiểm định
lại mức chính xác của hiệu suất tối ưu thu được ở
trên, chúng tôi tiến hành mô phỏng kết quả trên đồ


------------------------------------------------ 4
thị biểu diễn bể mật đáp ứng và đường đổng mức
(kết quả không trình bày trong bài báo này). Kết quả
cho thấy hiệu suất tối ưu thu được là 32,00; 29,80 và
32,08 %, xấp xỉ với giá trị cực đại của hàm mục tiêu
trong miền khảo sát (H J = 31,20 %). Như vậy, các
thông số tối ưu tìm được dựa vào hàm mục tiêu ở

trên là hoàn toàn phù hợp.
ở giai đoạn , tiến hành làm 17 thí nghiệm tại các
điểu kiện T, p, c lựa chọn và thu được số liệu được
nêu trong bảng .

PL) phụ thuộc T, p, c qua các biến mã hóa X,, Xj, X3,
sau khi so sánh với chuẩn Student để loại bỏ các hệ
số không có nghĩa của phương trình, thu được hàm
mục tiêu như sau:
H = 1 1 ,2 6 0 8 + 0 .9 5 6 3 5 7 X , + 1 ,4 2 8 3 2 ^ 2 + l,2 3 8 8 1 J r3 - 2 ,1 1986Jf,=
- 2 , 0 5 0 0 3 5 A r | - 1 ,3 9 0 5 8 X 1 + 0 , 4 3 9 6 3 9 ^ : 2 X 3

Để kiểm tra tính tương thích của phương trình
hổi quy, chuẩn số Fisher được tính có giá trị là
10,2, lớn hơn giá trị chuẩn Fisher Fp
Như vậy,
phương trình hồi quy thu được là tương hợp. Giá trị
cực đại của hàm mục tiêu trong miền khảo
Bàng 2. Mo trận thực nghiệm chiẽt phospholipid
sát: H ^= 11,67%, tương ứng với hiệu suất
Hiệu suất (%)
STT
thu
nhận PL cao nhất trong miền khảo sát
2,6
30
250
là 11,67 %. Các giá trị thông số tối ưu là: XI
60
250

3,7
=
0,427627 tươiĩg ứng với T , = 51,41“C; X2
400
3,8
30
=
0,57312 tương ứng với p J = 367,98 bar;
5,8
60
400
X3 = 0,587089 tương ứng với c , = 8,14 %
4.2
250
10
30
mol. Để kiểm định lại mức chính xác của
250
10
5,4
60
6,9
400
10
30
hiệu suất tối ưu thu được ở trên, chúng tôi
60
400
9,5
tiến hành mô phỏng kết quả trên đổ thị biểu

325
5,5
6,7
26,775
15
diễn bề mặt đáp ứng và đường đổng mức
9,6
63,225
325
5,5
10
15
(kết quả không trình bày trong bài báo này).
233,875
5,5
5,3
-1,215
45
11
Kết quả cho thấy, hiệu suất tối ưu thu được
45
416,125
5,5
9,8
1,215
12
là 11,84; n , 79 và 11,12 %, xấp xỉ với giá trị
325
0,0324998
7,9

-1,215
45
13
cực đại của hàm mục tiêu trong miền khảo
325
10,9875
10,7
1,215
45
14
sát H =11,67 %. Như vậy, các thông số tối
45
325
5,5
11,2
15
ưu tìm được dựa vào hàm mục tiêu ở trên là
11,3
325
5,5
45
16
hoàn toàn phù hợp.
45
325
5,5
17
11,2
Thí nghiệm kiểm chứng tại vừng tối ưu
Ghi chú: giá trị trên là két guũ trung bình ứ a 2 lán thí nghiệm trong cùng điêu kiện.

Sử
dụng các điểu kiện lý thuyết tối ưu
ĩrong đo: Xj,
lù c ầ bién mõ tìốũ của blễn thực T, p, c. T: nhiẹt độ chlểt ( ĩ) ; P: áp suốt chiẽt (bar); C:
nông độ dung mỗi phụ trợ (% moi).
tìm được, tiến hành khảo sát đối chứng trở
lại với lý thuyết. Thực hiện 3 thí nghiệtTi kiểm
chứng với lượng mẫu ban đẩu là 10Og lòng đỏ trứng
Bảng 2 thể hiện kết quả nghiên cứu của quá trình
đông khô tại các điểu kiện thực nghiệm: Giai đoạn 1:
chiết PL từ lòng đỏ trứng đông khô thực hiện theo
T = 46,60°c, p = 315,97 bar, tg = 123 phút; Giai đoạn
phương pháp bố trí ma trận thực nghiệm kê' hoạch
2: T = 51,41 “C, p = 367,98 bar, c = 8,14 % mol và thời
bậc 2 trực giao 3 yếu tố. Trong đó, X,, Xj, Xj lẩn lượt là
gian chiết xuất là giờ.
các biến mã hóa của T, p, c, cụ thể như sau:
2

3

2

10

2

AC _

r.

2

c, =

■P,r^

{T-T,)
ÁT

AP

)
-AC

x,= (C-C„)
AC

Từ các kết quả thực nghiệm, phương trình hồi
quy biêu diên hàm mục tiêu H (hiệu suất thu nhận

Bàng 3. Két quà kiếm chứng tại điềm tói ưu
Thí nghiêm số

Hiệu suất giai đoạn 1 (%)
Hiệu suất

1

30,91

2

31,23

3

31,19

Trung bình

Hiệu suất giai đoạn 2 (%)
Hiệu suất

Trung bình

11,71
31,11

11,63
11,50

11,61


Kết quả kiểm chứng tại điểm tối ưu cho thấy,
trong vùng khảo sát của các thông số T, p, tg, c, hiệu
suất thu nhận trong thực tế giống với các kết quả
tính toán (bảng 3). Điểu này cho thấy mô hình kế
hoạch hóa thực nghiệm đã mô tả sát thực với bức

tranh thực nghiệm. Như vậy điểu kiện tối ưu cho quá
trình chiết tách PL từ lòng đỏ trứng đông khô qua
2 giai đoạn tách biệt là: Giai đoạn 1: T = 47°c, p =
316 bar, thời gian chiết = 123 phút; hiệu suất thu
nhận lipid trung tính đạt 31,11 % theo nguyên liệu;
Giai đoạn 2: T = 51°c, p - 368 bar, c = 8,14% mol và
thời gian chiết tách là 2 giờ, hiệu suất thu nhận PL
là 11,61% theo nguyên liệu ban đẩu. Hiệu suất thu
được PL theo kết quả này tương đối cao so với với kết
quả nghiên cứu của Shah A. và cộng sự (4,9 %) Sự
khác biệt này có thể là do nguyên liệu đẩu vào của
nghiên cứu này là lòng đỏ trứng vịt đông khô còn
của Shah A. và cộng sự từ nguồn nguyên liệu là sản
phẩm trứng thải của ngành công nghiệp khác.
Phăn tích sản phẩm
Sửdụng các thông số kỹ thuật đã được tối ưu hóa
sau quá trình khảo sát ở trên, sản phẩm PL được đem
phân tích bằng phương pháp HPLC-ELS đối chiếu
với chất chuẩn. Kết quả phân tích cho thấy sản phẩm
chiết tách trong giai đoạn 1 bằng SCOj có thành
phần chính gổm 97% NL (lipid trung tính) và 3% PC.

Kết quả phân tích sản phẩm chiết tách trong giai
đoạn khi bổ sung thêm dung môi phụ trợ ethanol
cho thấy thành phẩn chủ yếu của sản phẩm thu
được gồm 90,1% PC, 7% PE và 2,9% NL‘". Như vậy
sản phẩm PL chiết bằng phương pháp sco^ có độ
tinh khiết cao hơn so với phương pháp chiết bằng
dung môi thông thường.
2

Kết luận
Đã đưa ra được các thông số kỹ thuật tối ưu
cho hai giai đoạn của chiết xuất. Trong giai đoạn 1:
tại 47°c, áp suất 316 bar, thời gian chiết 123 phút;
hiệu suất thu nhận lipid trung típh đạt 31,11 %theo
nguyên liệu. Trong giai đoạn 2: tại 51°c, áp suất 368
bar, nồng độ dung môi phụ trợ 8,14% mol và thời
gian chiết tách 2 giờ, hiệu suất thu nhận PL là 11,61 %
theo nguyên liệu ban đẩu.
Đã phân tích, xác định thành phẩn của
phospholipid cho thấy hàm lượng PL trong sản
phẩm thu được từ phương pháp sco^ chiếm 97%,
trong đó 90,1 % là PC, 7% PE. Kết quảhghiên cứu cho
thấy tiềm năng của phương pháp^sco^ trong chiết
xuất PL có hiệu suất và độ tinh ,4hiết cao với mục
đích sử dụng làm nguyên liệu chế tạo dạng mang
thuốc liposom và nguyên liệu làm thuốc khác.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Thị Lập, Lưu Hoàng Ngọc, Nguyên Thanh Bình (2010), "Nghiên cứu chiết xuất phospholipid từ lòng đỏ trứng bằng phương
pháp sử dụng co^ ở trạng thái siêu tới hạn", Tạp chí Dược học, 487, p.35-37.
2. Montanari L, King J.W., List G.R., Rennick K.A. (1995), "Selective extraction of phospholipids mixtures by supercritical carbon dioxide
and co-solvents", J. FoodSd. 61 (6), p.1230-1234.
3. Leyla T., Sefa K. and Aydin A. (2001), "Selective Extraction of Phosphatidylcholine from Lecithin by Supercritical Carbon Dioxide/
Ethanol Mix-ture", J/AOCS, 78(2), p.115-118.
4. Shah A., Akoh C.C., Toledo R.T, Corredig M. (2004), "Isolation of a phospholipid fraction from inedible egg", J. of Supercritical Fluids
30, p. 303-313.