định lượng thuốc mỡ benzosali bằng quang phổ tử ngoại khả kiến

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN HÓA HỌC
-----

-----

TRẦN QUÁN TRUNG

ĐỊNH LƯỢNG THUỐC MỠ BENZOSALI
BẰNG QUANG PHỔ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH HÓA DƯỢC

2015


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN HÓA HỌC
-----

-----

TRẦN QUÁN TRUNG

ĐỊNH LƯỢNG THUỐC MỠ BENZOSALI
BẰNG QUANG PHỔ TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ths. LÂM PHƯỚC ĐIỀN

2015


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN HÓA HỌC
-----

-----

Đề tài:

ĐỊNH LƯỢNG THUỐC MỠ BENZOSALI BẰNG QUANG PHỔ
TỬ NGOẠI KHẢ KIẾN
LỜI CAM ĐOAN
Đề tài đã được thực hiện qua quá trình tìm hiểu, đúc kết được từ nhiều nguồn tài liệu
với sự giúp đỡ của thầy Lâm Phước Điền và đã được chỉnh sửa theo góp ý của hội
đồng phản biện và cán bộ hướng dẫn.
Cần Thơ, ngày 30, tháng 5, năm 2015

Trần Quán Trung

Luận văn tốt nghiệp ngành: Hóa dược
Đã bảo vệ và được duyệt

Hiệu trưởng: ……………………………………..
Trưởng khoa: …………………………………….

Trưởng chuyên ngành

Cán bộ hướng dẫn

Lâm Phước Điền

i


Trường Đại học Cần Thơ
Khoa Khoa Học Tự Nhiên
Bộ môn Hóa

Cộng Hòa Xã hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Độc lập-Tự do-Hạnh phúc
---------

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
1. Cán bộ hướng dẫn: Ths. Lâm Phước Điền
Đề tài: Định lượng thuốc mỡ Benzosali bằng phương pháp quang phổ tử
ngoại khả kiến
Sinh viên thực hiện: Trần Quán Trung
2. Nội dung nhận xét:
a. Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:
............................................................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................
b. Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:
Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:

............................................................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................
Những vấn đề còn hạn chế:
............................................................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................
c. Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung
chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
............................................................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................
d. Kết luận, đề nghị và điểm:
............................................................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày….. tháng…...năm 2015
Cán bộ hướng dẫn

Ths. LÂM PHƯỚC ĐIỀN

ii


Trường Đại học Cần Thơ
Khoa Khoa Học Tự Nhiên
Bộ môn Hóa

Cộng Hòa Xã hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Độc lập-Tự do-Hạnh phúc

---------

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN
1. Cán bộ phản biện: ……………………………………
Đề tài: Định lượng thuốc mỡ Benzosali bằng phương pháp quang phổ tử
ngoại khả kiến
Sinh viên thực hiện: Trần Quán Trung
- MSSV: 2112108
- Lớp: Hóa dược
- Khóa: 37
2. Nội dung nhận xét:
a. Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:
............................................................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................
b. Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:
Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
............................................................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................
Những vấn đề còn hạn chế:
............................................................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................
c. Nhận xét đối với từng sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung
chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
............................................................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................
d. Kết luận, đề nghị và điểm:

............................................................................................................................
............................................................................................................................
............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày….. tháng…...năm 2015
Cán bộ phản biện

iii


LỜI CẢM ƠN
-----

-----

Qua quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, giúp em biết thêm được nhiều kiến
thức, hiểu sâu hơn những vấn đề được học trên lớp, rèn luyện những kĩ năng bổ ích
phục vụ cho công việc sau này, để đạt được kết quả như ngày hôm nay, em xin cảm
ơn:
Ban giám hiệu trường Đại học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Khoa Học Tự Nhiên, quý
thầy, cô đã tận tình truyền đạt kiến thức, giúp em biết thêm nhiều điều thú vị.
Tập thể cán bộ hướng dẫn phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện tốt nhất cho em
trong suốt quá trình tiến hành đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Lâm Phước Điền, thầyđã tận tình
cung cấp kiến thức, hướng dẫn, giúp em giải quyết những vấn đề mắc phải đểem có
thể hoàn thành được đề tài của mình.
Cuối cùng, con xin cảm ơn cha mẹ, người thân đã là nguồn động lực lớn nhất, tạo
điều kiện, làm chổ dựa tinh thần, giúp con vượt qua những khó khăn trong suốt quảng
thời gian học tập.
Xin chân thành cảm ơn!

Trần Quán Trung

iv


TÓM TẮT
-----

-----

Bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến kết hợp với chuẩn độ acid – base
nhằm xác định hàm lượng hai thành phần acid salicylic và acid benzoic trong thuốc
mỡ Benzosali.
Trong phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến, thông qua phản ứng tạo phức
màu giữa acid salicylic với Fe3+, tiến hành đo quang ở bước sóng 528nm trong miền
giá trị nồng độ trong khoảng 0,0048mg/ml – 0,0912mg/ml. Bằng việc thiết lập đường
chuẩn, tiến hành xác định hàm lượng acid salicylic trong mẫu thuốc. Qua kết quả việc
thử độ đúng, độ chính xác kết hợp với chuẩn độ acid-base xác định rằng phương pháp
có thể sử dụng được và mẫu thử đạt yêu cầu về hàm lượng.

v


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
-----

-----

UV/Vis(Ultraviolet-Visible): Tử ngoại – Khả kiến
Abs hoặc A(Absorbance): Độ hấp thu

C (Concentration): Nồng độ
AOAC (Association of Official Agricultural Chemists): Hiệp hội các nhà hóa phân
tích chính thống
SD (Standard Deviation): Độ lệch chuẩn
RSD(Relative Standard Deviation): Độ lệch chuẩn tương đối
LOD (Limit Of Detection): Giới hạn phát hiện
LOQ (Limit Of Quantification): Giới hạn định lượng

vi


DANH MỤC HÌNH
-----

-----

Hình 2.1: Thuốc mỡ Benzosali .................................................................................... 2
Hình 2.2: Đặc trưng năng lượng miền phổ ................................................................... 4
Hình 2.3: Sơ đồ thiết bị đo quang................................................................................. 5
Hình 2.4: Tương quan của phương pháp thêm chuẩn sử dụng đồ thị ............................ 9
Hình 2.5: Đồ thị đường chuẩn tương quan A-C.......................................................... 10
Hình 3.1: Máy quang phổ UV-VIS và máy quang phổ 6800 JENWAY ..................... 18
Hình 3.2: Sơ đồ phản ứng .......................................................................................... 19
Hình 3.3: Màu của phức giữa Fe3+ với acid salicylic .................................................. 20
Hình 4.1: Phổ đồ acid salicylic với nồng độ khác nhau .............................................. 25
Hình 4.2: Độ hấp thu của dãy dung dịch xác định khoảng nồng độ tuyến tính............ 26
Hình 4.3: Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính nồng độ 0,0048mg/ml – 0,0912mg/ml .. 27
Hình 4.4: Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính nồng độ 0,0048mg/ml – 0,1008mg/ml .. 27
Hình 4.5: Độ hấp thu dãy dung dịch chuẩn ................................................................ 28
Hình 4.6: Đường chuẩn biểu thị mối tương quan A – C ............................................. 29

Hình 4.7: Dung dịch mẫu sau khi chuẩn..................................................................... 32

vii


DANH MỤC BẢNG
-----

-----

Bảng 2.1: Nguồn phát năng lượng trong các thiết bị quang phổ ................................... 6
Bảng 2.2: Values of t for v Degrees of Freedom for Various Confidence Leveis ....... 16
Bảng 3.1: Nội dung thí nghiệm .................................................................................. 20
Bảng 3.2: Dãy dung dịch xác định bước sóng cực đại ................................................ 21
Bảng 3.3: Dãy dung dịch xác định khoảng tuyến tính ................................................ 22
Bảng 3.4: Dãy dung dịch xây dựng đường chuẩn ....................................................... 22
Bảng 3.5: Khảo sát độ đúng ....................................................................................... 23
Bảng 3.6: Khảo sát độ chính xác ................................................................................ 24
Bảng 4.1: Kết quả khảo sát nồng độ tuyến tính .......................................................... 26
Bảng 4.2: Kết quả khảo sát độ hấp thu dãy chuẩn ...................................................... 28
Bảng 4.3: Giá trị LOD, LOQ của phương pháp .......................................................... 29
Bảng 4.4: Kết quả định lượng acid salicylic trong mẫu phân tích ............................... 30
Bảng 4.5: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp ............................................... 30
Bảng 4.6: Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp ........................................ 31
Bảng 4.7: Kết quả định lượng acid benzoic trong mẫu phân tích ................................ 31

viii


MỤC LỤC

-----

-----

LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................... i
NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN .....................................ii
NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN ...................................... iii
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ iv
TÓM TẮT ................................................................................................................... v
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT...................................................................................... vi
DANH MỤC HÌNH................................................................................................... vii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................viii
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................... 1
1.1

Đặt vấn đề[9][10][6] ............................................................................................ 1

1.2

Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................... 1

1.3

Nội dung nghiên cứu [4][8] ................................................................................ 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN........................................................................................ 2
2.1

Giới thiệu sản phẩm thuốc mỡ benzosali......................................................... 2

2.1.1

Acid benzoic ............................................................................................ 2

2.1.2

Acid salicylic ........................................................................................... 3

2.2

Phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến[3][6]................................................ 3

2.2.1

Giới thiệu ................................................................................................. 3

2.2.2

Nguyên tắc ............................................................................................... 4

2.2.3

Cơ sở định lượng...................................................................................... 4

2.2.4

Ứng dụng của phổ tử ngoại, khả kiến ..................................................... 10

2.3

Nội dung thẩm định[4][8] ................................................................................ 11

2.3.1

Độ tuyến tính ......................................................................................... 11

2.3.2

Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng ................................................. 13

2.3.3

Độ chính xác .......................................................................................... 14

2.3.4

Độ đúng ................................................................................................. 15

2.3.5

Giới hạn tin cậy...................................................................................... 15

2.3.6

Miền giá trị (khoảng nồng độ tuyến tính) (Range) .................................. 16

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM ................................................................................. 18

ix

3.1

Địa điểm, thời gian và phương tiện nghiên cứu ............................................. 18

3.1.1

Địa điểm ................................................................................................ 18

3.1.2

Thởi gian................................................................................................ 18

3.1.3

Thiết bị, dụng cụ, hóa chất ..................................................................... 18

3.2

Định lượng thuốc mỡ benzosali[1] ................................................................. 18

3.2.1

Nguyên tắc chung: ................................................................................. 18

3.2.2

Nguyên tắc định lượng acid salicylic:..................................................... 19

3.3

Hoạch định thí nghiệm.................................................................................. 20

3.4

Tiến hành thí nghiệm .................................................................................... 20

3.4.1

Xác định bước sóng cực đại ................................................................... 21

3.4.2

Khảo sát khoảng tuyến tính, miền giá trị ................................................ 21

3.4.3

Thiết lập đường chuẩn............................................................................ 22

3.4.4

Khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng ................................... 22

3.4.5

Định lượng mẫu thuốc mỡ Banzosali (TRAPHACO) ............................. 23

3.4.6

Khảo sát độ đúng ................................................................................... 23

3.4.7

Khảo sát độ chính xác ............................................................................ 24

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ ............................................................................................ 25
4.1

Xác định bước sóng cực đại .......................................................................... 25

4.2

Xác định khoảng nồng độ tuyến tính và miền giá trị ..................................... 26

4.3

Xây dựng đường chuẩn ................................................................................. 28

4.4

Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) ................................. 29

4.5

Định lượng mẫu ............................................................................................ 30

4.6

Khảo sát độ đúng .......................................................................................... 30

4.7

Độ chính xác ................................................................................................ 31

4.8

Khảo sát hàm lượng acid benzoic ................................................................. 31

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 33
5.1

Kết luận ........................................................................................................ 33

5.2

Kiến nghị ...................................................................................................... 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 34

x


CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề[9][10][6]
Hiện nay, bệnh vể da đã xãy ra phổ biến trên thế giới nói chung, đặc biệt ở Việt
Nam nói riêng. Do điều kiện khí hậu nóng ẩm thay đổi theo mùa, thói quen thường
xuyên sử dụng các hóa chất, các sản phẩm công nghiệp trong lao động sinh hoạt, và
yếu tố vi khuẩn trong môi trường sống nên bệnh về da đã và đang xãy ra khắp cả nước,
phổ biến với các bệnh nấm da, nấm tóc, lang ben, viêm da tiết bã nhờn, vẩy nến ở
mình hoặc da đầu,… Với thực trạng trên nhằm phục vụ nhu cầu hiện nay, các loại

thuốc điều trị bệnh về da đã xuất hiện với nhiều dạng bào chế, thành phần,…. Thuốc
mở benzosali là một trong số đó, hiện đang góp phần trong công tác trị liệu bệnh về da
khá hiêu quả ở Việt Nam.
Tuy nhiên, cùng sự xuất hiện rộng rãi của benzosali với nhiều nhà sản xuất trên
thị trường như hiện nay, công tác kiểm định chất lượng là một việc quan trọng nhằm
đảm bảo an toàn trong chăm sóc sức khỏe cho cộng đồng. Có nhiều phương pháp có
thể thực hiện, vấn đề đặc ra là phải tìm ra phương pháp đơn giản có thể thực hiện trện
diện rộng, nhưng vẫn đảm bảo được độ chính xác và tính hiệu quả cao.
Phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến là phương pháp phân tích dựa vào mối
quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch theo định luật Lambert – Beer. Ưu
điểm của phương pháp quang phổ tử ngoại và khả kiến trong phân tích định lượng là
có độ nhạy cao, có thể phát hiện được một lượng nhỏ chất hữu cơ hoặc ion vô cơ trong
dung dịch, sai số tương đối nhỏ (chỉ 1 đến 3%). Do đó đang trở nên phổ biến trong
phân tích kiểm định dược phẩm.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài: Định lượng thuốc mỡ Benzosali bẳng phương pháp chuẩn độ acid-base
và quang phổ tử ngoại khả kiến. Nhằm xác định hàm lượng acid benzoic và acid
salicylic thực trong sản phẩm benzosali được bán trên thị trường.
1.3 Nội dung nghiên cứu [4][8]
− Định lượng acid benzoic bằng chuẩn độ acid-base
− Định lượng acid salicylic bằng quang phổ hấp thu tử ngoại khả kiến:
+
+
+
+
+
+

Khảo sát độ hấp thu cực đại (λmax) của acid salicylic.
Khảo sát khoảng tuyến tính.

Lập đường chuẩn.
Khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng.
Định lượng
Khảo sát độ đúng, độ lập lại của phương pháp.

1


CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1 Giới thiệu sản phẩm thuốc mỡ benzosali

Hình 2.1: Thuốc mỡ Benzosali
Công thức:

Acid benzoic ……………………… 0,6g
Acid salicylic……………………… 0,3g
Tá dược………. vừa đủ…………….10g

Tác dụng: Bạt sừng, bong vảy, chống tiết bã nhờn, chống nấm tại chỗ, sát khuẩn,
giảm ngứa.
Nhà sản xuất: TRAPHACO
2.1.1 Acid benzoic
Công thức:

Tính chất:
+ Tinh thể rắn, không màu
+ Ít tan trong nước, tan trong nước sôi, dể tan trong ethanol, ether,
chloroform, benzene, dầu béo.
+ Nhiệt độ nóng chảy: tnc= 121,7oC
+ Nhiệt độ sôi: ts= 249oC

Cơ chế tác dụng:


Acid benzoic tác dụng theo cơ chế trực tiếp. Khi các phân tử acid benzoic
khuếch tán vào bên trong tế bào vi sinh vật nó sẽ tác động lên một số enzyme gây hạn
chế sự trao đổi chất, làm ức chế quá trình hô hấp của tế bào, ức chế quá trình oxy hóa
glucose và pyruvate, đồng thời làm tăng nhu cầu oxy trong suốt quá trình oxy hóa
glucose nên có tác dụng ngăn cản sự phân đôi của vi khuẩn. Acid benzoic còn có khả
năng tác dụng lên màng tế bào để hạn chế sự hấp thu axit amin của tế bào vi sinh vật
và các túi màng.
2.1.2 Acid salicylic
Công thức

O

OH

OH

Tính chất:
+ Tinh thể hình kim hoặc kết tinh trắng nhẹ, không mùi, vị ngọt hơi chua.
+ Ít tan trong nước lạnh, tan trong nước sôi, dễ tan trong ethanol và ether,
hơi tan trong chloroform.
+ Nhiệt độ nóng chảy: tnc= 157-159oC
+ Nhiệt độ sôi: ts= 211oC
Cơ chế tác dụng:
Acid salicylic có tác dụng làm tróc mạnh lớp sừng da và sát khuẩn nhẹ khi
bôi trên da. ở nồng độ thấp, thuốc có tác dụng tạo hình lớp sừng (điều chỉnh những bất
thường của quá trình sừng hóa); ở nồng độ cao (>1%), thuốc có tác dụng làm tróc lớp
sừng. Acid salicylic làm mềm và phá hủy lớp sừng bằng cách hydrat hóa nội sinh, có

thể do làm giảm pH, làm cho lớp biểu mô bị sừng hóa phồng lên, sau đó bong tróc ra.
Khi bôi quá nhiều, thuốc có thể gây hoại tử da bình thường. Ở nồng độ cao (ví dụ
20%), acid salicylic có tác dụng ăn mòn da. Môi trường ẩm là cần thiết để acid
salicylic có tác dụng làm lợt và làm bong tróc mô biểu bì. Thuốc có tác dụng chống
nấm yếu, nhờ làm bong lớp sừng ngăn chặn nấm phát triển và giúp cho các thuốc
chống nấm thấm vào da. Khi phối hợp, acid salicylic và lưu huỳnh có tác dụng hợp lực
làm tróc lớp sừng.
2.2 Phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến[3][6]
2.2.1 Giới thiệu
Phổ tử ngoại và phổ khả kiến có thể dùng để nhận dạng hóa chất nếu có được thư
viện đầy đủ để có thể so sánh phổ hóa chất và phổ của thư viện. Việc nhận dạng hóa
chất (phân tích định tính) thường bị giới hạn vì số dãy hấp thu trong phổ tử ngoại rất ít

3


và thường rộng, người ta có thể ước lượng cấu trúc, sự bố trí của nhóm mang màu
trong phân tử chứ còn nhận dạng toàn vẹn phân tử thì vẫn còn nhiều khó khăn nhất
định.
Tuy nhiên, phổ tử ngoại và khả kiến rất có ích trong phân tích định lượng một
hợp chất nếu có sẵn chất chuẩn. Với các phân tử có ε lớn, nồng độ có thể xác định
được tương đối khá nhỏ.
2.2.2 Nguyên tắc
Phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến là phương pháp phân tích dựa trên sự
tương tác chọn lọc giữa chất cần xác định với năng lượng bức xạ thuộc vùng tử ngoại,
khả kiến.
Nguyên tắc của phương pháp là dựa vào lượng ánh sáng đã bị hấp thu bởi chất
hấp thu để tính hàm lượng của chất hấp thu.

Hình 2.2: Đặc trưng năng lượng miền phổ

2.2.3 Cơ sở định lượng
2.2.3.1

Tuân theo định luật Lambert – Beer

Khi chiếu một chùm bức xạ đơn sắc đi qua một lớp dung dịch có bề dày l và có
nồng độ là C, thì sau khi đi qua dung dịch cường độ bức xạ bị giảm đi do quá trình hấp
thu, phản xạ, tán xạ… Độ hấp thu quang của dung dịch tỉ lệ thuận với C và l.

Aλ=lg
Tỉ số

= εlC

x100% = Tđược gọi là độ truyền quang.

Trong đó:

+ Aλ: Độ hấp thu
4


+ ε: Hệ số hấp thu mol (lit.mol-1.cm-1), ε đặc trưng cho khả năng hấp thu
ánh sáng của dung dịch. Phụ thuộc vào bản chất dung dịch và bước sóng
λ.
+ l: Bề dày dung dịch (cm).
+ C: Nồng độ dung dịch (mol/l).
+ I0: Cường độ bức xạ ban đầu.
+ I: Cường độ của bức xạ khi đi ra khỏi dung dịch.
Độ truyền quang (T) hay độ hấp thu (A) phụ thuộc vào bản chất của vật chất, độ

dày truyền ánh sáng I và nồng độ C của dung dịch.
2.2.3.2

Khoảng tuân theo định luật Lambert-Beer

Khi biểu diễn định luật Lambert-Beer trên đồ thị tùy theo cách thực hiện phép đo,
ta thường gặp đường biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thu A vào cường độ C của dung
dịch có dạng: y=ax+b. Hệ số góc a cho biết độ nhạy của phương pháp, trong phương
pháp quang phổ tử ngoại khả kiến người ta chỉ đo dung dịch trong khoảng tuân theo
định luật Lambert – Beer tức là khoảng nồng độ mà ở đó giá trị εkhông thay đổi. Hệ số
góc a càng lớn và khoảng tuân theo định luật Lambert-Beer càng rộng là điều kiện
thuận lợi cho phép xác định.
2.2.3.3

Sự lệch khỏi định luật Beer

Khoảng tuyến tính LOL (Limit of Linear Response) là khoảng nồng độ tuân theo
định luật Beer (A=εlC) nghĩa là khi nồng độ tăng thì độ hấp thu quang A tăng. Ngoài
giới hạn LOL là sự lệch khỏi định luật Beer, nghĩa là khi nồng độ tăng nhưng độ hấp
thụ quang A hầu như không tăng nữa. Nguyên nhân của quá trình này là do nồng độ
quá lớn. Ngoài ra khoảng tuyến tính LOL còn bị ảnh hưởng bởi dung môi, mức độ đơn
sắc của ánh sáng sử dụng, pH của dung dịch, lực ion, sự pha loãng.

Hình 2.3: Sơ đồ thiết bị đo quang

5


Nguồn sáng:là chùm bức xạ phát ra từ đèn. Máy quang phổ dung đèn hydro hay
đèn Deuterium cho phổ phát xạ liên tục trong vùng UV từ 160-380nm (nhưng thường

sử dụng 200-340nm) và đèn Tungsten halogen đo vùng 380-1000nm. Để làm việc cho
cả hai vùng thì phải có đủ 2 loại đèn trên. Một yêu cầu đối với nguồn sáng là phải ổn
định, tuổi thọ cao và phát bức xạ liên tục trong vùng phổ cần đo.
Bảng 2.1: Nguồn phát năng lượng trong các thiết bị quang phổ
Nguồn

Vùng bước sóng

Sử dụng

Đèn H2 và D2

160 – 380 nm

Hấp thụ phân tử tử ngoại

Đèn Tungsten

320 – 2400 nm

Hấp thụ phân tử khả kiến

Đèn hồ quang Xe

200 – 1000 nm

Phát xạ huỳnh quang phân tử

Đèn Nernst

0,4 – 20 µm

Hấp thụ phân tử hồng ngoại

Đèn cực âm hallow

UV/Vis

Hấp thụ nguyên tử

Đèn hơi nước Hg

UV/Vis

Phát xạ huỳnh quang phân tử

Laser

UV/Vis

Hấp thụ phân tử, nguyên tử, huỳnh
quang, tán xạ

Hệ tán sắc: Có chức năng tách bức xạ đa sắc thành bức xạ đơn sắc, bao gồm
kính lọc, lăng kính hay cách tử.Cách tử là một bảng nhôm hay các kim loại Cu, Ag,
Au... được vạch thành những rãnh hình tam giác song song. Khi chiếu ánh sáng qua
cách tử, phần còn lại có tác dụng tạo nên vân nhiễu xạ có bước sóng khác nhau, khi
quay cách tử sẽ tạo ra phổ nhiễu xạ giống như trường hợp ánh sáng qua lăng kính. Ưu
điểm là cho độ phân giải tốt, tán sắc tuyến tính, độ rộng của dải ổn định, chọn bước
sóng đơn giản, gọn nhẹ, dễ chế tạo nên hiện nay sử dụng cách tử tạo ánh sáng đơn sắc

được ưa chuộng. Cách tử dùng cho UV/Vis có 1200 vạch/mm (thường dao động từ 300
– 3600 vạch/mm, số vạch càng nhiều thì năng suất phân giải càng cao.
Mẫu phân tích: chất phân tích có thể cho tác dụng với một thuốc thử trong môi
trường thích hợp nhằm tạo phức chất có độ nhạy đảm bảo tính định lượng cho phương
pháp. Nêu chất phân tích là chất khí thì phải chứa mẫu vào cuvet đóng kín. Cuvet phải
làm bằng chất liệu cho bức xạ ở vùng cần đo đi qua. Cuvet thủy tinh không thích hợp
cho vùng UV. Cuvet thạch anh cho bức xạ đi qua từ 190-1000nm. Cuvet nhựa chỉ
dùng trong vùng Vis và chỉ sử dụng được một vài lần.
Detector: trong các máy đơn giản dùng tế bào quang điện để chuyển tín hiệu
quang thành tín hiệu điện rồi cho qua bộ khuếch đại hiển thị kết quả đo. Trong các
máy thế hệ mới có độ nhạy cao thường dùng detector dạng ống nhân quang hoặc loại
chuỗi diot (DAD). Detector chuỗi diot thích hợp cho việc đo đồng thời nhiều cấu tử
với nhiều bước sóng khác nhau, thiết bị khá bền.

6


2.2.3.4

Nguyên lý hoạt động của máy quang phổ tử ngoại khả kiến

Hai nguồn sáng phát ra bức xạ tử ngoại, khả kiến từ đèn Deutrium và đèn
Tungsten qua khe vào đến bộ phận tán sắc (phổ biến là lăng kính thạch anh và cách
tử). Tại đây ánh sáng đa sắc sẽ được tách thành đơn sắc, bộ phận chia chùm sáng sẽ
hướng chùm sáng đơn sắc luân phiên đi đến cuvet chứa dung dịch mẫu và cuvet chứa
dung môi. Bộ phận phân tích detector sẽ so sánh cường độ chùm sáng đi qua dung
dịch mẫu (I) và cường độ chùm sáng đi qua dung môi (I0), các tế bào quang điện sẽ
chuyển tín hiệu quang thành tín hiệu điện rồi cho qua bộ khuếch đại hiển thị kết quả
đo.
2.2.3.5

Một số yêu cầu của phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến

Hợp chất cần xác định là phải bền, ít phân ly, ổn định, không thay đổi thành phần
trong khoảng thời gian nhất định để thực hiện phép đo (10-20 phút).
Hệ sốε lớn có giá trị từ 103-5.104 l.mol-1.cm-1, có thể thực hiện phản ứng tạo màu
với các thuốc thử vô cơ và hữu cơ.
Nồng độ các chất xác định theo định luật Lambert-Beer.
Các hợp chất phức cần đo phải có λmax khác với λmax củathuốc thử trong cùng
điều kiện tức là ∆λ = 80-100nm.
Dung môi để đo quang phổ tử ngoại, khả kiến không được hấp thu ở vùng phổ
cần đo. Người ta thường dùng các loại dung môi như: methanol, ethanol, nước,…
Trong khi đo thì dung môi đóng vai trò quang trọng nên dung môi phải được tinh
chế một cách cẩn thận. Nếu dung môi có lẫn tạp chất với một lượng nhỏ cũng có thể
làm sai lệch kết quả.
2.2.3.6

Một số phương pháp phân tích quang phổ tử ngoại khả kiến
− Phương pháp so sánh:

So sánh cường độ màu của dung dịch cần xác định với cường độ màu của
dung dịch chuẩn đã biết nồng độ. Gọi nồng độ của chất chuẩn là Ck, của mẫu phân tích
là Cx, dựa theo định luật Lambert-Beer có thể viết:
Ak = εklkCk

hay

εk = Ak/lkCk

Ax = εxlxCx

hay

εx = Ax/lxCx

Từ hai phương trình trên suy ra: Cx =
Nếu chọn cuvet đo mẫu chuẩn và mẫu phân tích có chiều dày như nhau tức
lk=lxthì có thể viết: Cx =
Khi sử dụng hai dung dịch chuẩn:

7


Cx = C1 +

(Ax – A1)

Với A1, A2, C1, C2 là độ hấp thu và nồng độ của dung dịch chuẩn tương ứng
sao cho A1< Ax< A2 có nghĩa C1 < Cx< C2 .
− Phương pháp thêm chuẩn
Phạm vi ứng dụng là xác định các chất có hàm lượng vi lượng hoặc siêu vi
lượng, loại bỏ ảnh hưởng của chất lạ. Có 2 phương pháp là phương pháp sử dụng công
thức và phương pháp đồ thị.
+ Phương pháp sử dụng công thức:
C = C
Trong đó:

A
A
−A

Axlà độ hấp thu của dung dịch xác định tương ứng với thể tích Vx

A

là độ hấp thu của dung dịch có thêm chuẩn.

Ca là nồng độ chất chuẩn thêm vào.

Cxlà nồng độ chất cần xác định trong thể tích Vx
Công thức đươc thiết lập từ:
Ax = εlCx

A

= εxl(Cx + Ca )

Cx được biểu diễn theo đơn vị của Ca
Cách thực hiện:

Lấy 3 lần của dung dịch cần xác định nồng độ cho vào 3 bình định
mức có thể tích V (ml).
Bình 1: Thêm thuốc thử và các chất để tạo môi trường pH cho
dung dịch, dung dịch gọi là dung dịch xác định Cx, độ hấp thu quang tương ứng là Ax.
Bình 2: Thêm một lượng chính xác dung dịch tiêu chuẩn đã biết
chính xác nồng độ Ca, tiến hành phản ứng tạo màu giống bình 1. Dung dịch có độ hấp
thu tương ứng là
.
Bình 3: Chỉ thêm các chất để tạo pH cho dung dịch, lấy dung dịch
này làm dung dịch so sánh.

Áp dụng công thức:
=

−
8


Từ Cx có trong thể tích Vx (ml) có thể quy về thể tích ban đâu của
mẫu V0 (ml):
=
+ Phương pháp sử dụng đồ thị:
Có ít nhất 3 dung dịch thêm chuẩn. Lấy ít nhất 4 lần của dung dịch cần
xác định nồng độ cho vào 4 bình định mức V (ml). Sau đó thêm chính xác một lượng
V1, V2, V3, dung dịch tiêu chuẩn có nồng độ tương ứng Ca1, Ca2, Ca3 vào 3 bình định
mức trên. Tiến hành phản ứng tạo màu. Bình còn lại để làm dung dịch so sánh, cũng
chuẩn bị giống như phương pháp công thức.
Độ hấp thu của các dung dịch thêm so với dung dịch so sánh
A
Ax + a3

Ax + a2
Ax + a1
Ax
Ca1

Ca2

Ca3

C

Hình 2.4: Tương quan của phương pháp thêm chuẩn sử dụng đồ thị
Có thể đọc kết quả trên đồ thị hoặc sử dụng phương trình hồi quy có
dạng:
A = aC + b (hồi quy tuyến tính y = ax + b)
Ax = b
Cx=
− Phương pháp lập đường chuẩn
Phương trình cơ bản của phép đo định lượng theo phổ UV-Vis là:
A= εlC (εl = const vậy A = f(C) là hàm bậc nhất)
Bằng cách chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần và biết
chính xác trước C1, C2, C3,… (thường là 5-7 nồng độ nằm trong vùng tuyến tính của
mối quan hệ A-C) và dung dịch mẫu có chất cần xác định nồng độ trong cùng điều
kiện phân tích như dãy dung dịch chuẩn. Nghiên cứu chọn điều kiện phù hợp nhất đo
phổ của các mẫu chuẩn và mẫu phân tích như các thông số về thời gian, môi trường,

9


loại cuvet,… Đo độ hấp thu quang của các dung dịch chuẩn, dựng đường chuẩn theo
hệ tọa độ A-C sau đó đo độ hấp thu quang của dung dịch mẫu cần xác định nồng độ
(giả sử là Ax), rồi áp vào đường chuẩn ta sẽ có nồng độ Cx tương ứng với nồng độ chất
cần xác định.

Hình 2.5: Đồ thị đường chuẩn tương quan A-C
2.2.4 Ứng dụng của phổ tử ngoại, khả kiến
2.2.4.1

Xác định mức độ tinh khiết của hợp chất

Nếu hợp chất trong suốt, các vết của tạp chất dễ phát hiện khi chúng có cường độ
hấp thụ đủ mạnh.
Nếu hợp chất có vạch hấp thụ ở vùng tử ngoại – khả kiến thì cần tinh chế cho đến
khi hệ số phân tử của sự hấp thụ đạt giá trị không đổi.
2.2.4.2

Nhận biết và xác định cấu trúc của hợp chất

Nhận biết sản phẩm của sự tổng hợp bằng cách so sánh đường cong hấp thụ của
sản phẩm tổng hợp và đường hấp thụ của sản phẩm thiên nhiên hay mẫu chuẩn.
Nhận biết nhóm chức của hợp chất dựa vào quang phổ, các thông tin về các
nguyên tố và phản ứng định các nhóm chức. Có thể sử dụng cường độ vạch hấp thụ
với mục đích nhận dạng trong trường hợp chất tinh khiết.
Nhận biết cấu tạo của hợp chất ban đầu dựa vào số liệu hấp thụ của các dẫn xuất
hay sản phẩm phân hủy của nó.
Xác định đồng phân hình học, dạng trans có λmax, εmaxlớn hơn dạng cis.
Xác định sự đồng phân do sự hỗ biến enol – keton, thiol – thion.

10


2.2.4.3

Phân tích hỗn hợp

Định tính và định lượng hỗn hợp.
Điều kiện để có kết quả xác đáng: chất phân tích tuân theo định luật Lambert –
Beer, đã biết hằng số hấp thụ của mỗi hợp chất tinh khiết.
2.2.4.4

Xác định trọng lượng phân tử

Khi hợp chất ban đầu không hấp thụ trong vùng sóng này, nếu nó phản ứng với
tác nhân có vạch hấp thụ đặc trưng, cường độ mạnh và độ dài sóng… thì hệ số hấp thụ
của chất dẫn xuất thu được không khác hệ số của tác nhân.
Nếu hệ số hấp thụ này không đổi trong bất cứ dẫn xuất nào thì mật độ quang học
Asẽ phụ thuộc vào M của chất ban đầu
=

!"

Trong đó:

2.2.4.5

+ ! là nồng độ chất
+ " là chiều dày cuvet

Xác định hằng số phân ly của acid, base

Ví dụ:

#$ + #& ' → #) ' + $
*+ = *# + ",

Quang phổ được sử dụng để xác định ",
2.2.4.6

Nghiên cứu phản ứng hóa học

012
02/

-.
./

, đo pH của dung dịch sẽ suy ra pKa.

Theo dõi biến đổi nồng độ các chất trong phản ứng.
Xác định vận tốc phản ứng.
Thiết lập công thức thực nghiệm và hằng số tạo phức trong dung dịch.
2.3 Nội dung thẩm định[4][8]
Kiểm định, đánh giá phương pháp bằng một số nội dung thẩm định sau:
2.3.1 Độ tuyến tính
−

Định nghĩa:

Độ tuyến tính của phương pháp phân tích là khả năng luận ra kết quả thử
của phương pháp hoặc bằng phép biến đổi toán học hay trực tiếp dựa vào tương quan
tỷ lệ giữa đại lượng đo được và nồng độ.
Độ tuyến tính trong một miền giá trị được xác định bằng hệ số tương quan.

11


−

Cách xác định:

Tiến hành thực nghiệm để xác định ứng với các nồng độ x biết trước của
giá trị đo được y. Như ta đã biết nếu y phụ thuộc tuyến tính vào x có nghĩa là trong
khoảng nồng độ cần khảo sát đường biểu diễn y theo x là một đường thẳng (đoạn
thằng) theo phương trình sau: y= ax + b.
Dựa vào kết quả thu được từ thực nghiệm của x và y tương ứng ta tính hệ số
tương quan:
3=

∑<7=>567 − 6̅ 95:7 − :;9

?∑<7=>567 − 6̅ 9& ∑<7=>5:7 − :;9&

Trong đó:
+
+
+
+
+
+
+
+
+

xi,yilà các giá trị thực nghiệm.
6̅ ,:; là giá trị trung bình.
R phải nằm trong giá trị -1 đến +1
Nếu:
R = 1: có tương quan tuyến tính rõ rệt.
R> 0: có tương quan đồng biến.
R < 0: có tương quan nghịch biến.

R< 0,5: coi như không có tương quan tuyến tính.
R> 0,5: có phụ thuộc tuyến tính.

Sau khi đã xác định được khoảng tuyến tính của phương pháp, ta có thể xây
dựng phương pháp hồi quy của khoảng này, tức là đi tìm hệ số a và b của phương
trình:
@=

A ∑<7=> 67 :7 − ∑<7=> 67 ∑<7=> :7
A ∑<7=> 67& − 5∑<7=> 67 9&
∑<7=> :7 − @ ∑<7=> 67
B=
A

Tính tuyến tính được biểu thị bằng hệ số tương quan R2
−
tuyến tính.

Yêu cầu:

Hệ số tương quan nằm traong khoảng 0,999 ≤ R ≤ 1 thì có sự tương quan

12


2.3.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng
2.3.2.1

Giới hạn phát hiện (LOD):
Định nghĩa:

−

Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ
không đảm bảo đo của phương pháp. Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích
trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng được (đối với phương
pháp định lượng).
Cách xác định:

−

Làm trên mẫu trắng (mẫu có thành phần như mẫu thử nhưng không có chất
phân tích)
Phân tích mẫu n (n = 6 – 10) lần song song, tính độ lệch chuẩn. Độ lệch
chuẩn này phải khác không.
Tính LOD:

D'E = 6̅ + 3GE
GE = H

∑<7=>56 7 − 6̅ 9&
A−1

Trong đó:
+
+
2.3.2.2

6̅ 0: trung bình của mẫu trắng.
SD0: độ lệch chuẩn của mẫu trắng.

Giới hạn định lượng (LOQ):

−

Định nghĩa:

Giới hạn định lượng là nồng độ tối thiểu của chất cần phân tích có trong
mẫu thí nghiệm còn có thể xác định được với độ đúng và độ chính xác có thể chấp
nhận được.
LOQ trong nhiều trường hợp có thể là điểm thấp nhất của khoảng tuyến
tính.
−

Cách xác định:
Làm trên mẫu trắng (mẫu có thành phần như mẫu thử nhưng không có chất

phân tích)
Phân tích mẫu n (n=6 – 10) lần song song, tính độ lệch chuẩn. Độ lệch
chuẩn này phải khác không.
Tính LOQ:

D'I = 6̅ + 10GE
13