Nghiên cứu tách các đồng phần quang học của atenolol bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với một số pha tĩnh đối quang

Nghiên cứu tách các đồng phẩn quang
học của Atenolol bằng sắc ký iỏng hiệu
năng cao với một số pha tĩnh đối quang
Tạ Mạnh Hùng', Trịnh Văn Lẩu\
Nguyễn Thị Thu Hiển^ Nguyễn Thị Kiểu Anh^
' Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, ^Trường Đợi học Dược Hà Nội

SUMMARY
This article describes the characteristics of atenolol chromatographic separation that resulted on vơriuos mo­
bile and stationary phases. The chromatograms showed quite different chơmcterìstics o f the separation process.
Atenolol enantiomers were separated using a Chirex'^ 3022 column (250x4.6 mm, 5 fjm) with the mobile phase of
hexane- l,2dichloromethane-methanol-acid trifiuoroacetk (50:35:7.5:0.2 v/v/v/v), ultraviolet detection at 230 nm
and flow rate o f 1.0 ml/min. As the method has less run time (20 min), it con be useful in quality control laboratories
for routine analysis.
Từ khóa: Atenolol, đổng phân quang học, HPLC, pha tĩnh đổi quanq.

Đặt vấn để

ký thông thường) hoặc bằng điện di mao quản. Tuy
nhiên, chưa có nghiên cứu nào về tách đổng phân

Atenolol (2-{4-[2-hydroxy-3-(propan-2-ylamino)
propoxy] phenyl} acetamid) có tác dụng ức chế
chọn lọc (31-adrenergic, được dùng trong điểu trị

quang học của atenolol được tiến hành tại Việt Nam
được công bố. Bài báo này trình bày kết quả nghiên
cứu tách các đổng phân quang học atenolol trong

tăng huyết áp là một trong số các hoạt chất có các
đồng phân quang học có tác dụng dược lý không

chế phẩm thuốc bằng HPLC với một số pha tĩnh đối

giống nhau [8], Trong hai đổng phân quang học, (S)atenolol có tác dụng ức chế (31-adrenergic cao hơn

quang có bản chất khác nhau.
Nguyên vật liệu và p h ư ơ n g pKáp nghiên cihi

khoảng 50 lần và ít tác dụng phụ hơn so với (R)-atenolol [8], Đã có một số nghiên cứu tách đổng phân

Dung môi, hoá chất

quang học của atenolol bằng điện di mao quản [4],

Chất chuẩn; ỈKtenoM chuẩn (racemic) -Viện Kiểm

sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [5-7,9] được công

nghiệm thuốc Trung líơng, hàm lượng 100,17%, độ

bố. Trong các nghiên cứu này, đồng phân quang học

ẩm 0,11 %; số kiểm soát; 0102093. (S) - Atenolol - Sig-

của atenolol tách nhau dựa trên một trong hai cơchế

ma, hàm lượng 99,2 %, số lô: 392.716.000.

hoặc là sử dụng cột sắc ký chứa pha tĩnh đối quang
có ái lực khác nhau đối với từng đồng phân hoặc sử

dụng tác nhân đặc biệt phản ứng đặc hiệu với đổng

Dung môi, hóơ chát: Đạt tiêu chuẩn tinh khiết
dùng cho HPLC.
Thiết bị và dụng cụ phân tích

phân quang học xác đinh tao ra hợp chất không đối

Tất cả các thiết bị phân tích đểu được chuẩn hóa,

quang, sau đó tiến hành tách bằng HPLC (với cột sắc

đáp ứng yêu cầu của ISO/IF.C 17025 - 2005 và GLP


bao gồm: Máy sắc ký lỏng (Shimadzu LC-20A, Nhậl Bản); cân phân tích (Sartoriiis Cp 224S, Thụy Sỹ) và các
dụng cụ thủy tinh, bình định mức, pipet có độ chính xác phù hợp.
Đối tượng
Bốn chế phẩm viên nén chứa atenolol dạng racemic; Viên nén Tenocar 50 mg (công ty Pymepharco),
SĐK:VNA-1974-04, số lô 010212; Viên nén Teginol 50 mg (công ty Dược Hậu Giang), SĐK;VD-4273-07, số lô
010112; Viên nén Atenolol Stada 50 mg (công ty Stada Việt Nam), SĐK:VN-10349-05, số lô 010112 và Viên nén
Tenormin 50 mg (AstraZeneca UK., Ltd), SĐK:VN-5753-01, số lô HF567.
Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát các điểu kiện sắc ký khác nhau trên một số cột phân tích chọn lọc đối quang có bản chất pha tĩnh
khác nhau theo qui trình phát triển phương pháp của nhà sản xuất [1 -3, 6].
ĐỐI với mỗi loại cột, tiến hành khảo sát các điểu kiện sắc ký khác nhau như; thành phẩn và tỷ lệ các thành
phần này trong pha động; ảnh hưởng yếu tố pH của dung dịch đệm trong pha động; tốc độ dòng; thể tích
tiêm mẫu; nổng độ chất phân tích,... Tiến hành khảo sát thành phần và tỷ lệ pha động đối với mỗi cột Ultron
ES-OVM, Ch\ra\ce\aĩ-acidglycoprotein fAGP), Chirex 3022 và Astec Cyclobond 12000 theo các sơ đổ sau:

Sơđỗ ĩ. Quytrhhkhắosátthònhphán, tỷlêphađộngừàưộtUltronES-OVM (4,6 x2S0m m ;Sịim }

Sơđỗ2.0uỵtrìnhkhảosàtthùnhphổn,tỷ!ệphođọngtrỂncộtChirũcelAũP(4,0xl50mm:5ịjm)

SỐ 6/2013 Nghỉên cứu dược Thông tin thuốc 219


Sơ đỗ 3. Quỵ trình khũo sát thành phán, tỷ lệ pha động trên cột Chirex Ỉ022 (4 ,0 x2 5 0 m ; 5 ịim)

C H sC N /Đ ệm : 35/65

I

:

Có rửa giải

Không rửa giải
CHaCN/Đệm : 75/25

I

ị Không tách

Có tách

1.Thay đổi pH
.Thav đổi duna môi
hữu cơ

Có tách

2

w

1

1.Điều chỉnh ti lệ dung môi hữu cơ
T V ia v ítni đ p m
Hoặc:
1. Đ iều chỉnh pH
2. Thay đổi dung môi hữu cơ
7

Không tách
Không tách

Chuyển sang sắc ký dùng hệ dung môi
hữu cơ phân cực
C H 3 C N /C H 3 OH/HOAC/TEA:
95/5/0,3/0,2

Có rửa giải
Có tách

ị

ị Không rửa giải

Không tách

ị
l.T ối ưu tì lệ

1. Giảm CH3OH xuống 1%

HOAc/TEA.

l.T ă n g CH3OH lên 10%

2. Thay đổi tì lệ và giảm nồng

2. Tăng nồng độ

độ HOAc/TEA

HOAc/TEA

2

.Tăng

nồng độ

HOAc/TEA
Không tách

t Có tách

Có rửa giải

k

Sơđô4.0uyữìnhkhũosầthònhphán,tỷlệphođộngtrêncộtAstecCydobon(ll2000(4,6 x 2 5 ũ m ;5 ijm )

Kết quả nghiên cứu
Khảo sát và lựa chọn các điều kiện phân tích
Kết quả khai triển sác ký mẫu dung dịch chuẩn atenolol racemic nồng độ khoảng 50 ng/ml theo các điểu
kiện sắc ký tương ứng với từng cột pha tĩnh chọn lọc đổi quang được trình bày ở hình 1 .


A
Maxirttnrtv: &6.101

mâU_
R
?

1

1
1
1

&

1
1
1

.'

__

^

'

y

■■■

\

■'

- 10I

ti

I

ti

t

ỉt

ỉ

N

4

2.5

S.0

(tì

oĩ

2!s

s!o

r:s

lỉ.o

\U

mìn'

tí

Kinh 1. Sêc ký đổ củũ mâu áuấn ũtenolol rũcemic ở bước sóng 2Ì0 nm thề tích mâu 50 ịiì vởi các điêu kiện:
aXộtUltronES-0VM;đệmphosphũt20mM,pH7AMe0Htylệ99:l;tốcđộ0J5ml/pUt.bXộtairalAGP:đệrnphosphat20mM,pH7-MeOHtỷlệ99M5:tK
cXộtAstec:đệmphosphcrt20mkpH7,0-^MeCNtỳlệ25:75;tổcđộlOml/phút,dXợtAstec:MeCN-MeOHWAc-TEA^

I2didoromethũne-methũnol-add tìầoroũcetictỷlệ 50:35:7,5:0,2; tóc độ 1,0 ml/phút.

Kết quả ở hình 1 cho thấy;
Với cột Ultron ES - OVM: Khi dung môi pha động
chỉ chứa thành phẩn đệm, không có các dung môi
có lực rửa giải mạnh như MeOH, MeCN, thì ateno­

MeOH đổng thời giảm tỷ lệ dung môi hữu cơ phân
cực (MeOH) trong pha động và tăng pH của dung
dịch đệm lên tới pH 7, thì khả năng phân tách các
đổng phân quang học R- và S-atenolol của cột tăng

lol cũng vẫn được rửa giải khỏi cột với thời gian lưu

lên. Tuy nhiên, với pha động bao gồm MeOH - đệm

tương đối ngắn. Tuy nhiên, khi khai triển sắc ký với

phosphat 20 mM, pH 7,0 tỷ lệ 0,5:99,5, tốc độ dòng

các điểu kiện sắc ký có thành phẩn pha động là đệm

0,75 ml/phút, thì các đồng phân quang học của at­

pH 7,0 - MeOH tỷ lệ 99:1, tốc độ dòng 0,75 ml/phút,

enolol vẫn chưa tách khỏi nhau (hình 1 b).

thì dung dịch chuẩn atenolol racemic vẫn chỉ cho 01

Với cột Astee Cyclobond 12000: Khi triển khai sắc

pic duy nhất trên sắc ký đồ, các đối quang R-atenolol

ký pha đảo, pha động chứa các thành phần MeCN:

và S-atenolol chưa phân tách khỏi nhau (hình la).

đệm phosphat pH 7,0, tỷ lệ 35:65, atenolol chưa

Với cột Chiralcel AGP: Khi thay isopropanot bằng

được rửa giải qua cột. Khi tăng tỷ lệ MeCN lên, at-


enolol đã được rửa giải khỏi cột, tuy nhiên các đổng

Qua kết quả khảo sát chúng tôi đâ lựa chọn được

phân quang học của atenolol không tách nhau (hình

điều kiện sắc ký, phân tách được các đổng phân

1c). Khi triển khai sắc ký pha đảo, pha động chứa
các thành phân dung môi hữu cơ phân cực (MeCN-

quang học R- và S-atenolol trên cột Chirex 3022
như sau: Cột Chirex 3022 (4,0 X 250 mm; 5|jm), nhiệt

MeOH-acid acetic-triethylamin), atenoloi đã được

độ phòng, có bảo vệ c ộ t ; Pha động; n-hexan 1,2

rửa giải qua cột, song các đồng phân quang học của

dicloromethan-methanol-acid

atenolol vẫn chưa tách khỏi nhau, ngay cả khi tỷ lệ

50:35:7,5:0,2; Tốc độ dòng: 1 ml/phút; Thể tích tiêm

MeOH trong pha động đã giảm xuống dưới 1% và

mẫu: 50 Ị jl; Detector UV: 230 nm. Trên sắc ký đổ, các

nồng độ add acetic, triethylamin trong pha động
giảm xuống 0, 1 % (hình Id).

2,0 ; thời gian lưu của các pic không quá dài, dưới 20

Với cột Chirex 3022 : Khi giảm tỷ lệ dung môi

trifluoroacetic

=

pic R- và S-atenolol cân đ ố i; hệ số Rs > 1,5; hệ số T <

không phân cực (n-hexan, dicloromethan) trong

phút (hình le).
Áp dụng điểu kiện sắc ký trên phân tích các mẫu

thành phẩn pha động, pic atenolol sẽ xuất hiện
sớm hơn, hệ số Rs giữa các pic R- và S-atenolol giảm

thuốc
Chuẩn bị các dung dịch sắc k ý ;

đi và ngược lại khi tăng tỉ lệ dung môi không phân

- Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn atenolol race-

cực thì thời gian lưu tăng lên và hệ số Rs lớn hơn.
Khi cố định tỷ lệ thành phẩn dung môi không phân

mic có nồng độ atenolol chính xác khoảng 0,05
mg/ml, dung dịch chuẩn (S)-atenolol và dung dịch

cực trong pha động, nếu tăng tỷ lệ MeOH trong pha

chuẩn (R)-atenolol có nổng độ 0,025 mg/ml trong

động thì pic atenolol sẽ xuất hiện sớm hơn, hệ số

methanol.

Rs giữa các pic R- và S-atenolol giảm đi và ngược
lại. Tỷ lệ acid trifluoroacetic trong pha động, ít ảnh

- Các mẫu thử có nồng độ atenolol racemic 0,05
mg/ml, được chuẩn bị trong methanol.

hưởng tới thời gian lưu của các pic R- và S-atenolol,

Tiến hành sắc ký các dung dịch trên theo các điểu

song có ảnh hưởng đến độ phân giải và hình dạng

kiện đã lựa chọn, sắc ký đổ các mẫu chuẩn R-ateno-

các pic.

lol, S-atenolol và mẫu thử được trình bày ở hình 2.

b. Mâu chuẩn S-otenolol
mAU,

Vo

c.M ẫuchm R-ũtm lol

ế

' ■ío ■ ■

d.MỗuáuđnS-atenolol

if

A

e. Màu thử Atenolol Stado50 mg

g.MũuthửĩenocorSOmg

h.MũuthửĩeginolSOmg

ì.MãuthừTemminSũmg

H«ìbì. Sáckỷđỗcácmẫuáuin vòthữũtenolol

Trên sắc đồ của các mẫu thử (hình 2e, 2g, 2h và

2 i) các pic của 2 đồng phân của atenolol được tách

có các hóa chất và thiết bị xử lý mẫu đặc biệt. So với
phương pháp của các tác giả Santoro M.l [6] và Torul

rõ ràng (Rs>2), tương ứng về thời gian lưu với pic của

H. [8], phương pháp này pha động chạy theo chế độ

chuẩn (S)-atenolol (15,3 phút) và chuẩn (R)-atenolol
(17,2 phút). Như vậy phương pháp HPLC đã được lựa

đẳng dòng thuận tiện và ổn định hơn so với chạy chế
độ gradient dung môi của tác giả, hơn nữa thời gian

chọn phù hợp với việc tách các đổng phân của ate­
nolol trong một số chế phẩm thuốc.

phân tích (thời gian lưu của các chất) ngắn hơn song
độ phân giải giữa các pic vẫn đảm bảo quy định của
dược điển. So với phương pháp phân tách bằng điện

Bàn luận

di mao quản của tác giả Huang J. [4], phương pháp

Dựa trên đặc điểm các đồng phân đối quang có
tính chất hóa lý tương tự nhau, chỉ có thể phân tách
sau khi phản ứng với tác nhân đối quang chọn lọc tạo
ra hợp chất không đối quang khác nhau, chúng tôi đã

HPLC dễ thực hiện hơn và thiết bị HPLC cũng phổ
biến ở các đơn vị kiểm tra chất lượng thuốc hơn so với
thiết bị điện di mao quản nên tính khả thi cao.
Kết luận

khảo sát các điểu kiện phân tách đối quang trực tiếp
trên các cột pha tĩnh đỗi quang có bản chất khác nhau

Phương pháp HPLC tách các đồng phân đối quang

và bước đẩu lưa chọn được điểu kiện sắc ký tương ứng

của atenolol trong một số chế phẩm thuốc bằng

với cột pha tĩnh Chirex 3022 cho phép tách được các

phương pháp HPLC với cột chọn lọc đối quang Chirex

đồng phân đổi quang của atenolol. So với kết quả

3022 [(S)-indoline-2-carboxylic acid Ẵ (R)-l-(a-naphtyl)

nghiên cứu của các tác giả Ribeiro [5] và Sonia Mo-

ethylamin] 4,0 X 250 mm; 5 ^im đã được xây dựng. Kết

rante-Zarcero [7], phương pháp phân tách các đồng

quả áp dụng trên một số chê' phẩm thuốc cho thấy, đã

phân đối quang trực tiếp bằng pha tĩnh đặc hiệu có

xây dựng thích hợp tách các đồng phân quang học R(+)

quá trình xử lý mẫu đơn giản hơn, không đòi hỏi phải

atenolol và S(-)atenolol.

Số 6/2013 Nghiên cứu dượcThông tin thuớc 1223


TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Agilent Technologies (2010), Ultron ẼS-OVM: Method development Protocol.
2. Astec (2002), Cydobond Handbook, sixth edition, Advanced Separation Technologies, Inc.

3. Chrom Tech (2011 ), Separation of chiral compounds on Chiral-AGP, Chiral-HSA, Chiral-CBH, second edition.
4. Huang J, Sun J, Zhou X, You T (2007), "Determination of atenolol and metoprolol by capillary electrophoresis with tris(2,2'-bipyridyl)
ruthenium(ii)electrochemiluminescence detection", Analytical Sciences, Vol. 23(2):183-8.
5. Ana Rita Ribeiro, Carlos Magalhães Afonso, Paula M. L. Castro, Maria Elizabeth Tiritan (2013), "Enantioselective HPLC analysis and bio­
dégradation of atenolol, metoprolol and fluoxetine”, Environmental Chemistry Letters ,Vo\. ^1 Issue 1, p.83.
6. Santoro M.l, Cho H.s (2000), "Enantiomeric separation and quantitative determination of atenolol in tablets by chiral high-perfor­
mance liquid chromatography", Drug development industrial pharmacy, Vol. 26(10), p. 1107-1110.
7. Sonia Morante-Zarcero, Isabel Sierra (2012), “Simultaneous Enantiomeric Determination of Propranolol, Metoprolol, Pindolol, and
Atenolol in Natural Waters by HPLC on New Polysaccharide-Based Stationary Phase using a Highly Selective Molecuiarly Imprinted
Polymer Extraction", Chirality, Volume 24, Issue 10, pages 860-866.
8. Stoschitzky K., et al (1993), "Stereoselective features of (R)- and (S)-atenolol: Clinical pharmacological, pharmacokinetic, and radioli­
gand binding studies", Chirality, Vol. 5(1 ), p. 15-19.
9.Torul H, Tamer

u (2011), "Determination of enantiomers of atenolol and propranolol in pharmaceutical formulations by HPIC", Jour­

nal ofAOAC International, Vol. 94(3):833-8.

Xây dựng phương pháp định lượng
Lansoprazol trong huyết tương chó
Vũ Ngọc Thắng', Nguyễn Ngọc Chiếng Trẩn Nguyên Hà^ Lương Quang Anh^
’ Trung tâm Kiểm nghiệm Nghiên cứu Dược Quân đội - Cục Quâny, ^Trường Đợi học Dược Hà Nội, ^Khoa Dược - Viện Bỏng Quốc gia

SUMMARY
A method was proposed to determine lansoprazole concentrations in dog plasma. Following a single - step liquid - liquid extraction
with tert-butyl methyl ether, lansoprazole and internal standard (pantoprazole) were separated using an isocratic mobile phase o f
0.01 M phosphate buffer (pH 8.0 adjusted with triethylamine)/acetonitrile (65:35, v/v) on reversed phase Waters symmetry 0 8 column,
ultraviolet detection at 285 nm. Linearity range was 0.05 - 3.0 ụg/mì (r > 0.9990 o f the regression line), the lower limit o f quantitation
was 50 ng/ml, mean percentage recoveries were from 97.67% to 101.02%. This method was validated with inter-day and intra-day
precision o f 2.27% - 5.96% and 3.79% - 4.82%, respectively; accuracy was from 97.50% to 101.68%. The method was successfully

applied to determine lansoprazole concentrations in dog plasma samples.

Từ khóa Lansoprazol, HPLC, huyết tương chó, thẩm định phương pháp.

Đặt Vấn đề

pháp khác nhau để định lượng LPZ trong huyết
tương nhưng phổ biến nhất là phương pháp sác

Lansoprazol (LPZ) là chất ức chế tiết acid dịch

ký lỏng hiệu năng cao [2-4, 6], ở Việt Nam chưa

vị, dùng để điểu trị viêm loét dạ dày tá tràng và các

có nghiên cứu định lượng LPZ trong huyết tương

triệu chứng trào ngược dạ dày, thực quản [1], Các

được công bố. Vì vậy để góp phán nghiên cứu sinh

tác dụng điểu trị của LPZ phụ thuộc vào nổng độ

khả dụng của viên nang LPZ, chúng tôi đã tiến

thuốc trong huyết tương (HT). Có nhiều phương

hành xây dựng phương pháp định lượng LPZ trong