Nghiên cứu tách các đồng phân quang học của atenolol bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với một số pha tĩnh đối quang

•r

Nghiên cứu tách các đông phân quang
học của Atenolol bằng sắc ký lỏng hiệu
năng cao vóri một số pha tĩnh đối quang
Tạ Mạnh Hùng’, Trịnh Văn Lẩu’,
Nguyễn Thị Thu Hiển^ Nguyễn Thị Kiểu Anh^
' ViệnKiểmnghiệmthuốc Trungương, ^TrườngĐại họcDượcHàNội

SUMMARY
This article describes the characteristics of atenolol chromatographic separation that resulted on variuos mo­
bile and stationary phases. The chromatograms showed quite different characteristics of the separation process.
Atenolol enantiomers were separated using a Chirex®3022 column (250x4.6 mm, 5 ụm) with the mobile phase of
hexane-1,2dichloromethane-methanol-ơcid trifluoroacetic (50:35:7.5:0.2 v/v/v/v), ultraviolet detection at 230 nm
and flow rate of 1.0ml/min. As the method has less run time (20 min), it can be useful in quality control laboratories
for routine analysis.
Từ khóa: Atenolol, đổng phân quang học, HPLC, pha tĩnh đối quang.

Đặtvấn đề
Atenolol (2-{4-[2-hydroxy-3-(propan-2-ylamino)
propoxy] phenyl} acetamid) có tác dụng ức chế
chọn lọc p i-adrenergic, được dùng trong điểu trị
tăng huyết áp là một trong số các hoạt chất có các
đồng phân quang học có tác dụng dược lý không
giống nhau [8]. Trong hai đồng phân quang học, (S)atenolol có tác dụng ức chê' p i-adrenergic cao hơn
khoảng 50 lẩn và ít tác dụng phụ hơn so với (R)-atenolol [8]. Đã có một số nghiên cứu tách đồng phân
quang học của atenolol bằng điện di mao quản [4],
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [5-7,9] được công
bố. Trong các nghiên cứu này, đổng phân quang học
của atenolol tách nhau dựa trên một trong hai cơ chế
hoặc là sử dụng cột sắc ký chứa pha tĩnh đối quang

có ái lực khác nhau đối với từng đồng phân hoặc sử
dụng tác nhân đặc biệt phản ứng đặc hiệu với đồng
phân quang học xác định tạo ra hợp chất không đối
quang, sau đó tiến hành tách bằng HPLC (với cột sắc

218

Nghiên Cứu dượcThông tin thuỡc Sỗ6/2013

ký thông thường) hoặc bằng điện di mao quản. Tuy
nhiên, chưa có nghiên cứu nào vể tách đổng phân
quang học của atenolol được tiến hành tại Việt Nam
được công bố. Bài báo này trình bày kết quả nghiên
cứu tách các đồng phân quang học atenolol trong
chế phẩm thuốc bằng HPLC với một số pha tĩnh đối
quang có bản chất khác nhau.
Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Dung môi, hoá chất
Chất chuẩn: Ater\o\o\ chuẩn (racemic) - Viện Kiểm
nghiệm thuốc Trung ương, hàm lượng 100,17%, độ
ẩm 0,11 %; số kiểm soát: 0102093. (S) - Atenolol - Sigma, hàm lượng 99,2 %, số lô: 392.716.000.
Dung môi, hóa chất: Đạt tiêu chuẩn tinh khiết
dùng cho HPLC.
Thiết bị và dụng cụ phân tích
Tất cả các thiết bị phân tích đểu được chuẩn hóa,
đáp ứng yêu cẩu của ISO/IEC 17025 - 2005 và GLP


A
bao gồm: Máy sắc ký lỏng (Shimadzu LC-20A, Nhật Bản); cân phân tích (Sartorius Cp 224S, Thụy Sỹ) và các

dụng cụ thủy tinh, bình định mức, pipet có độ chính xác phù hợp.
Đối tượng
Bốn chế phẩm viên nén chứa atenolol dạng racemic: Viên nén Tenocar 50 mg (công ty Pỵmepharco),
SĐK:VNA-1974-04, số lô 010212; Viên nén Teginol 50 mg (công ty Dược Hậu Giang), SĐK:VD-4273-07, số lô
010112; Viên nén Atenolol Stada 50 mg (công ty Stada Việt Nam), SĐK:VN-10349-05, số lô 010112 và Viên nén
Tenormin 50 mg (AstraZeneca UK., Ltd), SĐK:VN-5753-01, số lô HF567.
Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát các điều kiện sắc ký khác nhau trên một số cột phân tích chọn lọc đối quang có bản chất pha tĩnh
khác nhau theo qui trình phát triển phương pháp của nhà sản xuất [1-3,6].
Đối với mỗi loại cột, tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký khác nhau như: thành phần và tỷ lệ các thành
phần này trong pha động; ảnh hưởng yếu tố pH của dung dịch đệm trong pha động; tốc độ dòng; thể tích
tiêm mẫu; nồng độ chất phân tích,... Tiến hành khảo sát thành phẩn và tỷ lệ pha động đối với mỗi cột Ultron
ES-OVM, Chiralcel a1-acidglycoprotein (AGP), Chirex 3022 và Astec Cyclobond 12000 theo các sơ đổ sau:

Sữđồ 1. Quytrình kháo sát thùnh phán, tỷlệphođộngtrêncộtUltronB-OVM (4,6 x 250mm:5ụm)

Sơđố 2. Ouyninh kháosát thành phán, tỷ lệphũ động trên cột Chirace!AGP(4,0xl50mm;5 ịim)


Sơđồ 3. Ouytrình khảo sát thành phân, tỷ lệpho động trên cột Chirex3022 {ịO X 250 mm; 5 ịẨĩĩì)

CHaCN/Đệm : 35/65

I
Có rửa giải

BChông rửa giái

ị

CHgCN/Đệm : 75/25

ị
Có tách
1.Thay đổi pH
2.Thay đổi dung môi
hữu cơ

Có tách

1

1.Điều chỉnh tỉ lệ dung môi hữu cơ
2.Thay đổi đệm.
Hoặc:
1. Điều chỉnh pH
2. Thay đổi dung môi hữu cơ
Không tách

Không tách

Có rửa giải
Có tách
1.Tối ưu tỉ lệ
HOAc/TEA.
2.Tăng nồng độ
HOAc/TEA

Chuyển sang sắc ký dùng hệ dung môi
hữu cơ phân cực

CH3CN/CH3OH/HOAC/TEA:
95/5/0,3/0,2
ị Không rửa giải

Không tách
1. Giảm CH3OH xuống 1%
2. Thay đổi tỉ lệ và giảm nồng
độ HOAc/TEA
Không tách

1.Tăng CH3OH lên 10%
2.
Tăng nồng độ
HOAc/TEA
Có rửa giải

Sơđồ 4. Ouy trình M o sát thờnh phân, tỷ lệpho động trên cộtAstec Cỵdobond12000 (4,6 X 250 mm; 5 ụm)

Kết quả nghiên cứu

Khào sát và lựa chọn các điều kiện phân tích
Kết quả khai triển sắc ký mẫu dung dịch chuẩn atenolol racemic nồng độ khoảng 50 |jg/ml theo các điểu
kiện sắc ký tương ứng với từng cột pha tĩnh chọn lọc đối quang được trình bày ở hình 1.


(c)

(ữ)

U«Mmaỵ:ỉr4M

ifäL

Mk W ị m I I» :6 « 1 I

200-

'rets»^
1«^

W
<0;
tị

-2S^

Hình ĩ. Sáckỷ đỗ của mẫu chuẩn ũtenololmcemk ở bướcsóng 230nm thế tích mẫu 50ụì với cácđiêu kiện:
a. Cột Ultron ES-OVM; đệmphosphat 20mM, pH 7,0-Me0H tỷ lệ 99:1; tócđộ 0,75 mì/phút, b. CộtChiralAGP; đệmphosphđ20mM, pH 7-MeOHtỷlệ 99,5:0,5; tốc độ 0,75 mưphút;
c CộtAstee; đệmphosphot20wM,pH7fi-MeCNtỷlệ 25:75; t&độlOml/phút,dXộtAstee;MeCtề-MeOHWAc-TEAtỷlệ99:l:OJ:0,l:tốcđộl0ml/phút;eXộtữ^^^
I2dícloromethone-methanol-ocidưifluoroacetictỷ lệ50:35:7,5:0,2;ĩócđộ 1,0ml/phát.

Kết quả ở hình 1 cho thấy:
Với cột Ultron ES - OVM: Khi dung môi pha động
chỉ chứa thành phẩn đệm, không có các dung môi
có lực rửa giải mạnh như MeOH, MeCN, thì ateno­
lol cũng vẫn được rửa giải khỏi cột với thời gian lưu
tương đối ngắn. Tuy nhiên, khi khai triển sắc ký với
các điểu kiện sắc ký có thành phẩn pha động là đệm
pH 7,0 - MeOH tỷ lệ 99:1, tốc độ dòng 0,75 ml/phút,
thì dung dịch chuẩn atenolol racemic vẫn chỉ cho 01

pic duy nhất trên sắc ký đồ, các đối quang R-atenolol
và S-atenolol chưa phân tách khỏi nhau (hình la).
Với cột Chiralcel AGP: Khi thay Isopropanol bằng

MeOH đổng thời giảm tỷ lệ dung môi hữu cơ phân
cực (MeOH) trong pha động và tăng pH của dung
dịch đệm lên tới pH 7, thì khả năng phân tách các
đổng phân quang học R- và S-atenolol của cột tăng
lên. Tuy nhiên, với pha động bao gồm MeOH - đệm
phosphat 20 mM, pH 7,0 tỷ lệ 0,5:99,5, tốc độ dòng
0,75 ml/phút, thì các đổng phân quang học của at­
enolol vẫn chưa tách khỏi nhau (hình 1b).
Với cột Astee Cyclobond 12000: Khi triển khai sắc
ký pha đảo, pha động chứa các thành phẩn MeCN:
đệm phosphat pH 7,0, tỷ lệ 35:65, atenolol chưa
được rửa giải qua cột. Khi tăng tỷ lệ MeCN lên, at-


enolol đă được rửa giải khỏi cột, tuy nhiên các đổng
phân quang học của atenolol không tách nhau (hình
1c). Khi triển khai sắc ký pha đảo, pha động chứa
các thành phân dung môi hữu cơ phân cực (MeCNMeOH-acid acetic-triethylamin), atenolol đã được
rửa giải qua cột, song các đổng phân quang học của
atenolol vẫn chưa tách khỏi nhau, ngay cả khi tỷ lệ
MeOH trong pha động đã giảm xuống dưới 1% và
nồng độ acid acetic, triethylamin trong pha động
giảm xuống 0,1% (hình Id).
Với cột Chirex 3022 ; Khi giảm tỷ lệ dung môi
không phân cực (n-hexan, dicloromethan) trong
thành phẩn pha động, pic atenolol sẽ xuất hiện

sớm hơn, hệ số Rs giữa các pic R- và S-atenolol giảm
đi và ngược lại khi tăng tỉ lệ dung môi không phân
cực thì thời gian lưu tăng lên và hệ số Rs lớn hơn.
Khi cố định tỷ lệ thành phẩn dung môi không phân
cực trong pha động, nếu tăng tỷ lệ MeOH trong pha
động thì pic atenolol sẽ xuất hiện sớm hơn, hệ số
Rs giữa các pic R- và S-atenolol giảm đi và ngược
lại. Tỷ lệ acid trifluoroacetic trong pha động, ít ảnh
hưởng tới thời gian lưu của các pic R- và S-atenolol,
song có ảnh hưởng đến độ phân giải và hình dạng
các pic.

mẫu: 50 |jl; Detector UV: 230 nm. Trên sắc ký đổ, các
pic R- và S-atenolol cân đối; hệ số Rs > 1,5; hệ số T <
2,0; thời gian lưu của các pic không quá dài, dưới 20
phút (hình le).
Áp dụng điều kiện sắc ký trên phân tích các mẫu
thuốc
Chuẩn bị các dung dịch sắc ký:
- Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn atenolol racemic có nồng độ atenolol chính xác khoảng 0,05
mg/ml, dung dịch chuẩn (S)-atenolol và dung dịch
chuẩn (R)-atenolol có nổng độ 0,025 mg/ml trong
methanol.
- Các mẫu thử có nồng độ atenolol racemic 0,05
mg/ml, được chuẩn bị trong methanol.
Tiến hành sắc ký các dung dịch trên theo các điểu
kiện đã lựa chọn, sắc ký đồ các mẫu chuẩn R-atenolol, S-atenolol và mẫu thử được trình bày ở hình 2.

ũ.MỗLichuổnliS-Atenolol

b. Mẫu chuẩn S-ũtemlol

c Mầu chuẩn R-ũtenolol

d.MăuchuổnS-atenolol

Qua kết quả khảo sát chúng tôi đã lựa chọn được
điều kiện sắc ký, phân tách được các đồng phân
quang học R- và S-atenolol trên cột Chirex 3022
như sau: Cột Chirex 3022 (4,0 X 250 mm; 5^m), nhiệt
độ phòng, có bảo vệ c ộ t; Pha động: n-hexan-1,2
dicloromethan-methanol-acid trifluoroacetic =
50:35:7,5:0,2; Tốc độ dòng: 1 ml/phút; Thể tích tiêm

1*»

lOO'


ầ.

Hình 2. Sâcký đỗ cócmẫu chuẩn rà àử atenolol

Trên sắc đồ của các mẫu thử (hình 2e, 2g, 2h và
2i) các pic của 2 đổng phân của atenolol được tách
rõ ràng (Rs>2), tương ứng về thời gian lưu với pic của
chuẩn (S)-atenolol (15,3 phút) và chuẩn (R)-atenolol
(17,2 phút). Như vậy phương pháp HPLC đã được lựa
chọn phù hợp với việc tách các đồng phân của ate­
nolol trong một số chế phẩm thuốc.

Bàn luận
Dựa trên đặc điểm các đổng phân đối quang có
tính chất hóa lý tương tự nhau, chỉ có thể phân tách
sau khi phản ứng với tác nhân đối quang chọn lọc tạo
ra hợp chất không đối quang khác nhau, chúng tôi đâ
khảo sát các điều kiện phân tách đối quang trực tiếp
trên các cột pha tĩnh đối quang có bản chất khác nhau
và bước đẩu lựa chọn được điều kiện sắc ký tương ứng
với cột pha tĩnh Chirex 3022 cho phép tách được các
đồng phân đối quang của atenolol. So với kết quả
nghiên cứu của các tác giả Ribeiro [5] và Sonia Morante-Zarcero [7], phương pháp phân tách các đồng
phân đối quang trực tiếp bằng pha tĩnh đặc hiệu có
quá trình xứ lý mẫu đơn giản hơn, không đòi hỏi phải

có các hóa chất và thiết bị xử lý mẫu đặc biệt. So với
phương pháp của các tác giả Santoro M.l [6] và Torul
H. [8], phương pháp này pha động chạy theo chế độ
đẳng dòng thuận tiện và ổn định hơn so với chạy chế
độ gradient dung môi của tác giả, hơn nữa thời gian
phân tích (thời gian lưu của các chất) ngắn hơn song
độ phân giải giữa các pic vẫn đảm bảo quy định của
dược điển. So với phương pháp phân tách bằng điện
di mao quản của tác giả Huang J. [4], phương pháp
HPLC dễ thực hiện hơn và thiết bị HPLC cũng phổ
biến ở các đơn vị kiểm tra chất lượng thuốc hơn so với
thiết bị điện di mao quản nên tính khả thi cao.
Kết luận
Phương pháp HPLCtách các đồng phân đối quang
của atenolol trong một số chế phẩm thuốc Dằng
phương pháp HPLC với cột chọn lọc đối quang Chirex

3022 [(S)-indoline-2-carboxylic acid & (R)-l-(a-naphtyl)
ethylamin] 4,0 X 250 mm; 5 |jm đã được xây dựng. Kết
quả áp dụng trên một số chế phẩm thuốc cho thấy, đã
xây dựng thích hợp tách các đồng phân quang học R(+)
atenolol và S(-)atenolol.


TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Agilent Technologies (2010), Ultron ES-OVM: Method development Protocol.
2. Astec (2002), Cyclobond Handbook, sixth edition, Advanced Separation Technologies, Inc.
3. Chrom Tech (2011 ), Separation of chirol compounds on Chiral-AGP, Chirol-HSA, Chiral-CBH, second edition.
4. Huang J, Sun J, Zhou X, You T (2007), "Determination of atenolol and metoprolol by capillary electrophoresis with tris(2,2'-bipyridyl)
ruthenium(ii)electrochemiluminescence detection", Analytical Sciences, Vol. 23(2):183-8.
5. Ana Rita Ribeiro, Carlos Magalhaes Afonso, Paula M. L Castro, Maria Elizabeth Tiritan (2013), "Enantioselective HPLC analysis and bio­
dégradation of atenolol, metoprolol and fluoxetine", Environmental Chemistry Letters, Vol. 11 Issue 1, p.83.
6. Santoro M.l, Cho H.S (2000), "Enantiomeric separation and quantitative determination of atenolol in tablets by chiral high-performance liquid chromatography", Drug development industrial pharmacy, Vol. 26(10), p. 1107-1110.
7. Sonia Morante-Zarcero, Isabel Sierra (2012), "Simultaneous Enantiomeric Determination of Propranolol, Metoprolol, Pindolol, and
Atenolol in Natural Waters by HPLC on New Polysaccharide-Based Stationary Phase using a Highly Selective Molecularly Imprinted
Polymer Extraction", Chirality, Volume 24, Issue 10, pages 860-866.
8. Stoschitzky K., et al (1993), "Stereoselective features of (R)- and (S)-atenolol: Clinical pharmacological, pharmacokinetic, and radioli­
gand binding studies", Chirality, Vol. 5(1 ), p. 15-19.
9.Torul H, Tanner u (2011), "Determination of enantiomers of atenolol and propranolol in pharmaceutical formulations by HPIC Jour­

nal ofAOAC International, Vol. 94(3):833-8.

Xây dựng phương pháp định lượng
Lansoprazol trong huyết tương chó
Vũ NgọcThắng^ Nguyễn Ngọc Chiếng Trần Nguyên Hà^ Lương Quang Anh^

^TrungtâmKiểmnghiệmNghiên cứuDượcQuân đội - CụcQuâny, ^TrườngĐại họcDượcHàNội, ^KhoaDược- ViệnBỏng Quốcgia

SUMMARY

A method was proposed to determine lansoprazole concentrations in dog plasma. Following a single - step liquid - liquid extraction
with tert-butyl methyl ether, lansoprazole and internal standard (pantoprazoie) were separated using on isocmtic mobile phase of
0.01 M phosphate buffer (pH 8.0 adjusted with triethylamine)/acetonitrile (65:35, v/v) on reversed phase Waters symmetry c 18 column,
ultraviolet detection at 285 nm. Linearity range was 0.05 - 3.0 Ijg/m l (r > 0.9990 o f the regression line), the lower lim it ofquantitotion
was 50 ng/ml, mean percentage recoveries were from 97.67% to 101.02%. This method was validoted with inter-day and intra-day
precision o f 2.27% - 5.96% and 3.79% - 4.82%, respectively; accuracy was from 97.50% to 101.68%. The method was successfully
applied to determine lansoprazole concentrations in dog plasma samples.
Từ khóa Lonsoprazol, HPLC, huyết tương chó, thẩm định phương pháp.

Đặt vấn đề
Lansoprazol (LPZ) là chất ức chế tiết acid dịch
vị, dùng để điểu trị viêm loét dạ dày tá tràng và các
triệu chứng trào ngược dạ dày, thực quản [ 1]. Các
tác dụng điểu trị của LPZ phụ thuộc vào nổng độ
thuốc trong huyết tương (HT). Có nhiều phương

pháp khác nhau để định lượng LPZ trong huyết
tương nhưng phổ biến nhất là phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao [2-4, 6]. ở Việt Nam chưa
có nghiên cứu định lượng LPZ trong huyết tương
được công bố. Vì vậy để góp phẩn nghiên cứu sinh
khả dụng của viên nang LPZ, chúng tôi đã tiến
hành xây dựng phương pháp định lượng LPZ trong