NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN TRONG CHẾ PHẨM RẮN PHÂN LIỀU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC

CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
*************
NGUYỄN THỊ HẠNH
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN TRONG CHẾ PHẨM
RẮN PHÂN LIỀU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO (HPLC)
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC 2002-2007)

HÀ NỘI ,5 - 2007
BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
*******

1


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

NGUYỄN THỊ HẠNH
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN TRONG CHÊ PHẨM
RẮN PHÂN LIỀU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO (HPLC)
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC 2002- 2007)

Người hướng dẫn: TS Đoàn Cao Sơn
TS Nguyễn Hải Nam

Nơi thực hiện : Khoa kiểm nghiệm các dạng bào chế - VKN
Thời gian thực hiện: 9/2006 đến 5/2007

Hà nội, 5/ 2007

2


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại khoa kiểm nghiệm các
dạng bào chế - Viện kiểm nghiệm Bộ Y tế và bộ môn Hóa Dược trường Đại học
Dược Hà Nội. Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp tôi đã nhận được
sự giúp đỡ tận tình của các thầy hướng dẫn, các giảng viên của bộ môn Hóa
dược và các cán bộ khoa kiểm nghiệm các dạng bào chế - viện kiểm nghiệm.
Tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới :
− Tiến sĩ Đoàn Cao Sơn –Trưởng Khoa kiểm nghiệm các dạng bào chế
Viện kiểm nghiệm – Bộ Y tế.
− Tiến sĩ Nguyễn Hải Nam – Bộ môn Hóa Dược – Trường Đại học Dược
Hà nội.
− Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Thảo – Cán bộ khoa kiểm nghiệm các dạng
bào chế - Viện kiểm nghiệm – Bộ Y tế
Là những người thầy trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt chỉ bảo tôi những ý kiến
quý báu trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô các kĩ thuật viên bộ
môn Hóa Dược, các cán bộ khoa kiểm nghiệm các dạng bào chế - viện kiểm
nghiệm đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của ban Giám hiệu, phòng đào tạo
và các thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian ngồi trên ghế

nhà trường.
Tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè, và những người luôn sát cánh bên
tôi động viên và giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống.
Nguyễn Thị Hạnh
A1 K57

3


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

MỤC LỤC
BỘ Y TẾ...............................................................................................................1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI................................................................1
*************....................................................................................................1
NGUYỄN THỊ HẠNH.........................................................................................1
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN TRONG CHẾ PHẨM RẮN
PHÂN LIỀU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HPLC) 1
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC 2002-2007).....................1
HÀ NỘI ,5 - 2007.................................................................................................1
BỘ Y TẾ...............................................................................................................1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ...............................................................1
******* 1
NGUYỄN THỊ HẠNH.........................................................................................2
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN TRONG CHÊ PHẨM RẮN
PHÂN LIỀU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HPLC) 2
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC 2002- 2007)....................2
MỤC LỤC............................................................................................................4

PHẦN 1. TỔNG QUAN......................................................................................12
1.1. TỔNG QUAN VỀ CETIRIZIN [ 8, 13, 14, 15]...........................................12
1.1.1. Công thức cấu tạo....................................................................................12
1.1.2. Tính chất ..................................................................................................14
1.1.3. Tác dụng dược lý ......................................................................................14
1.1.4. Tác dụng không mong muốn.....................................................................15
1.1.5. Chỉ định.....................................................................................................15

4


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

1.1.6. Một số chế phẩm ......................................................................................15
1.1.7. Các phương pháp định lượng [ 7, 9, 10, 11, 12]......................................16
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HPLC)[3, 4, 5, 6, 16, 17, 18, 19, 20]..................................................................17
1.2.1. Khái niệm sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)..........................17
1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký ..............................................................18
1.2.3. Cơ sở lý thuyết sắc ký ...............................................................................19
1.2.4. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC...................................................19
1.2.5. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hưởng...21
1.2.6. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký...................................25
1.2.7. Ứng dụng của HPLC................................................................................29
PHẦN 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG TIỆN
NGHIÊN CỨU....................................................................................................32
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .....................................................................32
2.2. PHƯƠNG TIỆN, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT................................................32
2.2.1. Hóa chất....................................................................................................32
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................33

2.3. NỘI DUNG..................................................................................................33
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................34
2.4.1. Các thông số thống kê đặc trưng để xử lý kết quả nghiên cứu.................34
2.4.2. Cách đánh giá kết quả .............................................................................34
PHẦN 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ........................................................36
3.1. XÂY DỰNG ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN TRONG CHẾ PHẨM
36
3.1.1. Nghiên cứu lựa chọn sắc ký .....................................................................36
3.1.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký ...........................................43
3.1.3. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp.................................................44

5


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

3.1.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp .....................................................46
3.1.5. Khảo sát độ đúng của phương pháp:........................................................49
3.2. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN TRONG CHẾ PHẨM ...............................54
3.3. BÀN LUẬN VỀ KẾT QUẢ.................................................................................57
KẾT LUẬN........................................................................................................59
PHỤ LỤC...........................................................................................................60
MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ VÀ PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI THU ĐƯỢC TRONG
CHƯƠNG TRÌNH THỰC NGHIỆM.................................................................60
61
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................74
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT...........................................................74
TÀI LIỆU THAM KHẢO NƯỚC NGOÀI........................................................75

6

CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

BỘ Y TẾ...............................................................................................................1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI................................................................1
*************....................................................................................................1
NGUYỄN THỊ HẠNH.........................................................................................1
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN TRONG CHẾ PHẨM RẮN
PHÂN LIỀU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HPLC) 1
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC 2002-2007).....................1
HÀ NỘI ,5 - 2007.................................................................................................1
BỘ Y TẾ...............................................................................................................1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ...............................................................1
******* 1
NGUYỄN THỊ HẠNH.........................................................................................2
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN TRONG CHÊ PHẨM RẮN
PHÂN LIỀU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HPLC) 2
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC 2002- 2007)....................2
MỤC LỤC............................................................................................................4
PHẦN 1. TỔNG QUAN......................................................................................12
1.1. TỔNG QUAN VỀ CETIRIZIN [ 8, 13, 14, 15]...........................................12
1.1.1. Công thức cấu tạo....................................................................................12
1.1.2. Tính chất ..................................................................................................14
1.1.3. Tác dụng dược lý ......................................................................................14
1.1.4. Tác dụng không mong muốn.....................................................................15
1.1.5. Chỉ định.....................................................................................................15
1.1.6. Một số chế phẩm ......................................................................................15

1.1.7. Các phương pháp định lượng [ 7, 9, 10, 11, 12]......................................16

7


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
(HPLC)[3, 4, 5, 6, 16, 17, 18, 19, 20]..................................................................17
1.2.1. Khái niệm sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)..........................17
1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký ..............................................................18
1.2.3. Cơ sở lý thuyết sắc ký ...............................................................................19
1.2.4. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC...................................................19
1.2.5. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hưởng...21
1.2.6. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký...................................25
1.2.7. Ứng dụng của HPLC................................................................................29
PHẦN 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG TIỆN
NGHIÊN CỨU....................................................................................................32
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .....................................................................32
2.2. PHƯƠNG TIỆN, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT................................................32
2.2.1. Hóa chất....................................................................................................32
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................33
2.3. NỘI DUNG..................................................................................................33
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................34
2.4.1. Các thông số thống kê đặc trưng để xử lý kết quả nghiên cứu.................34
2.4.2. Cách đánh giá kết quả .............................................................................34
PHẦN 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ........................................................36
3.1. XÂY DỰNG ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN TRONG CHẾ PHẨM
36
3.1.1. Nghiên cứu lựa chọn sắc ký .....................................................................36

3.1.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký ...........................................43
3.1.3. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp.................................................44
3.1.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp .....................................................46
3.1.5. Khảo sát độ đúng của phương pháp:........................................................49

8


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

3.2. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CETIRIZIN TRONG CHẾ PHẨM ...............................54
3.3. BÀN LUẬN VỀ KẾT QUẢ.................................................................................57
KẾT LUẬN........................................................................................................59
PHỤ LỤC...........................................................................................................60
MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ VÀ PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI THU ĐƯỢC TRONG
CHƯƠNG TRÌNH THỰC NGHIỆM.................................................................60
61
TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................74
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT...........................................................74
TÀI LIỆU THAM KHẢO NƯỚC NGOÀI........................................................75

9


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

ĐẶT VẤN ĐỀ
Dị ứng là tình trạng tổn thương và rối loạn bệnh lý điển hình thể hiện
phản ứng miễn dịch của cơ thể với các dị nguyên. Nhưng con người sống trong
môi trường và luôn phải chịu tác động yếu tố ngoại cảnh vì vậy dị ứng rất dễ xảy

ra, có thể xảy ra với mọi đối tượng khác nhau. Để điều trị các rối loạn trên một
nhóm thuốc kháng histamin ra đời với tác dụng kháng histamin trên thụ thể H 1.
Nhưng các thuốc trước đây khi sử dụng luôn gây khó khăn cho con người trong
công việc và sinh hoạt do tác dụng phụ gây buồn ngủ, cùng việc sử dụng liều
nhiều lần trong ngày. Kháng histamin thế hệ 2 ra đời là một giải pháp hữu hiệu
khắc phục nhược điểm trên nên kháng histamin thế hệ 2 nhanh chóng được sử
dụng rộng rãi và phổ biến trong đó điển hình có cetirizin [1, 8].
Cetirizin là kháng histamin có tác dụng mạnh, kéo dài, chọn lọc trên thụ
thể H1. Hiện nay trên thị trường dược phẩm trong nước và nước ngoài có hàng
ngàn chế phẩm cetirizin được sản xuất. Chính vì vậy việc đảm bảo chất lượng
cho rất nhiều chế phẩm của một thuốc như vậy là vấn đề đáng được quan tâm.
Các dược điển European 4th, BP 2005 [9, 10] mới chỉ có chuyên luận kiểm tra
cetirizin dạng nguyên liệu mà chưa có chuyên luận kiểm tra chất lượng cetirizin
trong viên nén. Vì vậy xây dựng một phương pháp định lượng có thể dùng cho
cả dạng nguyên liệu và viên nén một cách chính thống là hết sức cần thiết.
Trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc, với sự phát triển vượt bậc của khoa
học kĩ thuật, đã có nhiều thành tựu mới được đưa vào ứng dụng đem lại cho
chúng ta những phương pháp kiểm nghiệm nhanh, đạt độ chính xác cao. Một
trong những phương pháp đó là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phương
pháp này đã được nghiên cứu và ứng dụng để định tính và định lượng có kết quả
nhiều hoạt chất trong đa dạng các loại chế phẩm.

10


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

Từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu định
lượng cetirizin trong chế phẩm rắn phân liều bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC) ” với các mục tiêu cụ thể sau:

− Nghiên cứu xây dựng, thẩm định phương pháp định lượng cetirizin
bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao, đóng góp cho ngành Dược một phương
pháp kiểm nghiệm cetirizin có tính đặc hiệu, độ chính xác cao, độ đúng cao.

11


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

PHẦN 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ CETIRIZIN [ 8, 13, 14, 15]
1.1.1. Công thức cấu tạo

12


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

N

OH

O
N

Cl

O

Công thức cấu tạo cetirizin.

Mô phỏng cấu tạo của cetirizin

13


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

Công thức phân tử : C18H25ClN2O3
Khối lượng phân tử: 461, 82
Tên khoa học: acid (RS)-2-[2[4[(4-Clorophenyl)phenylmethyl]piperazin1-yl] ethoxy]acetic.
1.1.2. Tính chất
Cetirizin có dạng bột kết tinh màu trắng, không mùi, pKa 1 = 2,9 tương
ứng pKa cuả nhóm cacboxylic; pKa2 = 8,3 tương ứng pKa nhóm amin bậc 3;
Tan tốt trong nước, đặc biệt là trong aceton và methylen clorid;
Trong phân tử cetirizin có dây nối liên hợp nên có khả năng hấp thụ ánh
sáng tử ngoại. Phổ hấp thụ của dung dịch 20µg/ml trong acid hydrochlorid R
(10,3g/l) trong giới hạn quét phổ từ 210nm đến 350 nm có cực đại hấp thụ tại
231nm với độ hấp thụ riêng 359-381.
1.1.3. Tác dụng dược lý
− Tác dụng dược lực học:
Cetirizin là chất thuộc nhóm dẫn chất của piperazin, là chất chuyển hoá
của hydroxyzin (oxy hoá nhóm chức –OH alcol thành –COOH) có tác dụng đối
kháng histamin mạnh, kéo dài và đặc biệt chọn lọc trên thụ thể H1. Cetirzin có
tác dụng an thần, gây ngủ và kháng cholinergic đều rất yếu, không kháng
serotonin. Cetirizin ức chế giai đoạn sớm của phản ứng dị ứng qua trung gian
histamin và cũng làm giảm sự di dời của các tế bào viêm. Giảm giải phóng các
chất trung gian ở giai đoạn muộn của phản ứng dị ứng. Chất này có tác dụng bảo
vệ dưỡng bào, giảm đáng kể đáp ứng hen suyễn với histamin.
− Tác dụng dược động học:

14


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

Cetirizin sau khi uống phân bố rất nhanh, nồng độ thuốc trong huyết
tương đạt được sau 30 phút đến 60 phút. Trên nghiên cứu những người tình
nguyện với 10mg cetirizin mỗi ngày, uống trong 10ngày nồng độ đỉnh huyết
tương đạt 311 ng /ml, nửa đời huyết tương xấp xỉ 11h, liên kết với protein mạnh
93%.
Thời gian bán huỷ trung bình khoảng 8,3h.
Thuốc chịu ảnh hưởng chuyển hoá của hệ enzym cytochrom 3A4P. Thuốc
được đào thải chủ yếu qua thận khoảng 70%, qua gan khoảng 10%.
1.1.4. Tác dụng không mong muốn
− Tác dụng không mong muốn xảy ra nhiều nhất là hiện tượng ngủ gà
phụ thuộc vào liều sử dụng.
− Ngoài ra thuốc có thể gây mệt mỏi, khô miệng viêm họng, chóng mặt,
buồn nôn, nhức đầu.
1.1.5. Chỉ định
− Cetirizin được chỉ định trong viêm mũi dị ứng dai dẳng, viêm mũi dị
ứng theo mùa.
− Mày đay mạn tính vô căn ở người lớn và trẻ em trên 12 tuổi. Cetirizin
chỉ định điều trị các dạng ngứa, ngứa kết hợp với tổn thương da
Theo nghiên cứu mới nhất của trường đại học ở Mỹ cetirizin có tác dụng
làm giảm các tổn thương da ở những người điều trị prednisolon
1.1.6. Một số chế phẩm
Hiện nay chế phẩm citirizine tương đối nhiều, có thể ở dạng đơn thành
phần:
− ZYRTEC viên nén 10mg

− ZYRTEC dung dịch uống 1mg/1ml lọ 75ml
− ZYRTEC dung dịch uống 10mg/ml lọ 10ml

15


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

− Chế phẩm của hãng UCB PHARM
− CETINAX viên nén 10mg
− Chế phẩm của MEDOPHARM -TENAMYD CANADA
− HICET viên nén 10mg bao phim
− Chế phẩm của công ty Micro labs limited
− CEZILviên nén 10mg bao phim
− Chế phẩm của công ty Alkem labs.
Ngoài ra cetirizin thường được kê đơn với pseudoephedrin nên có chế
phẩm kết hợp với pseudoephedrin
− ZYRTEC-D, VILIX-D chế phẩm của UCB pharma.
1.1.7. Các phương pháp định lượng [ 7, 9, 10, 11, 12]
Qua các tài liệu tham khảo ta có một số phương pháp định lượng đã được
đưa ra như sau:
∗ Phương pháp chuẩn độ acid –base [9, 10]
Cân chính xác lượng bột tương ứng với khoảng 0,1g cetirizin hoà tan
trong 100 ml dung dịch gồm 30 thể tích nước và 70 thể tích aceton. Chất chuẩn
độ dùng là dung dịch NaOH 0,1M.
1ml NaOH 0,1M tương ứng với 15,39mg C21H27Cl3N2O3
∗ Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao [7, 11, 12]
− Phương pháp 1 [7] :
+ Cột C18 (phenomenex)
+ Pha động dung dịch đệm phosphat 0,01M (1,36g KH2PO4 trong

1000ml H2O): acetonitrile tỉ lệ 70:45
+ Detector UV 230nm
+ Tốc độ dòng: 1,5ml/phút

16


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

+ Thể tích tiêm 10µl, nồng độ định lượng 20µg/ml
− Phương pháp 2 [12]:
+ Cột C18 (Nova – Pak, 300 x 4,6mm)
+ Pha động dung dịch đệm phosphat 0,067M pH=3,4: acetonitrile
(1:1;v/v)
+ Detector UV 227 nm
− Phương pháp 3 [11]:
+ Cột C18 (250 x 4,6mm; 5µm)
+ Pha động Acid orthophosphoric, pH 3,0 : acetonitril (60 : 40 )
+ Tốc độ 1,0ml/phút
+ Detector 232 nm.
1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO (HPLC)[3, 4, 5, 6, 16, 17, 18, 19, 20]
1.2.1. Khái niệm sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
a. Khái niệm về sắc ký
Sắc ký là một nhóm phương pháp hoá lý dùng để tách và phân tích các
cấu tử của những hỗn hợp phức tạp dựa vào việc sử dụng các quá trình sắc kí
khác nhau trong các điều kiện động. Sự tách các thành phần trong mẫu dựa vào
sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha là pha động và pha
tĩnh. Pha tĩnh có thể là chất rắn hay chất lỏng phủ nền chất rắn. Chất rắn được
nhồi vào trong cột hay tráng trên bản mỏng thành film. Pha động là khí hay chất

lỏng. Sự tách là do hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ [3].
b. Khái niệm về sắc kí lỏng hiệu năng cao

17


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

Phương pháp HPLC (High performance liquid chromatography) là một
phương pháp phân tách sắc ký dựa trên sự phân chia khác nhau giữa hai pha
luôn tiếp xúc không trộn lẫn vào nhau. Trong đó, pha động là chất lỏng được
đẩy qua pha tĩnh trong cột dưới áp lực của một bơm cao áp. Pha tĩnh chứa trong
cột là một chất rắn được phân chia dưới dang tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ
lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi băng liên kết hoá
học với các nhóm hữu cơ. Sắc ký lỏng phân tách dựa trên cơ chế hấp phụ, phân
bố khối lượng, trao đổi ion, loại cỡ hay tương tác hoá học trên bề mặt [3].
1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký
Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kỹ thuật nhất định. Pha tĩnh là
yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký:
Nếu pha tĩnh là bản chất hấp phụ (silicagel, nhôm oxy hoặc polyme thuần
tuý) thì ta có sắc ký hấp phụ.
Nếu pha tĩnh bản chất là silicagel có bao một lớp mỏng chất hữu cơ hoặc
đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ ta có sắc ký phân bố.
Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion ta có sắc ký trao đổi ion.
Nếu pha tĩnh là các gel, ta có sắc ký loại cỡ (sắc ký rây phân tử).
Khi đặt chất phân tích lên đầu cột ta cho pha động chạy liên tục cột ta đã
thực hiện quá trình sắc ký
Ví dụ, nếu ta nạp một hỗn hợp ba chất A, B, C vào cột tách thì khi bơm
pha đông qua cột tách các quá trình sắc ký xảy ra. Khi đó A, B, C tách ra khỏi
nhau sau khi đi qua cột tách. Yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký ở đây là

tổng hợp của các tương tác:
Tương tác giữa chất cần phân tích và pha tĩnh F 1 là lực giữ chất phân tích
trên cột.
Tương tác giữa chất phân tích và pha động F2 là lực kéo chất phân tích ra
khỏi cột.

18


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

Tương tác giữa pha tĩnh và pha động F3.
Theo sơ đồ sau:

Trong đó F1, F2 đóng vai trò quyết định, F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn
[6].
1.2.3. Cơ sở lý thuyết sắc ký
Quá trình phân tách trong phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là do
quá trình vận chuyển và phân bố chất tan giữa hai pha là khác nhau. Khi pha
động di chuyển với một tốc độ nhất định sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ
trong cột ra khỏi cột. Tuỳ theo bản chất pha động, pha tĩnh, chất tan mà quá
trình rửa giải tách đuợc các chất ra khỏi cột. Khi ra khỏi cột mỗi chất sẽ được
phát hiện và ghi lại dưới dạng pic. Tín hiệu của quá trình sắc ký cho chúng ta
sắc ký đồ. Một sắc ký đồ có một hay nhiều pic phụ thuộc vào mẫu có một hay
nhiều thành phần.
1.2.4. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC
a. Hệ thống bơm
Bơm được xem là một trong các thành phần quan trọng nhất của hệ thống
sắc ký. Bơm có tác dụng đẩy dung dịch pha động qua cột với một tốc độ hằng
định.

19


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

Có hai loại bơm
− Một loại bơm đẳng dòng (Isocratic pump)
− Hai là loại bơm chương trình dung môi và tốc độ dòng (Gradient pump)
b. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi
Bình chứa dung môi thường được làm bằng thuỷ tinh, đôi khi là thép
không gỉ. Cần lọc các hạt trong dung môi (thường dùng các màng lọc cỡ lỗ
0,45µm) và đuổi khí hoà tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi
khí). Trong phương pháp thông thường chỉ cần một bình dung môi. Trong
phương pháp gradient có thể cần đến 2, 3, 4 bình chứa dung môi.
c. Hệ tiêm mẫu
Để đưa mẫu vào cột có thể dùng bơm tiêm để tiêm vào đầu cột. Phương
pháp phổ biến là dùng van tiêm có vòng chứa mẫu (sample loop) có dung tích
xác định và chính xác, có thể thay đổi vòng chứa mẫu với các dung tích khác
nhau. Một số máy HPLC có hệ thống tiêm mẫu tự động có thể lập trình điều
khiển thể tích tiêm (microsyringe), số lần tiêm và chu kì rửa vòng chứa mẫu.
d. Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao
Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể coi là bộ phận quan trọng nhất của
hệ thống sắc ký vì ở đây xảy ra quá trình phân tách các chất. Cột có ảnh hưởng
lớn tới khả năng tách các chất cần phân tách. Cột được chế tạo bằng thép đặc
biệt trơ với hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar. Trong cột nhồi pha
tĩnh của hệ sắc ký. Cột có nhiều kích cỡ khác nhau, tuỳ mức độ và mục đích của
quá trình sắc ký. Một cột phân tích thông thường dài 10-30cm có đường kính 410mm, hạt nhồi cột cỡ 5-10µm, số đĩa lý thuyết 40.000 – 60.000 Với chất nhồi
cột cỡ 3-5µm có thể dùng các cột ngắn (3 - 7,5 cm) và nhỏ (đường kính trong 1 4, 6mm), số đĩa lý thuyết có thể lên đến 100.000 và cột này có hiệu lực rất cao.
e. Detector trong HPLC

20


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

Là bộ phận phát hiện các chất trong pha động khi nó ra khỏi cột sắc ký
liên tục. Đó là bộ phận thu nhận, phát hiện các hợp chất của chúng dựa theo một
tính chất nào đó của chất cần phân tích. Các loại detector phổ biến
− Detector UV-VIS (Utraviolet/Visible Spectrophotometric Detertor)
− Detector huỳnh quang (Fluorescence Detector)
− Detector khối phổ (Mass Spectrophometric Detector)
− Detector điện hoá (Electrochemical Detector)
− Detector tán xạ bay hơi (Evaprative Light Scattering Detector)
− Detector đo độ dẫn điện (Electrical Conductivity Detector)
− Detector đo chỉ số khúc xạ (Refractive Index Detector)
− Detector chuỗi Diod (Diod Array Detector)
f. Bộ phận ghi tín hiệu: Recorder
g. Bộ điều khiển: Computer
1.2.5. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hưởng
a. Thời gian lưu tR và thể tích lưu VR
Thời gian lưu tR (phút) là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm
mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm đến lúc
xuất hiện pic).
Nếu tR là thời gian lưu giữ của một chất thì
t R = t R' − t 0
Trong đó:
− tR’ là thời gian lưu hiệu chỉnh (thời gian lưu thực)
− t0 là thời gian chết (thời gian chất không bị lưu giữ nghĩa là tốc độ di
chuyển của chất bằng tốc độ di chuyển của dung môi).

21


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

Khi pha động chảy qua cột sắc ký với một tốc độ không đổi thì thời gian
lưu có thể thay thế bằng thể tích lưu, VR là thể tích dung môi đi qua cột cần để di
chuyển chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ.
VR = t R × Fc
Trong đó:
− VR phụ thuộc vào: tính chất pha tĩnh, bản chất của pha động, tốc F c là
thể tích pha động trong một đơn vị thời gian;
− tR và VR là các đại lượng phản ánh sự phân bố của chất tan vì vậy hai
đại độ dòng, tính chất chất tan, nhiệt độ…
b. Hệ số phân bố K
Trong quá trình sắc ký luôn có sự phân bố của các chất tan giữa pha động
và pha tĩnh. Sự phân bố này được đặc trưng bởi cân bằng phân bố với hệ số
phân bố tính theo công thức:
K=

Cs
Cm

Trong đó, Cs và Cm là nồng độ chất tan phân bố ở pha tĩnh và pha động
tương ứng, k là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình
của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển nó qua cột. K chỉ phụ thuộc vào:
bản chất của chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ.
− Nếu K lớn thì tR lớn (pic ra muộn)
− Nếu K nhỏ thì tR nhỏ (pic ra sớm)

c. Thừa số dung lượng K’
K’ là đại lượng biểu thị khả năng phân bố của chất tan trong hai pha cộng
với sức chứa của cột, tức là tỉ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng
chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng
K' =

t R − t0
V
= K. s
t0
Vm

22


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

Trong đó
− tR là thời gian lưu, to là thời gian chết.
− K’ phụ thuộc bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt độ, đặc điểm
cột, thể tích pha động và pha tĩnh.
− K’ càng lớn tốc độ di chuyển càng thấp.
Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích sao
cho: 1≤K’≤8
− Nếu K’ <1 thời gian phân tích ngắn pic ra sớm dễ lẫn với tạp
− Nếu K’ >8 thì thì gian phân tích sẽ quá dài, tốn dung môi
d. Tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất
Được đánh giá qua thừa số chọn lọc (selectivity-factor)
α=

K B tR ,B
=
K A tR , A

Để tách riêng hai chất thường chọn α = 1, 05 - 2,0. Nếu α càng lớn thì hai
chất tách nhau càng tốt, α nhỏ hai chất khó tách nhau, nhưng α qua lớn thì thời
gian phân tích sẽ quá dài.
e. Độ phân giải
Là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B)
Rs =

2.( t R , B − t R , A ) 1,18.( t R , B − t R , A )
=
W A + WB
W1 / 2 B + W1 / 2 A

Như vậy Rs phụ thuộc vào:
− Hiệu lực cột
− Thừa số chọn lọc α
− Thừa số dung lượng K’B
− Rs tối ưu ≥ 1, 5
Có thể làm tăng Rs bằng cách:
− Tăng N: Tăng chiều dài cột giảm tốc độ dòng.

23


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

− Tăng K’B: Thay đổi pha động làm Rs thay đổi lớn

− Tăng α: Thay đổi pha động hay pha tĩnh làm Rs thay đổi lớn f.
f. Hệ số bất đối AF
AF =

W
2d

Trong đó:
− W là độ rộng đáy píc đo ở 1/20 chiều cao của pic
− d là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường
cong phía trước ở 1/20 chiều cao pic.
Yêu cầu AF = 0,9 - 2,0.
Vai trò: AF càng gần 1 thì pic càng có dạng phân phối chuẩn Gauss nên
kết quả tính theo diện tích pic sẽ càng chính xác hơn.
Các yếu tố ảnh hưởng:
− pH quyết định dạng tồn tại của chất tan nên từ đó ảnh hưởng đến AF
− Cột tốt thì AF sẽ tốt
− Thể tích tiêm
Cải thiện AF
− Chọn cột phù hợp
− Điều chỉnh pH để chất tan tồn tại ở dạng thích hợp.
− Thể tích tiêm thích hợp.
g. Số đĩa lý thuyết N
N = 16.

t R2

= 5,54.

W12/ 2

t R2
W12/ 2

Số đĩa lý thuyết cho biết hiệu lực cột.
Từ công thức ta thấy N phụ thuộc vào tR và W (độ rộng pic)
Nếu tR càng lớn thì N có thể sẽ tăng, tuy nhiên thời gian phân tích kéo dài.

24


CH sè 11 - B1 - §H KTQD Chuyªn Photocopy - §¸nh m¸y - In LuËn v¨n, TiÓu luËn : 6.280.688

W (độ rộng pic ở đáy) hay W 1/2 (độ rộng pic đo ở 1/2 chiều cao) càng nhỏ
thì N càng lớn nhưng W và W1/2 sẽ nhỏ hơn khi tR nhỏ.
Khi tR cố định thì bản chất của cột, pha động, pH là các yếu tố quyết định
trong đó cột đóng vai trò quan trọng.
Để đánh giá hiệu lực cột thường tính số đĩa lý thuyết trên một đơn vị độ
dài cột :
N = 16.

t R2
WB2 .L

Khi các điều kiện khác cố định thì cột nào có số đĩa lý thuyết cao hơn cột
đó sẽ có hiệu lực cao hơn.
h. Xác định tỷ số giữa tín hiệu và nhiễu
T û sè tÝn hiÖu =

H

hn

Trong đó
− H là chiều cao pic thành phần cần quan tâm trong sắc ký đồ từ dung
dịch đối chiếu quy định (pic C).
− hn là giá trị tuyệt đối của chiều cao nhiễu lớn nhất lệch khỏi đường nền
trong khoảng sắc đồ thu được sau khi tiêm dung dịch mẫu trắng.
Khoảng sắc đồ cần quan sát có độ dài bằng 20 lần độ rộng đáy ở chiều
cao của pic C và ở điểm giữa của nó là vị trí tương đương với vị trí của pic C (vị
trí của pic thành phần cần quan tâm).
1.2.6. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký
a. Lựa chọn cột (pha tĩnh)

25