Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp proteasen ngoại bào của bacillus subtilis natto

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT Đ ộ , THỜI GIAN NUÔI CẤY
TỚI KHẢ NĂNG SINH TỐNG HỢP PROTEASE NGOẠI BÀO CỦA
BACILLUS SUBTILIS NATTO
Nguyễn Thùv Dương ^
HDKH: TS. Đàm Thanh Xuân, DS. Lê Ngọc Khánh^
‘Lớp M1.K64 -Trường Đại học Dược Hà Nội
^Bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội
Từ khóa: B. subtilis natto, nhiệt độ, protease, thời gian.
Tóm tắt
Trong quá trình sinh trưởng, Bacillus subtỉlis natto có khả năng tổng hợp
nhiều nhóm enzym ngoại bào: protease, cellulose, amylase, y-transpeptỉdase [1].
Nghiên cứu này nhằm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian nuôi cấy lên
khả năng sinh tổng hợp protease ngoại bào của B. subtilis natto. Từ đó bước đầu
lựa chọn điều kiện môi trường nuôi cấy cho sản xuất protease. Phương pháp
giếng thạch với cơ chất casein, CMC, tinh bột được dùng để khảo sát hoạt tính
enzym ngoại bào của B. subtilis natto. Kết quả: ở nhiệt độ 37°c và thời gian nuôi
cấy 24 giờ hoạt tính protease cao nhất trong dịch lên men, và dịch chiết enzym
bằng amoni Sulfat 60% bão hòa.
Đặt vấn đề
Protease - enzym phá vỡ liên kết peptid giữa các amino acid của protein là nhóm enzym được ứng dụng rộng rãi. Trong các nguyên liệu sản xuất protease,
các vi khuẩn thuộc chi Bacillus có nhiều ứng dụng nhất. Bacillus subtilis natto
thuộc chi Bacillus là vi khuẩn có khả năng sinh nhiều nhóm enzym\ protease,
cellulase, 'ftranspeptidase [ 1 ]; trong đó đặc biệt quan trọng là nhóm proíease có
khả năng phân giải fibrin, đang được ứng dụng để phòng ngừa các bệnh huyết
khối. Nghiên cứu: '’’Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian nuôi cấy tới khả năng
tổng hợp protease ngoại bào của B. subtilis natto” được tiến hành nhằm bước
đầu lựa chọn điều kiện môi trường nuôi cấy cho tách chiết protease tiêu fibrin.
Nguyên liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu và thiết bị
Vi sinh vật sử dụng: Bacillus subtilỉs natto - Nhật Bản
Nguyên liệu, hóa chất sử dụng- nguồn gốc: pepton, cao thịt-Ấn Độ; NaCl, casein,

CMC, KI, lod, HCl, Na-K tatrat, NaOH, (NH4)2 S0 4 , KH 2P 0 4 -Trimg Quốc; thạch
bột, tinh bột, xanh methylen - Việt Nam.
Môi trường: Công thức môi trường thạch thường: pepton (1,0 gam); thạch bột


(2,3 gam); cao thịt (0,5 gam); NaCl (0,5 gam); nước mảy vđ (100 ml); công thức
môi trường canh thang: pepton (1,0 gam); cao thịt (0,5 gam); NaCl (0,5 gam);
nước máy vđ ( 1 0 0 ml).
Máy móc và dụng cụ - nguồn gốc: Tủ cấy vô trùng (ưv Bioair) - Italia; tủ ấm, tủ
sấy (Memment) - Đức; nồi hấp tiệt trùng (ALP) - Nhật; lò vi sóng - Hàn Quốc;
máy li tâm (Rotofix) - Đức; cân phân tích (Satorius) - Đức; cân kỹ thuật
(Satorius) - Đức; máy đo pH (Presica) - Đức; máy đo vòng phân giải (Halopes
caliper) - Tây Ban Nha; các dụng cụ được sử dụng: bình nón, bình định mức, cốc
có mỏ, đĩa petri nhựa (đường kính 8,8 cm), ống nghiệm, pipetman, pipet tip...
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto
Giữ giống trên thạch nghiêng: cấy giữ giống trên môi trường thạch thường, ủ ở
tủ ấm 37°C/24 giờ, bảo quản ở 4-5°C, cấy truyền 1-2 tháng/lần.
Nhân giống trong bình nón: nhân giống trong bình nón 250 ml chứa 100 ml môi
trường canh thang đã hấp tiệt khuẩn ở latm/20 phút, ủ trên máy lắc ở 37°c trong
24 giờ với tốc độ lắc 100 vòng/phút.
PhưoTĩg pháp lên men: lên men trong bình nón 250 ml chứa 100 ml môi trường
canh thang đã hấp tiệt khuẩn ở latm/2 0 phút, tỷ lệ cấy truyền là 1 0 %, ủ trên máy
lắc ở nhiệt độ, trong thời gian nuôi cấy nghiên cứu với tốc độ lắc 1 0 0 vòng/phút.
Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính các nhóm enzym theo nguyên tắc khuếch tán
trên thạch
Thử sơ bộ hoạt tính enzym protease\ amylase', cellulase theo phưong pháp
giếng thạch trên môi trưòng thạch 2 % và cơ chất tưoTig ứng là: casein 1 % và 10
giọt xanh methylen; tinh bột 1%; CMC 1%. Đục các giếng thạch đường kính 0,6
cm. Nhỏ 0,05 ml dịch thử vào giếng thạch, ủ trong tủ ấm 37°c trong 24 giờ; nhỏ

dung dịch Lugol để quan sát vòng phân giải tinh bột, CMC. [3]
Phương pháp chiết xuất protease bằng amoni S u l f a t 60% bão hòa
Giữ dịch lên men ở 4“c /l giờ. Thêm dần amoni Sulfat vào lOOml dịch lên
men đến khi đạt nồng độ amoni Sulfat 60% bão hòa. Sau khi muối tan hết, để
yên 1 giờ. Li tâm với tốc độ 15.000 vòng/ phút ở 4°c trong 20 phút thu tủa
enzym. Hòa tan tủa enzym vào 10 ml dd đệm pH 7.6 thu được dịch chiết enzym.
[1 , 2 ]
Phương pháp khảo sát ảnh htrởng của nhiệt độ môi trường nuôi cầy lên
khả năng sinh protease của B. subtilis natto
Lên men 2 mẫu trong bình nón 250 ml, ủ trong máy lắc ở 2 điều kiện 30°c
và 37°c trong 24 giờ với tốc độ lắc 100 vòng/phút. Thử và so sánh hoạt tính


enzym của dịch lên men và dịch chiết enzym giữa các mẫu theo nguyên tắc
khuếch tán trên thạch đã nêu ở trên.
Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh
protease của B. subtiUs natto
Lên men 3 mẫu trong bình nón 250 ml, ủ trong máy lắc ở 37°c với tốc độ
lắc 100 vòng/phút. Lấy ra một mẫu tại mỗi thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ. Sau
đó thử và so sánh hoạt tính enzym của dịch lên men và dịch chiết enzym giữa các
mẫu theo nguyên tắc khuếch tán ứên thạch đã nêu ở trên.
Kết quả
Bảng 1. Đưòng kính vòng phân giải cơ chất (dcochất: mm) của dịch lên men B.
subtilis natto khi nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau
\d

^casein (ram)

dtinh bội (ram)

dcMC (mm)

f c \

L 1

L2

L3

TB

LI

L2

L3

TB

L 1

L2

L3

TB

30”c

17,23

17,97

18,00

17,73

13,20

13,50

13,30

13,33

13,05

13,55

13,27

13,29

17,80

17,60

17,56

17,65

(-)

(-)

(-)

(-)

9,21

8,94

9,31

9,15

37”C

Bảng 2. Đường kính vòng phân giải cơ chât (dcơchất: ĩiim) của dịch chiêt enzym
thu được từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto ở các nhiệt độ khác nhau
\

d

^casein

dcMC

dĩinh bột

L2

L3

TB

LI

L2

L3

TB

L 1

L2

L3

TB

30”C 23,49

23,76

23,46

23,57

19,00

18,76

18,85

18,87

20,26

20,82

20,76

20,61

23,10

23,12

23,22

23,14

10,26

10,14

10,00

10,13

16,74

16,38

16,53

16,55

t“C \

ĩT C

L 1

37°c

30“C

37“C

37“C

1

30"C
1

..

®
Cơ chất tinh bột

-a

cơ chất CMC

•

cơ chất casein
— ........... /

'"

Hình 3. Vòng phân giải của dịch lên men trên các cơ chât

---- ----- ------'


Hình 4. Vòng phân giải của dịch chiêt enzym trên các cơ chât
** Protease
® Amylase
Cellulase

DLM37

DC30

DLM30

Hình 5. Ảnh hưởng của nhiệt độ môi ữưòmg nuôi cấy tới khả năng sinh enzym
ngoại bào của B. subtilis natto
(Ghi chú: DLM 37, DLM 30, DC37, DC 30: lần lượt là dịch lên men ở 37°c,
30°c, dịch chiết enzym bằng amoni Sulfat 60% bão hòa ở 37°c, 30°C)
Khăo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tói khả năng sinh tổng họp
protease của B. subtilis natto
Bảng 6 . Đường kính vòng phân giải cơ chất (dca chất'- ĩĩmi) của dịch lên men theo
thời gian nuôi cấy B. subtilis natto
dcasein

V

dcMC

dxinh bột

t/x
24h

LI

L2

L3

TB

LI

L2 L3

TB

LI

L2

L3

TB

17,80

17,60

17,56

17,65

(-)

(-)

(-)

(-)

9,21

8,94

9,31

9,15

48h

17,40

17,3

16,9

17,20

(-)

(-)

(-)

(-)

10,72

1 0 ,8 8

10,77

10,79

72h

16,40

16,60

16,60

16,53

(-)

(-)

(-)

(-)

9,50

9,32

9,23

9,35

“■»^•ptotease

Tf ÍT
ã ầ 20

“■»“ Cellulâse

IS
10

ì

■

■

24h

amylase

48h

72h

th ờ i g ia « (h)

Hình 7. Biểu đồ thể hiện ảnh hưỏfng của thời gian nuôi cấy lên kliả năng tổng họp
enzym ngoại bào qua đường kính vòng phân giải cơ chất
(dcachất^

của dịch chiết enzyme
Bàn luận
- Các kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ môi trưòmg nuôi cấy lên khả
năng sinh tổng họp protease của B. subtilis natto cho thấy khi thay đổi nhiệt độ nuôi
cấy B. subtỉlỉs natto (30°c và 37°C), hoạt độ protease ở cả trong dịch lên men và
dịch chiết emym không thay đổi, trong khi ở 30“c hoạt độ amylase và cellulase lớn
hơn nhiều so với ở 37"c (Bảng 1, Bảng 3). Vì vậy chọn nhiệt độ nuôi cấy là 37°c để
tạo điều kiện thuận lợi cho việc chiết tách thu protease. Đã nhiều công trình được
công bố về ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ protease: Đỗ Thị Bích Thủy (2012)
trên chủng Bacillus amylolyquefacien NI là 35°C; nghiên cứu của c. Wang (2009)
và P. Chantawannakul (2002) đã chọn nhiệt độ 37°c để nuôi cấy B. subtilis natto [3,
5, 6 ]. Do đó, chọn nhiệt độ nuôi cấy là 37°c để tiếp tục khảo sát ảnh hưỏTig của thời
gian nuôi cấy lên sự sinh tổng hợp enzym ngoại bào của B. siibtilis natto.
- Từ kết quả kỉiảo sát hoạt độ enzym ngoại bào ở 3 thời đ i ể m 24 g iờ , 48 g iờ ,
72 giờ thấy; hoạt tính protease, amylase có xu hướng giảm dần (hoạt tính protease
trong dịch chiết enzym qua đường kính vòng phân giải cơ chất tưong ứng theo thời
gian 24 giờ; 48 giờ; 72 giờ là 23.14 mm; 20.19 mm; 19.65 mm). Hoạt tính của
celluỉase tăng nhẹ sau 48 giờ nuôi cấy. Sự giảm hoạt độ protease trong môi trường
nuôi cấy có thể giải thích bởi nhiều lý do; thành phần môi trưòrng thay đổi, lượng
dinh dưỡng giảm ... làm cho tế bào vi Iđiuẩn suy thoái, enzym bất hoạt. Hơn nữa, có
thể protease còn xảy ra hiện tượng autolysis (hiện tượng enzym tự thủy phân) hoặc
do vi khuẩn tổng hợp nên các chất kìm hãm trong môi trưòĩig làm hoạt độ protease
giảm. Vì vậy lựa chọn 24 giờ là thời gian nuôi cấy B. subtilis natto để thu hoạt độ
protease lớn nhất, đồng thời tiết kiệm được thời gian nuôi cấy. Đã có nhiều nghiên
cứii về ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới hoạt tính protease: Đỗ Thị Bích Thủy
(2012) trên chủng Bacillus amvlolyquefacien NI là 32 giờ; I. Ahmed (2011) cũng đã
lựa chọn thòd gian nuôi cấy B. subtilỉs là 24 giờ để cho hoạt tính protease cao nhất.
[3, 4]

Kết iuận
ở điều kiện nhiệt độ nuôi cấy 37°c, B. subtilis natto sinh tổng hợp protease
có hoạt tính cao, ở nhiệt độ này cũng hạn chế được sự sinh tổng hợp a m y la se và

cellulase của B. subtilis natto. v ề thời gian nuôi cấy B. subtilis natto, lựa chọn thời
gian nuôi cấy là 24 giờ, do vừa thu được hoạt tính protease cao nhẩt, đồng thời tiết
kiệm thời gian nuôi cấy.

Như vậy bước đầu lựa chọn được nhiệt độ môi trường và thời gian nuôi cấy
B. subtỉlỉs natto là 37°c trong 24 giờ để tạo điều kiện cho tách chiết protease enzym có khả năng tiêu fibrin - ứng dụng trong phòng ngừa huyết khối.
Tài liệu tham khảo
1. Đinh Thu Hương (2013), Nghiên cíai điều kiện nuôi cấy và chiết enzym protease
từ vi khuẩn Bacillus subtilis natto, Luận văn thạc s ĩ dược học, Trường đại học Dược
Hà Nội, Hà Nội, tr. 3, 45 - 48.
2. Lê Thanh Mai (2009), Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men,
NXB Khoa học và kỹ thuật, tr. 186 - 190.
3. Đỗ Thị Bích Thủy (2012), “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới sir thu nhận chế
phẩm protease ngoại bào của Bacillus amylolyquefacien N l, Tạp chí khoa học, Đại
học Huế, 71(2), tr. 286 - 288.
4. I. Ahmed, Muhammad Anjum Zia (2011), “Purification and kinetic parameters
characterization of an alkaline protease produced from Bacillus subtilis through
submerged fermentation technique”. World Applied Sciences Journal, 12 (6 ), p. 751
- 757.

5. P. Chantawannakul, Anchalee Oncharoena (2002), “Characterization of proteases
of Bacillus subtilis strain 38 isolated from traditionally fermented soybean in
Northern Thailand”, Science Asia, 28, p. 241 - 245.
6 . c. Wang, Ming Du (2009), “Purification and characterization of nattokinase
from Bacillus subtilis natto B - 12”, Journal o f Agricultural and food chemistry
article, 57, p. 9722 - 9729.