Xây dựng phương pháp định lượng ba kháng sinh carbapenem trong huyết tương bằng HPLC

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, tr. 902 - 903
2. Pham Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, NXBTrẻ,tr. 798-799
3. Đỏ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y hoc, tr. 852-853
4. Viên Dươc liêu (2004), Những cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa hoc kỹ thuật, tr. 976-978
5. Flora of China (2003), Vol. 5, pp. 271 - 325
5, Mohammed Rahmatullah et al. (2010), « Effect of Cuscuta reflexa stem and Calotropis procera leaf extracts on glucose tolerance in
glucose-induced hyperglycemic rats and mice », Afr. J.Tradit. Complement. Altern, Med 7(2), pp. 109 -112
7. M. Nisa, S. Akbar, M Tariq and z. Husain (1986), "Effect of Cuscuta chinensis water extract on 7,12-dimethylbenzo[a]anthraceneinduced skin f5apillomasand carcinomas in mice", J. Ethnopharmacol. 18, pp. 21 - 31
■
8. Wiley Periodical (2008),« Effect of Cuscuta reflexa Roxb. on androgen - induced alopecia ", Inc. Journal of cosmetic dermatology 7,
pp. 199-204
9. Xiao J, et al. (1990)," Effect of alcohol extract from Polygonatum odoratum (Mill) Druce and Cuscuta australis R.Br. on immunological
function of mice injured by burn », zhonggue Zhong Yao Za zhi 15 (9), pp. 557 - 559,578
10.
11.

Xây dựng phương pháp định lượng
ba kháng sinh carbapenem trong huyết
tương bằng HPLC
Trấn Mạnh Thông*, Pham Thị Thanh Hà*, Nguyễn Thị Kiểu Anh*,
Nguyễn Thanh Hiển**, Nguyễn Quốc Kính**, Nguyễn Hoàng Anh*
* Trường Đai hoc Dươc Hà Nội, ** Bênh viên Hữu nghị Việt Đức

Từ khóa: carbapenem, imipenem, meropenem, ertapenem, HPLQ simultaneous assay
SUM M ARY
A simple, precise HPLC m ethod with

uv detection

has been developed for simultaneous determination o f three carbapenem

antibiotics: imipenem, meropenem and ertapenem in hum an plasma. After precipitation of protein with acetonitril, separations were
performed on a Eclipsse, XDB-C8 column and peaks were eluted by a mobile phase com posed o f phosphate buffer 0,1 M (pH 7,4) and
methanol/water in gradient elution mode. Detection was by uv at 298 nm. Calibration curves were linear from 0,5 ụg to 80 fjg/m lwith
imipenem

VỜ

meropenem and from 0,5 ụg to 160 fjg/ml with ertapenem. Accuracy ranged from -5,08% to 5% and precision below

6,4%. This m ethod is suitable for therapeutic drug monitoring (TDM) o f carbapenerns in critically ill patients hospitalized in ICUs.

Đặt vấn đề
Carbapenem là nhóm kháng sinh có vị trí quan
trọng trong điểu tri nhiễm khuẩn do các vi khuẩn
kháng thuốc tại khoa Điểu trị tích cực (ICU). Tương tự
các beta-lactem khác, carbapenem là nhóm kháng
sinh phụ thilộc thời gian, hiệu quả phụ thuộc vào
thời gian trong khoảng đưa liều mà nóng độ thuốc ở

12

Nghỉencúudưọc Thòng tlnthuõc

dạng tự do duy trì được trên nổng độ ức chế tối thiểu
(MIC) [1], Với nhiều yếu tố ảnh hưởng làm thay đổi
dược động học của kháng sinh ở bệnh nhân nặng
cùng với hiện tượng giảm nhạy cảm, xuất hiện và lây
lan nhanh chóng các chủng vi khuẩn đề kháng như
Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa,

Klebsiella pneumoniae ở ICU, nhiểu nghiên cứu
đá chỉ ra rằng chế độ liều khuyến cáo hiện tại của


carbapenem có thể không đảm bảo đạt được mục
tiêu PK/PD trên [2]. Do vậy, vai trò của giám sát trị
liệu (TDM) dựa vào nổng độ thuốc trong huyết tương
để cá thể hóa điểu trị phác đổ dùng carbapenem là
công cụ hửu hiệu để tối ưu hiệu quả điểu trị, ngăn
ngừa độc tính và xuất hiện kháng thuốc ở bệnh nhân
nặng tại ICU [3],
Để triển khai giám sát trị liệu, việc xây dựng
phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học
là khâu then chốt, đóng vai trò quyết định. Phương
pháp định lượng cẩn đảm bảo xác định nhanh,
chính xác đổng thời nhiểu kháng sinh sửdụng trong
Khoa ICU với các trang thiết bị không quá phức tạp.
Phương pháp định lượng đổng thời kháng sinh trong
dịch sinh học cùng cho phép tiết kiệm thời gian,
dung môi, phù hợp với triển khai thường qui phục vụ
công tác TDM [4]. Trên thế giới, nhiều phương pháp
HPLC đã được xây dựng để định lượng các kháng
sinh carbapenem trong dịch sinh học, tuy nhiên các
phương pháp này hoặc mới được xây dựng để định
lượng từng carbapenem đơn độc hoặc đòi hỏi các
trang thiết bị không phổ biến trong điểu kiện phòng
thí nghiệm ở Việt Nam [5, 6, 7]. Trong bài báo này
chúng tôi trình bày một phương pháp định lượng
IMl Scarbapenem chính đượcsửdụng trên lâm sàng
là imipenem (IMI), meropenem (MER) và ertapenem

(ERT) trong huyết tương bệnh nhân bằng HPLC với
detector u v trong đó mẫu được xử lý huyết tương
được xử lý bằng qui trình đơn giản trước khi được
tiêm vào hệ thống sắc ký.

Hóa chất, thiết bi và phương pháp nghiên
cứu
Hóa chát, chát chuẩn
- Imipenem, meropenem và ertapenem được sử
dụng dưới dạng biệt dược của nhà phát minh tương
ứng Tienam® (Merck), Meronem® (Astrazeneca) và
INVANZ® (Merck).
- Chất ổn định 3-morpholinopropanesulfonic
(MOPS) (Sigma-Aldrich).
- Các hóa chất, dung môi thuộc loại dùng cho
HPLC hoặc tinh khiết phân tích (Merck, Đức).
- Huyết tương trắng (Viện huyết học và truyển
máu Trung ương).

Hệ thống sắc ký
- Hệ thống HPLC detector uv Agilent 1200.
Phương pháp nghiên cứu
- Dung dịch chuẩn gốc carbapenem: cân chính
xác lượng carbapenem rổi hòa tan trong dung dịch
ổn định (MOPS 2,64%; pH 6,8) đê’ thu được các dung
dịch chuẩn gốc IMI, MER, ERT có nồng độ 1 mg/ml.
Pha loãng các dung dịch gốc bằng dung dịch ổn
định để thu được các dung dịch chuẩn thứ cấp có
nổng độ của từng carbapenem nằm trong khoảng
0,5 đến 80,0 Ịjg/ml (riêng ERT: 0,5 đến 160,0 Ịjg/ml).

- Dung dịch chuẩn nội (dùng khi định lượng với
mẫu huyết tương bệnh nhân): MER 10 |jg/ml pha
trong dung dịch ổn định (khi đinh lượng IMI); IM I10
|jg/ml pha trong dung dịch ổn định (khi định lượng
MERhoặcERT).
- Xây dựng phương pháp định lượng:
+ Điểu kiện sắc ký: lựa chọn thành phẩn và pH
pha động, ảnh hưởng của sự có mặt của các đối ion,
chương trình gradient dung môi, tốc độ dòng, cho
kết quả tách tốt nhất 3 carbapenem trên sắc đổ và
bước sóng cho đáp ứng thích hợp.
+ Khảo sát lựa chọn các tác nhân kết tủa protein
(acid peclorid, acetonitril) để xử lý mẫu huyết tương
chứa các carbapenem. Tính hiệu suất chiết từng
carbapenem từ mẫu huyết tương bằng phương
pháp xử lý mẫu được lựa chọn.
- Thẩm định phương pháp định lượng đã được
xây dựng theo hướng dẫn của FDA trên các tiêu chí:
tính chọn lọc, tính tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, độ
ổn định, xác định giới hạn định lượng dưới (LOQ).

Kết quả và bàn luận
Khảo sát lựa chọn phương pháp xử lý mấu huyết
tương và chương trình sắc ký
Sau khi tham khảo các phương pháp định lượng
carbapenem trong dịch sinh học đà được công bố,
chúng tòi quyết định sử dụng phương pháp của
Legrand và cộng sự [5] làm điéu kiện ban đẩu để
triển khai sắc ký. Để thích ứng với hệ thống sắc ký
Agilent 1200 và cột sắc ký lựa chọn (Eclipse, XDB-C8;

4,6 X 150 mm, 5 |am), thành phẩn pha động, pH của
hệ đệm, ảnh hưởng của sự có mặt của chất đối ion
(tetrabutyl amoni bromid) đến độ doãng của chân


pic, chương trình gradient pha động, tốc độ dòng
pha động, bước sóng làm việc của detector đã được
khảo sát. Chúng tôi đã xác định được các điểu kiện
sắc ký để tách 3 kháng sinh carbapenem như sau:
Điều kiện sác ký:
Cột sắc ký: Eclipse, XDB-C8 (4,6 X 150 mm, 5 um).
Pha động
Kênh A: Dung dịch đệm phophat 0,1 M; pH = 7,4.
Kênh B: dung dịch methanol 40% trong nước (v/v).
Chế độ pha động (gradient):
- Detector UV: 298 nm.
Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.
Thể tích tiêm mẫu: 50 |jl
Thời gian định lượng: 19 phút
Xử lý mẫu huyết tương bệnh nhân: Mục tiêu của
của chúng tôi là xây dựng phương pháp xử lý mẫu
đơn giản chỉ thòng qua kết tủa protein trong huyết
tương trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký. Hai
tác nhân kết tủa protein đả được khảo sát là acid
peclorid (72%) và acetonitril.
Acid peclorid gây phân hủy mạnh 3 kháng sinh
carbapenem trong mẫu huyết tương do đó không
thể sử dụng được để xử lý mẫu.
Sửdụng acetonitril đểkếttủa protein huyếttương
cho thấy acetonitril có tương tác với ertapenem và

meropenem làm biến dạng hình dạng pic tương
ứng các chất này. Acetonitril tương tác mạnh nhất
với imipenem, khiến pic imipenem không tách được
khỏi các pic từ nễn huyết tương. Vì vậy chúng tôi
D M 01 c . S . g - 2 Ô 8 , i e R « t = o tt (K O 1_ T H O N o v s . 1 02 00 1 2 D )

quyết định loại acetonitril bằng cách bay hơi ở nhiệt
độ phòng dưới tác động của dòng khí nitơ thổi trên
bể mặt dung dịch. Phương pháp này cho hiệu suất
chiết carbapenem từ mẫu cao (>98%). Qui trình xử
lý huyết tương được xác định là: 400 |j| huyết tương
có chứa carbapenem (có mặt chất ổn định MOPS)
được trộn với 100 |jl dung dịch chuẩn nội. Thêm 500
|j| acetonitril để kết tủa protein. Hỗn hợp được lắc
rung, để yên trong 5 phút sau đó được ly tâm ở tốc
độ 6500 vòng trong 10 phút. Hút 500 |jl dịch trong
đem bay hơi hoàn toàn dung môi dưới dòng khí nitơ.
Cắn thu được hòa tan lại trong 200 |jl dung dịch ổn
định MOPS để tiêm vào hệ thống sắc ký.
Thẩm định phương pháp phán tích
Tính chọn lọc của phương pháp
Mầu huyết tương trắng và mẫu huyết tương chứa
đổng thời IMI, ERT và MER (nổng độ 10 |jg/ml) được
xử lý và phân tích theo phương pháp đả xây dựng.
Trên sắc ký đổ của mẫu huyết tương trắng (hình 1)
trên sắc đổ của mẫu trắng cho thấy tại vị trí tương
ứng với thời gian lưu của IMI, ERT và MER không xuất
hiện các pic tạp. Pic của 3 carbapenem tách hoàn
toàn ra khỏi nhau với thời gian lưu của imipenem,
ertapenem và meropenem tương ứng là 7,3 phút,

14,1 phút và 15,3 phút. Tương tự, sự có mặt của các
thuốc hay sử dụng trong gây mê hổi sức Ngoại khoa
cũng không làm thay đổi hình dạng và độ sắc pic của
3 carbapenem trên sắc đồ. Do vậy, phương pháp đáp
ứng yêu cẩu vể tính chọn lọc theo tiêu chuẩn.


Khoảng tuyến tính
Tiến hành pha các mẫu huyết tương chứa chuẩn
carbapenem ở các nồng độ trong khoảng 0,5 - 80
|jg/ml, riêng ERTIà 0,5 -160 |jg/ml và phân tích theo
quy trình đã xây dựng. Xác định sự tương quan giữa
nổng độ kháng sinh và tỷ lệ diện tích pic chất phân
tích/chất chuẩn nội (bảng 1). Các hệ sổ tương quan
tuyến tính xấp xỉ bằng 1 do đó nống độ carbapenem
với tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/chất chuẩn nội
có tương quan tuyến tính chặt chẽ.
Bảng ì. Sự phụ Ihuốí giữũ tỷ lê diện tích pic (châphán tích/chuổn nội) vã ỉìỗng độ
arbũpenem phú tionq huỳồ tương
Imipenem

Ertapenem

Meropenem

Phương trình
hổi qui

y = 0,1599x
+ 0,0118

y = 0,1549x
+ 0,0714

y = 0,1850x
+ 0,1054

Hệ số tương
quan

r = 0,9993

r = 0,9998

r = 0,9997

Xác định độ đúng, độ lặp lại của phương pháp
Tiến hành thẩm định độ đúng, lập lại trên 3 lô mẫu
thử có chứa nóng độ thấp, nóng độ trung bình và
nổng độ cao (LQC, MQC và HQC) từng carbapenem
(bảng 2). Nồng độ carbapenem có trong mẫu được
xác định bằng phương pháp đường chuẩn từ đó xác
định tỷ lệ % giữa nống độ xác định được so với nóng
độ thực của carnapenem có trong mẫu để tính độ
đúng. Tính chính xác (độ lặp lại) của phương pháp
được xác định từ độ lệch chuẩn tương đổi (RSD). Kết
quả cho thấy ở cả ba nống độ (thấp, trung bình và
cao), phương pháp có độ đúng tốt (-5.08 - 5% lệch so
với nổng độ lý thuyết) và độ lặp lại cao (RSD < 7%).
Bángl. K à quá thốm định đỗ đúng, độ lộp lũicủũ phương pháp

Im ipe nem

LQ C 0 ,5 |ig/
tnl

M Q C20M 9/
ml

H Q C60|tg/m l

Độ đúng

-2,6%

-5%

-3,5%

RSD

5,91%

4,73%

6,31%

Ertap en em

LQ C0,5 pg/
ml

M Q C 40|ig/
ml

H Q C 1 20 |ig/m l

Độ đúng

-3,2%

-2,25%

-5.08%

RSD

2,51%

1,86%

3,93%

M eropenem

L Q C 0 ,5 n g /
ml

M Q C20|ig/
ml

H Q C 6 0|ig/m l

Độ đúng

3,8%

5%

2,83%

RSD

2,75%

2,42%

2,91%

Giới hạn định lượng
Giới hạn định lượng dưới (LOQ) là nóng độ
thấp nhất của đường chuẩn (0,5 ng/ml với cả ba
carbapenem). ở nống độ này, độ chính xác có RSD
không quá 20% và độ đúng không lệch quá 20%.
Độ ổn định của mẫu huyết tương
Độ ổn định của mẫu huyết tương sau ba chu kỳ
đông và rã đông, độ ổn định ở nhiệt độ phòng và độ
ổn định khi bảo quản kéo dài đã được nghiên cứu.
Độ ổn định của thuốc được xác định sau 3 chu kỳ
đông - rã đông ở 3 nóng độ LQC, MQC, HQC đói với
mỗi carbapenem, mỗi nóng độ được xác định trên

3 mẫu huyết tương. Mẫu được để đông ở nhiệt độ
-40°c trong ít nhất 24 giờ sau đó mẫu được rã đông
ở nhiệt độ phòng. Lặp lại chu kỳ trên đến rã đông lán
thứ ba mẫu được phân tích định lượng. Độ ổn định ở
nhiệt độ phòng được xác định ở nóng độ LQC, MQC,
HQC, mỗi nồng độ được xác định trên 5 mẫu huyết
tương với từng carbapenem. Các mẫu được xử lý rói
bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 8 giờ. Vào các thời
điểm 0, 2, 4, 6, 8 giờ tiến hành phân tích mẫu, kết
quả được tính theo đường chuẩn trong ngày. Độ ổn
định của mẫu khi bảo quản kéo dài được xác định 3
nóng độ LQC, MQC, HQC đổi với mỗi carbapenem,
mỗi nóng độ được xác định trên 3 mẫu huyết tương.
Mẫu được bảo quản ở nhiệt độ -40°c và được lượng
vào các ngày 0,7,14.
Kết quả phân tích cho thấy các mẫu trải qua 3 chu
kỳ đông-rã đông, các mẫu định lượng trong ngày ở
nhiệt độ phòng đểu giữ được độ ổn định của mẫu,
đảm bảo với hàm lượng carbapenem còn lại trong
mẫu cao hơn 80% so với thời điểm ban đáu. Với các
mẫu huyết tương bảo quản kéo dài ở -40°c, sau 7
ngày hàm lượng carbapnem còn lại dao động trong
khoảng 83,7%-90,1% so với mẫu ban đáu. Trong khi
đó carbapenem sau 14 ngày, ở nóng độ LQC, cả 3
carbapenem không còn phát hiện được sau 14 ngày.
Với hai nóng độ còn lại, hàm lượng carbapenem chỉ
còn lại 51,4% - 59,6% so với mẫu ban đấu. Do vậy
thời gian tối đa bảo quản các mẫu huyết tương có
chứa carbapenem ở nhiệt độ -40°c là 7 ngày.
Ăp dụng định lượng mẫu huyết tương từ bệnh

nhân
Phương pháp định lượng đã được áp dụng với
mẫu huyết tương thu được từ một bệnh nhân điều


DAD1

c.

S I 8 - 2 0 8 . 1 6 R * f - o t t (M B 1 _ T H O N O \3 K S O a 2 0 1 0 D )

In ũ p e n c m

C huấn nội
M e ro p e n e n i

40

i

20

l.

ẳJ

0

ì

Kinh 2. Sổc đỗ cùa ĩĩìâu huyết tương thu đưac từ bênh á â íì, tợi thời điỂm két thúc (S Ũ U Ih) ímyễn tĩnh rriũch imipíieĩĩì (1000 íĩìgì

trị tại khoa Gây mê Hổi sức, Bệnh viện Hữu nghị
Việt Đức. Bệnh nhân được điểu trị bằng Tienam
(Imipenem) với phác đỗ 1g truyền tĩnh mạch trong
60 phút, 8 h một lần. Máu huyết tương được lấy vào
ngày thứ 3 sau khi bắt đẩu điều trị. Mẫu máu được
chống đòng bằng heparin được đem đi ly tâm ngay
để thu được huyết tương. Trộn đổng thể tích huyết
tương và dung dịch ổn định MOPS và bảo quản ở
-40°c. Mẫu huyết tương được rã đông 1 ngày sau khi
lấy mẫu, được xử lý và phân tích theo qui trình trên.
Sắc đó của mẫu huyết tương thu được khi kết thúc
truyền (tương ứng với c ) được trình bày trong
hình 2. Tính toán theo đường chuẩn xây dựng, nổng
độ imipenem trong mẫu là 18,1 ng/ml.

Kết luận
Đả xây dựng được phương pháp định lượng
imipenem, ertapenem và meropenem trong
huyết tương với độ chính xác cao, độ đúng tốt,
khoảng tuyến tính rộng với tương quan tuyến
tính chặt chẽ giữa nóng độ và tỷ số diện tích pic
chất phân tích/chất chuẩn nội. Mầu huyết tương
độ ổn định sau ba chu kỳ đông - rã đỏng, ở nhiệt
độ phòng trong 8 giờ và khi bảo quản kéo dài ở
-40°c trong 7 ngày sau khi lấy mẫu. Phương pháp
có thể ứng dụng để phân tích các mẫu huyết
tương trong giám sát điểu trị carbapenem tại
Khoa điểu trị tích cực.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Lod ise TP, Lom aestro BM, D rusan o G L, 2006, "A p p licatio n o f an tim icro b ial p h arm aco d yn am ic c o n ce p ts into clin ical practice: Focu s on
[5-lactam antibiotics", Pharmacotherapy, 26, pp. 1320-1332.

2. G ian n o n i E, M oreillon p, C o ttin g J et al, 2006, "Pro spective d ete rm in atio n o f p lasm a im ip e n em co n cen tratio n s in critically ill children",
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 50, pp. 2563-2558.

3. Robert JA , U lld e m o lin s M, Roberts M S et al, 2010, 'Th e ra p e u tic d ru g m o n ito rin g o f p -lactam s in critically III patients: p ro o f o f con cepts",
International Journal of Antimicrobial Agents, 36, pp. 332-339,

4. M cW h in n ey BC, W allis

sc, H illister T et al, 2010, "A n alysis o f 12 b eta-lactam

an tib io tics in h u m an p lasm a by H P LC w ith ultraviolet

detection", Journal of Chromatography B, 878, pp. 2039-2043.

5. Legran d T, C h h u n

s, Rey E et al, 2008, "Sim u ltan eou s d ete rm in atio n o f three carb ap e n em an tib io tics in p lasm a by H P LC w ith ultraviolet

detection", Journal of chromatography B, 875:551 -556.

5. Ta n ig u ch i s, H am ase K, Kino sh ita A et al, 1999, "Sim p le and rapid analytical m eth od for ca rb a p e n e m s u sin g cap illary zo n e
electrophoresis", Jo u rn al o f C h ro m a to g ra p h y B, 727; 219-225.
7. D ailly E, Bo u qu ie R, D e slan d es G, Jo lliet p, Le Floch R, (2011), "A liquid c h ro m a to gra p h y assay for a q u an tificatio n o f do rip en e m ,
ertap en em , im ip e n em , m erop en e m co n cen tratio n s in h u m an plasm a: ap p lica tio n to a clin ical p h arm aco kin etic study", Jo u rn al o f

C h ro m a to g ra p h y B, 879, p p 1137 -1 1 4 2 .

16

Ighien CỨU duợc Thong tin

uoc