Nghiên cứu thành phần hóa học và độc tính của dược liệu hoàng kinh (vitex negundo linn )

NGHIÊN CỬU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ Đ ộ c TÍNH CỦA DƯỢC LIỆU
HOÀNG KINH iVìtex negundo Linn.)
Nguyễn Tiến Tiẽp'
HDKH: TS. Đỗ Quyên^ ThS. Phạm Tuấn Anh^
ThS. Lê Thanh Bình^ ThS. Nguyễn Thị Thanh Tú^
’lớ p A3K64 - Trường Đại học Dược Hà Nội
^Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội
^Khoa YHCT- Đại học Y H à Nội

Từ khóa: Vitex negundo Linn., Hoàng kinh, độc tính.
Tóm tắt
Định tính các nhóm chất hữu cơ trong 3 phân đoạn dịch chiết n-hexan, methanol
và nước bằng phản ứng hóa học đặc trưng đã xác định được trong lá cây Hoàng kinh
có chứa tinh dầu, sterol, Aavonoid, alcaloid, iridoid, đường khử, acid hữu cơ,
triterpenoid và gôm (chất nhầy). Đã phân tích thành phần tinh dầu lá Hoàng Kinh
bằng GC-MS. Tinh dầu lá tại thời điểm mùa đông và mùa hè khác nhau cả về hàm
lượng và thành phần cấu tử. Cao Hoàng kinh không có độc tính cấp trên chuột ở liều
cao nhất chuột có thể dung nạp được (620g/kg) và chưa phát hiện thấy độc tính bán
trường diễn trên thỏ ở liều 3,2g/kg và 9,6g/kg.
Đặt vấn đề
Cây Hoàng kinh có tên khoa học là Vitex negundo L., còn gọi là cây Mầu kinh,
Ngũ trảo, Chân chim ... thuộc họ c ỏ roi ngựa (Verbenaceae). Đây là cây gỗ nhỏ hay
bụi thơm, được trồng và mọc hoang ở nhiều tỉnh thành nước ta [4], Những nghiên
cứu ở nước ngoài cho thấy lá Hoàng kinh có nhiều tác dụng dược lý như kháng
khuẩn, chống nấm, chống oxy hóa, chổng dị ứng, hạ sốt ..[6 ], trong đó nổi bật là tác
dụng chống viêm, giảm đau [7]. ở vùng Nam trung bộ nước ta, người dân thường
dùng lá tươi giã nhỏ đắp vào chỗ sưng đau hoặc sắc nước uống để chữa các bệnh lý
về khớp cho kết quả rất tốt. Tuy nhiên đến nay chưa có đề tài nào trong nước nghiên
cứu về hóa học cũng như tính an toàn và hoạt tính sinh học của dược liệu này. Do
vậy chúng tôi thực hiện báo cáo này với hai mục tiêu: (1) Nghiên cứu thành phần
hóa học; (2) đánh giá tính an toàn của lá cây Hoàng kinh Vitex negundo L.

Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Nguyên liệu
Nguyên liệu nghiên cứu: Lá cây Hoàng kinh thu hái tại Hà Nội vào tháng 6 và
11 năm 2013. Mau tiêu bản được lưu tại phòng tiêu bản Bộ môn Thực Vật, trường


Đại học Dược Hà Nội (Mã số HNIP/18050 A/13). Mầu dược liệu sau khi được rửa
sạch, đem cắt nhỏ, một phần dùng tươi để cất tinh dầu; một phần sấy khô trong tủ
sấy (50°C) rồi nghiền thành bột, bảo quản trong túi nilon kín, dùng để định tính các
nhóm chất.
- Cao lá Hoàng Kinh (CHK) để đánh giá tính an toàn được chuẩn bị như sau:
1000 gam dược liệu (hàm ẩm 10%) được chiết hồi lưu với dung môi EtOH 70° trong
5h, quá trình chiết được lặp lại 3 lần. Gộp dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp
suất giảm thu được cao lá Hoàng Kinh tỷ lệ 10:1.
- Động vật thỉ nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss, thỏ đều đạt tiêu chuẩn
được cung cấp bởi Viện Vệ sinh dịch tễ.
Phương pháp nghiên cứu
- Định tính một số nhóm chất hữu cơ: Chiết xuất lá Hoàng Kinh thành 3 phân
đoạn dịch chiết có độ phân cực tăng dần theo phương pháp của trưÒTig Đại học
Dược Rumani: bột lá (50g) lần lượt được chiết hồi lưu với các dung môi n- hexan,
methanol, nước. Mỗi dung môi tiến hành 3 lần, mỗi lần 30 phút. Bã dược liệu sau
khi chiết được làm khô dung môi trước, rồi chiết bằng dung môi tiếp theo. Gộp, lọc
và cất thu hồi dung dưới áp suất giảm riêng dịch chiết từng phân đoạn đến khi còn
lại khoảng lOOml dịch chiết mỗi loại. Xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch
chiết bằng các phản ứng hóa học đặc trưng [ 1 ], [2 ],
+ Phân đoạn dịch chiết n-hexan: xác định chấtbéo, tinh dầu, carotenoid, sterol,
alcaloid, coumarin, anthraquinon và flavonoid
+ Phân đoạn dịch chiết MeOH: xác định alcaloid, coumarin, glycosid tim,
anthranoid, flavonoid, iridoid, triterpenoid, tanin, saponin, đưÒTig khử, acid hữu cơ
+ Phân đoạn dịch chiết nước: xác định alcaloid, anthraglycosid, ílavonoid,

glycosid tim, tanin, saponosid, iridoid, đường khử, acid hữu cơ, gôm (chất nhầy).
- Nghiên cứu tinh dầu trong lá bằng phương pháp cất kéo hơi nước, sử dụng bộ
dụng cụ cất cải tiến. Thực hiện 3 lần, mỗi lần 180g lá tươi (độ ẩm 63%). Thời gian
cất: 2,5 giờ/lần. Sau khi cất kéo, đọc thể tích tinh dầu thu được rồi loại nước bằng
Na 2 S0 4 khan, sau đó pha loãng với dung môi CHCI3 đến nồng độ thích hợp (10'^).
Phân tích thành phần các chất bay hơi trong tinh dầu bằng GC-MS (tiến hành trên hệ
thống GC Agilent 7890A. Cột sắc kí Agilent 19091 s - 433 có kích thước 30 m X

250 |im, độ dày phim 0.25 Ịim. Nhiệt độ bắt đầu là 45°c giữ trong 2 phút, sau đó
tăng dần 5°c/phút đến 200°c, rồi tăng 10°c/phút đến 250°c, giữ trong vòng 2 phút.
Khí mang Heli, tốc độ dòng Iml/phút. Detector MS Agilent 5975C).


- Nghiên cứu về độc tính cấp và xác định LD 50 của cao Hoàng Kinh: Tiến hành
trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp Litchfield - Wilcoxon và
hướng dẫn của WHO [9, 10], Chuột nhắt được chia thành 5 lô, mỗi lô 10 con, được
uống mẫu thuốc nghiên cứu 3 lần /24h theo liều tăng dần từ 124 g/kg đến 620 g/kg
(liều tối đa chuột có thể dung nạp được). Theo dõi tình trạng chung và số lượng
chuột chết ở mỗi lô trong 72 giờ. Tiếp tục theo dõi tình trạng của chuột đến hết
ngày thứ 7 sau khi uống thuốc thử lần đầu.
- Nghiên cứu độc tính bán trường diễn: Thỏ được chia làm 3 lô, mỗi lô 10 con.
Lô chứng: uống nước cất 2ml/kg/ngày. Lô trị 1: uống Cao Hoàng kinh liều 3,2 g
dược liệu/kg (liều có tác dụng tương đương liều dùng trên người, tính theo hệ số 4).
Lô trị 2; uống Cao Hoàng kinh liều 9,6 g dược liệu/kg (gấp 3 lần lô trị 1). Thỏ được
uống nước cất hoặc thuốc ngày một lần vào buổi sáng liên tục trong 8 tuần. Đánh giá
tại các thời điểm trước uống thuốc (To), sau 4 tuần (T 4), sau 8 tuần (Tg) về tình trạng
chung, thể trọng, chức năng tạo máu, chức năng gan, chức năng thận [9, 10].
Kết quả và Bàn luận
Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hỏa học
Phân đoạn dịch chiết n-hexan cho kết quả dương tính với nhóm tinh dầu, sterol.

Phân đoạn dịch chiết MeOH cho kết quả dương tính với alcaloid, ílavonoid,
iridoid, triterpenoid, đường khử, acid hữu cơ.
Phân đoạn dịch chiết nước cho kết quả dương tính với flavonoid, iridoid, đường
khử, acid hữu cơ và gôm (chất nhầy).
Nhận xét: Bằng phản ứng hóa học đã xác định được trong lá Hoàng kinh có tinh dầu,
sterol, flavonoid, alcaloid, iridoid, đưòng khử, acid hữu cơ, triterpenoid, và gôm
(chất nhày). Các nhóm flavonoid, iridoid, đường khử, acid hữu cơ cho kết quả
dương tính ở cả hai phân đoạn dịch chiết MeOH và nước. Trong đó đáng chú ý là
flavonoid, một nhóm chất quan trọng trong thực vật, sở hữu nhiều tác dụng như
chống oxy hóa, chống viêm, chống gốc tự d o ....
Hàm lượng tinh dầu lả Hoàng Kinh và phân tích thành phần
Bảng 2. Kết quả phân tích tinh dầu lá Hoàng kinh thu hái mùa hè và mùa đông

s„
1
2

M ùa hè

M ùa đông

(% )

(% )

0,21

a - Pinene

0,81

0

Sabinene

0

12,14

Nội dung
Hàm lượng tinh dầu (theo dược liệu khô)

1,17


ß - Pinene
7

Thành phần
chính của
tinh dầu

- Terpinene

0
¥

0,94

a - Terpinene
ß - Caryophyllene

3,34

40,60

a - humulene

0,25

3,04

0

2,88

Valencene

21,95

0

Caryophyllene oxide

23,36

3,18

Cadinol

2,17

Dehydroabietan

4,14

0
0

Germacrene - D

0 !-

Kết quả nghiên cứu cho thấy lượng tinh dầu trong mẫu lá thu hái vào mùa hè
(0,81%) cao hơn nhiều so với mùa đông (0,21%). Tiến hành phân tích tinh dầu từ
hai mẫu nghiên cứu bằng GC - MS thu được kết quả; mẫu lá mùa đông phát hiện
được 47 chất nhưng chỉ có 21 chất xác định được cấu trúc, trong số đó, tỷ lệ
sesquiterpen là 61.84%; mẫu lá mùa hè tương ứng là 48 chất - 15 chất - 51.07%.
Trong mẫu lá thu hái mùa hè còn xác định được Dehydroabietan - là một diterpen.
Tỷ lệ các thành phần tinh dầu giữa hai mẫu cũng khác nhau đáng kể. ở mẫu lá mùa
đông, ß - Caryophyllen là thành phần chính chiếm 40.60% (mùa hè là 3.34%, rất
thấp). Trong khi đó, ở mẫu mùa hè, Caryophyllene oxide chiếm tỉ lệ cao nhất với
23.36% (mùa đông là 3.18%). /3-Caryophyllen, Caryophyllene oxide và valencene
là những thành phần chính trong tinh dầu lá đã được chứng minh là có tác dụng
chống viêm giảm đau hiệu quả.
Ket quả thử độc tỉnh cấp
Sau
giờ.
liều
thở,

khi uống cao Hoàng kinh, tất cả các lô không có chuột nào chết trong vòng 72
ở các lô từ lô 1- lô 3 (tương ứng liều Hoàng kinh là 124g dược liệu khô/kg đến
372g dược liệu khô/kg), chuột ăn uống, vận động bình thường, không bị khó
đi ngoài phân khô. ở lô 4 và lô 5 (tương ứng với liều 496g dược liệu khô đến

620g dược liệu khô) một số chuột có hiện tưọng ỉa chảy trong vòng 24 giờ sau khi
uống, những ngày sau về bình thường. Hoàng kinh là một dược liệu mới và ít được
đề cập tới trong các y văn trước đây. Xác định độc tính cấp và liều chết 50% để đánh
giá mức độ độc và có cơ sở chọn liều thử tác dụng cho các bước nghiên cứu tiếp


theo. Chuột nhắt đã được uống cao lỏng Hoàng kinh ở nồng độ đậm đặc nhất, thể
tích tối đa 0,25 ml/lOg và số lần tối đa 3 lần trong 24 giờ, tương đương 620 g dược
liệu/kg thể trọng chuột. Tính theo kinh nghiệm dân gian thì chuột nhắt đã uống gấp
64,61 lần liều trên người (tính hệ số ngoại suy trên chuột nhắt 10). Theo hướng dẫn
của WHO và hưóng dẫn nghiên cứu thuốc mới Hoàng kinh là dược liệu an toàn [7 .
Kết quả thử độc tỉnh bán trường diễn
Tinh trạng chung và sự thay đổi thể trọng của thỏ: Tình írạng chung; Trong thời
gian thí nghiệm, thỏ ở cả 3 lô hoạt động bình thường, nhanh nhẹn, mắt sáng, lông
mượt, ăn uống tốt, phân khô. Sự thay đổi thể trọng thỏ: biểu đồ la.
Đánh giả chức năng tạo máu: Theo WHO, tinh trạng chung, trọng lượng cơ thể và
các chỉ số huyết học là những xét nghiệm bắt buộc khi đánh giá độc tính của thuốc
thử. Vì vậy, các xét nghiệm công thức máu của thỏ thí nghiệm được xác định. Sau
4 tuần và 8 tuần uống cao Hoàng kinh, các chỉ số máu của thỏ (cả hàm lượng huyết
sắc tố, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, công thức bạch cầu) ở cả hai lô trị
đều thay đổi không có ý nghĩa thống kê so với trước khi dùng (p >0,05) và so với lô
chứng cùng thời điểm. Như vậy Hoàng kinh không có độc tính với cơ quan tạo máu.
Đánh giá chức năng gan: Trong cơ thể gan là cơ quan đảm nhận nhiều chức năng
rất quan trọng. Khi đưa thuốc vào cơ thể có thể gây độc với gan, làm ảnh hưởng đến
chức năng gan. Vì vậy, khi đánh giá độc tính của thuốc thì nghiên cứu ảnh hưởng

của thuốc đối với chức năng gan là rất cần thiết [5]. Để đánh giá mức độ tổn thương
tế bào gan, người ta thường định lượng nồng độ các enzym có nguồn gốc tại gan có
trong huyết thanh. Trong nghiên cứu này, sau 4 tuần và 8 tuần uống thuốc hoạt độ
ALT, AST và các chỉ số đánh giá chức năng gan (bilirubin toàn phần, albumin và
cholesterol trong máu) ở cả 2 lô nghiên cứu đều nằm trong giới hạn bình thường
(p>0.05).
Đánh giá chức năng thận: Thận là cơ quan bài tiết. Khi vào cơ thể thuốc có thể
gây độc, làm tổn thương thận. Đánh giá chức năng thận thường dùng xét nghiệm
định lượng creatinin máu. Creatinin là thành phần đạm trong máu ổn định nhất, chỉ
phụ thuộc vào khả năng đào thải của thận. Khi cầu thận bị tổn thương, nồng độ
creatinin máu tăng. Nồng độ creatinin trong máu thỏ sau uống cao Hoàng kinh
không có sự thay đổi khác biệt với lô chứng và so sánh giữa hai thời điểm trước và
sau khi uống thuốc thử (p>0,05).
Thay đổi về mô bệnh học sau 8 tuần dùng thuốc:


- Đại thể: Trên tất cả các thỏ thực nghiệm không quan sát thấy thay đổi bệnh lý
nào về mặt đại thể các cơ quan tim, phổi, gan, lách, tụy, thận và hệ thống tiêu hóa.
- Vi thể:
+ Hình thái vi thể gan: Lô chứng: hình ảnh gan bình thường, có một số vị trí bị
thoái hóa nhẹ. Lô trị 1; hình ảnh gan bình thường, một vài vị trí bị thoái hóa nhẹ. Lô
trị 2 : hình ảnh gan gần như bình thường.
+ Hình thái vi thể thận: Tất cả các lô đều có hình ảnh thận bình thường.
Giải phẫu đại thể và vi thể gan thận là chỉ số bắt buộc idii đánh giá độc tính bán
trường diễn theo hướng dẫn của WHO [9]. Hơn nữa xét nghiệm vi thể là tiêu chuẩn
vàng để đánh giá tổn thương

cơ quan chính chịu trách nhiệm chuyển hóa và thải
trừ thuốc. Theo kểt quả trên, giải phẫu mô bệnh học các cơ quan của thỏ đều bình
thường so với thời điểm trước khi dùng thuốc.

2

Kết luận
Lá cây có chứa các nhóm chất: tinh dầu, sterol, flavonoid, alcaloid, iridoid, đường
khử, acid hữu cơ, triterpenoid, gôm (chất nhầy). Có sự khác nhau về hàm lượng và
tỷ lệ các chất trong tinh dầu hai mẫu lá thu hái vào hai thời gian khác nhau. Hàm
lượng tinh dầu mùa hè cao hơn so với mùa đông. Cao Hoàng kinh là dược liệu an
toàn, không có độc tính cấp theo đường uống trên chuột nhắt trắng. Cao Hoàng kinh
liều 3,2g dược liệu/kg/ và liều 9,6g dược liệu/kg uống trong
gây độc tính bán trường diễn trên thỏ.

8

tuần liên tục không

Tài liệu tham khảo
1. Trần Hùng, Nguyễn Viết Kình, Bùi Mỹ Linh... (2012), Phương pháp nghiên cứu
dược liệu, Bộ môn Dược liệu, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh.
2. Võ Văn Chi (1997), Hoàng kinh, ’T ử điển cây thuốc Việt Nam ”, Nhà xuất bản Y
học, tr. 564
3. PL.Ladda và CS.Magdum “Vitex negundo Linn.: Ethnobotany, Phytochemistry
and Pharmacology- A R eview ”.
4. World Health Organization (2000), “Working group on the safety and efficacy o f
herbal medicine Report o f regional office for the western pacific of the World
Health Organization.
5. Litchfield J T& Wilcoxon F A. (1949^, “A simplified method o f evaluating doseeffect experiments". J. Pharmacol. Exp. Ther. 96:99-113.