Nghiên cứu chiết tách, xác định alcaloit trong vỏ cây Mức hoa trắng (Holarrhena antidysenterica) xã Đại Tân, huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam

-1-

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
KHOA HÓA
-------  -------

Nghiên cứu chiết tách, xác định alcaloit
trong vỏ cây Mức hoa trắng (Holarrhena
antidysenterica)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Ngành cử nhân hóa dƣợc

GVHD

: Th.S Đỗ Thị Thúy Vân

SVTH
Lớp

: Phạm Ngọc Văn
: 08CHD


-2-

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Hiện nay ngành công nghiệp dược đã sản xuất ra khoảng 10.000 biệt dược
từ khoảng 3000 hoạt chất khác nhau nhưng lại đang tồn tại tối thiểu 30.000 loại

bệnh. Điều đó cho thấy rằng nhu cầu tìm ra hoạt chất mới dùng trong điều trị
bệnh là điều cấp thiết hàng đầu. Đặc biệt là các bệnh nan y vẫn chưa có thuốc
đặc hiệu để điều trị như cảm lạnh, AIDS, ung thư, các bệnh về thần kinh trung
ương,…
Ở Việt Nam các hoạt chất dùng để làm thuốc có thể tự sản xuất được chỉ
khoảng 5%, đa phần là nhập khẩu từ nước ngoài về bào chế. Các hoạt chất dùng
để làm thuốc thường đi bằng hai con đường chủ yếu là tổng hợp hoặc chiết tách
từ dược liệu. Tổng hợp các hoạt chất từ hóa chất lại không đảm bảo an toàn khi
sử dụng vì chứa nhiều hóa chất độc hại có thể chứa trong hoạt chất mà mình cần
tổng hợp. Vì vậy các hoạt chất chiết tách từ dược liệu luôn được quan tâm vì tính
an toàn của nó.
Nước ta vốn được biết là một trong những nước có nguồn thực vật phong
phú và đa dạng nhất trên thế giới, đa phần trong số đó có thể được dùng để làm
thuốc. Để có thể chiết tách các hoạt chất trong các cây dược liệu vẫn còn là điều
khó khăn, nan giải.
Trong quá trình tìm hiểu, nghiên cứu tôi thấy cây Mức hoa trắng không
chỉ có tác dụng lấy gỗ mà trong cây còn có chứa nhiều hoạt chất dùng để chữa
bệnh đặc biệt là các alcaloit có chứa nhiều trong vỏ cây. Trong các bộ phận của
cây thì hạt có tác dụng bổ thận, lá và rễ có tác dụng cầm ỉa chảy, vỏ thân có vị
chát, có tác dụng trừ lỵ, trừ giun, lợi tiêu hoá, hạ sốt và tăng trương lực. Vỏ thân
và các bộ phận khác được dùng trị lỵ amip, vỏ cũng được dùng trị sốt, ỉa chảy,
viêm gan. Vỏ và lá dùng nấu nước tắm ghẻ, có thể dùng vỏ rễ giã giập ngâm


-3-

rượu cùng với vỏ rễ cây Hoè dùng bôi. Liều dùng: bột vỏ 10g, hạt 3-6g hoặc cao
lỏng 1-3g. Trong đó conessin chlorhydrat hay bromhydrat trị lỵ amip, có tác
dụng như emetin nhưng không độc và tiện dụng hơn emetin. Nó có tác dụng đối
với kén và amip, còn emetin chỉ có tác dụng đối với amip... Hiện tượng không

chịu thuốc rất ít hoặc không đáng kể.
Trên thế giới có các công trình nghiên cứu Holarrehena antidysenterica
như: Đánh giá hoạt động chống oxy hóa hạt giống của Holarrehena
antidysenterica trong các mô hình in vitro của sở Y sinh học phòng thí nghiệm
khoa học và quản lý đại học Vidyasagar Ấn Độ thực hiện. Nghiên cứu ảnh
hưởng của các alkaloid có trong loài Holarrhena antidysenterica tới việc điều trị
kháng khuẩn do cục Hóa sinh, Đại học Madras, Guindy Campus Ấn Độ thực
hiện. Nghiên cứu steroidal alkaloids từ vỏ của loài Holarrhena do Phòng nghiên
cứu thí nghiệm khu vực (CSIR), Jammu Tawi Ấn Độ thực hiện.
Trong nước có công trình nghiên cứu như: Đề tài nghiên cứu chiết tách và
thử hoạt tính chống ung thư từ cây Mộc hoa trắng của viện sinh thái và tài
nguyên sinh vật. Thuốc Mộc hoa trắng, viên nén bao phim do Công ty CP Dược
& TBYT Hà Tĩnh sản xuất.
Nhận thấy trong cây có chứa nhiều alcaloit và những ứng dụng của nó trong
thực tế như vậy nên việc nghiên cứu để xây dựng một quy trình chiết tách hỗn
hợp alcaloit từ vỏ cây Mức hoa trắng, từ đó xác định thành phần hóa học chính
của nó là một vấn đề cần thiết. Vì lý do trên tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu
chiết tách, xác định alcaloit trong vỏ cây Mức hoa trắng (Holarrhena
antidysenterica) xã Đại Tân, huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam”.
2. Đối tƣợng nghiên cứu
Vỏ cây Mức hoa trắng ở xã Đại Tân, huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam.
3. Mục đích nghiên cứu


-4-

- Xây dựng quy trình chiết tách alcaloit trong vỏ cây Mức hoa trắng.
- Xác định thành phần hoá học, cấu trúc các alcaloit trong vỏ cây Mức hoa trắng.
4. Phƣơng pháp nghiên cứu
4.1. Nguyên cứu lí thuyết

- Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tư liệu, sách báo trong và ngoài nước có liên
quan đến đề tài.
- Hội thảo, trao đổi kinh nghiệm với các thầy cô, các bạn cùng ngành.
4.2. Phƣơng pháp thực nghiệm
- Phương pháp lấy mẫu, thu hái và xử lý mẫu.
- Phương pháp phân tích trọng lượng để xác định độ ẩm.
- Phương pháp phân hủy mẫu phân tích để khảo sát hàm lượng tro
- Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS để xác định hàm lượng các
kim loại nặng trong vỏ cây Mức hoa trắng.
- Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: Khảo sát các điều kiện chiết
tối ưu: tỉ lệ R-L, thời gian chiết.
- Chiết bằng phương pháp chiết soxhlet.
- Phương pháp sắc ký khí-phổ khối liên hợp (GC-MS) nhằm phân tách và xác
định thành phần hóa học các hợp chất alcaloit trong dịch chiết.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
5.1. Ý nghĩa khoa học
- Cung cấp những thông tin khoa học về quy trình chiết tách, xác định thành
phần hóa học, công thức cấu tạo của alcaloit có trong vỏ cây.
- Cung cấp những thông tin, tư liệu làm cơ sở cho việc nghiên cứu sau này.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn: Trau dồi kinh nghiệm về việc tách các hợp chất có hoạt
tính sinh học và các phương pháp nghiên cứu.


-5-

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu cây Mức hoa trắng
1.1.1. Tên gọi [3], [11]
- Tên khoa học: Holarrhena antidysenterica
- Tên khác: Cây Sừng Trâu, Mức lá to, Thừng mực lá to, Mộc hoa trắng, Mộc

vài (Thổ), Mức lông, Hồ liên lá to.
- Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
- Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
- Phân Lớp Hoa Môi (Lamiidae)
- Bộ Trúc đào (Apocynales)
- Họ Trúc đào (Apocynaceae)
- Chi Holarrhena
1.1.2. Đặc tính thực vật và phân bố [11]
Cây gỗ to mọc thẳng đứng có thể cao trên 10 m, có nhựa mủ trắng. Thân
già màu nâu đen xù xì, có lớp vỏ dày, thân non màu xanh hoặc màu đỏ nâu có
nhiều lông che chở màu trắng (hình 1.1).

Hình 1.1: Quả, lá và thân cây


-6-

Lá đơn, nguyên, mọc đối, phiến lá hình xoan hoặc hình trứng đỉnh kéo dài
thành mũi nhọn dài 0,5-1 cm, màu xanh đậm mặt trên hơn mặt dưới, có lông
trắng ở mặt dưới nhiều hơn mặt trên, kích thước dài 7-11 cm, rộng 5-6 cm.
Gân lá hình lông chim, 9-13 cặp gân phụ cấp 1 hơi chếch không đối nhau
chạy sát mép và nối nhau ở mép rất mờ, gân phụ cấp 2 hình lưới rõ.
Cuống lá ngắn, hình trụ, dài 0,5-0,6 cm, màu xanh, nhiều lông. Không có
lá kèm.
Cụm hoa xim 2 ngả mọc ở nách lá hoặc ở ngọn cành, cuống cụm hoa dài
1,5-2 cm.
Hoa màu trắng, thơm, đều, lưỡng tính, mẫu 5. Cuống hoa dài 1-1,5 cm,
màu xanh, có lông dày.
Lá bắc và lá bắc con dạng vẩy màu xanh có lông, tồn tại lâu. Đài hoa: 5 lá
đài nhỏ, đều, rời, màu xanh, dạng vẩy dài 0,15-0,2 cm, rộng 0,7-1 cm, mặt ngoài

có nhiều lông màu trắng; có các tuyến hình vảy màu vàng ở gốc mặt trong của lá
đài, tiền khai năm điểm.
Tràng hoa: 5 cánh hoa đều, màu trắng, dính phía dưới tạo thành ống phình
to ở gần đáy dài 0,4-0,5 cm, 5 phiến phía trên hình thuôn dài đầu tù, dài 1,31,5cm, rộng 0,3-0,4 cm, mặt trong của phiến có lông tiết dính, mặt ngoài có lông
che chở, tiền khai vặn theo chiều kim đồng hồ; họng tràng có tràng phụ dạng bản
mỏng chia 2-3 thùy, dài 0,8-1 cm, rộng 0,2-0,3 cm, màu hồng, có lông.
Bộ nhị: 5 nhị đều, rời; chỉ nhị ngắn đính trên họng tràng; bao phấn màu
vàng chụm vào nhau, chung đới kéo dài thành mũi nhọn và dính với đầu nhụy,
dài 0,7-0,8 cm.
Hạt phấn rời, hình cầu màu vàng, đường kính 52,5 µm. Bộ nhụy: 2 lá noãn
rời, bầu trên, màu xanh, hình trứng cao 0,1 - 0,15 cm, nhiều noãn đính bên. 1 vòi
nhụy hình trụ tròn, màu trắng, dài 0,6 - 0,7 cm.


-7-

* Đặc điểm bột dược liệu:
Bột vỏ thân Mức hoa trắng có màu vàng, thể chất tơi thô, không có mùi, vị
rất đắng gồm các thành phần sau: Rất nhiều tế bào mô cứng vách dày, khoang
hẹp, có ống trao đổi rõ, kích thước khác nhau, có màu vàng, nằm riêng lẻ hoặc
tập trung thành cụm.
Mảnh bần tế bào đa giác, kích thước khác nhau, vách dày, màu vàng.
Mảnh mô mềm gồm những tế bào đa giác, vách mỏng.
Tinh thể calci oxalat hình khối dài khoảng 40 µm, rộng 30 µm. Hạt tinh bột hình
cầu có tễ rõ.
Ống nhựa mủ với khoang rộng vách mỏng hay những ống có vách dày,
khoang hẹp.
* Phân bố, sinh học và sinh thái:
Có ở Ấn Độ, Miến Điện, Thái Lan, Malaysia. Ở Việt Nam mọc ở khắp
nơi, tại miền bắc có ở Bắc Giang, Bắc Ninh, Cao Bằng, Lạng Sơn, Vĩnh Phúc,

Phú Thọ, Hà Tây, Hòa Bình và nhiều tỉnh khác. Mùa hoa: tháng 3-7, mùa quả:
tháng 6-12.
* Bộ phận dùng:
Lá, hạt, vỏ thân và rễ
Vỏ cây thu hái vào tháng 2 - 3. Phơi hoặc sấy khô.
1.2. Tổng quan về thành phần hóa học [3]
Vỏ thân chứa 9,5% gôm; 6,2% chất nhựa; 1,14% tannin; triterpen alcol;
lupeol; β-sitosterol; ankan và nhiều alcaloit.
Hàm lượng alcaloit thay đổi tùy theo sự phát triển của cây, cao nhất vào
lúc cây 8 – 12 tuổi.
Hàm lượng alcaloit toàn phần: 0,22 – 4,2% trong vỏ. Cho tới nay đã tìm
thấy nhiều alcaloit như: conessimin (C 23H28N2), isoconessimin (C23H38N2),


-8-

holarimin (C21H34N2O), conimin (C22H36N2), conarimin (C21H34N2), holaremin
(C24H38ON2), cokurchin (C21H32N2), conessidin (C22H34N2)… Đặc biệt conessin
là alcaloit chính trong cây.
R

R1

R2

R3

Conarimin

H

H

H

H

Conimin

Me

H

H

H

Conamin

H

H

Me

H

Conessimin

Me

Me

H

H

Isoconessimin Me

H

Me

H

Conessin

Me

Me

Me

H

Holarenin

Me

Me

Me

OH

R

R1

R2

Conkurchin

H

H

H

Conessidin

Me

H

H

R2
N

R3

CH3

12
11

2

R
N

H

CH3

1

9

10

H

5

14
8

H

7

3

R1

H

13

4

6

R2
N
12
11

CH3

1
2

R
N
R1

9

10
5

H

13
14
8

H

7

3
4

H

6

1.3. Tính chất chung của alcaloit [3]
1.3.1. Lý tính
- Những alcaloit có oxi thường ở thể rắn ở nhiệt độ thường
- Những alcaloit không có oxi thường ở thể lỏng nhưng cũng có những chất
không có oxi ở thể rắn như Conessin...
- Các alcaloit ở thể rắn thường kết tinh được và có điểm chảy rõ ràng. Các
alcaloit ở thể lỏng bay hơi được và thường không bền vững.

-9-

- Mùi vị: đa số không mùi, có vị đắng, một số it có vị cay.
- Màu sắc: hầu hết là không màu, trừ một số có màu vàng.
- Độ tan: không tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ: metanol,
etanol, ether, cloroform, benzen... Các alcaloit dạng muối dễ tan trong nước.
1.3.2. Hóa tính
Có tính bazơ yếu có khả năng làm xanh giấy quỳ, có thể giải phóng
alcaloit ra khỏi muối của nó bằng những kiềm trung tính và mạnh như NH4OH,
MgO, cacbonat kiềm, NaOH,...
Tác dụng với các axit cho muối tương ứng.
Kết hợp với kim loại mạnh tạo ra muối phức.
* Phản ứng tạo kết tủa
+ Thuốc thử Dragendorff tạo kết tủa vàng da cam đến đỏ.
+ Thuốc thử Mayer tạo kết tủa màu trắng hoặc vàng cam.
+ Thuốc thử Wagner (Bouchardat) tạo kết tủa nâu.
* Tạo màu với alcaloit
+ Dung dịch H2SO4 đậm đặc (D = 1,84 g/ml)
+ Dung dịch HNO3 đậm đặc (D = 1,4 g/ml )
1.4. Tác dụng dƣợc lý và công dụng [3], [11].
Conesin rất ít độc, với liều cao tác dụng của nó gần giống với morphin,
gây liệt với trung tâm hô hấp. Tiêm có thể gây tê tại chỗ nhưng kèm theo hiện
tượng hoại thư do đó không gây tê được. Đào thải một phần qua đường ruột, một
phần qua đường tiểu tiện, gây hạ huyết áp, làm tim đập chậm. Conesin kích thích
sự co bóp của tử cung và ruột, có tác dụng trừ giun đối với chuột bạch. Chữa lỵ
amip (conessin hydrat hay bromohydrat).
Vỏ cây được sử dụng giải nhiệt, lợi tiểu, đau bụng, khó tiêu.


-10-

Nó là một loại thuốc nổi tiếng với bệnh lỵ amoebic và rối loạn dạ dày
khác. Nó cũng được chỉ định trong tiêu chảy, khó tiêu, đầy hơi và đau bụng.
* Công dụng
Thân và các bộ phận khác được dùng làm thuốc trị lỵ amip, dùng dưới
dạng bột, cồn thuốc hoặc cao lỏng chữa lỵ amip. Liều dùng 1 ngày: vỏ cây khô
3-10g, hoặc hạt 3-6g. Còn dùng dưới dạng alcaloid toàn phần, hoặc conessin.
Dùng vỏ cây hoặc lá nấu nước tắm chữa ghẻ. Vỏ rễ giã ngâm rượu cùng với rễ
hòe bôi ghẻ.
1.5. Các phƣơng pháp kỹ thuật
1.5.1. Xác định độ ẩm trong vỏ cây Mức hoa trắng
* Cơ sở của phƣơng pháp: Nguyên liệu ẩm có thể xem như hỗn hợp cơ học
gồm chất khô tuyệt đối và nước tự do: m = mo + w.
Trong đó:
m: khối lượng chung của nguyên liệu.
mo: khối lượng của chất khô tuyệt đối (không có ẩm).
w: khối lượng nước chứa trong nguyên liệu (nước tự do).
Độ ẩm tương đối (ω) của nguyên liệu ẩm: là tỷ số giữa khối lượng nước
trên khối lượng chung (m) của nguyên liệu ẩm, tính bằng phần trăm:



w
w
.100 
.100
m
mo  w

1.5.2. Xác định hàm lƣợng tro trong vỏ cây Mức hoa trắng

* Cơ sở của phƣơng pháp :
Mẫu nguyên liệu khô có thành phần gồm vô cơ (tro) và hữu cơ.
Hàm lượng tro là hiệu số khối lượng giữa mẫu sau khi xác định độ ẩm
(mẫu nguyên liệu khô ) với mẫu sau khi tro hóa so với khối lượng nguyên liệu


-11-

ẩm ban đầu. Vì sau khi tro hoá ở nhiệt độ cao, các chất hữu cơ trong mẫu nguyên
liệu đã bị phân huỷ và bay hơi hết, còn lại tro là phần vô cơ.
H (%) 

Trong đó:

m3  m0
 100%
m,

m0: Khối lượng chén sứ
m3: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi tro hoá (g)
m : Khối lượng nguyên liệu ban đầu (g)

1.5.3. Phƣơng pháp hấp thụ nguyên tử AAS
1.5.3.1. Đặc điểm của phổ AAS
Nếu ta chiếu một chùm tia sáng có bước sóng xác định vào đám hơi
nguyên tử thì các nguyên tử tự do sẽ hấp thụ các bức xạ có bước sóng ứng đúng
với những tia bức xạ mà có thể phát ra được trong quá trình phát xạ. Phổ sinh ra
trong quá trình này gọi là phổ hấp thụ nguyên tử.
Nghiên cứu sự phụ thuộc cường độ một số vạch phổ hấp thụ của một
nguyên tố vào nồng độ C của nguyên tố đó trong mẫu phân tích, người ta nhận

thấy trong vùng nồng độ C nhỏ, mối quan hệ giữa cường độ vạch phổ hấp thụ và
số nguyên tử của nguyên tố tuân theo định luật Lămbe-Bia: D= lC.
1.5.3.2. Nguyên tắc của phép đo AAS
Trên cơ sở của sự xuất hiện phổ hấp thụ nguyên tử, chúng ta thấy phổ hấp
thụ nguyên tử chỉ sinh ra được khi nguyên tử tồn tại ở trạng thái khí tự do và
trong mức năng lượng cơ bản. Do vậy, muốn thực hiện được phép đo AAS cần
phải thực hiện các công việc sau:
1. Hóa hơi mẫu phân tích, đưa vật mẫu về trạng thái khí.
2. Nguyên tử hóa đám hơi đó, tức là phân ly các phân tử để tạo ra các đám
hơi các nguyên tử tự do của các nguyên tố cần phân tích ở trong mẫu có khả


-12-

năng hấp thụ bức xạ đơn sắc. Hai công việc này được gọi là quá trình nguyên tử
hóa mẫu. Đây là giai đoạn quan trọng nhất và ảnh hưởng đến quyết định kết quả
của phép đo AAS vì nó tạo ra môi trường hấp thụ nguyên tử của phép đo.
3. Chọn nguồn phát tia sáng có bước sóng phù hợp với nguyên tố phân
tích (bức xạ cộng hưởng) và chiếu vào đám hơi đó, như vậy phổ hấp thụ sẽ xuất
hiện.
4. Thu toàn bộ chùm sáng sau khi đi qua môi trường hấp thụ, phân ly
chúng thành phổ và chọn 1 vạch phổ cần đo của nguyên tố phân tích để hướng
vào khe đo, để đo cường độ của nó.
5. Thu và ghi lại kết quả đo của cường độ vạch phổ hấp thụ bằng thiết bị
ghi và xử lý thích hợp.
1.5.4. Phƣơng pháp chiết
* Giới thiệu chung
Chiết là dùng dung môi thích hợp có khả năng hòa tan chất đang cần tách
và tinh chế để tách chất đó ra khỏi môi trường rắn hoặc lỏng khác.
Trong đề tài này tôi sử dụng hai phương pháp chiết chính là:

+ Ngâm chiết nóng
+ Chiết Soxhlet
* Ngâm chiết nóng:
Cho nguyên liệu và dung môi vào trong dụng cụ ngâm. Cụ thể trong đề tài
này dụng cụ là bình tam giác, rồi sau đó cho vào bình đun cách thủy ở một nhiệt
độ và thời gian đã được quy định.
* Chiết Soxhlet:
Dung môi được đun nóng, cho bay hơi liên tục chảy vào bình chứa hỗn
hợp cần chiết tách, nó sẽ hòa tan chất rắn cần tinh chế và nhờ một ống xiphong,


-13-

dung dịch chảy xuống bình cầu bên dưới, dung môi nguyên chất lại tiếp tục được
cất lên, cứ lặp đi lặp lại như vậy đến khi chiết xong.
1.5.5. Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS
* Giới thiệu phƣơng pháp
Theo nguyên tắc chung, để xác định một chất bất kì, ta có thể tìm cách đo
một tín hiệu bất kỳ có quan hệ trực tiếp hoặc gián tiếp với chất đó. Phương pháp
phân tích đo quang có nhiệm vụ nghiên cứu cách xác định các chất dựa trên việc
đo đạc những tín hiệu bức xạ điện từ và tác dụng tương hỗ của bức xạ này với
chất nghiên cứu.
Các phương pháp phân tích đo quang cổ điển chỉ mới dựa trên quan hệ
của những ánh sáng khả kiến –VIS tức là vùng bức xạ nhạy cảm với mắt người
có bước sóng 400nm - 800nm) với chất nghiên cứu nên vẫn được gọi là phương
pháp so màu.
Ngày nay, phương pháp phân tích đo quang dùng để khảo sát cả một vùng
bức xạ điện từ rộng lớn từ tử ngoại (có vùng bước sóng từ 10nm) đến hồng ngoại
(10-2 cm), và có thể tới các vùng có bước sóng bé hơn nữa (như ở các phương
pháp phổ tia X hoặc các vùng có bước sóng lớn hơn nữa (như ở các phương

pháp cộng hưởng spin-electron-miền sóng viba-và cộng hưởng từ hạt nhân).
Phương pháp này cho phép nghiên cứu mối quan hệ giữa cấu trúc phân tử
và sự hấp thụ bức xạ do đó dẫn tới làm sáng tỏ mối quan hệ giữa cấu tạo và màu
sắc của các chất.
1.5.6. Phƣơng pháp sắc ký ghép khối phổ GC-MS
1.5.6.1. Phƣơng pháp sắc ký khí (GC)
* Nguyên tắc hoạt động: Nhờ có khí mang trong bom chứa trong bom khí
(hoặc máy phát khí), mẫu từ buồng bay hơi được dẫn vào cột tách nằm trong


-14-

buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký xảy ra tại đây. Sau khi rời khỏi cột tách tại
các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào detectơ, tại đó chúng được
chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này được khuếch đại rồi chuyển sang bộ
ghi, tích phân kế hoặc máy vi tính. Các tín hiệu được xử lý ở đó rồi chuyển sang
bộ phận in và lưu kết quả (bộ hiện số, máy in hoặc máy ghi). Trên sắc đồ nhận
được, sẽ có tín hiệu ứng với các cấu tử được tách gọi là pic.Thời gian lưu của pic
là đại lượng đặc trưng cho chất cần phân tích. Diện tích pic là thước đo định
lượng cho từng chất trong hỗn hợp cần nghiên cứu.
Sắc đồ là tập hợp tất cả các pic, mỗi pic đại diện cho mỗi chất. Dựa vào
thời gian lưu ta có thể xác định được tên chất và đo diện tích mỗi pic ta xác định
được thành phần mỗi chất trong hỗn hợp.
1.5.6.2. Phƣơng pháp khối phổ (MS)
* Nguyên tắc của phương pháp khối phổ: Dựa vào chất nghiên cứu được
ion hóa trong pha khí hoặc pha ngưng tụ dưới chân không bằng những phương
pháp thích hợp thành những ion (ion phân tử,ion mảnh) có số khối khác nhau,
sau đó những ion này được phân tách thành những dãy ion theo cùng số khối m
(chính xác là theo cùng tỷ số khối trên điện tích ion, m/e) và xác suất có mặt của
mỗi dãy ion có cùng tỉ số m/e được ghi lại trên đồ thị có trục tung là xác suất có

mặt (hay cường độ), trục hoành là tỉ số m/e gọi là khối phổ đồ.
Phổ khối lượng được ghi lại dưới dạng phổ vạch hay bảng, trong đó cường
độ vạch được đo bằng phần trăm so với đỉnh có cường độ cao nhất. Đỉnh ion
phân tử thường là đỉnh cao nhất, tương đương với khối lượng phân tử của hợp
chất khảo sát.
Phổ khối lượng không những cho phép xác định chính xác phân tử lượng,
mà căn cứ vào các mảnh phân tử tạo thành, ta cũng suy ra được cấu trúc phân tử


-15-

.Xác suất tạo thành mảnh phụ thuộc vào cường độ liên kết trong phân tử cũng
như vào khả năng bền hóa các mảnh tạo thành nhờ các hiệu ứng khác nhau. Các
mảnh có độ bền lớn sẽ ưu tiên tạo thành, các liên kết yếu nhất dễ bị đứt nhất. Có
những mảnh có khối lượng đặc trưng gọi là mảnh chìa khóa, chúng cho phép
phân tích các phổ khối lượng dễ dàng.
1.5.7. Phƣơng pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS
Phương pháp GC-MS dựa trên cơ sở “nối ghép” máy sắc ký khí (GC) với
máy phổ khối lượng (MS).
Việc liên kết hai kĩ thuật đó đã tạo ra một công cụ mạnh mẽ để tách biệt
và nhận biết các hợp chất. Nhờ có sự liên kết chặt chẽ này người ta có thể thu
được phổ khối lượng đủ chấp nhận đối với tất cả các hợp phần mà sắc ký khí
tách ra được, kể cả những hợp phần với khối lượng chỉ cỡ vài picogam và có mặt
trong vài giây.


-16-

CHƢƠNG 2
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu
- Vỏ cây Mức hoa trắng (Holarrhena pubescens) được lấy vào tháng 9 năm 2011
ở huyện Đại Lộc tỉnh Quảng Nam.
- Vỏ cây tươi cạo lớp vỏ bên ngoài, sau đó phơi khô ngoài nắng và nghiền thành
bột mịn rồi cho vào lọ thủy tinh sạch để bảo quản nơi khô ráo thoáng mát.
2.2. Hóa chất và thiết bị thí nghiệm
2.2.1. Hóa chất
- Acid hydroclorid 5%, sữa vôi, cát mịn, cồn, hecxan, dung dịch NaOH.
- Dung môi dùng cho sắc ký khí ghép khối phổ (Merck) đạt tiêu chuẩn.
2.2.2. Thiết bị thí nghiệm
- Phễu lọc Buchner, cân phân tích, tủ sấy, tủ nung, máy cô quay chân không, bộ
chiết soxhlet, bếp điện, cốc thủy tinh, bình tam giác, ống nghiệm, cốc sứ, bình
hút ẩm,…
- Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS.
- Máy đo sắc ký khí ghép khối phổ GS-MS.
- Máy đo quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phân tích trọng lƣợng
Áp dụng phương pháp phân tích trọng lượng để phân tích các yếu tố sau:
- Khảo sát độ ẩm
- Khảo sát hàm lượng tro
2.3.2. Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS


-17-

- Xác định hàm lượng kim loại nặng trong vỏ cây Mức hoa trắng.
2.3.3. Phƣơng pháp chiết chất rắn
- Chiết nóng bột vỏ cây Mức hoa trắng khô trong dung môi HCl 5%.
2.3.4. Phƣơng pháp vật lý

- Đo phổ UV-VIS khảo sát tỉ lệ rắn lỏng, khảo sát thời gian chiết.
- Đo phổ GC-MS để định danh alcaloit trong vỏ cây Mức hoa trắng.
* QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU
Bột vỏ
Ngâm chiết nóng với dung dịch HCl 5% ở nhiệt độ 800C
Dịch chiết 1
- Kiềm hóa bằng sữvôi đến pH = 9 - 10
- Sau đó lọc

Dịch lọc

Kết tủa
- Làm khô
- Sau đó tán nhỏ
Bột alcaloit thô
Trộn cát mịn đã rửa sạch
Hỗn hợp bột và cát
Chiết bằng cồn tuyệt đối
Dịch chiết 2
Đuổi dung môi

Cặn chứa alcaloit

Chạy GC-MS


-18-

CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nguyên liệu
Vỏ cây sau khi đã phơi khô ta đem nghiền mịn thành bột rồi cho vào bình
thủy tinh sạch bảo quản (hình 3.1).

Hình 3.1: Vỏ cây khi phơi khô và sau khi xay
mịn
3.2. Xác định một
số chỉ số vật lý
3.2.1. Xác định độ ẩm trong bột vỏ cây Mức hoa trắng
 Nguyên tắc: Sấy nguyên liệu ẩm ở 1000C đến khối lượng không đổi. Từ đó
suy ra khối lượng nước tự do trong nguyên liệu.
* Cách tiến hành:
Chuẩn bị sẵn 5 chén sứ sạch, đã được sấy khô trong tủ sấy đến 1000C và
đánh số từ 1 đến 5. Đặt vào bình hút ẩm, làm nguội đến nhiệt độ phòng.
Cho vào mỗi chén sứ 5 g bột vỏ cây Mức hoa trắng. cân chén và mẫu: m1.
Sau đó, tiến hành sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 1000C, sau 1 giờ lấy ra cân, cứ như
vậy đến khi thu được kết quả tổng khối lượng của mẫu và chén không đổi m2 thì
cho vào bình hút ẩm để làm nguội. Độ ẩm của mỗi mẫu là hiệu số của tổng khối
lượng chén và mẫu trước khi sấy so với tổng khối lượng chén và mẫu sau khi sấy


-19-

Hàm lượng % ẩm được tính theo công thức:
W(%) 

m1  m2
100%
m

Độ ẩm trung bình là trung bình cộng 5 mẫu độ ẩm.
5

W(%) 

1 W (%)
5

Kết quả xác định độ ẩm trong vỏ cây Mức hoa trắng được thể hiện ở bảng
3.1.
Bảng 3.1: Kết quả xác định độ ẩm trong vỏ cây Mức hoa trắng
STT

m0

m1

m

m2

W (%)

1

30.492

35,610

5,118

34.960

12,700

2

30,226

35,150

5,092

34,507

12,790

3

31,182

36,280

5,098

35,618

12,980

4

36,231

41.542

5,311

40,849

13,040

5

30.500

35,666

5,166

35,003

12,830

Độ ẩm trung bình: 12,868%
Trong đó:

m0: khối lượng chén sứ (g).
m1: Khối lượng chén sứ và nguyên liệu (g).
m : Khối lượng nguyên liệu (g).
m2: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi sấy (g).

W (%): độ ẩm của mỗi mẫu.

Từ bảng 3.1 thu được độ ẩm bột vỏ cây Mức hoa trắng là 12,868%.
3.2.2. Xác định hàm lƣợng tro trong vỏ cây Mức hoa trắng
* Nguyên tắc: Tro hoá hoàn toàn mẫu ở nhiệt độ 5000C – 6000C khoảng 8 giờ.


-20-

* Cơ sở của phƣơng pháp : Mẫu nguyên liệu khô có thành phần gồm vô cơ
(tro) và hữu cơ.
Hàm lượng tro là khối lượng giữa mẫu sau khi tro hóa so với khối lượng
nguyên liệu ban đầu. Vì sau khi tro hóa ở nhiệt độ cao, các chất hữu cơ trong
mẫu nguyên liệu đã bị phân hủy và bay hơi hết, còn lại tro là phần vô cơ.

H (%) 

m3  m0
 100%
m

Trong đó: m0: Khối lượng chén sứ
m3: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi tro hoá (g)
m: Khối lượng nguyên liệu ban đầu (g)
 Cách tiến hành:
Từ 5 mẫu vỏ cây Mức hoa trắng vừa được xác định độ ẩm ở thí nghiệm
trên, đem than hóa trên bếp điện trong vòng 2 giờ. Sau đó đem tro hoá ở 500 0C –
6000C trong lò nung với thời gian 8 giờ cho đến khi tro có màu trắng. Lấy mẫu
ra, làm nguội mẫu trong bình hút ẩm và cân lại mẫu để xác định hàm lượng tro.
Kết quả xác định hàm lượng tro trong vỏ cây Mức hoa trắng được thể hiện

ở bảng 3.2.
Bảng 3.2: Kết quả xác định hàm lƣợng tro trong vỏ cây Mức hoa trắng
STT

m0

m

m3

%H

1

30.492

5,118

30,866

7,307

2

30,226

5,092

30,580

6,952

3

31,182

5,098

31,567

7,551

4

36,231

5,311

36,606

7.060

5

30.500

5,166

30,859

6,949

Hàm lƣợng tro trung bình: 7,164%


-21-

Trong đó: m0: Khối lượng chén sứ
m3: Khối lượng chén sứ và mẫu sau khi tro hoá (g)
m : Khối lượng nguyên liệu ban đầu (g)
%H: Hàm lượng tro của mỗi mẫu.
Như vậy hàm lượng tro trung bình trong vỏ cây Mức hoa trắng là: 7,164%
3.2.3 Hàm lƣợng kim loại nặng
Mẫu vỏ cây Mức hoa trắng sau khi tro hóa được hòa tan bằng dung dịch
HNO3 loãng và định mức đến 50ml. Lấy dung dịch đã định mức trên đem xác
định hàm lượng một số kim loại nặng tại Trung Tâm Khí Tượng Thủy Văn Quốc
Gia Đài Khí Tượng Thủy Văn Khu Vực Trung Trung Bộ.
Kết quả xác định hàm lượng kim loại nặng trong vỏ cây Mức hoa trắng
được thể hiện ở hình 3.2 và bảng 3.3.

Hình 3.2: Kết quả đo hàm lƣợng kim loại
nặng


-22-

Bảng 3.3: Hàm lƣợng một số kim loại trong vỏ cây Mức hoa trắng
Kim loại

Hàm lƣợng ( mg/l)

Zn2+

37,7930

Pb2+

0,3711

* Nhận xét: Theo quyết định số 867/1998 QĐ-BYT ngày 04/4/1998 của
Bộ Y tế về việc ban hành “Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực, thực
phẩm” thì giới hạn tối đa cho phép của Zn là 40 (mg/l) và Pb là 2 (mg/l). Trong
mẫu đo được Zn là 37,7930 (mg/l) và Pb là 0,3711 (mg/l). Như vậy hàm lượng
kim loại nặng trong mẫu nằm trong giới hạn cho phép.
3.3. Kết quả chiết tách các hợp chất trong vỏ cây Mức hoa trắng
3.3.1. Khảo sát phƣơng pháp chiết
3.3.1.1. Phƣơng pháp chiết ở nhiệt độ phòng
Lấy 10g bột vỏ cây Mức hoa trắng đã nghiền mịn vào bình tam giác. Tiếp
tục cho vào bình 150ml dung dịch HCl 5%, sau đó đậy kín nắp để trong bóng tối
3 ngày.
Sau đó đem lọc, kết quả thu được dịch lọc như hình 3.3.

Hình 3.3: Dịch lọc ngâm ở nhiệt độ phòng


-23-

Dịch lọc thu được cho kiềm hóa bằng dung dịch vôi sữa. Khi tiến hành
kiềm hóa thấy không có hiện tượng gì.
3.3.1.2. Phƣơng pháp chiết nóng

Lấy 10g bột vỏ cây Mức hoa trắng đã nghiền mịn vào bình tam giác. Tiếp
tục cho vào bình 150ml dung dịch HCl 5%, sau đó đậy kín nắp rồi đun trên bếp
cách thủy ở t = 800C, thỉnh thoảng lắc bình trong quá trình đun. Đun trong thời
gian 5h.
Sau đó lọc nóng, kết quả thu được dịch lọc như hình 3.4.

Hình 3.4: Dịch lọc khi chiết nóng
Dịch lọc thu được đem kiềm hóa bằng dung dịch vôi sữa. Vừa kiềm hóa vừa đo
pH. Trong quá trình kiềm hóa khi thấy pH = 9 bắt đầu thấy hiện tượng vẩn đục,
tiếp tục kiềm hóa đến khi dừng kết tủa ở pH = 10 như hình 3.5.

Hình 3.5: Kết tủa thu đƣợc ở pH = 9 đến 10


-24-

* Như vậy: Quá trình tạo muối alcaloit với dung dịch axit HCl 5% phụ
thuộc rất lớn vào yếu tố nhiệt độ. Do đó chiết nóng là phương pháp tối ưu để
chiết alcaloit từ vỏ cây Mức hoa trắng.
3.3.2. Khảo sát điều kiện chiết
3.3.2.1. Khảo sát tỉ lệ rắn – lỏng
- Lấy cùng một khối lượng chất rắn (15g/1 mẫu) cho vào 4 bình tam giác
với các thể tích dung dịch HCl 5% lần lượt là 100ml, 150ml, 200 ml, 250ml.
- Sau đó chiết nóng ở t = 800C trong 6 giờ rồi lọc, kết quả thu được dịch
lọc như hình 3.6.

Hình 3.6: Dịch chiết tỷ lệ R/L
- Các dịch lọc đem pha loãng 50 lần rồi tiến hành đo UV-VIS.
- Kết quả thu được trình bày ở hình 3.7, hình 3.8 và bảng 3.4.

MAU2
MAU1
MAU3

MAU4

Hình 3.7: Phổ hấp thụ phân tử của dịch chiết với các tỉ lệ R/L
khác nhau


-25-

Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của tỉ lệ R-L đến độ hấp thụ.
Mẫu

Nguyên liệu (g)

Vdm(ml)

Độ hấp thụ tại λmax = 275,9 nm

1

15

100

1.048

2

15

150

1.143

3

15

200

0.775

4

15

250

0.585

Độ hấp thụ
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4

0.2
0
0

50

100

150

200

250

300
Vml

Hình 3.8: Biểu đồ giữa độ hấp thụ phân tử với các thể tích khác nhau
* Nhận xét: Ở cùng một khối lượng như nhau, nhưng chiết với tỷ lệ dung
môi khác nhau. Thì độ hấp thụ tăng theo độ tăng thể tích từ 100 ml đến 150 ml,
sau đó độ hấp thụ giảm mạnh theo thể tích từ 150 ml đến 200 ml, rồi độ hấp thụ
giảm ít theo thể tích từ 200 ml đến 250 ml. Vậy ở thể tích dung môi là 150 ml có
độ hấp thụ lớn nhất. Do đó tỷ lệ chiết tối ưu là 1/10 (g/ml).
3.3.2.2. Khảo sát thời gian chiết
- Lấy 10g bột dược liệu cho vào 4 bình tam giác, sau đó cho 150ml dung
dịch HCl 5% vào mỗi bình đó. Đun 4 bình trên trong bếp cách thủy ở nhiệt độ
800C trong thời gian lần lượt 4h, 6h, 8h, 10h rồi lọc qua giấy lọc thu được dịch
lọc.
- Các dịch lọc đem pha loãng 50 lần rồi tiến hành đo UV-VIS.