Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phương pháp điện di mao quản

Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt
chất kháng HIV trong thuốc bằng phương pháp
Điện di mao quản


Nguyễn Thị Thùy Linh


Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Luận văn ThS chuyên ngành: Hóa Phân tích; Mã số: 60 44 29
Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Văn Ri
Năm bảo vệ: 2012


Abstract: Giới thiệu về các thuốc điều trị (virus gây suy giảm miễn dịch ở người) HIV;
tình hình sử dụng thuốc HIV ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay; các phương pháp phân
tích định lượng thuốc HIV; Giới thiệu chung về phương pháp điện di mao quản. Nghiên
cứu các tài liệu về (điện di mao quản) CE và các đặc tính lý hóa của hoạt chất cần phân
tích. Khảo sát các điều kiện điện di nhằm tìm ra điều tối ưu nhất để tách và định lượng
đồng thời Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin trong chế phẩm viên nén. Tiến hành kiểm
tra chất lượng các thuốc có cùng hoạt chất đang được sử dụng trên thị trường.

Keywords: Hóa phân tích; Định lượng thuốc; Phương pháp điện di mao quản


Content
MỞ ĐẦU
Theo phân tích của các chuyên gia, tổng số người nhiễm HIV vẫn đang tiếp tục duy
trì sự sống ngày càng được tăng cao là hệ quả của hai tác động chủ yếu. Một là số người
nhiễm HIV hàng năm trên toàn cầu vẫn ở mức cao. Chỉ tính riêng năm 2008, thế giới vẫn có
khoảng 2,7 triệu người mới nhiễm HIV. Hai là do kết quả tích cực của liệu pháp điều trị

kháng virut (ARV) làm giảm số người tử vong, kéo dài sự sống cho người bệnh. Đến tháng
12/2008 ước tính khoảng 4 triệu người nhiễm HIV ở các nước có thu nhập thấp và trung bình
được điều trị bằng thuốc kháng HIV, tăng lên 10 lần trong vòng 5 năm. Trong vòng 4 năm
(2004- 2008) nhờ chăm sóc điều trị tốt, số người chết do AIDS đã giảm 10% [12].
HIV/AIDS đang là vấn đề lớn hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Ở nước ta
Thành Phố Hồ Chí Minh là nơi có nhiều ca nhiễm HIV/AIDS nhất (Sau đó là Hội An, An
Giang, Hải Phòng, Quảng Ninh, ). Chúng ta không chỉ ngăn chặn sự lây lan của bệnh mà
còn điều trị hiệu quả để giảm nguy cơ tử vong kéo dài và cải thiện chất lượng cuộc sống cho
người HIV/AIDS. Trong điều trị thì kháng Retrovirut đóng vai trò rất lớn. Trước đây nước ta
chưa đầy đủ các loại thuốc Retrovirut nên thường dùng đơn hóa hoặc phối hợp hai loại thuốc
trong điều trị HIV/AIDS. Giờ có thể kết hợp 3 hoặc 4 loại thuốc trong những trường hợp lâm
sàng nặng hơn. Hiện nay, nước ta đã sản xuất được thuốc chống HIV là Lamididrir
(Lamivudine 150mg + Zidovudine 300mg). Tuy nhiên phần lớn vẫn đang sử dụng thuốc
kháng HIV theo chương trình quốc gia được cấp [12]
Để đảm bảo trong điều trị, an toàn trong sử dụng, việc quản lý chất lượng thuốc kháng
HIV là rất cần thiết. Vì vậy cần có phương pháp phân tích có độ tin cậy cao, nhanh nhằm
đáp ứng yêu cầu kiểm soát tốt chất lượng thuốc HIV.
Cho tới nay sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích hóa lý đa số được
sử dụng để định lượng các loại thuốc. Ưu điểm của phương pháp này là độ lặp lại, độ chính
xác và khả năng tách tốt. Đồng thời thiết bị HPLC hiện đã được tích hợp với hầu hết các kỹ
thuật hóa lý hiện có (phổ UV-VIS, phân tích điện hóa, MS, NMR,…) cho phép nâng cao độ
nhạy và hạ thấp giới hạn phát hiện của phương pháp. Tuy vậy, phương pháp HPLC đòi hỏi
sử dụng dung môi có độ tinh khiết cao, đắt tiền, có nhiều loại gây ảnh hưởng xấu, gây ô
nhiễm môi trường. Đó là xuất phát điểm của việc lựa chọn và phát triển phương pháp định
lượng thuốc dựa trên kỹ thuật hóa lý khác thay thế cho HPLC mà chúng tôi thực hiện trong
nghiên cứu này. Kỹ thuật tách mà chúng tôi lựa chọn làm cơ sở cho nghiên cứu này là điện di
mao quản (CE) [15].
CE là phương pháp mới được phát triển, tuy nhiên có nhiều ưu điểm vượt trội là hiệu lực
tách rất cao, kinh tế và đặc biệt là thời gian phân tích nhanh có thể đáp ứng không những cho
phân tích trong phòng thí nghiệm mà còn phục vụ cho phân tích lâm sàng và trong sản xuất.

Vì thế đây là kỹ thuật rất hữu hiệu để thay thế hay hỗ trợ HPLC trong nhiều lĩnh vực phân
tích, trong đó có nghiên cứu về Dược.
Hơn nữa, chuyên luận chung về CE đã được quy định trong Dược điển một số nước như
Hoa Kỳ, Anh, Trung Quốc…Tuy nhiên ở Việt Nam, CE chưa được ứng dụng nhiều và kinh
nghiệm ứng dụng trong phân tích dược phẩm còn hạn chế. Do vậy chúng tôi nhận định
hướng nghiên cứu của mình sẽ rất có ý nghĩa thực tiễn cho công tác nghiên cứu quản lý chất
lượng thuốc ở nước ta.
Từ những phân tích trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ứng dụng của phương pháp điện
di mao quản vào định lượng thuốc kháng HIV với đề tài:
“Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phương
pháp điện di mao quản”

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN
1.1.Giới thiệu về các thuốc điều trị HIV
Phác đồ phối hợp Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin trong điều trị
Lamivudin và Zidovudin có cấu trúc tương tự nucleosid có tác dụng kháng retrovirus bao
gồm cả HIV-1 và HIV-2 do ức chế enzym phiên mã ngược của virus. Hai thuốc này được sử
dụng phối hợp trong liệu pháp kháng retrovirus để điều trị HIV. Bệnh nhân uống 3TC, AZT kết
hợp Nevirapine trong 6 tháng cho kết quả khá khả quan. Các chỉ số đánh giá tình trạng bệnh
nhân được cải thiện rõ rệt và có ý nghĩa thống kê. Người bệnh tăng cân, có số lượng tế bào
lymphocyte tăng rõ rệt (từ 1273/mm
3
lên 1547/mm
3
), số lượng tế bào CD4 từ 70/mm
3
lên
145/mm
3
làm cho số lượng tế bào CD4 bị phá hủy giảm đi. Như vậy, phác đồ D4T/3TC/NVP có

thể khống chế sự phát triển của virus. Liệu pháp kháng retrovirus làm tăng thời gian sống sót của
người bệnh có số lượng tế bào CD4 dưới 500 trong 1mm
3
. Liệu pháp này cũng có thể dùng cho
những người bệnh có mật độ virus HIV trên 30000/ml huyết tương, không phụ thuộc vào số
lượng tế bào CD4, vì mật độ HIV là một yếu tố tiên lượng sự tiến triển của bệnh [12].
* Lamivudin:
(3TC)
Công thức phân tử: C
8
H
11
N
3
O
3
S. Phân tử lượng 229,3.
Tên khoa học: 4-amino-1[2-(hydroxymethyl)-1,3- oxathiolan-5- yl]-2(1H) pyrimidinon
Tính chất: Là bột kết tinh màu trắng.
Nhiệt độ nóng chảy: 160
0
-162
0
C. Dễ tan trong nước, ít tan trong cồn, khó tan trong các dung môi
hữu cơ.
Năng suất quay cực: [α]
21
D
= - 135
0

( C = 0,38 % trong methanol )
Hằng số pK
a
= 3,31.
Lamivudin hấp thụ UV ở bước sóng hấp thụ cực đại là 278nm; A
1%
1cm
trong H
+
1M ~ 600
*Zidovudin:
(AZT)
Công thức phân tử C
10
H
13
N
5
O
4
. Phân tử lượng 267.242 g/mol.
Tên khoa học:
1-[(2R,4S,5S)-4-azido-5-(hydroxymethyl) oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione
Tính chất : Tinh thể trắng hoặc hơi nâu.
Nhiệt độ nóng chảy: ~ 124
0
C. Khó tan trong nước, ít tan trong cồn .
Năng suất quay cực + 60,5
0
→ + 63,0

0
( C = 1% trong EtOH) ; + 99
0
(C = 0,5% trong nước)
Hằng số pK
a
= 9,36
*Nevirapin
(NVP)
Công thức phân tử C
15
H
14
N
4
O. Phân tử lượng 266.888 g/mol.
Tên khoa học:
11-cyclopropyl-4-methyl-5,11-dihydro-6H- dipyrido[3,2-b:2′,3′-e][1,4]diazepin-6-one
Tính chất : Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng. Thực tế không tan trong nước, ít tan
trong CH
3
Cl.
Năng suất quay cực + 60,5
0
→ + 63,0
0
( C = 1% trong EtOH) ; + 99
0
(C = 0,5% trong nước)
Hằng số pK

a
= 2,42.
1.2. Tình hình sử dụng thuốc HIV ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay
Tính đến 31/5/2012, trên toàn quốc có 66.191 người nhiễm HIV trong đó có 62.654 người
lớn và 3.537 trẻ em, đạt 94,6% kế hoạch năm 2012. Kết quả báo cáo tại 10 tỉnh có số người
được điều trị cao nhất là 46.332 bệnh nhân, chiếm 70% số người nhiễm HIV đang được điều trị
trên toàn quốc. Thành phố Hồ Chí Minh tiếp tục là thành phố dẫn đầu cả nước về số lượng
người nhiễm HIV đang điều trị. Tính đến 31/5/2012, thành phố Hồ Chí Minh có 20.435
người nhiễm HIV đang điều trị, chiếm 30,9% số lượng bệnh nhân đang điều trị trên toàn
quốc
[10].

Kể từ ca nhiễm HIV được phát hiện đầu tiên tại Mỹ từ năm 1981, cho đến nay loài người đã
trải qua 30 năm đối phó với một đại dịch quy mô lớn, phức tạp, tính đến cuối năm 2009, có 33,3
triệu người đang bị nhiễm HIV, tỷ lệ người nhiễm HIV trong nhóm tuổi 15-49 là 0,8%. Riêng
năm 2009 ước tính có 2,6 triệu người nhiễm mới HIV và 1,8 triệu người tử vong do AIDS. So
sánh với năm 1999, số người nhiễm mới HIV đã giảm 21%. Báo cáo UNAIDS cũng ghi nhận
tính cuối năm 2009 đã có 33 nước có số ca nhiễm mới giảm, trong đó 22 nước khu vực cận
Saharan, Châu Phi. Tuy nhiên hiện vẫn còn 7 nước tỷ lệ nhiễm mới tăng trên 25% khi so sánh
giữa năm 1999 và 2009[11].
1.3. Các phƣơng pháp phân tích định lƣợng thuốc HIV
1.3.1. Các phƣơng pháp sắc ký (HPLC & HPTLC)
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng
trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là trong việc tách và
phân tích lượng vết các chất. Phương pháp HPLC với cột tách pha đảo được sử dụng rất rộng rãi
để xác định thuốc HIV trong các loại mẫu khác nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp
khác vì có độ chính xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng…
Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau khi rửa giải.
Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã mở rộng khả năng phân
tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối với phân tích dư lượng, detector khối

phổ (MS) là một sự lựa chọn ưu tiên do có thể phát hiện và phân tích chất trong các đối tượng
phức tạp.
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) với pha động là 20mM đệm
Natri photphats (8mM muối Natrioctanesulphonic acid) : axetolnitril (04:01,v/v), pH= 3,5 điều
chỉnh bằng acid photphoric. Pha tĩnh là Cột C18-ODS Hypersil (5µm x 250mm x 4,6mm). Thời
gian lưu của mỗi chất là Stavudine là 2,85 phút, Lamivudine là 4,33 phút và Nevirapine là 8,39
phút.[26]
Xác định bằng Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao với dung môi pha động là
chloroform: methanol(9:1,v/v), pha tĩnh là bản mỏng Silicagen 60F
254
và định lượng các chất ở
bước song hấp thụ 265nm. Hệ số lưu giữ của Stavudine, Lamivudine và Nevirapine lần lượt là
0.21-0.27, 0.62-0.72 và 0.82-0.93.[26]
Xác định thuốc HIV trong huyết tương bằng phương pháp LC-MS/MS với metaxalone là
chất chuẩn nội với giai đoạn đầu tiên là Chiết pha rắn, sau đó sử dụng cột C18 (5µm x 150mm x
3.9mm) pha động là 0.5% acetic băng trong nước : axetolnitril (20:80,v/v). Các ion được tách ra
và theo dõi trên máy phổ khối tứ cực.[21]
1.3.2. Phƣơng pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)
Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao,
thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định
thuốc HIV trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau.
Xác định Lamivudin (3TC), Stavudine( d4T) và Nevirapin (NVP) bằng phương pháp MEKC.
Tác giả đã sử dụng Cột mao quản silica trần dài 73,5 cm (chiều dài hiệu dụng 62cm), đường kính
trong là 75µm. Dung dịch điện li nền bao gồm 10mM sodium tetraborat (pH= 9,8), 100mM
sodiumdodecylsunphat (SDS) và 15%(v/v) 2-propanol. Áp thế 20kV.Bơm mẫu bằng áp suất
50mbar trong 9s. Tất cả các chất được tách ra trong vòng 14 phút. Khoảng tuyến tính 20-200
µg/ml (r
2
= 0,9996) cho 3TC; 5-50 µg/ml (r
2

= 0,9985) cho d4T và 25-250 µg/ml (r
2
= 0,9987)
cho NVP[24]
Nhóm nghiên cứu đã tách được lamivudin và tạp đồng phân hoàn toàn (độ phân giải 1,95)
với điều kiện điện di thích hợp là: cột mao quản silaca nung chảy, đường kính trong 50 µm,
chiều dài 48 cm, chiều dài hiệu quả 39,5 cm, nhiệt độ cột 25
0
C, điện thế 15 kV, bước sóng phát
hiện 270 nm… Về định lượng lamivudin trong chế phẩm, với dung dịch đệm natri tetraborat (pH
khoảng 9,2) và sự hiện diện của chất hoạt động bề mặt là SDS (sodium dodecyl sulfat) có thể
phân tích đồng thời lamivudin và chất phối hợp zidovudin…; điều kiện điện di thích hợp là: cột
mao quản silaca nung chảy, đường kính trong 50 µm, chiều dài 48 cm, chiều dài hiệu quả 39,5
cm, nhiệt độ cột 25
0
C, điện thế 15 kV, bước sóng phát hiện 270 nm, dung dịch đệm natri
tetraborat 50 Mm chứa 50 mM SDS [9]
Micellar điện động sắc ký (MEKC) phương pháp để tách và định lượng đồng thời lamivudine
và zidovudine trong dược phẩm đã được phát triển. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tách, chẳng hạn
như pH, nồng độ chất hoạt động bề mặt (sodium dodecyl sulfate, SDS), dung môi hữu cơ và điện
áp áp dụng đã được tối ưu hóa. Dung dịch điện ly nền bao gồm 12,5 decahydrate tetraborat mM
sodium và 15 mM axit boric điều chỉnh pH 10,8, có chứa 90 mM SDS 5% (v / v) acetonitrile
(ACN) đã được khảo sát là phù hợp cho việc tách các loại thuốc. p-aminobenzoic acid (PABA)
đã được sử dụng như là chất chuẩn nội (IS). Phát hiện chất phân tích và IS được thực hiện ở
bước sóng 210 nm. Điện di đồ đã được quan sát thấy rằng cả hai loại thuốc và IS đã được di
chuyển trong vòng 20 phút ở điện áp 10 kV. Đánh giá của phương pháp này đã được thực hiện
về tính chính xác, độ tuyến tính, độ đúng, giới hạn phát hiện (LOD) và định lượng
(LOQ). Khoảng tuyến tính từ 10-80 mg / ml cho Lamivudine và 10-100 mg / ml cho
Zidovudine. Các giới hạn phát hiện cho Lamivudine và Zidovudine được tìm thấy là 2,5 và 2,0
mg / ml, tương ứng. Phương pháp đã được áp dụng để xác định đồng thời Lamivudine và

Zidovudine trong huyết tương. Độ thu hồi của cả hai thuốc ở dạng bào chế viên thuốc và trong
huyết tương ≥ 99,72% (độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ≤ 1,84%) và ≥80,4% (RSD ≤ 5,4%),
tương ứng.[25]



CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. ĐIỀU KIỆN NGHIÊN CỨU
2.1.1.1. Các chất chuẩn đối chiếu
- Chuẩn quốc gia Lamivudine (200mg/ lọ) hàm lượng 99,45 % C
8
H
11
N
3
O
3
S
tính theo nguyên trạng, SKS 031214603, bảo quản nhiệt độ 5
0
C, tránh ánh sáng - Viện kiểm
nghiệm – Bộ Y Tế.
- Chuẩn quốc gia Zidovudin (200 mg/ lọ) hàm lượng 99,64 % C
10
H
13
N
5
O

4
(HPLC) tính theo
nguyên trạng, SKS 0105143, bảo quản nhiệt độ 5
0
C, tránh ánh sáng – Viện kiểm nghiệm - Bộ Y
Tế.
- Chuẩn quốc gia Nevirapin (200 mg/ lọ) hàm lượng 99,49 % C
15
H
14
N
4
O tính theo nguyên
trạng, SKS WS 0109263, bảo quản nhiệt độ 2
0
C – 8
0
C, tránh ánh sáng – Viện kiểm nghiệm - Bộ
Y Tế.
2.1.1.2. Hóa chất:
- Nước cất deion: là nước cất hai lần mới, được lọc qua bộ lọc tinh khiết có cột trao đổi anion và
cation, sau đó lọc qua màng lọc 0,2µm.
- Axít Boric H
3
BO
3
, muối natri tetraborat Na
2
B
4

O
7
.10H
2
O, chất hoạt động bề mặt Natri dodecyl
sunfat SDS, NaOH, NaH
2
PO
4
.2H
2
O, Na
2
HPO
4
… của hãng MERCK KGaA Germany
2.1.1.3. Thiết bị và dụng cụ
- Máy điện di mao quản Aligent CE system 9001 được điều khiển bằng phần mềm Chemstation
100001 (sản xuất tại hãng Hewlett Packard, Đức) của bộ môn Hóa phân tích- Độc chất, Trường
đại học Dược Hà Nội.
- Máy lọc nước tinh khiết Sartorius arium 611: model SARTORIUS AG GOTYINGEN, áp suất
tối đa 100psi/ 6,9bar.
- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H ( sản xuất tại hãng Elma, Đức).
- Máy đo pH EUTECH Instrument.
- Cân phân tích Sartorius TE214S.
- Giấy lọc đường kính lỗ lọc 11cm- Trung Quốc.
- Màng lọc PTFE với kích thước lỗ lọc 0,2 µm.
- Bộ lọc hút chân không màng lọc cenlulose với kích thước lỗ lọc 0,45 µm.
- Các dụng cụ chính xác: bình định mức, pipet chính xác với các thể tích khác nhau.
- Các dụng cụ khác: cốc có mỏ, ống nghiệm, đũa thủy tinh, chày và cối.

2.1.2. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.2.1. Chế phẩm làm việc
- Chế phẩm làm việc Lamivudine 150mg, Nevirapine 200mg & Zidovudine 300mg do công ty
Ranbaxy laboratories Limited Ấn Độ sản xuất . Ngày sản xuất 9/2011. Hạn sử dụng 9/ 2013.
- Chế phẩm làm việc Lamivudine 150mg & Zidovudine 300mg do công ty Matrix Laboratories
Limited Ấn Độ sản xuất. Ngày sản xuất 9/2011. Hạn sử dụng 10/2013
2.1.2.2. Chuẩn bị mẫu
* Pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử:
- Dung dịch gốc chuẩn: cân chính xác khoảng 30,9 mg Lamivudin, 39,7 mg Nevirapin và 59,6
mg Zidovudin vào cốc có mỏ. Thêm vào 10,0 ml MeOH hòa tan, sau đó thêm nước cất deion hòa
tan. Chuyển hết vào bình định mức 100 ml, siêu âm cho tan hoàn toàn, thêm nước deion đến thể
tích vừa đủ và lắc đều.
- Dung dịch chuẩn: hút chính xác 5,0ml dung dịch gốc chuẩn pha vào bình định mức 10ml, thêm
nước deion vừa đủ thể tích và lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,2µm.
- Dung dịch mẫu thử: Cân 20 viên thuốc viên, xác định khối lượng trung bình một viên và nghiền
thành bột mịn. Cân một lượng bột viên tương ứng với 15,00 mg Lamivudin, 20,00 mg
Nevirapin và 30,00 mg Zidovudin cho vào bình định mức 100,0 ml, thêm 70 ml nước deion siêu
âm cho tan hết, thêm nước deion đến vừa đủ thể tích, lắc đều. Lọc qua giấy lọc đường kính lỗ lọc
11cm. Bỏ 20 ml dịch lọc đầu. Dịch lọc được tiếp tục lọc qua bộ lọc hút chân không màng lọc
0,45µm. Tiếp tục bỏ 20ml dịch lọc đầu. Dịch lọc được lọc qua màng lọc 0,2µm trước khi tiêm
vào lọ đựng mẫu.
-Dung dịch mẫu trắng: Chuẩn bị như mẫu chuẩn nhưng không có chất phân tích.
*Chuẩn bị dung dịch điện ly nền:
- Dung dịch điện ly nền Na
2
B
4
O
7
10mM: Cân chính xác khoảng 0,1906 g Na

2
B
4
O
7
vào bình định
mức 50,0 ml thêm nước để siêu âm và hòa tan hoàn toàn. Điều chỉnh nước tới vạch và lắc đều.
- Dung dịch điện ly nền Na
2
B
4
O
7
10mM + SDS 50mM : Cân chính xác khoảng 0,1906 g
Na
2
B
4
O
7
và 0,7210 g SDS vào bình định mức 50,0 ml thêm nước để siêu âm đuổi khí và hòa tan
hoàn toàn. Điều chỉnh nước tới vạch và lắc đều. Dung dịch điện ly nền này điều chỉnh pH đến
pH 8,5 ; pH 9,2 và pH 10.
- Dung dịch điện ly nền Na
2
B
4
O
7
10mM + β-cyclodextrin 10mM: Cân chính xác khoảng 0,1906

g Na
2
B
4
O
7
và 0,4820g β-cyclodextrin vào bình định mức 50,0 ml thêm nước để siêu âm đuổi khí
và hòa tan hoàn toàn. Điều chỉnh nước tới vạch và lắc đều.
2.2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nội dung nghiên cứu
Tham khảo và nghiên cứu các tài liệu về CE và các đặc tính lý hóa của hoạt chất cần phân
tích. Trên cơ sở đó khảo sát các điều kiện điện di nhằm tìm ra điều tối ưu nhất để tách và định
lượng đồng thời Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin trong chế phẩm viên nén. Từ phương pháp
đã xây dựng được, tiến hành kiểm tra chất lượng các thuốc có cùng hoạt chất đang được sử dụng
trên thị trường.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
Hai kỹ thuật được lựa chọn ở đây là CZE, MEKC xem ở kiểu điện di nào có thể tách tốt các
hoạt chất.
Sau đó tiến hành khảo sát các điều kiện để chọn chương trình điện di thích hợp, cụ thể là:
- Lựa chọn kiểu (mode) điện di phù hợp.
- Nghiên cứu chọn điều kiện tối ưu tách 3 hoạt chất và định lượng đồng thời như: pH, nồng độ
chất điện ly, điện thế, nhiệt độ….
- Đánh giá thống kê phương pháp phân tích
- Áp dụng phân tích một số mẫu thuốc
- Đánh giá ưu khuyết điểm của phương pháp

CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ƣu điều kiện tách 3TC, AZT và NVP
3.1.1. Chọn bƣớc sóng phát hiện chất
Để khảo sát phổ 3TC,AZT và NVP, detector được chọn là DAD. Do 3 hoạt chất đều là

những hợp chất không có mầu, hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại nên chúng tôi sử dụng máy
điện di với detector DAD để quét phổ trực tiếp với khoảng quét phổ là 190 – 400 nm để xác định
các bước sóng hấp thụ tối ưu của các chất này. Các chất được pha với nồng độ 120µg/ml trong
10 mM đệm Borat, 50 mM SDS, pH=9,3. Phổ thu được thể hiện hình 3.1.
Kết quả quét phổ cho ta thấy: Lamivudin có phổ hấp thụ quang cao nhất ở 270,5nm,
Zidovudin có phổ hấp thụ quang cao nhất ở 264,5nm và Nevirapin có phổ hấp thụ quang cao
nhất ở 268,5nm.Chúng tôi chọn các bước sóng hấp thụ cực đại cho từng chất trong phép định
lượng để cho kết quả chính xác nhất. Detector sử dụng của máy điện di là detector DAD của
hãng HP.
3.1.2. Mao quản và xử lý mao quản
Để phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm loại mao quản chúng tôi sử dụng trong
nghiên cứu này có đường kính trong là 75 µm .
Thời điểm bắt đầu : lần lượt rửa bằng nước deion 5 phút, dung dịch NaOH 1M 10 phút ,
dung dịch NaOH 0,1 M 5 phút và rửa lại bằng nước deion 10 phút (tất cả các dung dịch trước khi
chạy đều được lọc qua màng lọc 0,2µm).
Giữa các lần chạy: 2 phút nước cất deion- 1 phút NaOH 0,1 M – 1 phút nước cất deion– 2
phút dung dịch đệm.
Thời điểm kết thúc: lần lượt rửa bằng nước cất deion 5 phút, dung dịch NaOH 0,1M 5
phút, nước cất deion 10 phút.
3.1.3. Chọn phƣơng pháp bơm mẫu
Phương pháp bơm mẫu bằng áp suất là dùng một áp suất thích hợp để nén vào lọ chứa
mẫu và tạo chân không phía đầu kia mao quản trong một thời gian nhất định. Do lực áp suất đẩy
và hút mà một lượng mẫu sẽ được bơm vào đầu mao quản. Áp suất hay được dùng từ 50 – 300
mbar. Mẫu được bơm vào sẽ có nồng độ đều và giống với nồng độ của chất tan trong mẫu phân
tích. Trong phương pháp này chúng tôi chọn bơm mẫu theo phương pháp thủy động lực học với
áp suất là 50 mbar và cách bơm mẫu này sẽ được dùng trong suốt quá trình thí nghiệm
3.1.4. Độ điện di và độ điện di hiệu dụng
Trong kỹ thuật MEKC chất tạo Mixen có vai trò rất quan trọng, nó quyết định đến độ
phân giải của quá trình tách. Các hạt Mixen hình thành trong dung dịch điện di đóng vai trò như
pha tĩnh giả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dung loại Natri dodecyl sunphat (SDS), tức

là Mixen được hình thành bởi các phân tử SDS.
3.1.5 Lựa chọn cơ chế tách
Tiến hành chạy điện di hỗn hợp mẫu chuẩn tương ứng với nồng độ của Lamivudin
150µg/ml, Nevirapin 200 µg/ml và Zidovudin 300 µg/ml trên 3 loại dung dịch điện li nền là
dung dịch Na
2
B
4
O
7
10mM; Na
2
B
4
O
7
10mM + SDS 50mM ; Na
2
B
4
O
7
10mM + β-cyclodextrin
10mM.
Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 5s, nhiệt độ mao quản
25
0
C
Nhận thấy nếu chỉ dùng phương pháp điện di mao quản vùng (CZE) thì không tách được 3 chất
ra khỏi nhau. Vì pK

a
của Lamivudin (pK
a
= 3,31 ) và Nevirapin (pK
a
= 2,42) khá gần nhau. Trong
dung dịch điện ly nền với khoảng pH nhất định thì 2 chất này bị ion hóa giống nhau, 2 chất đi ra
khỏi mao quản trong cùng một thời điểm nên trên điện di đồ chỉ xuất hiện 2 pic mà thôi.
Thêm vào dung dịch điện li nền Na
2
B
4
O
7
10mM một chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm
(SDS) thì độ phân giải giữa 3 chất tăng rõ rệt. Cả 3 chất được tách rõ ràng trên điện di đồ. Vì mỗi
chất sẽ có sự phân bố vào Pha tĩnh giả SDS khác nhau nên có thể tách ra khỏi nhau. Như vậy các
hoạt chất này sẽ tách được theo cơ chế MEKC.
Còn khi thêm vào dung dịch điện li nền Na
2
B
4
O
7
10mM một chất chọn lọc đối quang β- CD thì
trên điện di đồ cũng chỉ xuất hiện 2 pic có nghĩa là yếu tố không gian của 3 chất này không ảnh
hưởng tới quá trình tách. Chất hoạt động bề mặt β- CD không được lựa chọn.
Chọn phương pháp MEKC với chất hoạt động bề mặt là SDS đối với các khảo sát còn lại cho các
hoạt chất này.
3.1.6. Ảnh hƣởng pH của dung dịch điện li nền

Ảnh hưởng pH trong dung dịch đệm điện di được khảo sát với dung dịch điện di với giá trị pH
thay đổi tại pH = 8,76; 9,06; 9,30; 9,62; 10,17.
Từ hình 3.3, ở pH =8,76 đến 9,06 các chất vẫn tách nhau tốt, nhưng thời gian phân tích
dài hơn, đường nền dốc.
Nhận thấy càng tăng pH từ 9,62 đến 10,17 thì khả năng tách tốt hơn, và pic nhọn hơn,
ảnh hưởng của nền có hấp thụ UV và các chất phân tích hấp thụ UV giảm dẫn đến diện tích pic
giảm. Ở pH= 9,30 các chất tách nhau tốt, độ hấp thụ tốt, giảm hấp thụ đường nền và thời gian
phân tích hợp lý.Vì thế chúng tôi chọn pH= 9,30 cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.7. Ảnh hƣởng của thành phần dung dịch đệm
Cùng với pH của dung dịch đệm, chất điện ly trong pha động cũng có vai trò rất quan
trọng và nó phải có nồng độ phù hợp.
Thực nghiệm nhận thấy, khi chạy điện di trong dung dịch điện li nền Na
2
HPO
4
10mM và
Natricitrat 10mM thì chưa xuất hiện pic trước thời gian 15 phút, mặt khác cường độ dòng điện
không ổn định. Vì vậy chúng tôi quyết định chọn dung dịch điện li nền Natritetraborat cho các
khảo sát tiếp theo.
3.1.8. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ chất tạo mixen SDS
Chất hoạt động bề mặt SDS được xem như pha tĩnh giả của quá trình tách vì thực chất nó
vẫn chuyển động cùng với dòng điện di. Nồng độ SDS trong dung dịch đệm điện di có ảnh
hưởng mạnh tới độ điện li hiệu dụng của các chất bởi nó liên quan đến sự hình thành hạt Mixen
cũng như nồng độ Mixen trong dung dịch đệm điện di. Để khảo sát ảnh hưởng của SDS đến quá
trình điện di, nồng độ SDS đã bị thay đổi tại ba giá trị là 25 mM; 50 mM và 75 mM. Tại nồng độ
75 mM nhận thấy thời gian phân tích dài hơn so với nồng độ 50 mM và 25 mM,chiều cao pic
giảm. Nồng độ SDS 25 mM hiệu quả tách cũng tốt nhưng chiều cao pic không bằng 50 mM, sẽ
gây ảnh hưởng độ nhạy. Vì vậy chúng tôi chọn nồng độ SDS = 50 mM tối ưu để khảo sát các thí
nghiệm tiếp theo.
3.1.9. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ đệm

Cùng với pH của dung dịch đệm, chất điện giải (chất điện ly) trong pha động cũng có vai
trò quan trọng và nó phải có nồng độ phù hợp. Trong thực tế, người ta cố gắng chọn chất đệm pH
cũng đồng thời chính là chất điện giải của điện di. Như vậy, pha động sẽ không phức tạp, không
gây khó khăn ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Ở đây tôi chọn Natri tetraborat vừa là chất đệm pH
vừa là chất điện giải. Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ dung dịch điện ly nền Na
2
B
4
O
7
tại
bốn gía trị là 5 mM; 10 mM; 20 mM; 30 mM. Nồng độ đệm 5 mM, lực ion thấp hơn, giảm được
cường độ dòng điện I, tăng sự hấp phụ của mẫu lên thành mao quản, tốc độ di chuyển của các
chất tan nhanh hơn nhưng chiều cao, diện tích pic giảm hơn. Còn nồng độ đệm là 20mM thì độ
phân giải cũng tăng nhưng thời gian phân tích dài hơn. Do đó chúng tôi chọn nồng độ 10 mM
đệm Borat là điều kiện tối ưu.
3.1.10. Khảo sát ảnh hƣởng thời gian bơm mẫu
Chúng tôi tiến hành khảo sát thời gian bơm mẫu tại ba gía trị là 3s, 5s và 7s. Hình 3.6 thể
hiện mối quan hệ giữa chiều cao pic và thời gian bơm mẫu, khi tăng thời gian bơm mẫu, chiều
cao pic tăng lên nhưng không đáng kể. Trong cùng một điều kiện, khi tăng thời gian bơm mẫu,
thời gian lưu các chất hầu như không thay đổi hoặc thay đổi rất ít, chỉ có chiều cao các pic thay
đổi. Vì vậy chúng tôi chọn thời gian bơm mẫu 5s là điều kiện tối ưu.
3.1.11. Khảo sát ảnh hƣởng thế điện di
Khảo sát thế điện di tại ba gía trị 15 kV, 20 kV và 22 kV. Khi tăng thế điện từ 15kV đến
22kV, thời gian di chuyển của các chất càng giảm. Tại thế 15kV và 20kV đạt hiệu quả tách tốt,
nhưng thời gian di chuyển của cấc chất ở 15kV khá lớn gần 14 phút mới xuất hiện pic của chất
thứ 3.
Với thế 22kV, thời gian di chuyển ngắn hơn, độ điện di hiệu dụng lớn hơn so với 15kV,
20kV nhưng kết quả tách kém, độ phân giải giữa pic thứ 1 và pic thứ 2 không cao và chiều cao
pic thứ nhất giảm. Vì khi tăng thế V, dòng điện I lớn sẽ gây ra hiệu ứng nhiệt Jun lớn, làm nóng

mao quản gây ra sự doãng pic. Tức là làm giảm hiệu quả tách. Vì vậy chúng tôi chọn thế tại
20kV là phù hợp.
3.1.12. Ảnh hƣởng nhiệt độ của mao quản
Sự khác nhau về nhiệt độ ảnh hưởng không lớn tới hiệu quả tách nên để bảo vệ cột và hệ
thống CE, chúng tôi sẽ làm mát Cột và để Cột trong hệ thống điều nhiệt Cột. Cột được giữ ổn
định ở nhiệt độ phòng 25
0
C.
3.1.13.Tổng kết điều kiện tối ƣu
Bảng 3.1. Tổng kết các điều kiện tối ưu
Các yếu tố
Điều kiện
Detector
DAD
Số đo bước sóng chung
Lamivudin 270nm, Zidovudine 264,5 nm và Nevirapin 268,5nm
Kích thước mao quản
Mao quản silica trần, tổng chiều dài 64.5cm, chiều dài hiệu
dụng 60 cm, đường kính trong 75µm, loại bubble cell.
Chất tạo mixen
SDS
Phương pháp bơm mẫu
Thủy động hoc : 5s; 50 mbar
Thế điện di
20 kV
Dung dịch điện ly
Na
2
B
4

O
7
10mM + SDS 50mM, pH = 9,30.
Nhiệt độ
25
0
C


Hình 3.8. Điện di đồ của 3TC, AZT, NVP tại điều kiện tối ưu.
3.1.14. Định tính Lamivudin, Nevirapin và Zidovudin trong điều kiện điện di đã thiết lập
Chúng tôi định tính 3TC, NVP và AZT theo phương pháp thêm chuẩn.
Tiến hành chạy điện di lần lượt các mẫu: chuẩn hỗn hợp 3TC, NVP và AZT;chuẩn hỗn
hợp sau khi thêm chuẩn 3TC; chuẩn hỗn hợp sau khi thêm chuẩn NVP; chuẩn hỗn hợp sau khi
thêm AZT.
Kết quả trên điện di đồ hình cho thấy pic di chuyển tới detector thứ nhất có đáp ứng (diện
tích pic) tăng vọt lên (từ 47,42 lên 83,28) khi thêm 3TC chuẩn nên chất di chuyển đến Detector
sớm nhất là Lamivudin .Tương tự chất di chuyển đến Detector thứ hai là Zidovudin và chất di
chuyển đến Detector cuối cùng là Nevirapin.
3.2. Đánh giá phƣơng pháp phân tích
3.2.1. Khảo sát tính tƣơng thích hệ thống
Tiêm lặp lại 6 lần cùng một mẫu chuẩn trên. Kết quả phân tích được trình bày ở bảng 3.2.
Nhận xét: kết quả thống kê cho thấy sau 6 lần điện di thông số thời gian di chuyển và
diện tích pic có RSD < 2%, giá trị độ phân giải lớn hơn 1,5. Vậy phương pháp đạt tính tương
thích hệ thống ( Thẩm định phương pháp theo ICH)
3.2.2. Tính đặc hiệu
Chúng tôi đã tiến hành điện di mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử theo điều kiện điện di tối
ưu( theo ICH). Kết quả thu được như hình bên.
Nhận xét: mẫu trắng không có pic trùng với pic chất phân tích. Điện di đồ mẫu chuẩn và mẫu thử
là giống nhau. Khi thêm chất chuẩn Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin vào mẫu thử thì diện

tích pic tăng lên. Vậy phương pháp có tính đặc hiệu.
3.2.3. Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đƣờng chuẩn
Chúng tôi tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính trong điều kiện tối ưu mục 3.1.14 của
3TC, AZT và NVP. Chuẩn bị 6 hỗn hợp dung dịch chuẩn có chứa 3TC nồng độ từ 77,25 µg/ml
đến 231,7µg/ml, NVP nồng độ từ 99,25 µg/ml đến 297,7 µg/ml và AZT nồng độ từ 149,0 µg/ml
đến 447,0 µg/ml , mỗi nồng độ được đo lặp lại 3 lần.
được như sau:
Bảng 3.3: Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ 3TC tương ứng
Nồng độ (µg/ml)
77,25
123,6
154,5
169,95
185,4
231,7
Diện tích pic
(mAU.s)
29,85
47,60
62,10
70,70
78,76
97,80
Phương trình hồi quy tuyến tính : S = (-6,10 ±5,79) + (0,449 ±0,036)C
Hệ số tương quan : r = 0,996
Bảng 3.4. Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ AZT tương ứng
Nồng độ (µg/ml)
149,0
238,4
298,0

327,8
357,6
447,0
Diện tích pic (mAU.s)
57,4
94,8
120,6
138,7
149,4
186,5
Phương trình hồi quy tuyến tính : S = (-8,29 ±8,22) + (0,439 ±0,025)C.
Hệ số tương quan : r = 0,998

Bảng 3.5. Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ NVP tương ứng
Nồng độ (µg/ml)
99,25
158,8
198,5
218,3
238,2
297,7
Diện tích pic
(mAU.s)
58,6
93,7
119,48
136,7
148,6
188,4
Phương trình hồi quy tuyến tính : S= (-9,05 ±8,36) + (0,661 ±0,039)C.

Hệ số tương quan : r = 0,998
3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ)
Bảng 3.6.Giới hạn phát hiện(LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của đường chuẩn
Chất
phân
tích
Phương trình đường
chuẩn
Hệ số góc (b)
Độ lệch
chuẩn (S
y
)
LOD
(µg/ml)
LOQ
(µg/ml)
3TC
S= -6,10 +0,449.C
0,449
1,50
10.02
33,41
AZT
S= -8,29 + 0,439.C
0,439
2,13
14,55
48,52
NVP

S= -9,05 + 0,661.C
0,661
2,17
9,85
32,83
3.2.5. Độ lặp lại của phƣơng pháp
Một phương pháp phân tích tốt ngoài việc có sai số nhỏ còn yêu cầu có độ lặp lại cao. Để đánh
giá độ lặp lại của phương pháp, chúng tôi tiến hành khảo sát độ lặp lại ở 3 nồng độ của 3TC là
(77,25; 154,5 và 231,7 µg/ml), của AZT là (149; 298,0 và 447 µg/ml), của NVP là (99,25; 198,5
và 297,7 µg/ml). Mỗi mức nồng độ tiến hành với 5 mẫu độc lập.
Nhận xét: Từ bảng kết quả cho thấy ở cả 3 mức nồng độ thấp, trung bình và cao của khoảng
nồng độ tuyến tính của Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin đều có RSD <2% chứng tỏ phương
pháp có độ tập trung dữ liệu cao.( Theo hướng dẫn thẩm định phương pháp của ICH).
3.2.6. Độ đúng của phƣơng pháp
Độ đúng của phương pháp được xác định bằng tỷ lệ tìm lại của một mẫu thử đã được cho thêm
những lượng chuẩn nhất định. Trong phần thẩm định này, chúng tôi thêm khoảng 20% so với
lượng có trong mẫu. Tỷ lệ thu hồi lý thuyết là 98% - 102%.
Nhận xét: Từ bảng 3.10 , 3.11 và 3.12 ta thấy tỷ lệ phần trăm thu hồi của Lamivudin và
Zidovudin và Nevirapin trong hỗn hợp chế phẩm nằm trong giới hạn cho phép (98% - 102%). Do
đó phương pháp này có độ đúng cao(Theo hướng dẫn thẩm định phương pháp của ICH).
3.2.7. Kết quả định lƣợng trong chế phẩm
3.2.7.1. Kết quả định lượng trong viên nén AVOCOMB-N:
Bảng 3.13.Kết quả định lượng viên nén Avocomb-N
Mẫu
thử
Hàm lượng hoạt chất trong 1 viên
(mg)
% Hàm lượng so với trên nhãn
Lamivudin
Nevirapin

Zidovudin
Lamivudin
Nevirapin
Zidovudin
T
1

152,6
203,5
298,3
100,4
101,8
99,43
T
2

148,3
205,0
295,5
98,87
102,5
98,5
T
3

154,3
200,8
286,4
102,87
100,4

95,47
3.2.7.2.Kết quả định lượng viên nén Lamivudine 150mg & Zidovudine 300 mg
Bảng 3.14. Kết quả định lượng viên nén Lamivudine 150mg & Zidovudine 300 mg
Mẫu
thử
Hàm lượng hoạt chất trong 1 viên (mg)
% Hàm lượng so với trên nhãn
Lamivudin
Zidovudin
Lamivudin
Zidovudin
T
1

148,5
304,7
99,0
101,57
T
2

153,6
297,4
102,4
99,13
T
3

151,5
302,5

101,0
100,83

Nhận xét: Chế phẩm được khảo sát có hàm lượng nằm trong khoảng giới hạn định lượng cho
phép (95%- 105%) ( theo phụ lục 11.1 Dược điển Việt Nam IV)
3.3. Ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp điện di mao quản (CE)
Phương pháp CE là một phương pháp phân tích hiện đại cho độ tin cậy và hiệu quả tách
cao. Phương pháp có thể xác định được trên nhiều đối tượng khác nhau bao gồm cả chất mang
điện tích và chất trung tính. Phương pháp có một số đặc điểm cơ bản sau:
- Lượng mẫu phân tích nhỏ, tốc độ phân tích nhanh, thao tác đơn giản hơn nhiều so với
kỹ thuật phân tích HPLC.
- Dung dịch điện li nền cũng như mẫu phân tích thường được pha trong nước deion và sử
dụng rất ít, không sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại nên CE rất thân thiện với môi trường và
với người làm phân tích.
- Cột tách là ống mao quản nhỏ, rẻ, cho hiệu suất tách cao, dễ tái sinh hơn nhiều so với
phương pháp HPLC.
- Có thể can thiệp trực tiếp các loại cơ chế tách một cách đơn giản bằng cách thêm vào các
chất phụ gia cần thiết.
Tuy nhiên phương pháp cũng có một số nhược điểm sau:
- Do flowcell nằm ngay trên mao quản nên độ nhạy của phương pháp thấp hơn nhiều so
với phương pháp khác. Giới hạn của nó khoảng cỡ mg/l đối với detector UV-VIS, DAD. Trong
khi đó các phương pháp khác như: HPLC có giới hạn nhỏ hơn nhiều.
- Máy làm việc ở vùng điện áp rất cao nên phải cẩn trọng khi làm việc.
- Lượng mẫu sử dụng nhỏ là một ưu điểm của phương pháp, đồng thời cũng là nhược
điểm của nó. Khi lượng mẫu nhỏ và không tập trung dẫn đến sai số lớn khi phân tích hàm lượng
lớn do hệ số pha loãng cao. Đối với mẫu có hàm lượng nhỏ, khi tăng thời gian bơm mẫu thì gây
ra hiện tượng doãng pic, hiệu suất tách không cao.
- Thời gian lưu của của dung dịch phụ thuộc rất nhiều vào thành phần đệm, dung dịch
điện ly vì vậy đòi hỏi phải cẩn thận và tỉ mỉ.
3.4. Hƣớng phát triển của đề tài.

Trong bản luận văn này, do điều kiện còn hạn chế nên chúng tôi chỉ xây dựng được
phương pháp định lượng đồng thời một số hoạt chất kháng HIV trong mẫu chế phẩm thuốc.
Phương pháp còn có thể được mở rộng phân tích trong những dạng nền mẫu khác nhau ví dụ
như: mẫu máu, mẫu nước tiểu, Vì vậy rất cần có những nghiên cứu tiếp theo để phát triển
phương pháp áp dụng vào thực tiễn hơn. Việt Nam đang tiến hành nghiên cứu sản xuất các thuốc
HIV trong phối hợp điều trị. Hiện nay, nước ta đã sản xuất được thuốc chống HIV là Lamididrir
(Lamivudine 150mg + Zidovudine 300mg). Đây là một phương pháp đóng góp cho công tác
kiểm tra chất lượng thuốc đang lưu hành và sử dụng.




KẾT LUẬN
Qua cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm, với mục đích ứng dụng phương pháp
điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) để tách và định lượng một số hoạt chất
kháng HIV sử dụng phối hợp điều trị trong chế phẩm thuốc, chúng tôi thu được kết quả như sau:
1. Đã chọn được phương pháp phân tích một số hoạt chất kháng HIV với yêu cầu chuẩn bị mẫu
đơn giản, dung môi sử dụng là các muối vô cơ, chất hoạt động bề mặt đơn giản là SDS nên rất
đơn giản, ít tốn kém và ít độc hại. Chuẩn bị mẫu bằng hòa tan trực tiếp nên tiến hành nhanh
chóng và ít sai số.
2. Khảo sát và chọn được thông số tối ưu cho quá trình điện di
Detector: DAD
Số đo bước sóng chung: Lamivudin 270nm, Zidovudine 264,5 nm và Nevirapin 268,5nm
Kích thước mao quản : Mao quản silica trần, tổng chiều dài 64,5cm, chiều dài hiệu dụng 60 cm,
đường kính trong 75µm, loại bubble cell.
Chất tạo mixen : SDS.
Phương pháp bơm mẫu : Thủy động học 50mbar/5s.
Thế điện di: 20kV
Dung dịch điện ly nền : Na
2

B
4
O
7
10mM + SDS 50mM, pH = 9,30.
Nhiệt độ : 25
0
C
3. Đánh giá phương pháp phân tích
- Phương pháp đạt tính tương thích hệ thống với RSD <2% và R
s
>1,5.
- Phương pháp có tính đặc hiệu ( tính chọn lọc) cao.
- Khoảng tuyến tính của chất phân tích rộng : 3TC (77,25- 231,7 µg/ml) với r=0,996 ; NVP
(99,25- 297,7 µg/ml) với r= 0,998 ; AZT (149,0- 447,0 µg/ml) với r= 0,998 ; đã xử lý thống kê
để khẳng định không có sai số hệ thống.
- Xác định LOD, LOQ dựa vào đường chuẩn : 3TC có LOD= 10,02µg/ml và LOQ= 33,41µg/ml ;
AZT có LOD= 14,55 µg/ml và LOQ= 48,52 µg/ml ; NVP có LOD= 9,85 µg/ml và LOQ= 32,83
µg/ml.
- Phương pháp có độ lặp lại cao RSD < 2%.
- Phương pháp có độ đúng cao, độ thu hồi nằm trong khoảng 98%- 102%
4.Phân tích hàm lượng trong viên nén
-Với viên nén 3 thành phần dược chất, hàm lượng 3TC từ 98,87%- 102,87% ; NVP từ 100,4%-
102,5% ; AZT từ 95,47%- 99,43% so với hàm lượng trên nhãn, nằm trong giới hạn cho phép
95% → 105% (Theo Dược điển Việt Nam IV).
-Với viên nén 2 thành phần dược chất, hàm lượng 3TC từ 99,0%- 102,4% ; AZT từ 99,13%-
101,57% so với hàm lượng trên nhãn, nằm trong giới hạn cho phép 95%-105% ( Theo Dược điển
Việt Nam IV).

References
TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Thị Kiều Anh (2004), Một số đặc điểm và ứng dụng của điện di mao quản, Chuyên
đề chuyên sâu 3 của nghiên cứu sinh, Trường Đại học Dược Hà Nội.
2. Bộ Y Tế (2007), Hóa dược, tập 2, NXB Y học, Hà Nội.
3. Bộ Y Tế (2004), Dược thư quốc gia Việt Nam, xuất bản lần thứ ba, nhà xuất bản Y học.
4. Bộ Y Tế (2007), Dược thư quốc gia Việt Nam bản bổ sung, xuất bản lần thứ nhất, nhà xuất
bản Y học.
5. Bộ Y Tế (2009), Dược điển Việt Nam 4, nhà xuất bản Y học.
6. Bộ Y Tế (2007), Kiểm nghiệm thuốc, nhà xuất bản Y học.
7. Bộ Y Tế (2007), Hóa phân tích 1, nhà xuất bản Y học.
8. Bộ Y Tế (2007), Hóa phân tích 2, nhà xuất bản Y học.
9. Bộ Y Tế (2008) , Tạp chí Dược học, số 385 năm 48, tr 38-42.
10. Bộ Y Tế (2012), Báo cáo tổng kết công tác phòng, chống HIV- AIDS 6 tháng đầu năm và
định hướng kế hoạch 6 tháng cuối năm 2012, số 612/BC- BYT.
11. Bộ Y Tế (2011), Chiến lược quốc gia phòng chống HIV/AIDS đến năm 2020 và tầm nhìn
2030, Ủy ban quốc gia phòng chống HIV/AIDS và phòng chống tệ nạn ma túy, mại dâm
12. Nguyễn Hữu Chí (2006), Hiệu quả và dung nạp của Stavidine, Lamivudine, Nevirapin ở
bệnh nhân nhiễm HIV/ AIDS điều trị tại bệnh viện nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh, Bệnh
viện nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh.
13. Phạm Luận (2004), Cơ sở lý thuyết điện di mao quản hiệu năng cao, Sách chuyên đề cho
sinh viên chuyên ngành hóa phân tích, ĐH Quốc Gia Hà Nội.
14. Tạ Thị Thảo (2005), Bài giảng chuyên đề thống kê trong hóa phân tích, ĐH Quốc gia Hà
Nội.
15. Nguyễn Văn Ri (2011), Các kỹ thuật Phân tích Điện di , Sách chuyên đề cao học). Đại học
Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội.
16. Nguyễn Văn Ri (2007), Các phương pháp tách sắc ký, chuyên đề cao học trường ĐH KHTN
- ĐHQG Hà Nội.
TIẾNG ANH
17. A.K. Hemanth Kumar, V.Sudha, Soumya Swaminathan & Geetha Ramachandran (2010),

„‟Comparison of HPLC & spectrophotometric method for estimation of antiretroviral drug
content in pharmaceutical products‟‟, Indian J Med Res, 132, pp. 390- 394.
18. Arthur L.L. Silva (2012), Journal of pharmaceutical sciences, vol.101 (1), pp.12.
19. Hammer S. M. (2006), “Treatment for Adults HIV infection 2006 Recommendations of the
international AIDS Society - USA Panel”, The journal of American medical Association,
pp.827-843.
20. Heifer D. (2000), High performance capillary electrophoresis, Agilent Technologies, pp.61-
77.
21. Hiren.N.Mistri, ArvindG.Jangid, Ashutosh Pudage, Noel Gomes, Mallika, Sanyal, Pranav,
Shrivastav(2007), “High throughput LC-MS/MS method for simultaneous quantification of
Lamivudine, stavudine and Nevirapine in human plasma”, Journal of Chromatography B,
volum 853, p320-332.
22. Namita Kapoor, Sateesh Khandavilli, Ramesh Panchagnula(2006); Anylytica Chimica
Acta;Volum 570, Issue1, p. 41- 45.
23. Mikaela Malm(2008), Drug Analysis Bioanalytical Method Development and Validation;
p.23- 25.
24. Ramaiya Sekar, Srinivasan Azhaguvel (2008), “MEKC Determination of Antiretroviral
Reverse Transcriptase Inhibitors Lamivudine, Stavudine and Nevirapine in Pharmaceutical
Formulations‟‟, Chromatographia, (67), pp.389-398.
25. Shintani H.; Pholonsky J. (1997), Handbook of capillary electrophoresis application,
Blackie academic & professional, p.158.
26. SekarR, Azahaguvels (2005), “Simultaneous determination of HIV- protase inhibitors
lamivudin and zidovudin in pharmaceutical formulations by micellar electrokinetic
chromatography”, Journal of Pharmaceutical and biomedical analysis, India, p.653-660.
27. Sokalingam Anbazhagan (2005), “Simultaneous quantification of Stavudine, Lamivudine
and Nevirapine by UV spectroscopy, reverse phase HPLC and HPTLC in tablets”, Journal of
Pharmacy and Biomedical Analysis, Volum 39, Issues 3-4, Pages 801-804.
28. Weerasak Samee, Paron Srilamai, Sasithorn Ongart, Ritthichai Suwannaratana, Chayanid
Sornchaithawatwong, Suwanna Vorarat (2007), „‟Simultaneous Determination of
Lamivudine, Stavudine and Nevirapine in the Presence of Their Acid- Induced Degradation

Products by HPLC‟‟, Thai Pharmaceutical and Science Journal, ‘Vol. 2, No. 1‟ , pp. 39-45.
29. Interscience Dublication Johnwiley & sons,inc, Cappilary Electrophoresis method for A
wiley , Newyork/ Chichester/ Weinheim/ Brisbane/ Singapore/Toronto. Tr 792, 1297.
30. Laboratory for Analytical Chemistry University of Amsterdam (1996), CE Amsterdam
Summercourse.
31. Norbert to A Guzman, Capillary Electrophoresis Technology, Tập 1,2,3. The R.W Johnson
Pharmaceutical Reseach Institute Raritan, New Jersey.
32. UNAIDS ( 2002 ) Report on the global HIV/ AIDS Epidemic.
33. USP XXVI (2003), p.2716.