Nghiên cứu sự thay đổi hàm lượng oxostephanin trong một số mẫu củ và lá loài stephania dielsiana y c WU trồng tại ba vì, hà nội bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

NGHIÊN CỨU S ự THAY ĐỎI HÀM LƯỢNG OXOSTEPHANIN TRONG
MỘT SỐ MẪU CỦ VÀ LÁ LOÀI STEPHANIA DIELSIANA Y. c . w u
TRỒNG TẠI BA v ì, HÀ NỘI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẤC KÝ LỚP
MỎNG HIỆU NĂNG CAO
Nguvễn Thi Thùv Linh*
HDKH: TS. Nguyễn Quốc Huy^
DS. Nguyễn Vũ Minh^
‘Lớp A2K64 - Trường Đại học Dược Hà Nội
^Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội
^HV cao học 17, Trung tâm kiểm nghiệm nghiên cứu dược quãn đội
Từ khóa: Ba Vĩ, HPTLC, oxostephanin, Stephania dielsiana Y. c. wư.
Tóm tẳt
Nghiên cứu đã xãy dựng được quy trình định lượng oxostephanin trong
loài Stephania dielsiana Y. c. wu (S. dielsỉana) bằng phương pháp HPTLC. Các
mẫu nghiên cứu được chiết bằng phương pháp ngẩm kiệt trong dung môi
MeOH. acid acetic 5% (6:4)., Hệ dung môi khai triển CHCls-MeOH (9:1) cho kết
quả tách tốt. Thẩm định quy trình định lượng: tính đặc hiệu, độ tuyến tỉnh, độ
thích hợp của hệ thống. Dựa vào quy trình định lượng để đảnh giá sự thay đổi
hàm lượng oxostephanin và kết quả cho thấy hàm lượng oxostephanin trong các
mẫu lá cao hơn so với mẫu củ.
Đặt vấn đề
Stephania dielsiana Y. c. Wu là một loài (trong Sách Đỏ Việt Nam) thuộc
chi Bình vôi (Stephania Lour.), hiện đang được nghiên cứu trồng tại Ba Vì (Hà
Nội). Oxostephanin là alcaloid chính của loài, có khả năng gây độc trên 3 dòng tế
bào ung thư gan (Hep-2), phổi (LU) và màng tim (RD) [4], Người dân địa
phương tại Ba Vì thường dùng cả củ và lá để điều trị phong thấp đau nhức, đau
dạ dày...[4] nên rất cần nghiên cứu đánh giá hàm lưọTig của alcaloid này ở các
bộ phận khác nhau của cây. Đây là hoạt động rất quan trọng trong quá trình tiêu
chuẩn hóa dược liệu và rộng hơn là quy trình “Trồng trọt và thu hái cây thuốc tốt
(GACP)” mà Bộ Y x ế đang triển khai thực hiện.
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là phương pháp phân tích định

tính định lượng hiện đại. Kỹ thuật này có nhiều ưu điểm về độ nhạy, tính chính
xác, độ tin cậy, dễ thực hiện, chi phí thấp, nhanh. Tuy nhiên ứng dụng kỹ thuật
HPTLC trong định tính, định lưọBg oxostephanin chưa tìmg được tiến hành trước
đây. Trong khuôn khổ của nghiên cứu này, chúng tôi đưa ra quy trình định lượng


oxostephanin bằng HPTLC, thẩm định quy trình và áp dụng để địiứi lưọ-ng đánh
giá hàm lượng hợp chất này ừong một số mẫu củ và mẫu lá.
Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu
Nguyên liệu là các mẫu củ và mẫu lá của cây trồng loài s. dielsỉana thu hái
tại Ba Vì (Hà Nội), đã được TS. Nguyễn Quốc Huy giám định tên khoa học [4],
sấy Iđiô tại 60°c và xay thành bột thô.
Thiết bị và hóa chất
Thiết bị phân tích: Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Camag,
máy đo hàm ẩm Precisa, cân phân tích, tủ sấy, thiết bị chiết ngấm kiệt, bình ừiển
khai sắc ký, bản mỏng Silicagel Gp 254 (MERCK) và bản mỏng dành cho HPTLC.
Dung môi hóa chất: MeOH, acid acetic, nước cất, ammoniac đậm đặc đạt
tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam IV.
Chất chuẩn: Oxostephanin tmh thể (do TS. Nguyễn Quốc Huy cung cấp).
Phương pháp nghiên cứu
Xây dựng quy trĩnh định lượng
- Lựa chọn các điều kiện chiết mẫu [1, 2, 4, 5].
- Lựa chọn điều kiện HPTLC [1,7, 8].
- Thẩm định phương pháp: tính đặc hiệu, độ tuyến tính, độ thích hợp của hệ
thống [1,3, 6, 7].
Kết quả
Xây dựng quy trình định lượng
Lựa chọn các điều kiện chiết mẫu và xử lý dịch chiết
Dung môi chiết mẫu: Dung môi MeOH đă được chọn.

Các mẫu được chiết xuất bằng dung môi MeOH tại các pH Idiác nhau.
Điều chỉnh pH của dung môi chiết xuất bằng acid acetic 5% và ammoniac đậm
đặc. Cô cách thủy dịch chiết đến cắn, cắn được sấy đến khối lưọTig (KL) không
đổi, sau đó đem cân.
Bảng 1. Khối lượng cắn các mẫu dịch chiết ở pH khác nhau
TT

pH

Khôi lưọng dưọc liệu (g)

Khối lưọng cắn (g)

1

4-5

10.43

0.72

2

5-6

10.02

0.43

3

7

10.07

0.41

4

8-9

10.13

0.4

5

9-10

10.02

0,55

Nhận xét: Khối lưọng cắn trong cốc thứ 1 (pH=4-5) là lớn nhất. Vì vậy hệ
dung môi được lựa chọn là MeOH : Acid acetic 5% (6:4).


Phương pháp chiết xuất và xử lý dịch chiết: Lựa chọn phương pháp chiết
xuất ngấm kiệt vì đây là phương pháp chiết xuất đan giản, hiệu suất chiết tương
đối tốt.

Lựa chọn điều kiện HPTLC và chuẩn bị dung dịch chuẩn
Bản mỏng: Bản mỏng hiệu năng cao được tráng sẵn Silicagen GF254, hoạt
hóa ở 110°c trong 30 phút (loại thường và loại dùng cho HPTLC). Kích thước
bản mỏng 20 cm X 10 cm.
Hệ dung môi khai triển; Tiến hành triển khai bản mỏng trên một sổ hệ dung
môi: Chloroform : MeOH (5:5; 6:4; 7:3; 8:2; 9:1). Kết quả quan sát cho thấy hệ
Chloroform : MeOH (9;1) cho kết quả tốt nhất. Các vết tách được, gọn đều,
không có vết phụ, vết oxostephanin phát huỳnh quang rõ nét dưới ánh sáng tử
ngoại 366 nm.
Đưa mẫu lên bản mỏng; Sử dụng máy TLC tự động hóa Camag Linomat 5
với lượng khí nitơ cung cấp tốc độ phun cho ổng tiêm là 150 riL/s. Thể tích các
vết 2.0 |il, cách mép dưới và mép bên bản mỏng 8 miTi và 15 mm. Các thông số
này được giữ hằng định trong quá ừình phân tích các mẫu.
Điều kiện chạy HPTLC
- Điều kiện chạy HPTLC; nhiệt độ 28°c và độ ẩm tương đối 55%.
- Thể tích dung môi bão hòa: 25 ml; dung môi khai triển: 10 ml.
- Thời gian bão hòa dung môi: 20 phút.
- Thời gian bão hòa bản mỏng: 5 phút.
- Thời gian sấy khô bản mỏng: 5 phút.
- Khoảng cách dịch chuyển của pha động: 80 tnm.
Bản mỏng sau khai triển được sấy khô và soi u v ở bước sóng 366 nm. Phân tích
định lượng oxostephanin được thực hiện nhờ phần mềm VideoScan.
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Pha các dãy dung dịch chuẩn có các giới hạn
nồng độ khác nhau để khảo sát khoảng nồng độ oxostephanin trong các mẫu thử:
Dãy 1: gồm các nồng độ 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05 (mg/ml).
Dãy 2; gồm các nồng độ 0,02; 0,05; 0,08; 0,1; 0,12; 0,15 (mg/ml).
Kết quả khảo sát cho thấy các nồng độ của dãy 2 phù hợp hơn để xây dựng
đường chuẩn.
Khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp
Chuẩn bị mẫu:

Mầu trắng: dung môi MeOH pha mẫu.
Mầu thử: dịch chiết lá có nồng độ khoảng 0,0265 mg/ml.
Mầu chuẩn: chất chuẩn oxostephanin pha trong MeOH có nồng độ 0,02 mg/ml.
Tiến hành: Triển khai sắc ký lần lượt các dung môi pha mẫu, dưng dịch mẫu thử


và dung dịch mẫu chuẩn đối chiếu.
Kết quả: Sắc ký đồ mẫu thử cho các vết chính có cùng hình dạng và giá trị Rf so
với các vết chính có trong sắc ký đồ mẫu chuẩn.
Sắc ký đồ của mẫu trắng Iđiông xuất hiện các vết tương ứng với các vết chính
trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn.

A

-X;:

Hình 1. Kết quả chồng peak của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu ữắng
Trị số Rf của mẫu thử và mẫu chuẩn lần lượt là 0,429 và 0,427, độ lệch chuẩn là
0,4662%, nằm trong giới hạn chấp nhận được.
Khảo sát độ tuyến tính
Chuẩn bị dãy mẫu chuẩn với nồng độ: 0,02; 0,05; 0,08; 0,1; 0,12; 0,15 (mg/ml).
Phương trình đường chuẩn theo diện tích peak làY = 14511X + 41809 với hệ số
tương quan r = 0,9877 (tương ứng với giá trị = 0,97), nồng độ X tính theo đơn
vị mg/ml.
Kết quả khảo sát cho thấy khoảng nồng độ khảo sát có sự tưong quan tuyến tính
giữa nồng độ oxostephanin và diện tích peak.
300000

Seriesl
----- Linear (Series 1)

----- Linear (Seriesl)

10

15

20

ETinh 2. Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích peak


Khảo sát độ thích hợp của hệ thống
Chuẩn bị mẫu chuẩn oxostephanin có nồng độ 0.03 mg/ml. Tiêm 6 lần dung dịch
chuẩn, tiến hành sắc ký, ghi nhận sắc ký đồ, giá trị Rf ,diện tích peak.
Bảng 2. Kết quả đo độ lặp lại của các lần tiêm mẫu
L ầnl
Lần 2
Lần 3
Lần 4
Lần 6
Lần 5
Giá trị Rf
0.429
0.426
0.426
0.424
0.425
0.424
51308.4 51261.4 51523.4 51137.0 52723.6 53285.6
Diện tích

RSD của giá ừị Rf là 0.44%, RSD của diện tích peak là 1.74%. Giá trị RSD tính
theo diện tích peak hay Rf đều nằm trong giới hạn chấp nhận được.
Kết quả định lượng
Oxostephanin trong dược liệu được định lượng bằng kỹ thuật HPTLC theo
phương pháp xây dựng đường chuẩn. Đường chuẩn được xây dựng dựa trên
cường độ màu của các vết sắc ký oxostephanin mẫu chuẩn ở bước sóng 366 nm.
Từ đó xác định hàm lượng oxostephanin (O) trong dịch chiết dược liệu:

0 (%) =

1250 x c

m x(iOO—a)

X 100 (%)

mm ^

mề

mm 1KB


(B
PôLVrK!l,1l-4. R ESRES3‘£(f 4 Cs.!Bfaíicití ríssir.aa
T1IS ^ a lfb ra lio ft is ũ s s e ii o fl õ s tìis á a ỉd s

CeSfcraiiM « 3UỄÊ0 ftrV = h s ig h ta tó a A « a rn o t'it đ a te de a ire j.r,

Y = 1.Í1Ì-ÍKỈ4. » 2 .4 5 ỉ-ẵ 3 4 ‘ .. -583 * * ‘ 2

&ứv=ỉ.'í1

Hình 4. Đường chuẩn ửieo diện tích peak
Dựa vào đường chuẩn, phần mềm VideoScan cho kết quả nồng độ (% g/ml) của
các dung dịch thử. Từ các thông số về khối lượng, hàm ẩm của các mẫu thử, và
nồng độ dung dịch thử, kết quả định lượng thu được ở bảng 3.
Bảng 3. Hàm lượng oxostephanin trong củ và lá tính theo diện tích peak
Mâu

Khối lưọ-ng

Hàm ẩm

(g)

(%)

Hàm lưọTig
tính theo diện
tích peak (%)

5.0178

8.44

0.1823

Cù cây 1 năm tuôi

5.0247

8.78

0.1282

Củ cây 2 nàm tuôi

5.0313

9.18

0.2052

Lá non cây 1 tuổi trồng từ hạt

5.0845

6.93

0.3422

Lả bánh tẻ cãy 1 tuổi trồng từ hạt
Lá già cây 1 tuổi trồng từ hạt

5.0579
5.0817

5.94
6.17

0.2909
0.2671

Lá non cãy 1 tuổi trổng từ hom

5.0164

5.81

0.3936

Lả bánh tẻ cây 1 tuổi trồng từ hom

5.0381

6.68

0.2977

Lả già cây 1 tuổi trồng từ hom

5.1168

5.58

0.3230

Lá bảnh tẻ cãy 6 tháng tuổi tr. từ hom

5.0314

6.17

0.2357

Lá bánh tẻ cây 2 năm tuôi tr. từ hom

5.0313

7.01
/\

Củ cây trưởng thành (>3 năm)

0.3286
1r

củ, có thể cao hơn tới 3 lần. Trong các mẫu lá, lá non có hàm lượng oxostephanin
cao hơn lá bánh tẻ và lá già (khoảng 0,05 - 0,09%). Hàm lượng oxostephanin
trong các mẫu lá của cây trồng từ hom cao hơn trong cây trồng từ hạt.
Bàn luận
Đây là lần đầu tiên đưa ra quy ừình định lượng oxostephanin (là 1 chất
mới) bằng HPTLC, còn nhiều yếu tố cần nghiên cứu hoàn thiện hooi như lựa


chọn dung môi, phương pháp chiết xuất,... và các tiêu chuẩn thẩm định kỹ thuật
HPTLC. HPTLC là kỹ thuật bán tự động, việc xây dựng đường chuẩn định lượng
dựa trên cường độ màu các vết sắc ký tại bước sóng tử ngoại 366nm nên sai số
của phưong pháp khá cao, chỉ thích họp trong ứng dụng bán định lượng, làm

nhanh. Khi cần chính xác cần xây dựng quy trình định lượng bằng HPLC.
Kết quả thực nghiệm cho thấy hàm lượng oxostephanin trong các mẫu lá
cao hơn hẳn các mẫu củ. Bên cạnh đó, thòd gian cần thiết để thu hái lá thấp hcm
nhiều so với thời gian cần để thu hái củ, việc thu hái lá không làm ảnh hưởng tới
cây như khi thu hái củ.
Kết quả hàm lượng oxostephanin trong các mẫu trồng từ hom cao hon các
mẫu trồng từ hạt, trong khi việc nhân giống vô tính có nhiều ưu điểm hon như
sinh khối thân lớn, có thể thu hoạch thân quanh năm. Qua nghiên cứu này có thể
thấy hướng phát triển loài cây thuốc này bằng phương pháp vô tính là rất khả thi.
Kết quả phân tách vết ừên bản mỏng có thể cung cấp các thông tin để xây
dựng tiêu chuẩn dược liệu và góp phần sơ bộ xác định nhanh các loài dựa vào
hình ảnh của HPTLC dịch chiết toàn phần (dịch chiết chuẩn) và các chất chuẩn
(oxostephanin).
Kết luận
Đã xây dựng quy trình định lượng oxostephanin bằng HPTLC:
+ Hệ dung môi chiết xuất nguyên liệu bằng hệ dung môi MeOH : Acid acetic 5%
(6:4), lượng dung môi sử dụng là 300 ml cho mỗi mẫu thử.
+ Hệ dung môi triển khai bản mỏng là C H C I3 : MeOH (9:1).
+ Đã lựa chọn điều láện của HPTLC và chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn, khoảng
nồng độ tuyến tính của mẫu chuẩn là từ 0,02 đến 0,15 mg/ml.
+ Đã khảo sát tính đặc hiệu và độ thích họp của phương pháp đạt yêu cầu.
Đã định lượng được hàm lượng oxostephanin trong các mẫu củ và lá thử
nghiệm cho thấy nồng độ oxostephanin trong các mẫu lá cao hơn nồng độ
oxostephanin trong các mẫu củ.
Tài liệu tham khảo
1. Nguyễn Vân Chi (2010), Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học và thăm dò
khả năng tái sinh, phát triển của loài Stephania dielsiana Y.C.Wu, Khóa luận
tổt nghiệp thạc s ĩ khỏa 2009 - 2010, TrưÒTig Đại học Dược Hà Nội.
2. Mai Thị Hằng (2008), Xây dựng phương pháp định lưọng nhanh Rotundin
trong bán thành phẩm viên Sen vông - R, Khóa luận tốt nghiệp dược s ĩ khóa

2003 - 2008, Trường Đại học Dược Hà Nội.


3. Nguyễn Thị Thu Hằng (2012), Nghiên cứu tính đa dạng di truyền và định
lượng Berberin của một số loài thuộc chi Berberin L. ở Việt Nam, Khóa luận
tốt nghiệp dược s ĩ khỏa 2007 - 2012, Trường Đại học Dược Hà Nội.
4. Đặng Văn Hòa, Vĩnh Định (2011), Kiểm nghiệm thuốc, NXB Giáo dục Việt
5.

6.
7.
8.
9.

Nam.
Nguyễn Quốc Huy (2010), Nghiên cứu về thực vật, thành phần hóa học, một
sổ tác dụng sinh học của một số loài thuộc chi Stephania Lour, ở Việt Nam,
Luận án Tiến s ĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội.
Phạm Thanh Kỳ (2007), Dược liệu học, tập 2, NXB Y học.
Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2012), Khỏa đào tạo thẩm định quy
trình phân tích SKLMvà HPLC trong thuốc đông dược.
Man Mohan Srivastava (2011), High - Performance Thin - Layer
Chromatography, Springer.
Harish C.Andola, R.S.Rawal, M.S.M.Rawal (2010), Analysis of Berberin
Content using HPTLC fingerprinting of Root and Bark of three Himalayan
Berberin Species, Asian Journal o f Biotechnology, pp. 240-243.