Bước đầu nghiên cứu tổng hợp và thiết lập tạp chuẩn captopril disulfid

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN BÌNH NGUYÊN

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ
THIẾT LẬP TẠP CHUẨN CAPTOPRIL
DISULFID

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN BÌNH NGUYÊN

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ
THIẾT LẬP TẠP CHUẨN CAPTOPRIL
DISULFID
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH : KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ : 60720410
Người hướng dẫn khoa học: GS.TS.Nguyễn Hải Nam

Nơi thực hiện đề tài:
Bộ môn Hóa Dược – Trường Đại Học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2015


LỜI CẢM ƠN
Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những
sự hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp của người
khác. Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập ở giảng đường đại học đến nay,
em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và
bạn bè. Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô ở Bộ môn Hóa
Dược cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý
báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại bộ môn.
Em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới GS. TS. Nguyễn Hải Nam, ThS.
Trần Lan Hương đã tận tâm hướng dẫn em trong suốt quá trình học tập cũng
như hướng dẫn khoa học. Nếu không có những lời hướng dẫn, dạy bảo của thầy
cô thì em nghĩ bài luận văn này của em rất khó có thể hoàn thiện được. Một
lần nữa, em xin chân thành cám ơn thầy cô.
Em cũng xin cám ơn tới thầy Lê Xuân Kỳ - Bộ môn Hóa lý, các anh chị kỹ
thuật viên ở bộ môn Hóa Phân tích, các anh chị ở Khoa Hóa Pháp – Viện pháp y
quốc gia, các anh chị đồng nghiệp ở chuyên ngành kiểm nghiệm lớp cao học 19
đã giúp đỡ em trong suốt quá trình làm và hoàn thiện luận văn này.
Bài luận văn này được thực hiện trong khoảng thời gian dài. Bước đầu đi
vào thực tế tìm hiểu về lĩnh vự sáng tạo trong nghiên cứu khoa học, kiến thức của
em còn nhiều hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ. Do vậy không tránh khỏi những thiếu
sót là điều chắc chắn, em rất mong nhận được các ý kiến đóng góp quý báu của

các thầy cô để kiến thức của em trong lĩnh vực này được hoàn thiện hơn.
Sau cùng, em xin kính chúc quý Thầy Cô ở bộ môn Hóa Dược và GS.TS.
Nguyễn Hải Nam, ThS.Trần Lan Hương thật dồi dào sức khỏe, niềm tin để tiếp
tục thực hiện sứ mệnh cao đẹp của mình là truyền đạt kiến thức cho thế hệ mai
sau.
Trân trọng cám ơn
Hà Nội, ngày 19 tháng 8 năm 2015


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1: Các tạp chuẩn đã được thiết lập bởi các cơ sở trong nước

2

Bảng 1.2: Một số chế phẩm có chứa Captopril

4

Bảng 3.1: Sự phụ thuộc giữa thế điện cực với lượng Iod thêm vào

33

Bảng 3.2: Mối tương quan giữa lượng Iod thêm vào và khối lượng
cắn thu được
Bảng 3.3: Tương quan giữa nồng độ và thể tích Iod thêm vào với khối
lượng cắn
Bảng 3.4: Tương quan giữa khối lượng cắn với pH đệm

38

Bảng 3.5: Tương quan giữa khối lượng cân và lượng dung môi thêm
Vào
Bảng 3.6: Thể tích dung môi cần thiết để hòa tan vừa đủ 1 lượng chất
đã tổng hợp
Bảng 3.7: Kết quả đo phổ hồng ngoại

41

Bảng 3.8 : Kết quả đo phổ khối lượng

45

Bảng 3.9: Kết quả đo phổ NMR của Captopril Disulfid

46

Bảng 3.10: Kết quả xác định độ tinh khiết bằng đo quét nhiệt vi sai

48

Bảng 3.11: Thông số sắc ký đồ của Captopril Disulfid

53

Bảng 3.12: Thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết khi chạy độ
ổn định.
Bảng 3.13: Cách pha dãy dung dịch khảo sát độ tuyến tính

53

Bảng 3.14: Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic

55

Bảng 3.15: Kết quả độ chính xác của phương pháp

57

Bảng 3.16: Kết quả khảo sát tính đúng của phương pháp

58

Bảng 3.17: Kết quả định lượng Captopril Disulfid trong mẫu tổng hợp

61

2

40
41

42
44

55


DANH MỤC HÌNH
Trang

Hình 1.1: Phổ hồng ngoại của Captopril chuẩn

4

Hình 1.2: Kết quả sau khi chạy sắc ký

9

Hình 1.3: Phân tích thông số sắc ký

9

Hình 1.4: Phố khối lượng của sản phẩm sau khi phản ứng với KBrO3

15

Hình 1.5: Cấu trúc cột LC-DB

22

Hình 1.6: Cấu trúc cột có gốc Isopropyl

23

Hình 3.1: Biểu đồ mối tương quan giữa thế điện cực với lượng Iod
thêm vào
Hình 3.2: Sắc ký lớp mỏng khi chạy sản phẩm sau tổng hợp

33

Hình 3.3: Phân tích phổ khối lượng của sản phẩm

35

Hình 3.4: Mối tương quan giữa dE/dV với thể tích Iod thêm vào

36

Hình 3.5: Mối tương quan giữa lượng Iod thêm vào và khối lượng
cắn
Hình 3.6: Kết quả đo phổ khối lượng

39

Hình 3.7: Nhiệt độ nóng chảy và điểm chảy

44

Hình 3.8: So sánh phổ hồng ngoại giữa Captopril Disulfid với
Captopril
Hình 3.9: Sắc ký đồ thể hiện sự tinh khiết của hợp chất

45

Hình 3.10: Sắc ký đồ khi chạy DSC

47

Hình 3.11: Sắc ký đồ chạy theo dược điển anh

49

Hình 3.12: Sắc ký đồ sau khi thay đổi thể tích tiêm

49

Hình 3.13: Sắc ký đồ chạy hệ dung môi I

50

Hình 3.14: Sắc ký đồ khi chạy hệ dung môi II

50

Hình 3.15: Sắc ký đồ khi chạy hệ dung môi III

50

Hình 3.16: Sắc ký đồ chạy với tốc độ dòng 1,0 ml/min

51

Hình 3.17: Sắc ký đồ chạy với tốc độ dòng 1,2 ml/min

51

Hình 3.18: Sắc ký đồ khi chạy với 2 bước sóng

52

34

42

47


Hình 3.19: Sắc ký đồ của Captopril Disulfid

52

Hình 3.20: Sắc ký đồ của dung môi pha mẫu – mẫu trắng

54

Hình 3.21: Sắc ký đồ mẫu chuẩn

54

Hình 3.22: Sắc ký đồ mẫu thử

54

Hình 3.23: Sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích pic

56

Hình 3.24: Tương quan giữa lượng thêm vào và lượng tìm lại

59

Hình 3.25: Độ mất khối lượng do làm khô

60

2


Mục lục
ĐẶT VẤN ĐỀ.............................................................................................................................. 1
CHƯƠNG I : TỔNG QUAN....................................................................................................... 1
1.1.

CHẤT CHUẨN VÀ TẠP CHUẨN DÙNG TRONG KIỂM NGHIỆM .......................... 1

1.1.1.

Chất chuẩn dùng trong kiểm nghiệm [11].............................................................. 1

1.1.2.

Tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm [9][10]........................................................... 1

1.2.

ĐẠI CƯƠNG VỀ CAPTOPRIL.................................................................................... 2

1.1.1.

Công thức, tính chất .............................................................................................. 2

1.1.2.

Tác dụng, chỉ định, chống chỉ định : ...................................................................... 3

1.3. KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU CAPTOPRIL VÀ CÁC CHẾ PHẨM CHỨA
CAPTOPRIL ........................................................................................................................... 4
1.3.1.

Định tính ............................................................................................................... 4

1.3.2.

Định lượng............................................................................................................. 5

1.3.3.

Tạp chất liên quan ................................................................................................. 6

1.4.

ĐẠI CƯƠNG VỀ CAPTOPRIL DISULFID ................................................................. 9

1.4.1.

Công thức, tính chất .............................................................................................. 9

1.4.2.

Độc tính [18] [24] [42] [44] [45]........................................................................... 10

1.4.3.

Các sản phẩm chuyển hóa của Captopril Disulfid ............................................... 10

1.5.

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP LIÊN KẾT DISULFID ............................... 11

1.5.1.

Phương pháp 1 [27] ............................................................................................. 11

1.5.2.

Phương pháp 2 [32] ............................................................................................ 12

1.5.3.

Phương pháp 3 [37] ............................................................................................ 12

1.5.4.

Tác nhân oxy hóa là Na2 S4 O6 [28]........................................................................ 13

1.5.5.

Tác nhân oxy hóa là K 3 (Fe(CN)6 ) [30] [38]........................................................... 14

1.5.6.

Tác nhân oxy hóa là H 2 O2 [47]............................................................................. 15

1.5.7.

Với tác nhân oxy hóa là Br2,KBrO3 [25] .............................................................. 15

1.6.

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HỮU CƠ [5]............... 16

1.6.1.

Phổ IR ................................................................................................................. 16

1.6.2.

Phổ khối – Mass spectrum ................................................................................... 17

1.6.3.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân................................................................................ 17

1.7.

TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO [1][4][46] ............................. 18

1.7.1.

Định nghĩa ........................................................................................................... 18

1.7.2.

Các thông số cơ bản của quá trình sắc ký ............................................................ 18

1.7.3.

Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC....................................................... 20

1.7.4.

Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký............................................... 21

1.7.5.

Phương pháp định lượng bằng HPLC ................................................................. 24

1.8.

QUÉT NHIỆT VI SAI ................................................................................................ 25


1.9.

THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH [10]..................................................... 26

1.9.1.

Yêu cầu chung ..................................................................................................... 26

1.9.2.

Các tiêu chí trong thẩm định phương pháp ......................................................... 26

CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................. 28
2.1.

NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU................................................................................. 28

2.1.1.

Hóa chất, thuốc thử ............................................................................................. 28

2.1.2.

Thiết bị và dụng cụ .............................................................................................. 28

2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 28
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 28
2.2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 29
2.2.3. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả .................................................................... 32
CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ....................................................................... 33
3.1
NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP CAPTOPRIL DISULFID TỪ CAPTOPRIL Ở QUY
MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM.................................................................................................. 33
3.1.1

Lựa chọn phương pháp và khảo sát điều kiện tổng hợp Captopril Disulfid ......... 33

3.1.2

Tinh chế Captopril Disulfid ................................................................................. 42

3.1.3

Quy trình bán tổng hợp và tinh chế Captopril Disulfid ....................................... 43

3.2
XÂY DỰNG BỘ DỮ LIỆU NHẬN DẠNG VÀ XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA
CAPTOPRIL DISULFID....................................................................................................... 43
3.2.1

Đặc điểm cảm quan ............................................................................................. 43

3.2.2

Nhiệt độ nóng chảy - DSC.................................................................................... 43

3.2.3

Kết quả đo phổ .................................................................................................... 44

3.2.4

Độ tinh khiết của hợp chất................................................................................... 47

3.3

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU ........................................ 48

3.3.1

Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích.................................................. 48

3.3.2
Áp dụng phương pháp xây dựng tiến hành định lượng Capotpirl Disulfid trong
mẫu đã tổng hợp được........................................................................................................ 60
CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN ...................................................................................................... 62

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……………………………………….66

2


ĐẶT VẤN ĐỀ
Tạp chuẩn trong kiểm nghiệm dược phẩm là chất chuẩn của các tạp chất liên
quan trong nguyên liệu làm thuốc hoặc thuốc thành phẩm. Các nguyên nhân dẫn
đến xuất hiện tạp chất liên quan: có sẵn trong nguyên liệu điều chế, tạo ra trong
quá trình điều chế, xuất hiện trong quá trình bảo quản nguyên liệu làm thuốc và
thuốc thành phẩm.
Thông thường giới hạn tạp chất liên quan được kiểm soát bằng cách so sánh
đáp ứng (ví dụ: diện tích pic trong kỹ thuật HPLC) của tạp chất so với đáp ứng
của hoạt chất chính trong cùng điều kiện.
Tuy nhiên với những tạp chất ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả điều trị, tác dụng
không mong muốn hoặc thường xuất hiện với tỷ lệ lớn thì có yêu cầu định lượng
hàm lượng tạp chất. Việc định lượng này bắt buộc phải có tạp chuẩn để so sánh.
Đối với các hội đồng Dược Điển Anh, Mỹ, Nhật Bản thì các tạp chuẩn cần
thiết luôn được cung cấp bởi bộ phận chuyên trách thuộc hội đồng Dược Điển.
Trong đó Captopril Disulfid là sản phẩm oxy hóa của Captopril. Trong các
chuyên luận dược điển về nguyên liệu và các dạng bào chế của Captopril thường

có chỉ tiêu yêu cầu định lượng tạp chất Captopril Disulfid. Lý do là vì tạp chất
này thường xuất hiện với tỷ lệ cao, ảnh hưởng đến độ tinh khiết hóa học của thuốc.
Hiện tại, tạp chuẩn Captopril Disulfid cũng như nhiều tạp chuẩn khác phải mua
từ nước ngoài với giá cao. Vì vậy, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài: “Bước
đầu nghiên cứu tổng hợp và thiết lập tạp chuẩn Captopril Disulfid”
Mục tiêu đề tài:
1. Nghiên cứu bán tổng hợp được Captopril Disulfid từ Captopril ở quy mô
phòng thí nghiệm.
2. Thiết lập được một số tiêu chí của tạp chuẩn Captopril Disulfid dùng trong
kiểm nghiệm.


CHƯƠNG I : TỔNG QUAN
CHẤT CHUẨN VÀ TẠP CHUẨN DÙNG TRONG KIỂM NGHIỆM

1.1.

1.1.1. Chất chuẩn dùng trong kiểm nghiệm [11]
Hiện nay, theo dược điển Việt Nam IV thì hầu các phương pháp kiểm nghiệm
các chế phẩm đều phải sử dụng chất chuẩn để so sánh và đối chiếu. Gồm có các
dạng:
Dạng nguyên chất - neat : ưu điểm của loại này là có hạn dài, có thể pha ra
các loại nồng độ khác nhau. Tuy nhiên dạng này cũng đòi hỏi trình độ pha chế
chuẩn, ngoài ra một số chất chuẩn đòi hỏi pha chế trong điều kiện tiêu chuẩn như
Aflatoxin, Asen, đồng vị phóng xạ.
Dạng pha chế sẵn - ready to use : ưu điểm là có nồng độ rất tin cậy, tuy nhiên
khi đặt cần đặc biệt chú ý về dung môi của chất chuẩn. Các dung môi nên gần
nhất với dung môi pha mẫu. Thông thường các dung môi là nước, Methanol,
Aceton, Acetonitril, n-Hexan, Dichloromethan, acid HCl, HNO3.
Hỗn hợp chuẩn - Mix là hỗn hợp các chất chuẩn pha trong một loại dung

môi có nồng độ biết trước. hỗn hợp chuẩn có ưu điểm dùng trong phân tích đa
thành phần với các yếu tố ảnh hưởng. Người sử dụng có thể quan sát thời gian
lưu, cường độ tín hiệu tương đối của các cấu tử trên tài liệu đi kèm chất chuẩn.
Mẫu chuẩn - Reference certified material : Gần như hỗn hợp chuẩn nhưng
thành phần và nồng độ các cấu tử mô phỏng một mẫu có thật trong tự nhiên ví dụ
mẫu nước thải, mẫu bùn thải, mẫu ngô nhiễm nấm, mẫu thép.
1.1.2. Tạp chuẩn dùng trong kiểm nghiệm [9][10]
Theo dược điển Việt Nam 4 thì có hơn 20 chuyên luận về dạng bào chế có
yêu cầu bắt buộc phải sử dụng tạp chuẩn. Trên thực tế hiện nay các cơ sở trong
nước mới chỉ đáp ứng được một số tạp chuẩn như bảng sau:


Bảng 1.1- Các tạp chuẩn đã được thiết lập bởi các cơ sở trong nước
Tên Tạp Chuẩn

STT
1

Acid 7-ADCA

2

4-Aminophenol

Hoạt chất
Các
Cephalosporin
Paracetamol

Nguồn gốc tạp

Nguyên liệu tổng hợp
Nguyên liệu tổng hợp
Sản phẩm phụ trong

3

4-Chloroacetanilid

Paracetamol

quá trình tổng hợp hoạt
chất

2-amino-1-(44

nitrophenyl) propan-1,3- Cloramphenicol

Sinh ra khi bảo quản

diol
Do nhu cầu sử dụng hạn chế, có ít nhà cung cấp nên giá thành của tạp chuẩn
thường cao gấp nhiều lần so với chất chuẩn dược chất. Đặc biệt khác với chất
chuẩn dược chất, một số tạp chuẩn thường không có sẵn ở nhà máy, mặt khác giá
thành chất chuẩn của tạp chất là cao dẫn đến khó khăn triển khai các tiêu chuẩn
này trên thực tế, khó tuân thủ các tiêu chuẩn dược điển của nguyên liệu và thành
phẩm.
1.2.

ĐẠI CƯƠNG VỀ CAPTOPRIL

1.1.1. Công thức, tính chất


Công thức hóa học :



Tên khoa học :
Acid 1-(3-mercapto-2-methylpropanoyl) pyrolidin-2-carboxylic

2




Công thức phân tử :



Tính chất:

C9H15NO3S ;

M = 217,28;

Bột kết tinh màu trắng ngà, ở 25oC: tan tốt trong nước (160 mg/ml),
ethanol, methanol, methylclorid, tan trong glyceryl triacetat (20 mg/ml), trong
dung dịch NaOH loãng, rất ít tan trong dầu ngô, ethyl acetat (< 1mg/ml). Nhiệt
độ nóng chảy: 105oC – 108oC. Góc quay cực riêng trong ethanol tuyệt đối là αD25
= - 127,8o, hai đồng phân R,S có góc quay cực riêng lệch nhau +5o. Hằng số phân

ly trong nước pKa lần lượt là 3,7 (-COOH) và 9,8 (-SH). Hệ số phân bố logP
(octhanol/nước) = 0,34, logP (CH2Cl2/nước(pH=2)) = 1,39, logP (octhanol/HCl
0,1M) =1,9. [6] [12] [13] [14]
1.1.2. Tác dụng, chỉ định, chống chỉ định :
1.1.2.1.Dược động học :[3] [8]
Captopril hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, có F tuyệt đối là 60% - 75%, Cmax
trong huyết tương đạt được khoảng 1 giờ sau khi uống. Captopril liên kết với
protein khoảng 30%. Chủ yếu được bài tiết trong nước tiểu, khoảng 40% - 50%
đào thải qua thận ở dạng còn nguyên hoạt tính, còn lại chuyển hóa qua gan thành
dạng Captopril Disulfid và Captopril-Cystein. Captopril có t1/2= 2–3h, Cls=13,33
ml/min/kg.
1.1.2.2.Dược lực học [3] [8] [33]
Captopril có tác dụng ức chế enzym chuyển Angiotensin I→Angiotensin
II, giảm tái hấp thu muối nước ở ống thận nên hạ huyết áp, giảm tiết các yếu tố
gây phì đại cơ tim và phì đại mạch máu. Captopril được chỉ định trong điều trị
tăng huyết áp, điều trị suy tim, đau thắt ngực, bệnh thận do tiểu đường phụ thuộc
Insulin có protein niệu > 300mg/24h.
1.1.2.3.Chỉ định và tác dụng không mong muốn [3] [8] [33]
Liều dùng: Điều trị tăng huyết áp : liều đầu 12,5mg /lần x 2 lần /ngày, sự
tăng giảm phụ thuộc vào huyết áp của bệnh nhân, nếu sử dụng thêm thuốc lợi tiểu
thì liều đầu là 6,25 mg/lần x 2 lần /ngày. Điều trị bệnh thận do tiểu đường : 75-

3


100 mg/ngày, với bệnh nhân suy thận cần được hiệu chỉnh liều cho phù hợp với
từng đối tượng. Một số chế phẩm Captopril đang có trên thị trường đươc trình bày
ở bảng 1.2
Bảng 1.2 : Một số chế phẩm có chứa Captopril
Biệt dược

Lopril
Ecazide

Captopril
STADA®25
DH-CaptoHasan
1.3.

Nồng độ/Hàm lượng
Captopril 25 mg
Captopril 50 mg
Captopril 50 mg +
Hydroclothiazid
25mg
Captopril 25 mg
Captopril 25 mg

Dạng thuốc

Viên nén

Hãng sản xuất
Bristol-myers
Ssquibb
Bristrol-myers
Ssquibb
Stadapharm
GmnH
Hasan

KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU CAPTOPRIL VÀ CÁC CHẾ
PHẨM CHỨA CAPTOPRIL

1.3.1. Định tính
1.3.1.1.

Nguyên liệu Captopril

Dựa vào phổ hấp thụ hồng ngoại của nguyên liệu phù hợp với phổ hấp thụ
hồng ngoại của Captopril chuẩn. [20]

Hình 1.1: Phổ hồng ngoại của Captopril chuẩn.

4


1.3.1.2.

Chế phẩm chứa Captopril

A. Cân một lượng bột viên tương ứng với 50 mg Captopril, thêm 5 ml
ethanol 96% (TT), lắc kỹ 5 phút, lọc. Lấy 2 ml dịch lọc, thêm một vài tinh thể
natri nitrat (TT) và 10 ml dung dịch acid sulfuric 10% (TT), lắc mạnh, xuất hiện
màu đỏ.
B.Trong phần Định lượng, thời gian lưu của pic chính trong sắc ký đồ thu
được của dung dịch thử phải tương ứng với thời gian lưu của pic Captopril trong
sắc ký đồ thu được của dung dịch chuẩn.
1.3.2. Định lượng
1.3.2.1.

Nguyên liệu Captopril [17]

Định lượng Captopril bằng phép đo Iod
Nguyên tắc : Oxy hóa Captopril bằng dung dịch I2. Hòa tan 0,15g chế phẩm
trong 30,0 ml nước cất. Chuẩn độ bằng dung dịch Iod 0,05 M. Xác định điểm kết
thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế (dùng điện cực Platin).
Phương trình phản ứng :
2R

SH

-2e

R

S
S

+
R

+

2H

Nhận xét :


Phương pháp có trong dược điển Việt Nam (IV), dược điển anh (BP2009)

và nhiều tiêu chuẩn cơ sở khác .


Phương pháp định lượng thực hiện đơn giản. Tuy vậy, nếu trong nguyên

liệu có các tạp khử hoặc oxy hóa khác có thể dẫn đến sai số. Đồng thời, Captopril
có nhiều mức oxy hóa nên bước nhảy thế có thể diễn ra ở nhiều mức khác nhau,
điều này cũng sẽ ảnh hưởng tới kết quả định lượng.
1.3.2.2.

Chế phẩm chứa Captopril [17]

Tiến hành bằng phương pháp sắc ký lỏng
Pha động: Hỗn hợp methanol - nước - acid phosphoric (550 : 450 : 0,5).

5


Dung dịch chuẩn: Dung dịch có nồng độ Captopril chuẩn 0,01% và Captopril
Disulfid chuẩn 0,0005% trong pha động.
Dung dịch thử: Cân 20 viên (đã loại bỏ lớp vỏ bao, nếu là viên bao), nghiền thành
bột mịn. Cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 25 mg Captopril
vào ống ly tâm, thêm 25,0 ml pha động, để siêu âm 15 phút và ly tâm. Pha loãng
1 ml dịch trong ở trên thành 10,0 ml với pha động.
Điều kiện sắc ký:
Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C18 (10 m).
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 220 nm.
Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
Thể tích tiêm: 20 l.
Cách tiến hành: Tiêm dung dịch chuẩn. Phép thử chỉ có giá trị, khi hệ số phân

giải giữa pic Captopril và pic Captopril Disulfid trong sắc ký đồ thu được ít nhất
là 2,0.
Tiêm riêng biệt dung dịch chuẩn và dung dịch thử.
Tính hàm lượng Captopril, C9H15NO3S, trong viên dựa vào diện tích (hay chiều
cao) pic Captopril thu được của dung dịch chuẩn, dung dịch thử và nồng độ
C9H15NO3S của dung dịch chuẩn
1.3.3. Tạp chất liên quan
1.3.3.1.

Phương pháp 1: Phương pháp sắc ký lỏng (theo ĐVN IV)

Đối với tạp chất là Captopril Disulfid
Pha động:Acid phosphoric - methanol - nước (0,05 : 50 : 50).
Dung dịch thử: Hoà tan 50 mg chế phẩm trong pha động và pha loãng bằng pha
động thành 100,0 ml.
Dung dịch đối chiếu (1): Pha loãng 2,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml bằng pha
động.

6


Dung dịch đối chiếu (2): Hoà tan 10 mg chế phẩm trong pha động, thêm 1 ml
dung dịch iod 0,05 M rồi pha loãng thành 100,0 ml bằng pha động. Lấy 10,0 ml
dung dịch này cho vào bình định mức 100,0 ml, thêm pha động đến vạch.
Điều kiện sắc ký:
Cột thép không gỉ (12,5 cm  4 mm), chất nhồi octylsilyl silica gel dùng cho sắc
ký (TT) (5 µm).
Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 220 nm.
Thể tích tiêm: 20 µl.

Thời gian chạy sắc ký: Gấp 3 lần thời gian lưu của Captopril.
Cách tiến hành:
Xác định tính thích hợp của hệ thống: Tiêm dung dịch đối chiếu (2). Trên sắc ký
đồ của dung
dịch đối chiếu (2) có 3 pic. Độ phân giải giữa hai pic cuối ít nhất là 2,0.
Tiêm dung dịch thử và dung dịch đối chiếu (1): Trên sắc ký đồ của dung dịch thử,
diện tích của bất kỳ pic phụ nào không được lớn hơn ½ lần diện tích pic chính
trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (1,0%). Tổng diện tích của tất cả các
pic phụ trừ các pic có diện tích bằng hoặc nhỏ hơn 0,1 lần diện tích của pic chính
trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (1) (0,2%) và diện tích các pic có thời
gian lưu nhỏ hơn 1,4 phút) không được lớn hơn diện tích của pic chính trên sắc
ký đồ của dung dịch đối chiếu (1). (2,0%).
1.3.3.2.

Phương pháp 2: Chạy sắc ký lỏng – gradient [41]

Dung dịch A: Methanol
Dung dịch B: 0.1 % Acid Trifluoroacetic trong nước.
Dung môi pha loãng: Acid Trifluoroacetic : Nước : acetonitrile = 0.1:90:10
Chương trình chạy Gradient:

7


Thời gian (phút) Dung dịch A (%)

Dung dịch B(%)

0.00

10

90

5.00

10

90

15.00

50

50

20.00

50

50

20.01

10

90

25.00

10

90

Dung dịch phù hợp: 0.50 mg/mL of USP Captorpril RS trong hệ dung môi pha
loãng.
Dung dịch chuẩn : 2.0µg/ml của USP Captopril RS, USP Captopril Disulfid RS,
tạp USP Captopril B RS, tạp USP Captopril C RS, tạp USP Captopril D RS, tạp
USP Captopril E RSvà tạp USP Captopril J RS trong hệ dung môi pha loãng.
Dung dịch mẫu : 2.0 mg/mL của Captopril trong hệ dung môi pha loãng
Điều kiện sắc ký :
Phát hiện : UV : 220nm
hoặc MS : ES Scan ( + hoặc –): Hiệu điện thế U= 500(V)
Dòng khí : 8 lít/phút
Phun sương : 35psig
Nhiệt độ làm khô : 300oC.
Cột : 15cm x 4,6mm; 2,7µm L60
Tốc độ dòng : 0.7 ml/min
Nhiệt độ cột : 40oC
Thể tích tiêm : 10µl

8


Hình 1.2: Kết quả sau khi chạy sắc ký

Hình 1.3 : Phân tích thông số sắc ký
1.4.

ĐẠI CƯƠNG VỀ CAPTOPRIL DISULFID

1.4.1. Công thức, tính chất


Công thức hóa học: [32]

9




Tên khoa học:
1,1'-[Disulfanediylbis-[(2S)-2-methyl-1-oxopropane-3,1-diyl]]-bis[(2S)pyrrolidine-2-carboxylic] Acid



Công thức phân tử : C18H28N2O6S2 ;



Tính chất:

M = 432,555;

Bột kết tinh màu trắng ở 25oC. Độ tan trong nước ở 25oC (dự đoán) <
120mg/l (vì từ công thức chỉ thấy có 2 vị trí cho liên kết hydro). Dự đoán tan tốt
trong các dung môi không phân cực như: ethyl acetat, Methanol, Acetonitril, Di
methyl sulfoxid. Có 2 giá trị pKa: pKa1 < 3,7; pKa2 > 3,7.
1.4.2. Độc tính [18] [24] [42] [44] [45]
Mắt: Rất nguy hiểm khi tiếp xúc với mắt – chất được tìm thấy gây mẫn cảm

với mắt của chuột lang.
Những dữ liệu về nghiên cứu trên người cho biết: khi tiếp xúc lâu dài có
thể gây tổn thương thận, rối loạn thai sản (Thai nhi và trẻ sơ sinh bị chấn thương).
Đã có báo cáo về trường hợp gây quái thai. Hiện đã có tụt huyết áp ở trẻ sơ sinh,
suy thận, kém phát triển của hộp sọ và phổi, thiếu nước ối, và chậm phát triển và
chi co ở thai. Thai chết lưu hoặc sẩy thai có thể xảy ra.
Có thể gây ra tăng trưởng ở các tuyến, nhưng hiếm khi gây ra bệnh ung thư
ác tính. Tiếp xúc với một lượng nhỏ có thể gây ra phản ứng quá mẫn cấp tính đặc
trưng bởi sự co thắt phế quản, phát ban, phù chảy nước mũi (viêm mũi) và mờ
mắt. Sốc phản vệ và phát ban da - ban xuất huyết có thể xảy ra.
1.4.3. Các sản phẩm chuyển hóa của Captopril Disulfid
1.4.3.1.

Các sản phẩm oxy hóa

(A)

(B1)
10


(B2)

(C)

Thứ tự mức độ oxy hóa của Captopril: A→B1/B2 → C
1.4.3.2.

Sản phẩm thủy phân

(D1)
1.5.

(D2)

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP LIÊN KẾT DISULFID

1.5.1. Phương pháp 1 [27]
Phương trình phản ứng:

Cơ chế phản ứng : Theo cơ chế : kim loại có hóa trị thay đổi

11


Chất xúc tác là MoO2Cl2(DMSO)2 với lượng bằng 5 mol% RSH, dung môi
là DMSO (Di methyl sulfoxid), nhiệt độ phản ứng là : nhiệt độ phòng (25oC) hoặc
cao hơn (= 70oC với alkyl-thiol ), thời gian phản ứng là từ 20 phút đến 24 giờ .
Hiệu suất từ 87% đến 98%.
Nhận xét :
Phương pháp này thực hiện khó vì nguyên liệu MoO2Cl2 khó mua, đồng thời
sản phẩm sau khi phản ứng cũng hòa tan trong DMSO nên khó cho tinh chế.
1.5.2. Phương pháp 2 [32]
Phương trình phản ứng :

Cơ chế phản ứng :
NaI + H2O2 → NaOI + H2O
OI- + R-SH → RS-SR + I- + H2O
Chất xúc tác là NaI, dung môi là ethyl acetat
Nhiệt độ phản ứng: nhiệt độ phòng, thời gian phản ứng 0,5 h .

Nhận xét :
Dung môi để phản ứng là ethyl acetat không hòa tan Captopril, nhưng lại
hòa tan Captopril Disulfid nên khó tinh chế. Mặt khác OI- có khả năng oxy hóa
RSSR lên bậc oxy hóa cao hơn tạo ra nhiều sản phẩm phụ hơn.
1.5.3. Phương pháp 3 [37]
Phương trình phản ứng :

Cơ chế phản ứng :

12


Dung môi là CH2Cl2
Nhiệt độ phản ứng: nhiệt độ phòng , thời gian phản ứng từ 0,8 - 5h .
Nhận xét :
Với dung môi là CH2Cl2 thì hòa tan cả Captopril và Captopril Disulfid, khó
cho tinh chế. Đồng thời : Br2 mới ra có khả năng oxy hóa RSSR tạo ra các sản
phẩm khác.
Captopril có nhóm thiol (-SH) dễ dàng bị các tác nhân có khả năng oxy hóa
chuyển hóa thành Disulfid (-S-S-), (-S(=O)-S-). Các tác nhân oxy hóa có nhiều
loại có mức độ mạnh yếu khác nhau, dẫn đến khả năng phản ứng, hiệu suất phản
ứng và mức độ tinh khiết của sản phẩm tạo thành.
Theo các tài liệu tham khảo thì các tác nhân có thể phản ứng với thiol
gồm có: Na2S4O6, K3(Fe(CN)6), I2, H2O2, Br2, KBrO3.
1.5.4. Tác nhân oxy hóa là Na 2S4O6 [28]
Na2S4O6 có phản ứng với thiol nhưng phải thực hiện ở pH = 7 thì phản ứng
mới nhanh chóng và hoàn toàn, trong khi ở pH=7 thì ảnh hưởng đến độ bền của
liên kết amid của Captopril và Captopril Disulfid, mặt khác nếu để giữ độ bền của
Captopril và Captopril Disulfid thì cần pH <4, với pH<4 thì khả năng phản ứng
của Na2S4O6 bị giảm xuống, đồng thời quá trình phản ứng sẽ sinh ra H+ nên làm

pH giảm xuống và quá trình tinh chế cần pH< pka-1 = 2,7; và ở khoảng pH này
thì có phản ứng phụ:
Na2S2O3 + 2H+ → H2S2O3 → H2SO3 + S ↓

13


Lưu huỳnh được tạo thành có khả năng hòa tan trong dung môi hữu cơ, mặt
khác Captopril Disulfid dễ tan trong dung môi hữu cơ, ít tan trong nước nên khó
tinh chế. Nên không chọn Na2S4O6 làm tác nhân oxy hóa
1.5.5. Tác nhân oxy hóa là K3(Fe(CN)6) [30] [38]
Với K3(Fe(CN)6) thì chỉ có ở pH =7 tốc độ phản ứng mới nhanh, trong khi
ở pH = 4-5 thì phản ứng hoàn toàn khi lượng K3(Fe(CN)6)/Captopril =1/10 và thời
gian phản ứng kéo dài 20h.

Mặt khác quá trình tinh chế cần pH < 2,7 nên khi hạ pH xuống ảnh hưởng
đến khả năng tạo phức và sinh ra HCN là 1 chất độc.
Vì vậy K3(Fe(CN)6) là 1 chất không thích hợp khi dùng để phản ứng
14


1.5.6. Tác nhân oxy hóa là H2O2 [47]
H2O2 là một tác nhân oxy hóa không bền, độ ổn định không cao, tốc độ
phản ứng chậm. Đã có bài báo công thời gian để phản ứng là 10-12h, chính với
khoảng thời gian dài và tác nhân phản ứng không ổn định, đồng thời thế oxy hóa
của H2O2 cao dễ dàng tạo ra các sản phẩm oxy hóa các bậc tiếp theo nên hiệu suất
và độ ổn định của phản ứng sẽ thấp và mức độ tinh khiết của sản phẩm sau khi
tổng hợp sẽ không cao, phải thực hiện nhiều bước tinh chế nên hao hụt sản phẩm
và giảm hiệu suất cuối cùng. Chính vì vậy mà H2O2 không thích hợp để làm chất
oxy hóa.

1.5.7. Với tác nhân oxy hóa là Br2,KBrO3 [25]
Br2,KBrO3 là những chất có thế oxy hóa cao, tốc độ phản ứng nhanh, nên
khả năng khống chế phản ứng sẽ khó khăn. Đồng thời đã có tài liệu chứng minh:
khi sử dụng Br2 hoặc KBrO3 thì tạo ra các sản phẩm phụ nhiều như: -S(=O)-S, S(O2)-S-, và các sản phẩm có bậc oxy hóa cao hơn, đồng thời cũng có sự xuất
hiện của ion SO42- . cle
Nên hai tác nhân này chỉ dùng trong nghiên cứu sự chuyển hóa của Captopril
là phù hợp, không nên dùng trong bán tổng hợp để tạo ra Captopril Disulfid.

Hình 1.4 : Phố khối MS của sản phẩm sau khi phản ứng với KBrO3
15


1.6.

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HỢP CHẤT HỮU
CƠ [5]

1.6.1. Phổ IR
Quang phổ kế hồng ngoại là dụng cụ sử dụng để nghiên cứu cấu trúc các hợp
chất hữu cơ. Các phổ hồng ngoại ở vùng có bước sóng từ 2,5 đến 25 µ (1µ=10-4
cm) thường được dùng .
λ=

Trong đó : ν(số sóng , cm-1)= f/c ; f là tần số, c là tốc độ ánh sáng.
Trong những dao động của một phân tử, các nguyên tử có thể chuyển động

theo chiều của liên kết (hóa trị), hoặc có thẻ chuyển động sao cho khoảng cách
giữa các nguyên tử không thay đổi mà chỉ biến dạng những góc liên kết. Vì năng
lượng kích thích cho những biến dạng như vậy thấp hơn hẳn một dao động hướng
liên kết nên trong những dao động nội phân tử ta có thể phân biệt dao động hóa

trị và dao động biến dạng .
Số sóng ứng với dao động hóa trị của một liên kết, nhờ định luật Hooke:

ν=

x

Trong đó : ν : số sóng (cm-1), c là tốc độ ánh sáng,

k là hằng số lực của liên kết, Mx My lần lượt là khối lượng của nguyên tử x và y
tương ứng.
Phần lớn các nhóm nguyên tử như –OH, -NH2, -NO2 ,… và các liên kết như
C=C, C≡C được đặc trưng bằng các tần số xác định. Các tần số đó được gọi là tần
số đặc trưng trong phổ hồng ngoại là một bước rất quan trọng trong quá trình phân
tích các nhóm chức các nhóm chức của hợp chất hữu cơ. Dải miền hấp thụ của
hầu hết các nhóm chức là từ 4000-1250 cm-1 hay còn gọi là vùng nhóm chức.
Các băng hấp thụ giữa 1250-675 cm-1 thường liên quan đến những biến thiên
phức tạp của năng lượng dao động và quay của toàn phân tử và rất đặc trưng cho
từng phân tử. Người ta gọi vùng phổ này là vùng vân tay hay vùng chỉ điểm.

16