QUÁ TRÌNH XÂM NHẬP VÀ SỰ LAN TRUYỀN CỦA CỦA HPV

MỤC LỤC
MỤC LỤC.................................................................................................................... 1
MỤC LỤC HÌNH.........................................................................................................2
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................... 4
NỘI DUNG................................................................................................................... 5
CHƯƠNG I. TẦM QUAN TRỌNG CỦA VIỆC NGHIÊN CỨU HPV...............5
1.1. Vị trí phân loại của HPV trong sinh giới.....................................................5
1.2. Vai trò của HPV ...........................................................................................5
CHƯƠNG II. CÁC PHƯƠNG PHÁP HIỆN TẠI ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ
NGHIÊN CỨU HPV................................................................................................7
2.1. Quan sát bằng mắt thường...........................................................................7
2.2. PAP’s smear..................................................................................................7
2.3. Phương pháp lai phân tử sử dụng sử dụng mẫu dò trực tiếp....................9
2.4. PCR (Polymerase Chain Reaction)............................................................10
2.5. Định genotype HPV bằng kỹ thuật PCR – ELISA...................................14
2.6. Xác định genotype của HPV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản
phẩm PCR đặc hiệu...........................................................................................15
2.7. Xét nghiệm bắt mồi lai (Hybrid Capture 2 – HC2)..................................16
2.8. Real-time PCR.............................................................................................16
CHƯƠNG III: CẤU TRÚC CỦA HPV................................................................19
3.1. Cấu tạo.........................................................................................................19
3.2. Chức năng các vùng gene và protein.........................................................21
3.3. Vòng đời và đáp ứng miễn dịch..................................................................23
CHƯƠNG IV. QUÁ TRÌNH XÂM NHẬP VÀ SỰ LAN TRUYỀN CỦA CỦA
HPV......................................................................................................................... 25
4.1. Quá trình tương tác và xâm nhập vào tế bào chủ của HPVs...................25
4.1.1. Các thụ thể của HPV............................................................................25
4.1.2. Sự xâm nhập của HPV vào trong tế bào.............................................27
4.2. Sự lan truyền của HPV...............................................................................30
4.2.1. Sự lan truyền trong cơ thể...................................................................30
4.2.2. Sự lan truyền từ cơ thể này sang cơ thể khác.....................................30

CHƯƠNG V. SAO CHÉP, PHIÊN MÃ VÀ DỊCH MÃ......................................32
5.1. Sao chép.......................................................................................................32
5.2. Phiên mã......................................................................................................33
5.3. Dịch mã........................................................................................................37
9.1. Bệnh ung thư cổ tử cung.............................................................................38
9.1.1. Cơ chế gây bệnh của HPV...................................................................38
9.1.2. Các tổn thương tiền ung thư đường sinh dục.....................................40
9.2. Mụn cóc ở da...............................................................................................41
9.3. Mụn cóc hậu môn – sinh dục......................................................................42
9.4. U nhú hô hấp tái diễn..................................................................................44
9.5. U nhú miệng.................................................................................................44
KẾT LUẬN................................................................................................................46
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................47

1


MỤC LỤC HÌNH
MỤC LỤC 1
MỤC LỤC HÌNH 2
ĐẶT VẤN ĐỀ 4
NỘI DUNG 5
CHƯƠNG I. TẦM QUAN TRỌNG CỦA VIỆC NGHIÊN CỨU HPV 5
1.1. Vị trí phân loại của HPV trong sinh giới 5
1.2. Vai trò của HPV 5
CHƯƠNG II. CÁC PHƯƠNG PHÁP HIỆN TẠI ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ
NGHIÊN CỨU HPV 7
2.1. Quan sát bằng mắt thường 7
2.2. PAP’s smear 7
Hình 1. Các tế bào cổ tử cung bình thường dưới kính hiển vi 8

Hình 2. Các tế bào bất thường cổ tử cung dưới kính hiển vi 9
2.3. Phương pháp lai phân tử sử dụng sử dụng mẫu dò trực tiếp 9
Hình 3. Kỹ thuật lai phân tử 10
2.4. PCR (Polymerase Chain Reaction) 10
Hình 4. Vị trí các gen L1 và E6/E7 của HPV và độ dài sản phẩm PCR trong phát
hiện và định type HPV 12
Hình 5. Kết quả ts-PCR định type HPV type 33, 6/11, 58, 52 và 56 13
Hình 6. Kết quả ts-PCR định type HPV type 35, 42, 43 và 44 13
Hình 7. Kết quả ts-PCR định type HPV type 68, 39, 51 và 66 13
Hình 8. Kết quả ts-PCR định type HPV type 16, 18, 31, 59 và 45 13
Hình 9. Phát hiện và định type HPV bằng kỹ thuật NM – PCR 14
2.5. Định genotype HPV bằng kỹ thuật PCR – ELISA 14
2.6. Xác định genotype của HPV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản
phẩm PCR đặc hiệu 15
2.7. Xét nghiệm bắt mồi lai (Hybrid Capture 2 – HC2) 16
2.8. Real-time PCR. 16
CHƯƠNG III: CẤU TRÚC CỦA HPV 19
3.1. Cấu tạo 19
Hình 11. Cấu trúc của HPV 19
Hình 12. Cấu trúc L1, L2 của HPV 20
3.2. Chức năng các vùng gene và protein 21
Hình 13. Cấu trúc gene DNA của HPV 16 22
3.3. Vòng đời và đáp ứng miễn dịch 23
CHƯƠNG IV. QUÁ TRÌNH XÂM NHẬP VÀ SỰ LAN TRUYỀN CỦA CỦA
HPV 25
4.1. Quá trình tương tác và xâm nhập vào tế bào chủ của HPVs 25
4.1.1. Các thụ thể của HPV 25
4.1.1.1. Thụ thể α6 intergrin 25
2

Hình 14. Sơ đồ cấu tạo của thụ thể α6 intergrin 25
4.1.1.2. Thụ thể Heparan sulfate proteoglycans (HSPGs)/Heparan
sulfate 26
Hình 15. Sơ đồ HSPG và HS 26
4.1.2. Sự xâm nhập của HPV vào trong tế bào 27
4.1.2.1. Nhập bào qua trung gian là clathrin 27
Hình 16. Sơ đồ cấu trúc của Clathrin 27
4.1.2.2. Nhập bào qua trung gian caveolae 27
Hình 17. Sơ đồ cấu trúc của Caveolae 28
Hình 18. Sơ đồ các con được xâm nhập vào tế bào của HPVs 29
4.2. Sự lan truyền của HPV 30
4.2.1. Sự lan truyền trong cơ thể 30
4.2.2. Sự lan truyền từ cơ thể này sang cơ thể khác 30
Hình 19. HPV tấn công tế bào cổ tử cung 31
CHƯƠNG V. SAO CHÉP, PHIÊN MÃ VÀ DỊCH MÃ 32
5.1. Sao chép 32
5.2. Phiên mã 33
Hình 20. Sơ đồ biểu hiện của những gene sớm papillomavirus16 ở biểu mô tế bào
cổ tử cung W12 34
Hình 21. Phát hiện mRNA được mã hóa từ các gene muộn ở tế bào W12 35
Hình 22. Sơ đồ các promoter ở HPV16 36
Hình 23. ESE, ESS, các nhân tố điều khiển adenyl hóa 36
Hình 24. Các mRNA tạo ra từ genome HPV 37
5.3. Dịch mã 37
9.1. Bệnh ung thư cổ tử cung 38
9.1.1. Cơ chế gây bệnh của HPV 38
Hình 25. Cơ chế sinh ung thư của HPV 39
Hình 26. Các giai đoạn xâm lấn của HPV 40
9.1.2. Các tổn thương tiền ung thư đường sinh dục 40

Hình 27. Diễn tiến tự nhiên của nhiễm HPV nguy cơ cao và khả năng tiến triển
thành ung thư cổ tử cung 41
9.2. Mụn cóc ở da 41
9.3. Mụn cóc hậu môn – sinh dục 42
9.4. U nhú hô hấp tái diễn 44
9.5. U nhú miệng 44
KẾT LUẬN 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

3


ĐẶT VẤN ĐỀ
Virus gây u nhú ở người (Human Papilloma Virus – HPV) là nguyên nhân
chủ yếu gây ung thư cổ tử cung cho phụ nữ. Các nhà khoa học đã tìm thấy HPV
trong 99,7% các trường hợp ung thư tế bào gai ở cổ tử cung. HPV cũng là nguyên
nhân gây ra mụn cơm hay những nốt sần ở vùng sinh dục. Có hơn 100 chủng
HPV nhưng chỉ có 15 chủng gây ung thư cổ tử cung, trong đó hai chủng 16 và 18
là nguyên nhân gây ra hơn 70% các trường hợp ung thư cổ tử cung.
Có khoảng 100 loại HPV, trong 40 loại gây bệnh ở cơ quan sinh dục con người,
có 15 loại được liệt vào hạng "độc" tạo nguy cơ cho sức khỏe. Hai loại thông thường
nhất là HPV-16 và HPV-18 có khả năng nhiễm sâu vào cổ tử cung phụ nữ (3-10%),
sau đó làm thay đổi mô tử cung và gây bệnh ung thư cổ tử cung. Ngoài ra HPV
loại độc cũng là nguyên nhân gây ung thư âm đạo, ung thư âm hộ, ung thư hậu
môn, ung thư dương vật, ung thư đầu và cổ. Loại ít độc hơn, HPV-6 và HPV-11,
có thể gây 90% chứng mụn cóc (mào gà) của cơ quan sinh dục. Loại nhẹ gây
chứng mụn cóc ở tay (HPV-2) và bàn chân (HPV-1).
Mặc dù tỷ lệ gây bênh không cao nhưng HPV dễ dang lây lan và không biểu hiện
triệu chứng cụ thể trong nhiều năm liền nên việc phòng bệnh là rất khó khăn. Do đó
cần có những hiểu biết đầy đủ về các thông tin cần thiết về HPV và bệnh do

chúng gây ra để có ý thức trong việc ngăn ngừa và kiểm soát nguồn bệnh.

4


NỘI DUNG
CHƯƠNG I. TẦM QUAN TRỌNG CỦA VIỆC NGHIÊN CỨU HPV
1.1. Vị trí phân loại của HPV trong sinh giới
Virus papilloma ở người (HPV) là một loại siêu vi trùng dạng DNA, rất hay lây,
và có khả năng gây nhiều chứng bệnh từ nhẹ đến trầm trọng.
Phân loại virus:
- Nhóm: I (dsDNA)
- Bộ (ordo): không xếp
- Họ (Family): Papillomaviridae
- Chi (Genus): Alphapapillomavirus
- Các chi:
Alphapapilloma
Betapapilloma
Gammapapilloma
Mupapilloma
Nupapilloma
Có nhiều hơn 100 type HPV có vai trò gây bệnh liên quan đến bệnh lý da và
niêm mạc và khoảng 40 type có tác động lên đường sinh dục, đặc biệt liên quan đến
bệnh lý ung thư cổ tử cung. Nhóm được gọi là nguy cơ cao bao gồm các type 16
(HPV-16), 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 59, 66 và HPV-68. Các type HPV-6, 11,
42, 43, 44 được gọi là nhóm nguy cơ thấp.
1.2. Vai trò của HPV
Theo điều tra của Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế, tỉ lệ nhiễm HPV của phụ
nữ toàn cầu dao động trong khoảng 9-13%, nghĩa là cứ 10 phụ nữ có 1 người nhiễm
HPV. Ở Việt nam nếu chỉ tính riêng ung thư cổ tử cung thì số người chết vì HPV đã

cao hơn nhiều so với HIV. Trong 10 năm qua có khoảng 6.000 phụ nữ chết vì ung thư
cổ tử cung cao gấp đôi so với phụ nữ chết vì HIV/AIDS; mặc dù khác với HIV, các
tổn thương do HPV, thậm chí ung thư do HPV có thể chữa khỏi hoàn toàn nếu được
phát hiện sớm. Tuy nhiên thực tế ở Việt Nam, phần lớn bệnh nhân ung thư cổ tử cung
chỉ được phát hiện ở giai đoạn cuối, vài năm trước khi qua đời.
Human Papilloma Virus (HPV) thuộc họ Papillomaviridae. HPV được lây truyền
qua da và phổ biến nhất là qua đường tình dục và tất nhiên những nơi có tiếp xúc trực
5


tiếp hay gián tiếp như âm đạo, cổ tử cung, hậu môn, đường niệu, bàng quang, miệng,
mắt… sờ mó, hôn, đồng tính luyến ái, gây lây nhiễm qua niêm mạc miệng và từ đó
xâm nhập vào cơ thể. Người bị nhiễm HPV có thể biểu hiện lâm sàng là các thương
tổn tại chỗ với trạng thái tăng sinh nội mô biểu bì thuộc nhiều dạng khác nhau như sùi
niêm mạc, viêm, xơ cứng biểu mô, khối u papilloma vùng sinh dục, vùng hầu họng,
dạng tăng sinh tế bào keratin. Hầu như mọi type HPV đều có biểu hiện đặc trưng liên
quan đến papilloma vùng sinh dục như condyloma, u xơ và u mềm cổ tử cung …
HPV là một trong những tác nhân lây nhiễm qua đường tình dục phổ biến. Biểu
hiện lâm sàng là hình ảnh u sùi điển hình vùng hậu môn – sinh dục như âm hộ, âm
đạo, trực tràng, vùng hậu môn, dương vật và u sùi vùng hầu họng đặc biệt là ung thư
cổ tử cung. Hiện nay nguyên nhân gây nên ung thư cổ tử cung đã được biết một cách
rõ ràng là do HPV gây ra. HPV được chia làm hai nhóm, nhóm nguy cơ cao và nguy
cơ thấp (về tính gây ung thư). Nhóm nguy cơ cao có liên quan trực tiếp đến bệnh lý
ung thư chúng được phát hiện có mặt trên 90% các trường hợp ung thư cổ tử cung
(ung thư tế bào lát hay ung thư tế bào tuyến), trái lại nhóm nguy cơ thấp thì hiếm gặp
trong trong các trường hợp ung thư. Tần suất lưu hành HPV cao trong cộng đồng, 611% ở người bình thường (có tài liệu báo cáo là >20%).

6

CHƯƠNG II. CÁC PHƯƠNG PHÁP HIỆN TẠI ĐƯỢC SỬ
DỤNG ĐỂ NGHIÊN CỨU HPV
2.1. Quan sát bằng mắt thường
Quan sát bằng mắt thường với iodine Lugol (VILI): VILI cũng dùng tương tự
như VIA nhưng có bôi dung dịch iodine Lugol lên cổ tử cung và sau đó xem có vùng
nào không bám màu. VILI cho thấy ngay kết quả, tại Ấn Độ và Châu Phi, các kết quả
của phương pháp này đã được đánh giá bằng phương pháp soi cổ tử cung và type cho
kết quả tốt (42, 48, 50, 51). Các phát hiện không hoàn toàn chính xác nhưng phương
pháp này có thể kết hợp với Pas Stream và Hybrid capture để tăng độ chính xác hơn
bất kỳ xét nghiệm đơn lẻ nào. Tuy nhiên độ nhạy và độ đặc hiệu còn hạn chế.
Quan sát bằng mắt với acid acetic (VIA): có thể là biện pháp thay thế cho xét
nghiệm tế bào. Với phương pháp VIA dung dịch acid acetic 3-5% được bôi lên cổ tử
cung và quan sát bằng mắt thường sau 1 phút. Nếu quan sát thấy các vùng bị trắng gần
khu vực chuyển tiếp thì xét nghiệm này được coi là dương tính đối với các tế bào tiền
ung thư hoặc ung thư xâm lấn sớm. Ưu điểm: không tốn kém, nhanh, không đòi hỏi kỹ
thuật cao, độ đặc hiệu 64%-98%, độ nhạy của VIA (66%-98%) tốt bằng hoặc tốt
hơn độ nhạy của Pap smear, nhưng cũng giống như Pap smear, kiểm tra
bằng mắt thường là rất chủ quan, và cần phải giám sát để kiểm soát chất
lượng của các phương pháp kiểm tra bằng mắt thường.
2.2. PAP’s smear
Năm 1928, George Nicolas Papanicolaou – một bác sĩ người Hy Lạp giới thiệu
những phát hiện mới của mình về một phương pháp chẩn đoán ung thư mới với tựa đề
bài báo là "New Cancer Diagnosis" (Phương pháp chẩn đoán ung thư mới). Cũng từ
năm này, Papanicolaou đến và làm việc tại Hoa Kỳ. Tại đây, năm 1939, ông cùng với
một đồng nghiệp của mình là bác sĩ Herbert Traut, một nhà bệnh học về phụ khoa, làm
phết tế bào âm đạo cho nhiều bệnh nhân, và từ đó chứng minh khả năng chẩn đoán
ung thư cổ tử cung ở giai đoạn sớm của phương pháp này.
Năm 1943, họ giới thiệu những kết quả nghiên cứu của mình trong một bài báo
nổi tiếng "Diagnosis of Uterine Cancer by the Vaginal Smear" (Chẩn đoán ung thư tử
cung bằng phết tế bào âm đạo). Từ đó, phương pháp này được gọi theo tên của người

đã khởi xướng nó – xét nghiệm Pap.
7


Từ đó đến nay, phương pháp làm xét nghiệm này đã có nhiều cải tiến để tăng tính
chính xác và hiệu quả, và hiện được dùng rất rộng rãi để tầm soát ung thư cổ tử cung.
Cũng cần biết rằng đây là xét nghiệm chỉ dùng để tầm soát, mà không dùng để chẩn
đoán và chỉ áp dụng với ung thư cổ tử cung chứ không phải dùng cho “ung thư tử
cung” như bài báo mà Papanicolaou đã viết.
Tại Việt Nam, trước đây xét nghiệm này thường được gọi tên là phết mỏng tế bào
âm đạo, nhưng tên gọi trên không chính xác vì thực chất là lấy tế bào của cổ tử cung
chứ không phải của âm đạo, nên một số tài liệu mới gần đây đã gọi xét nghiệm này là
phết tế bào cổ tử cung, hoặc phết mỏng tế bào cổ tử cung, hoặc cũng gọi tắt là xét
nghiệm Pap.
Nguyên lý dựa trên tính chất bong ra một cách tự nhiên, liên tục của tế bào âm
đạo, cổ tử cung, đặc biệt là các tế bào bất thường thì tính bong sớm và rất dễ bong.
Phân tích hình thái học chi tiết người ta cho rằng dấu hiệu của tế bào bị nhiễm
HPV là sẽ bị biến đổi thành các dạng tế bào đa nhân, tế bào đa nhân khổng lồ, hoặc
nhân teo lại, hay có thể tìm thấy tế bào bóng, tế bào có vòng sáng quanh nhân …

Hình 1. Các tế bào cổ tử cung bình thường dưới kính hiển vi

8


Hình 2. Các tế bào bất thường cổ tử cung dưới kính hiển vi
* Cách thực hiện
- Dùng que Ayre đặt áp vào ỗ cổ tử cung
- Trải đều tế bào lên lame kính
- Cố định mẫu trong dung dịch cồn + ether hoặc xịt một lớp keo mỏng lên bề mặt

lame.
Phương pháp PAP’s smear có độ nhạy 44 – 78% và độ đặc hiệu cao 91 – 96%,
đơn giản, rẻ tiền, không gây tác động trên người được làm, dễ áp dụng đại trà. Tuy
nhiên phương pháp này cũng có tỉ lệ âm tính giả, theo các tác giả giao động từ 1,1 –
29,7%.
2.3. Phương pháp lai phân tử sử dụng sử dụng mẫu dò trực tiếp
Để phân tích kiểu gene của HPV, người ta sử dụng kỹ thuật Southern Blot (là
kỹ thuật được sử dụng trong nghiên cứu đầu tiên về HPV). Phương pháp lai tại chỗ (là
kỹ thuật gần giống với phương pháp hoá mô miễn dịch, người ta đánh giá sự biểu hiện
của kháng nguyên trong điều kiện của mô học bệnh lý).

9


Hình 3. Kỹ thuật lai phân tử
Nhược điểm của phương pháp này là độ nhạy thấp, tốn nhiều thời gian và cần
một lượng lớn DNA tinh khiết cao. Đối với các mô được cố định sự liên kết chéo của
DNA do có xúc tác bởi formol gây ra sự thoái hoá của DNA hoặc tế bào hư hại.
2.4. PCR (Polymerase Chain Reaction)
Với PAP’s smear ta có thể nói có hay không tổn thương nghi ngờ ác tính hay
không ác tính trên cổ tử cung. Ngày nay nhờ sự phát triển của sinh học phân tử, đặc
biệt là kỹ thuật PCR cho phép nhận biết chính xác có nhiễm HPV hay không và nhiễm
type nào để tìm thấy nguy cơ cao hay thấp có khả năng dẫn đến ung thư cổ tử cung.
PCR dương tính không có nghĩa là ung thư cổ tử cung, việc nhận định có nhiễm HPV
hay không nhiễm không nói được tình trạng mô học hay tế bào học của cổ tử cung mà
chỉ có thể nói rằng người được thử đang trong tình trạng nhiễm HPV.
Ứng dụng từ nhiều nghiên cứu đã được công bố trên thế giới kỹ thuật PCR đã được
triển khai thực hiện và áp dụng tại Bệnh viện Phong Da liễu Trung ương Quy Hòa để
phát hiện và định type HPV. Phản ứng chuỗi Polymerase là một dụng cụ có giá trị vì
nó cho phép các vùng gene đặc hiệu của DNA nhân lên trong ống nghiệm. Điều này

làm cho chủng có thể được phát hiện với số lượng lớn như hầu hết các trường hợp
nhiễm virus khác. Với các ưu điểm đó, việc ứng dụng quy trình kỹ thuật PCR để phát
hiện DNA của HPV trong mẫu bệnh phẩm dịch phết cổ tử cung.

10


- Đầu tiên người ta tách chiết DNA từ mẫu dịch phết tế bào cổ tử cung. PCR đặc
hiệu theo nhóm (gs-PCR: Group–specific PCR) phát hiện nhiều type HPV cùng một
nhóm. Sử dụng cặp mồi chung (consensus primers) là MY09 và MY11 có trình tự: (5’GCG ACC CAA TGC AAA TTG GT- 3’) và (5’- GAA GAG CCA AGG ACA GGT
AC-3’), có khả năng khuếch đại đoạn DNA đích có độ dài 450 cặp nucleotide, nằm
trên gen L1 (gen cấu trúc nằm trên vỏ capsid của HPV).
- Để tăng tuyệt đối độ nhạy của phản ứng PCR cặp mồi thứ hai cũng được sử dụng
cho kỹ thuật nested PCR là cặp mồi GP5 + và GP6+ có trình tự: (5’- TTT GTT ACT
GTG GTA GAT ACT AC-3’) và (5’ – GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT3’), cặp mồi này khuếch đại một đoạn DNA nằm trong trong đoạn DNA sản phẩm của
PCR lần I từ cặp mồi MY9 và MY11, có độ dài 150 cặp nucleotide.
- PCR đặc hiệu cho từng type HPV (ts-PCR: type specific PCR), việc định type
HPV dựa vào sự khác nhau về trình tự các nucleotid trên gen E6/E7 (gen gây ung thư oncogenes) có khả năng tổng hợp protein gây ung thư, do đó nó có khả năng quyết
định tính gây bệnh của virus và chúng có mức độ biến đổi khác nhau.

11


Hình 4. Vị trí các gen L1 và E6/E7 của HPV và độ dài sản phẩm PCR trong phát hiện
và định type HPV
- Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho từng type bao gồm các type được gọi là nguy
cơ cao là: HPV type 16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 và 68. Các type được
gọi là nguy cơ thấp là: HPV type 6-11, 42, 43 và 44.
- Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên gel agarose. Thời gian xét
nghiệm: 3 – 4 giờ.

12


Hình 5. Kết quả ts-PCR
định type HPV
type 33, 6/11,
58, 52 và 56

Hình 6. Kết quả ts-PCR
định type HPV
type 35, 42, 43
và 44

Hình 7. Kết quả ts-PCR
định type HPV
type 68, 39, 51
và 66

Hình 8. Kết quả ts-PCR
định type HPV
type 16, 18, 31,
59 và 45

13


Hình 9. Phát hiện và định
type HPV bằng
kỹ thuật NM –
PCR

Kỹ thuật Nested-Multiplex PCR (NM-PCR) cũng được ứng dụng, hỗn hợp phản
ứng PCR bao gồm đồng thời 3 – 4 cặp mồi sao cho sản phẩm PCR có độ dài khác biệt
để có thể phân biệt được trên thạch điện di. Kỹ thuật đòi hỏi nghiêm ngặt các điều kiện
về nhiệt độ, nồng độ các thành phần của hỗn hợp PCR và việc chọn lựa các cặp mồi để
phản ứng khuếch đại đặc hiệu có thể xảy ra.
Phản ứng PCR với ưu điểm là độ nhạy: hơn 90%, cần 5 DNA; giá trị tiên đoán
âm: 99%; xác định được type; giá thành tương đối rẻ (200.000đ đến 1.000.000đ;
nhưng chưa được FDA chứng nhận và tốn thời gian). Xét nghiệm PCR ngày nay được
khuyến cáo sử dụng kèm với xét nghiệm PAP’s smear nhằm nâng cao khả năng sàng
lọc các trường hợp nghi ngờ, giúp theo dõi bệnh chặt chẽ hơn và có hiệu quả thật sự
trong tầm soát ung thư cổ tử cung.
2.5. Định genotype HPV bằng kỹ thuật PCR – ELISA
Sử dụng sản phẩm của phẩm Công ty Khoa Nam, mẫu bệnh phẩm cho lai lai với
9 mẫu dò đặc hiệu genotype là 16, 18, 31, 33, 35, 39/45, 6/11.
- Trích ly DNA – HPV từ mẫu bệnh phẩm: sử dụng dung dịch PROKPREP là
proteinase K/detergent để thủy phân protein bám trên DNA của virus, sau đó ly trích
DNA.
- Phát hiện DNA – HPV : phản ứng PCR sử dụng mồi MY09, MY11 (Invitrogen)
và dUTP có gắn DIG (Roche) được pha với nồng độ thích hợp để khuếch đại đoạn gen
đặc hiệu dài 450bp trên vùng L1 của HPV (sản phẩm PCR có gắn DIG trong suốt quá
trình thực hiện). Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2%, kết quả được dương tính
khi vạch khuếch đại rõ nét ở vị trí 450 bp.

14


- Xác định genotype của HPV: những mẫu HPV – DNA dương tính được tiến
hành xác định genotype như sau: biến tính sản phẩm PCR (HPV dương tính) ở 95 0C,
trong 10 phút. Sản phẩm sau biến tính được giữ ngay trong đá (để duy trì tình trạng

biến tính). Sản phẩm này được đem lai trong các giếng ELISA (có đoạn dò đặc hiệu
cho từng genotype của HPV đã được gắng trên các giếng ELISA). Sản phẩm lai được
được phát hiện bằng cộng hợp là anti-DIG gắng HRPO, phức hợp này được phát hiện
bằng chất hiện màu TMP. Kết quả được đọc ở bước sóng 450nm. Khi OD của giếng
có giá trị > OD của giếng chứng âm và có trị số cao nhất so với OD của các giếng khác
trong cùng một mẫu thì là kiểu gen của mẫu. Nếu tất cả các giếng có OD < OD của
giếng chứng âm thì kết luận là mẫu dương tính với HPV nhưng với kiểu gen khác với
kiểu gen 16, 18, 31, 33, 35, 39/45, 6/11.
Ưu, nhược điểm: phát hiện và định vị genotype trong các mẫu quệt cổ tử cung là
xét nghiệm rất cần thiết để chuẩn đoán, phát hiện sớm ung thư và để dùng vaccine
phòng ngừa kịp thời. Mặc dù phương pháp PCR – ELISA hữu hiệu để phát hiện và
định genotype HPV nhưng phương pháp này bị giới hạn số genotype cần xác định vì
phụ thuộc vào đoạn dò đặc hiệu cho từng genotype.
/>2.6. Xác định genotype của HPV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản
phẩm PCR đặc hiệu
Hiện nay, công ty Nam Khoa đã có kit PCR – ELISA để phát hiện và định
genotype HPV và kit này đã triển khai sử dụng khá hữu hiệu tại một số phòng thí
nghiệm tại thành phố Hồ Chí Minh. Tuy nhiên hãy còn một tiếp cận khác để có thể
định được genotype HPV, đó là sử dụng phương pháp giải trình tự để giải trình tự trực
tiếp sản phẩm PCR đặc hiệu vùng gen L1 của HPV và so sánh trình tự này trên thư
viện trình tự các genotype của HPV, nhờ vậy mà có thể cho được kết quả genotype
HPV.
Mẫu bệnh phẩm được đem PCR mồi MY09 và MY11 (Invitrogen) và dUTP để
khuếch đại đoạn gen đặc hiệu dài 450bp trên vùng L1 của HPV. Điện di sản phẩm
PCR trên gel agarose 2%, kết quả được dương tính khi vạch khuếch đại rõ nét ở vị trí
450 bp. Sản phẩm PCR có kết quả dương tính được làm sạch để loại bỏ dimer primer,
thành phần không sử dụng của PCR mix. Sản phẩm PCR tinh sạch được định lượng
bằng quang phổ và điện di lại trên gel agarose 2% để chắc chắn loại bỏ primer dimer.
15

Sau đó thực hiện phản ứng chu kỳ giải trình tự với bộ mồi MY09 và MY11 bằng máy
giải trình tự và phân tích bằng phần mềm sequences analysis. Sau khi giải trình tự, tiến
hành định genotype của trình tự bằng 2 cách: (1) đăng nhập trình tự giải được trên
NCBI Blast để chương trình so sánh trình tự đăng nhập với trình tự trong genbank và
hiển thị kết quả so sánh; (2) xây dựng một thư viện các trình tự của các genotype tham
chiếu của HPV cho thư viện này vào các thư viện của chương trình Bio-Edit, sau đó
dùng phần mềm này để đăng nhập trình tự giải được với trình tự đã đăng nhập.
Mặc dù kỹ thuật PCR-ELISA phát hiện và định genotype HPV ứng dụng được
trong nghiên cứu và chuẩn đoán, tuy nhiên với phương pháp bị giới hạn một số
genotype. Phương pháp giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR khá tốn kém, phức tạp,
mất nhiều thời gian, nhưng phương pháp này giúp ta có thể xác định được hầu hết các
genotype.
2.7. Xét nghiệm bắt mồi lai (Hybrid Capture 2 – HC2)
Hybrid Capture 2 hoạt động trên nguyên tắc khuếch đại tín hiệu, dùng probes là
sợi đơn RNA (1kb) thuận tiện cho cả bắt mồi và phát hiện DNA HPV mục tiêu. Tiếp
theo làm biến tính DNA mục tiêu và lai với probe (lai RNA – DNA trên màng chứa
anti đặc hiệu ở nhiệt độ phòng). Sau đó phosphatase kiềm đánh dấu kháng thể đơn
dòng anti – RNA – DNA (liên quan với captured hybrids). Acid nucleic không được
lai (gồm DNA mục tiêu và probe) được rửa bỏ. Sản phẩm sau khi lai và đánh dấu bằng
phosphatase kiềm được phát hiện phát quang hóa học, đo luminometer.
Xét nghiệm có thể phát hiện 13 loại HPV (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56,
58, 59 và 68) nhạy hơn phương pháp quan sát bằng mắt thường và tế bào học, với độ
nhạy trên 90%; giá trị tiên đoán âm: 99% nhưng độ đặc hiệu thấp: 87%; không xác
định được type; ít nhạy hơn PCR, cần 5000 DNA và giá thành đắt, tuy nhiên xét
nghiệm này được Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) chấp thuận.
2.8. Real-time PCR.
Tách chiết DNA và tiến hành phản ứng real–time PCR. Hiện nay có 4 kiểu
phản ứng được sử dụng trong kỹ thuật real–time. Cả 4 kiểu phản ứng đều sử dụng các
chất nhuộm huỳnh quang (flourescent dye), có sự kết hợp bước nhân bản và phát hiện

sản phẩm PCR mục tiêu theo thời gian thật (Realtime) của phản ứng.

16


Người ta dựa vào đặc tính exonuclease 5’ – 3’ của Taqman polymerase để hình
thành phương pháp. Probe Taqman được gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ và
một chất “dập tắt” ở đầu 3’, sao cho ánh sáng huỳnh quang của chất phát huỳnh quang
bị hấp thu bởi chất “dập tắt”. Khi còn nguyên vẹn tín hiệu của chất phát huỳnh quang
bị hấp thụ do chúng nằm gần chất hấp thụ. Trong giai đoạn kết hợp bắt cặp và kéo dài
DNA trong phản ứng khuếch đại, probe liên kết với trình tự đích và hoạt động 5’ – 3’
exonuclease đặc hiệu cho DNA mạch đôi của Tapman sẽ cắt đứt đầu gắn chất huỳnh
quang. Kết quả chất phát huỳnh quang tách rời khỏi chất hấp thụ và tín hiệu huỳnh
quang phát ra tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch đại trong mẫu.

Hình 10. Phản ứng Taqman probe
Các xét nghiệm sử dụng kỹ thuật realtime PCR với công nghệ hiện đại nhất
hiện nay, do đó các kết quả định lượng đều là định lượng chính xác. Các phương
pháp định lượng dựa trên kỹ thuật PCR – Điện di hoặc giải trình tự chỉ mang tính
chất tương đối không chính xác. So với PCR – Điện di và nhất là Nested PCR –
Điện di, kỹ thuật realtime PCR sẽ tránh được nhược điểm lớn nhất của PCR là
17


ngoại nhiễm gây dương tính giả, do đó kết quả sẽ chính xác nhất. Xét nghiệm định
genotype sử dụng kỹ thuật realtime PCR và lai phân tử đều cho phép xác định chính
xác sự đồng nhiễm các genotype. Kỹ thuật giải trình tự bình thường không xác
định được đồng nhiễm, để làm được việc này bằng giải trình tự phải tốn chi phí rất
cao và rất khó, có thể không thành công. Nhất là đối với HPV, tỷ lệ đồng nhiễm rất
cao, do đó áp dụng kỹ thuật giải trình tự sẽ cho kết quả không chính xác. Việc xác

định sai hoặc không xác định được sự đồng nhiễm các genotype có thể dẫn đến hậu
quả nghiêm trọng. Ví dụ: 1 bệnh nhân đồng nhiễm HPV genotype 11 (nguy cơ gây
ung thư thấp) và 16 (nguy cơ gây ung thư cao) với 11 chiếm ưu thế, xác suất phương
pháp giải trình tự cho kết quả genotype 11 là rất cao, như vậy việc theo dõi và can
thiệp của bác sỹ sẽ không chính xác.

18


CHƯƠNG III: CẤU TRÚC CỦA HPV
3.1. Cấu tạo
Human Papillomavirus (HPV) là loại virus có cấu trúc DNA thuộc họ
Papovaviridae. Khác với các loại virus như viêm gan siêu vi A.C.SARS cororlavirus
có cấu tạo di truyền RNA. Bởi vì virus này không thể phát triển trong thực nghiệm và
không có xét nghiệm huyết thanh nào đáng tin cậy nên sự nhận diện Papillomavirus và
định type HPV căn cứ vào tiêu chuẩn nucleic acid.
HPV có cấu trúc DNA gồm 8000 bp. Hai chuỗi, phân tử DNA cuộn lại trong một
vỏ protein bao gồm 2 phân tử L1 và L2. Bộ mã di truyền của HPV ngoài phần mã để
tạo L1, L2 còn có phần mã hóa của 6 loại protein sớm từ E1 đến E7 cần thiết cho sự
nhân đôi của DNA và sự thành lập những hạt thể virus mới trong những tế bào bị
nhiễm virus.

Hình 11. Cấu trúc của HPV
Cấu trúc DNA của HPV được phân vùng gene sớm E (early region) mã hóa
protein trước khi nhân đôi DNA, vùng gene muộn L (late region) mã hóa vỏ bọc của
virus và vùng không mã hóa hay vùng điều hòa ngược (URR upstreeam regulatory
region).
Vùng gene sớm và vùng gene muộn có những khung đọc mở (ORF) cho việc
dịch các protein chức năng.
- Vùng gene sớm (E1, E2, E4, E5, E6, E7) biểu hiện sớm trong đời sống virus, có

đặc điểm là có tính đặc hiệu mô cao, quan trọng nhất là các gene E6, E7 có vai trò
chính trong việc gây ung thư ở tế bào kí chủ.

19


- Vùng muộn L gồm protein chính L1 (trọng lượng phân tử 54-58 kDa) và một
protein phụ L2 (trọng lượng phân tử 68 – 76 kDa) mã hóa protein vỏ bọc chủ yếu và
thứ yếu. Sự biểu hiện vùng muộn này muộn hơn vùng sớm và có thể tìm thấy trong
các tế bào keratin trưởng thành ở lớp trên biểu mô lát.

Circular DNA

Hình 12. Cấu trúc L1, L2 của HPV
20


3.2. Chức năng các vùng gene và protein
- Gene E1:
Là một trong hai vùng ổn định nhất ở HPV. Chức năng chính của E1 là mã hóa
cho protein gắn đặc hiệu vào DNA. E1 có hoạt động tháo xoắn không phụ thuộc ATP,
rất cần thiết cho sự sao chép của virus.
- Gene E2:
Đây là gene mã hóa chủ yếu cho các yếu tố phiên mã của tế bào. Bên cạnh đó, E2
còn tương tác với E1, giúp E1 dễ dàng gắn liền vào điểm khởi động sao chép và có thể
bắt đầu sao chép tăng cường hơn. Các thí nghiệm cho thấy rằng ở nồng độ thấp, E2
tăng cường sự phiên mã, nhưng ở nồng độ cao, nó lại ức chế sự phiên mã. Sự chèn
DNA virus vào bộ gene của vật chủ thường làm gián đoạn gene E2, ảnh hưởng tới khả
năng ức chế sự biểu hiện protein E6, E7.
- Gene E4:

Gene E4 mã hóa cho protein E4, có vai trò giúp sự trưởng thành và phóng thích
HPV ra khỏi tế bào mà không làm ly giải tế bào chủ.
- Gene E5:
Để xâm nhập và tồn tại trong tế bào chủ, HPV sẽ rất cần đến sản phẩm protein
E5 do gene này sản xuất, protein E5 tác động ngay trong giai đoạn đầu của sự xâm
nhiễm, chúng tạo ra các phức hợp với các thụ thể của yếu tố tăng trưởng và biệt hóa,
từ đó kích thích sự phát triển của tế bào. Mặt khác, protein E5 còn có vai trò quan
trọng trong việc ngăn chặn sự chết theo chương trình của tế bào khi có sự sai hỏng
DNA do chính virus gây ra.
- Gene E6:
Gene mã hóa protein E6, cực kỳ quan trọng trong vai trò gây ung thư, nhất là ở
những type virus được xếp vào nhóm nguy cơ cao trong gây ung thư. Protein E6 gồm
151 axit amin hình thành cấu trúc Cys-X-X-Cys gắn với phân tử điều hòa. Chức năng
chủ yếu của E6 cũng là chức năng rất nguy hiểm đối với tế bào chủ:
+ Liên kết hoặc không liên kết với protein E7, điều có khả năng kích thích tế bào
chủ phân bào mạnh mẽ và sự phân chia này là mãi mãi, tức tế bào chủ sẽ là những tế
bào hóa bất tử.

21


+ Gắn kết với protein p53, một protein ức chế sinh u của tế bào chủ, làm tăng sự
phân giải của p53 bởi hệ thống protein của tế bào và làm giảm khả năng ức chế khối u
của protein này.
+ Liên kết với gene trong quá trình bất tử hóa. Thực nghiệm trên chuột cho thấy
liên kết với gene kích thích sự phát triển tế bào NIH 3T3. Tế bào trở nên bất tử, đồng
thời hoạt động hóa chất hoạt hóa E2 của Adenovirus.
- Gene E7:
Protein E7 được mã hóa từ gene này chỉ gồm 98 acid amin và hình thành 2 cấu
trúc gắn kẽm. Gen E7 có vai trò không kém phần quan trọng trong việc gây ung thư ở

tế bào chủ mặc dù nó nhỏ hơn gene E6. Gene E7 tương đồng ở cấu trúc gắn kẽm với
E6, đều là cấu trúc Cys–X–X–Cys, góp phần liên kết chặt chẽ với E6 hơn, hỗ trợ nhau
tác động lên sự bất tử tế bào chủ.
Nếu E6 cản trở quá trình tự sửa sai của tế bào chủ yếu thông qua liên kết với p53
thì E7 thực hiện vai trò này thông qua liên kết với pRB, cũng là một protein ức chế
khối u. Liên kết này có ái lực cao cấp 10 lần ở những type virus thuộc nhóm nguy cơ
cao so với nhóm nguy cơ thấp. Điều này phải làm giải phóng số lượng lớn yếu tố
phiên mã E2F tự do, kích thích quá trình phiên mã, kéo dài đời sống tế bào.

Hình 13. Cấu trúc gene DNA của HPV 16
- Gene L1 và L2:
22


Đây là 2 vùng gene cấu trúc. Vùng L1 mã hóa protein L1, là thành phần chủ yếu
cấu tạo nên nang của virus. L1 có trọng lượng phân tử 56 – 60 kDa, được phosphoryl
hóa yếu và không gắn với DNA. Vùng L2 mã hóa protein vỏ capsid phụ, có trọng
lượng phân tử 60 – 69 kDa, lại được phosphoryl hóa cao và khả năng gắn DNA.
3.3. Vòng đời và đáp ứng miễn dịch
Human Papillomavirus có kích thước nhỏ, không có vỏ, gene hình cầu được mã
hoá bằng cấu trúc protein Ll và L2. Vòng đời toàn vẹn của virus được nối liền giai
đoạn trưởng thành của sự sừng hoá. Các nhiễm trùng sơ khởi xuất hiện ở tế bào tầng
cơ bản. Những sản phẩm gene đặc hiệu được sao chép lại ở mọi mức độ biệt hóa của
sự sừng hoá tế bào vảy. Tại bề mặt, vỏ protein L1 được sao chép và nhờ vào sự bong
ra của tế bào có đời sống ngắn, các virion HPV chuyển qua các tế bào trong biểu mô
kế tiếp.
HPV tránh được hệ thống miễn dịch thông qua nhiều cơ chế khác nhau. Nhiễm
trùng HPV dẫn đến sự đáp ứng kém biểu hiện của interferon và những con đường điều
hoà bằng cách ngăn chặn hoạt động gây độc tế bào của các lympho T. Không có sự
phối hợp huỷ tế bào, hay giải phóng các cytokine tiền viêm xuất hiện như là kết quả

của nhiễm trùng tế bào cơ bản. Sự vắng mặt của các dấu hiệu để xác định sự nhiễm
virus, hệ thống miễn dịch không hoạt động và sự nhiễm vẫn tiếp tục. Tầm quan trọng
của miễn dịch tế bào thể hiện rõ ở những bệnh nhân nhiễm HIV trên lâm sàng và ở
những bệnh nhân ghép thận. Đây là những đối tượng vốn có nguy cơ cao với những
bệnh lý liên quan với HPV.
Khoảng 75-90% nhiễm HPV xuất hiện rõ ràng trong vòng một năm sau khi
nhiễm bệnh. Khoảng trống được làm trung gian qua sự bong tự nhiên của tế bào biểu
mô, tế bào miễn địch gián tiếp và một phần bởi nồng độ thấp của kháng thể được trung
hoà đáp ứng một cách đặc hiệu với HPV L1 epitope. Đáp ứng kháng thể giảm dần và
mất đi sau khoảng 3 năm trong trường hợp lây nhiễm tự nhiên.
Những người nhiễm một loại HPV có thể tạo ra kháng thể đặc hiệu với type đó
nhưng có thể không miễn dịch đối với các type HPV khác. Vì vậy, chiến lược sản xuất
vaccine cần phối hợp kháng nguyên của những type HPV gây bệnh. Khoảng thời gian
từ nhiễm HPV đến xuất hiện tổn thương ác tính thường mất 10 năm hoặc lâu hơn nữa.
Nhiễm HPV chỉ có ở tế bào biểu mô và không đi vào máu nên HPV tránh được
sự nhận diện của hệ thống miễn dịch. Ở những phụ nữ đã được chủng ngừa, có thể

23


không phát hiện được bất kỳ kháng thể nào đặc hiệu cho type HPV. Nồng độ kháng
thể bảo vệ tuỳ thuộc vào đáp ứng của vaccine và đáp ứng miễn dịch được duy trì liên
tục hay cần thiết tiêm nhắc lại.
Hiện nay, người ta khuyến cáo tiêm nhắc lại trong khoảng thời gian từ 7 đến 10
năm để duy trì sự bảo vệ. Chuẩn độ của kháng thể duy trì liên tục được báo cáo với
việc sử dụng hệ thống tá dược AS04 ở vaccine nhị giá được thiết kế để kích thích
kháng nguyên trình diện tế bào và kéo dài đáp ứng tế bào lympho B nhớ.

24

CHƯƠNG IV. QUÁ TRÌNH XÂM NHẬP VÀ SỰ LAN TRUYỀN
CỦA CỦA HPV
4.1. Quá trình tương tác và xâm nhập vào tế bào chủ của HPVs
4.1.1. Các thụ thể của HPV
Vỏ capsid của HPV ngoài vai trò bảo vệ bộ gen của virus, nó còn có vai trò là vị
trí gắn với các thụ thể (receptor) trên bề mặt tế bào chủ. Sự xâm nhập của HPV vào tế
bào khởi đầu từ quá trình tương tác của virus với các receptor trên bề mặt tế bào để đi
vào trong tế bào.
4.1.1.1. Thụ thể α6 intergrin
Thụ thể α6 intergrin là một loại glycoprotein ở màng, kết hợp bởi các tiểu đơn vị
α và β, chúng có mặt ở nhiều loại tế bào. Theo Lantien et al., 2010, hiện nay đã phát
hiện khoảng 17 loại tiểu đơn vị α và 8 loại β có khả năng hấp phụ HPV, trong đó phức
hợp α6/β4 và α6/β1 có vai trò quan trọng trong sự tương tác giữa HPV và bề mặt tế
bào. Thụ thể α6/β4 hầu như chỉ xuất hiện ở bề mặt tế bào biểu mô tầng, trong khi đó
thụ thể α6/β1 lại có mặt ở các tế bào ở nhiều vị trí khác nhau. Điều này giải thích tại
sao HPV có thể liên kết với một loạt tế bào trong ống nghiệm, mặc dù đó không phải
là những tế bào chủ của HPV.

Hình 14. Sơ đồ cấu tạo của thụ thể α6 intergrin

25