Ứng dụng toán hóa trong định lượng hỗn hợp cefoperazon và sulbactam bằng quang phổ tử ngoại

BÀI NGHIÊN CỨU

ứng dụng toán hóa trong định lượng
hỗn hợp cefoperazon và sulbactam
bằng quang phổ tử ngoại
Vũ Đặng Hoàng
TrườngĐại họcDượcHàNội

SUMMARY
Chemometrics (i.e. bivaritơte calibration method and multi-lineơr regression calibration method) were proposed for
possible spectrophotometric quantification of binary mixtures. The accuracy and precision of these chemometrics-assisted u v
spectrophotometric methods were successfully tested with cefoperazone - sulbactam mixture in both self-made and real samples.
These spectrophotometric methods were also statistically comparable to HPLC
Từ khóa: Toán hóa, quang phổ tử ngoại, hỗn hợp đa thành phân.

một lọ: Cefoperazon (CP) 500 mg + sulbactam (SB)

Đặt vấn để

500 mg.
ở Việt Nam, nghiên cứu ứng dụng các quang phổ
UV-VIS vào kiểm nghiệm các chế phẩm đa thành
phẩn đã được chú ý từ những năm cuối của thế kỷ
XX [1], Đây là kỹ thuật có ưu điểm nổi bật là tiết kiệm
dung môi hóa chất cũng như thời gian thực nghiệm.
Tuy nhiên, do điều kiện cơ sở vật chất, nhân lực nên
các để tài thuộc lĩnh vực này còn hạn chế [2]. Trên thê'
giới, việc kết hợp toán hóa (chemometrics) và phổ
hấp thụ UV-VIS để định lượng các hỗn hợp đa thành
phẩn không ngừng được mở rộng cùng với sự phát
triển các thuật toán và phẩn mểm chuyên dụng [3,5].

Mục tiêu của nghiên cứu này là xây dựng được
phương pháp định lượng đổng thời cefoperazon và
sulbactam trong hỗn hợp bằng quang phổ tử ngoại
kết hợp toán hóa (có thể thực hiện được với phẩn
mềm Microsoft EXCEL) có độ chính xác cao.
Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
Thuốc bột pha tiêm Sulperazon (Pfizer) số lô
12902400, Jincetam (Hankook Korus) số lô A01709,
Bacamp {Hanlim) số lô 10701 có công thức chung cho

50

N ghỉên cứ u dư ợ cĩhóngtlnthuõc

Số 2/2014

Chất đối chiếu
Cefoperazon {99,82% C^jHj^N^NaOjSj; sổ lô
0211230) và sulbactam (99,91% CgHj^NOjS/mg; số lô
0103159) do Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương.
Dung môi
Acetonitril, acid phosphoric đạt tiêu chuẩn HPLC.
Nước cất được sử dụng làm dung môi.
Trang thiết bị
Máy quang phổ hai chùm tia Unicam u v 300
(ThermoSpectronic) được kết nối với máy tính (chạy
trên hệ điều hành Windows XP) với phẩn mểm chuyên
dụng Vision 32 với chế độ đo: start Lambda: 200 nm stop Lambda: 300 nm; Data Mode: absorbance; band
width; 1,5 nm; scan Speed: intelliscan nm/min; data

Interval: very high resolution.
Máy HPLC: Agilent Technologies 1200 series
(Agilent Technologies - My). Cột sắc ký: Apollo Cl 8
(150 mm X 4,6 mm; 5 urn).
XỬ lý số liệu được tiến hành trên phẩn mềm
Microsoft EXCEL 2007'


ề
Phương pháp nghiên cứu

A n iix , — b x | C x + b Y i C y + a x Y |

Với phép đo quang, mối quan hệ tuyến tính giữa
nổng độ của chất phân tích X và độ hấp thụ quang
Aj^.tại một bước sóng xác định X. được biểu diễn bằng
phương trình hồi qui (1 )
A x i

=

b x i C x

+

a x i

(1)

trong đó b, a lẩn lượt là độ dốc và hệ số chắn.

Phương pháp hiệu chuẩn nhị biến (Bivariơte
calibration method)
Trong phương pháp này, độ hấp thụ A . của
hỗn hợp hai chất (X và Y) được đo tại hai bước sóng
khác nhau (i = 1 , 2) được biểu diễn theo hệ phương
trình (2):
A m ix i
A m ix

=

b x ,C x

+

b Y iC y

+

axY|

2=

b x ,C x

+

b y ỊC y

+

'à x Y ỉ

axY,

=

axi

+

A m iX 2 =

b x X x + b y X y + ÜXY2

Am iXn

b x „ C x

—

+

b Y „C Y

+

(6 )

axY„

Hệ phương trình (6) có thể được biểu diễn dưới
dạng ma trận (7)
^ n iix i

[b x ,
bx'

b v ,'

axY|

b v,

axYj
(7 )

'C x '
+
. C

_A m i x „ _

y

.

.b x „

Hoặc ở dạng đơn giản hofn (8) và thu gọn (9)

A n iix i

- axY,'
—

ay,

by.l

[•b x.

b y .

a x Y ĩ

C x

axY2 = ax, + ay^

C

Hệ phương trình (2) có thể được viết dưới dạng
ma trận như sau (3):
=
A m iX ]

‘ bx,
_bx,

b Y ,‘

b y ,.

âxY 1

A m ix Ị

-

3 x Y2

_

C x‘
+
.C y _

axY,
axY,

bxi

by.

' C x '

bx:

by.

. C y .

-

(A m ix ~

-

a x y )2 x 1=

=

bx.

by,

bx.

by

2X

1 —

( K

K nx2

bY^• C

2X 1

by,

bY
K „

^2x2 •C2x 1

(9)

2 =

x

-bx„

C2X 1 =

b Y „.

C x

Hệ phương trình (9) được chuyển thành (10) khi
nhân cả hai vế với ma trận chuyển vị của ma trận K:

Khi đó, nổng độ của X và Y có thể được tính thông
qua ma trận nghịch đảo của ma trận K theo phương
trình (5)
C

^ X Y )n X 1 =

■bx,

(3)

(4)
K

- h x ’

trong đó:

Hoặc dưới dạng đơn giản hơn (4)
(A m ix

axY„.

(8 )
y

)2 X

2

■( A m i x

— a x v ) 2x 1

(5)

Để xác định hai bước sóng tối ưu cho phương
pháp này (trị tuyệt đối của ma trận K đạt giá trị lớn
nhất), thuật toán Kaiser được sử dụng cho các cặp
bước sóng khác nhau [6]. Nói một cách khác, phương
pháp này dựa vào phương trình hồi qui tuyến tính của
từng chất tại các cặp bước sóng khác nhau.
Phương pháp hiệu chuẩn hổi qui đa tuyến tính
(Multì-linear regression-calibratìon method)
Hệ phương trình (6) biểu diễn độ hấp thụ của hỗn

) 2 k ii (^ m ix “

I

=

(K

K „ x 2

•C 2 x 1

(10)

Trong trường hợp này, nồng độ của X và Y trong
hỗn hợp có thể xác định dựa vào (1 1 )
Cjx

I

= -(K )2xn K n x 2J

' (K

)2 Xn (-^mix

~ axv)„ X I

(11)

Thuật toán này được thực hiện với phẩn mểm
EXCEL đã cài đặt thêm phần Add-in có chứa hàm hổi
qui đa tuyến tính. Nồng độ của X và Y trong hỗn hợp
được tính toán sau khi nhập đẩy đủ các dữ liệu vể độ
hấp thụ ánh sáng (A) của hỗn hợp cũng như các giá trị
vể độ dốc (b) và hệ số chắn (a) của các phương trình
hồi qui tuyến tính của X và Y được xây dựng tại các
bước sóng lựa chọn.

hợp hai chất (X và Y) được đo tại n bước sóng (i = 1,

Chuẩn bị mẫu

2, . . . , n)

Dung dịch chuẩn gốc CP 5000 mg/l và SB 5000

SỐ2/2014 Nghiên cứu duợcThông tin thuõc 51

BÀI NGHIÊN CỨU *
mg/l được pha trong nước. Các dung dịch hỗn hợp chuẩn (CP + SB) đều được pha từ các dung dịch gốc một
thành phẩn đã nêu theo bảng 1 .
Bảng 1. Các dung dịch mẫu tựtạo
S B (» ^

S ố th ứ q r
1

15

15

15

20

3

15

25

4

20

15

5

20

20

6

20

25

7

25

15

8

25

20

9

25

25

2

Dung dịch thử có nổng độ khoảng CP 20 mg/l + SB 20 mg/l.
Kết quả nghiên cứu
Kết quả đo quang ở hình 1 cho thấy SB 20 mg/l không có cực đại hấp thụ và khả năng hấp thụ ánh sáng
yếu hơn nhiều so với dung dịch CP cùng nồng độ. Sự trùng lặp của phổ cộng, CP 20 mg/l + SB 20 mg/l, và
phổ hỗn hợp có nồng độ tương ứng chứng tỏ sự cộng tính ánh sáng của CP và SB trong khoảng bước sóng
210-300nm .

Bước sóng (nm)

1 1. Phổ hóp thụ củo CP20mg/l, SB20mgA phổ cộng vờ phổ hỗn hợp (CP20mg/l+ SB20mg/l)
Với phương pháp hiệu chuẩn nhị biến, 6 bước sóng được lựa chọn là 214, 218, 222, 226, 230, 234 nm.
Phương trình hổi qui tuyến tính biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ của CP (10 - 35 mg/l) và SB (10 - 35
mg/l) với độ hấp thụ ánh sáng được trình bày ở bảng 2. Cặp bước sóng được lựa chọn cho phương pháp này là
214 và 234 nm (bảng 3).
52

1Nghiên CỨU d u Ợ G Ĩhô ng tln th uõ c 1 Số 2/2014


Báng 2. Phương trình hôi qui tuyễn tính tại 6 bước sóng được lựũ chọn
Phương trinh hoi qui tuyến tính (R)
CP

SB

214

A = 0,0344C + 0,0085 (0,9998)

A = 0,0079C + 0,0458 (0,9965)

218

A = 0,0334C + 0,0072 (0,9998)

A = 0,0062C + 0,0400 (0,9959)

2 2 2

A = 0,0340C + 0,0074 (0,9998)

A = 0,0051C + 0,0361 (0,9954)

226

A = 0,0348C + 0,0075 (0,9998)

A = 0,0042C + 0,0325 (0,9953)

230

A = 0,0348C + 0,0089 (0,9998)

A = 0,0033C + 0,0299 (0,9953)

234

A = 0,0337C + 0,0062 (0,9998)

A = 0,0023C + 0,0250 (0,9951)

Bâng 3. Giá trị tuyệt đổi củũ mơ trận (K106)
214

218

222

226

0

50,6

93,2

130,4

161,4

187,1

0

40,5

75,5

105,5

132,1

0

34,7

65,3

93,7

0

31,3

61,5

0

31,2

230

234

.
214
218
222

226
230
234

Dựa vào bảng 2, mối quan hệ giữa độ hấp thụ
quang và nổng độ của từng chất trong hỗn hợp CP và
SB tại 6 bước sóng được biểu diễn lần lượt bằng các
phương trình sau:
J A = 0,0344C„ + 0,0079C53+ 0,0543
>12, A = 0,0334C^p + 0,0062C55 + 0,0472
A - 0,0340C„ + 0,0051 C53+ 0,0435
A = 0,0348C„ + 0,0042C5[+ 0,0400
A = 0,0348C^p + 0,0033C5[+ 0,0388
ằ“ }. A = 0,0337Qp + 0,002305] + 0.0312
Dựa trên giá trị mật độ quang của hỗn hợp đo tại
6 bước sóng lựa chọn cũng như các giá trị vể độ dốc
và hệ số chắn của các phương trình hồi qui tuyến tính
(bảng 2), nồng độ của CP và SB trong hỗn hợp được
xác định đổng thời bằng phán mểm EXCEL
Hai phương pháp đã nêu (đo quang tại 2 và 6

0

bước sóng) được ứng dụng để định lượng đồng thời
CP và SB trong các mẫu tự tạo (bảng 4) và một số
dạng thuốc bột pha tiêm hiện đang lưu hành trên thị
trường (bảng 6).
Trong nghiên cứu này, HPLC được sử dụng làm
phương pháp đối chiếu với điểu kiện sắc ký; Pha động
(hỗn hợp acetonitril - nước pH 3,2 được điểu chinh

bằng acid phosphoric đặc (75 :25 tt/tt)); tốc độ dòng
0,8 ml/phút; thể tích tiêm mẫu 20 |al; bước sóng phát
hiện 210 nm. sắc ký đổ và các thông số của quá trình
sắc ký được trình bày lần lượt ở hình 2 và bảng 5.
Kiểm định thống kê ANOVA (so sánh các giá trị
trung bình) và Bartlett (so sánh các phương sai) của
các phương pháp quang phổ và HPLC khi định lượng
CP và SB trong chế phẩm cho thấy sự khác biệt không
có ý nghĩa thống kê với mức tin cậy 95%.

M ] . Sáckýđổrửơgiáihỗnhợpchuổn CP20mg/l+SB20mg/l

Số 2/2014 Nghiên Cứu d u ộ c lh ố n g tln th u õ c

53


BÀI NGHIÊN CỨU *
Báng4. Két quả định lượng các mẫu tựrạo
% t ìm i|i
H ổ i^ đ a ^ tín h

Nhi biên
STT

SP

SB

SP

SB

1

97,9

98,9

98,6

99,2

2

98,5

99,5

99,4

100,3

98,2

99,5

98,9

100,9

3
4

99,1

101,9

99,8

100,7

5

100,7

100,5

99,5

99,9

101,3

98,8

100,1

99,3

7

99,6

100,7

100,7

101,5

8

100,6

103,0

100,6

102,7

9

101,7

102,1

100,9

102,0

100,0

100,4

99,9

100,5

1,3

1,7

0,8

1,3

6

Trung
bình
SD

Bỏng 5. Thông sỗ quá trình HPLC của hỗn hợp CP 20 mg/ỉ và SB 20 mg/l
SB

CP

T ii^ s ố

STT

1

Độ lặp

RSD<2%

2

Độ đúng

99 - 101%

3

Khoảng tuyến tính 10-35 mg/L

4

Hệ số bất đối (AF)

5

Độ phân giải (RJ

6

Sô'đĩa lý thuyết (N)

990

3645

7

Thời gian lưu (t„ phút)

4,4

2,7

R> 0,990
1,2

0,95
12

Bảng 6. Két quả định lượng các chếphổm
% so với nhãn
Phương pháp
Nhị biến

bình ± SD, n = 6)
Jincetam

Sulperazon

Bacamp
CP

SB

CP

SB

CP

SB

100,3 ±1,8

99,5 ±2,1

100,8 ±1,1

99,1 ±1,6

99,3 ±2,1

98,9 ±1,8

99,8 ±1,5

99,2 ±1,7

100,3 ±0,9

99,6 ±1,1

100,5 ±1,7

99,4 ±1,4

100,6 ±1,0

100,2 ±1,4

100,4 ±1,5

99,9 ±1,6

Hổi quỉ đa tuyến
tính
HPLC

100,1 ±1,6

99,9 ±1,5

Bàn luận
Hiệu chuẩn nhị biến và hiệu chuẩn hổi qui đa tuyến
tính được để xuất cho phép định lượng đổng thời các
hoạt chất trong hỗn hợp hai thành phẩn vì đây là hai
thuật toán có thể tiến hành được với Microsoft EXCEL.
CP và SB được chọn là một ví dụ điển hình vì đây là
hỗn hợp có chồng phổ khá rõ rệt trong vùng ánh sáng
tử ngoại {hình 1 ).
Nguyên tắc cơ bản của phép định lượng bằng
quang phổ là sự cộng tính ánh sáng. Trong nghiên

54 N g h ỉè n cứ u d u ợ cT h ô n g tlnth u õ c: Số 2/2014

cứu này, các bước sóng (AX = 4 nm) trong khoảng
2 10 - 240 nm đã được khảo sát vì (i) hỗn hợp CP và SB
cộng tính ánh sáng trong khoảng bước sóng 210 - 300
nm và (ii) SB gần như không hấp thụ ánh sáng sau 240
nm.Tuy nhiên, chỉ có khoảng bước sóng 214 - 234 nm
đã được sử dụng cho phép định lượng (bảng 2) vì mối
tương quan tuyến tính giữa nổng độ SB và độ hấp thụ
ánh sáng bị suy giảm đáng kể từ bước sóng 238 nm (A
= 0,0013C + 0,0060; r = 0,940). Với phương pháp hiệu
chuẩn nhị biến, cặp bước sóng 214 và 234 nm được
coi là tối ưu vì cho giá trị tuyệt đối của ma trận K là


-------------------------------------lớn nhất (bảng 3); phép định lượng sẽ có độ nhạy cao
nhất. Ngược lại, cả 6 bước sóng này đểu được sử dụng
cho phương pháp hổi qui đa tuyến tính.
Kết quả khảo sát trên mẫu tự tạo cho thấy hai
phương pháp quang phổ đã nêu có độ chính xác cao:
độ lặp (RSD < 2%) và độ đúng (99-101%) (bảng 4).
Ngoài ra, kiểm định thống kê cũng xác nhận không có
sự khác biệt về độ lặp (Bartlett) và độ đúng (ANOVA)
khi áp dụng cả hai phương pháp quang phổ và HPLC
để định lượng đổng thời CP và SB trong các mẫu
thuốc bột pha tiêm (bảng 6). Do vậy, vể nguyên tắc
có thể sử dụng được cả hai phương pháp quang phổ
đã nêu cho việc định lượng đổng thời CP và SB trong
hỗn hợp vì kết quả thu được đối với các mẫu thử khi
phân tích ở hai điều kiện đo, 2 hoặc 6 bước sóng, cho

kết quả tương đóng.

4

.

Kết luận
Kết quả nghiên cứu với hỗn hợp CP và SB cho thấy
khả năng ứng dụng của việc kết hợp toán hóa (hiệu
chuẩn nhị biến và hiệu chuẩn hồi qui đa tuyến tính)
với quang phổ hấp thụ để định lượng hỗn hợp đa
thành phần. Các phương pháp quang phổ được xây
đựng có khả năng thay thế HPLC trong kiểm nghiệm
thường qui. Đây là hướng nghiên cứu nên được tiếp
tục triển khai với các thuật toán hiện đại khác cũng
như nhiểu dạng bào chê đa thành phẩn để tận dụng
được những ưu điểm của kỹ thuật đo quang.
Lời cám tfn
Nghiên cứu này được thực hiện trong để tài số
104.07-2012.58 do quỹ phát triển khoa học và công
nghệ quốc gia Việt Nam (NAPOSTED) tài trợ.

tAi liệu tham khảo

1.

Trấn Việt Hùng, Trịnh Văn Qùy (1997), Phương pháp định lượng toàn phổ FSQ (Full spectrum Quantitation) phân tích đa cấu tử trên
may quang phô uv - VIS Beckman DUR - series. Thõng báo kiểm nghiệm số2.

2.

Thái Duy Thìn (2003-2005). Nghiên cứu phương pháp quang phổ và HPLC để định lượng các thuốc từ 2-5 thành phẩn. Đề tài cấp bộ

3.

Forina M., Casolino M.C., Martinez c. de la Pezuela (1998), "Multivariate calibration: applications to pharmaceutical analysis". Journal of
Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 18,21-33.

4.

Massart, D.L, Vandeginste, B.G.M., Deming, S.N., Michotte, Y„ Kaufman, L (1988), Chemometrics:A Textbook, p. 124, Elsevier, Amsterdam.

5.

Richard G.B. (2003), Chemometrics: Data Analysis for the Laboratory and Chemical Plant, John Wiley & Sons, Ltd.

SỐ2/2014 Nghiên cứu dượclhổng tin thuõc 55