Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ streptomyces 155 21

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM HUY BÁCH

NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH
TỪ STREPTOMYCES 155.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

PHẠM HUY BÁCH

NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH
TỪ STREPTOMYCES 155.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ
THUỐC
MÃ SỐ: 60720402

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Cao Văn Thu

HÀ NỘI 2015


LỜI CẢM ƠN
T i xi g i ời
gười

ậ

h hướ g ẫ

i

ế

hiệ

nghiên cứu h
T i xi
y
họ Dư

hi

h

g

h
ih

h

h y gi

g ướ

i

ậ v

y

h y

gi

h h

i

ế

PGS TS. C

V

Th -

t lúc chuân bị ề ư

h ậ vi

Vi i h - Si h họ

C

g ghiệ

ư

g

gi g

T ườ g Đ i

H N i; B môn Hóa vật liệu - khoa Hóa, T ườ g Đ i học Khoa học tự

nhiên Hà N i, Phòng phân tích phổ - Viện Hóa học, Viện Hàn lâm khoa học và công
gi

nghệ Việt Nam
Nh
h y
h

gi
i

v

y

i

g hời gi

ối

g

ố hời gi

D

hời gi

y
h
T i xi

hự
hiề

ậ

ư
h

hiế
h

gi

y

v

hiệ
ọi iề

g

h

iệ

h ậ

i

i ườ g

ời

i g i ới gi

hự hiệ

ghiệ

ế

H N i

i họ ậ

g

hự

g xi g i ời

ườ g Đ i họ Dư
g hời gi

V
i

ị

i

hv

g vi

gi

ậ v

ghiệ
T i

g hư iế
g hậ

hứ

h

ư

ựg

h

còn

ậ

h y

hiệ h

h h

H N i

g y 30 h g 08
Học viên

PHẠM HUY BÁCH

2015


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1
Chư

g I TỔNG QUAN ................................................................................................ 2

11 Đ i ư

g về kháng sinh .......................................................................................... 2

1 1 1 Định ghĩ .......................................................................................................2
1.1.2. Phân lo i .........................................................................................................2
113 C

hế tác dụng .............................................................................................. 4

1.1.4. Ứng dụng c a ch t kháng sinh........................................................................6
12 Đ i ư

g về x khuẩn ............................................................................................. 7

1.2.1. M t số ặ

i m.............................................................................................. 7

1.2.2. Các yếu tố

h hưở g ến sinh tổng h p kháng sinh .....................................8

1 2 3 Đặ

i m x khuẩn chi Streptomyces ............................................................. 9

1.2.4. Phân lo i chi Streptomyces ...........................................................................10
1 2 5 Đặ

i m x khuẩn Streptomyces 155.21 .................................................... 10

1.3. C i t o giống và lên men ........................................................................................ 11
1.3.1. C i t o giống .................................................................................................11
1.3.2. Lên men sinh tổng h p KS ...........................................................................12
1.4. Chiết tách, tinh chế ................................................................................................. 14
1.4.1. Chiết xu t ......................................................................................................14
1.4.2. Tách và tinh chế ............................................................................................ 14
1.5. Nghiên cứu c u trúc KS bằ g

hổ ..................................................................... 15

1.5.1. Phổ hồng ngo i ............................................................................................. 15
1.5.2. Phổ t ngo i ..................................................................................................15

1.5.3. Phổ c

g hưởng t h t nhân .........................................................................16

1.5.4. Khối phổ .......................................................................................................16
1.6. Phân lo i x

ịnh tên x khuẩn bằng k thuật gen .............................................. 17

1.7. M t số nghiên cứu mới về tổng h p kháng sinh t ch ng Streptomyces............... 19
1.7.1. K thuậ

g i h ổng h p toyocamycin t Streptomyces

diastatochromogenes 1628...................................................................................... 19


1.7.2. Kháng sinh kháng n m dòng Actinomycin-D do Streptomyces sp. IA1 phân
lập t
Chư

t vùng Saharan .......................................................................................... 19

g 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................21

2 1 Đối ư ng nghiên cứu ............................................................................................. 21
2.1.1. Ch ng x khuẩn nghiên cứu .........................................................................21
ịnh .................................................................................... 21

2.1.2. Vi sinh vật ki

2 2 M i ường nghiên cứu ........................................................................................... 21
2 2 1 M i ường nuôi c y ch ng x khuẩn nghiên cứu ........................................21
2 2 2 M i ường nuôi c y VSV ki

ịnh ........................................................... 22

2.2.1. Thuốc th , dung môi, hoá ch t .....................................................................22
2 2 2 Phư
2 3 Phư

g iện và máy móc ..............................................................................22

g h

ghi

ứu ........................................................................................ 23

2 3 1 Phư

g h

i

2 3 2 Phư

g h

h gi h

2 3 3 Phư

g h

g ọ

2 3 4 Phư

g h

iế ................................................................................... 24

2 3 5 Phư

g h

men mẻ .............................................................................25

2 3 6 Phư

g h

hiế

h g i h

2 3 7 Phư

g h

h

ậ

2 3 8 Phư

g h

i

2 3 9 Phư

g h

x

Chư

y v gi giố g ............................................................. 23
h h g i h ằ g hư

gẫ

hi

h

g h

h ế h

23

................................................................ 24

ị h ọ

ằ g

g

ih

...............26

h ............................................................. 26

tinh khiết các h p ch t phân lậ

ư c.................26

ịnh c u trúc hoá học các h p ch t ..................................27

g 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..........................................................................29

3.1. Nghiên cứu c i t o giống ........................................................................................ 29
3.1.1. Kết qu sàng lọc ngẫu nhiên .........................................................................29
3.1.2. Kết qu

t biến l n 1 ................................................................................... 30

3.1.3. Kết qu

t biến l n 2 ................................................................................... 33

3.2. Nghiên cứu chọn ch ng lên men mẻ phù h p ........................................................ 35
3.3. Chiết tách, phân lập kháng sinh sinh tổng h
3.3.1. Kh o sát

h hưở g H

3.3.2. Kết qu tách bằ g hư

ư c.............................................. 37

i ườ g ến quá trình chiết xu t ...................... 37
g h

c ký c t ..................................................39


3.3.3. Ki
334 S
Chư

g4

tinh khiết h p ch t phân lậ
biện gi i h p ch t phân lậ

ư c ............................................40

ư c........................................................ 44

ÀN LUẬN.................................................................................................47

4.1. Nghiên cứu c i t o giống c a ch ng Streptomyces 155.21 .................................... 47
4.2. Nghiên cứ

i ường lên men chìm.................................................................... 48

4.3. Chiết xu t, tinh chế và biện gi i phổ kháng sinh phân lậ

ư c ............................ 48

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 52


Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt
AND

Acid Deoxyribonucleic

ARN

Acid ribonucleic

ATCC

American Type Culture Collection (T

DM

Dung môi

Đ

Đ

iế

IR

I f

e (hồ g g i)

ISP

International Streptomyces Project (Chư

g

ư gi

g

h

hS e

gH

Kỳ)

y e Q ố

ế)
KS

Kháng sinh

MT

M i ườ g

NMR

Nuclear magnetic resonance (C

SLNN

S g ọ

SKLM (TLC)

S

STH

Si h ổ g h

UV

Ultra vio e (

VK

Vi h ẩ

VSV

Vi i h vậ

gẫ
ớ

g hưở g

h

h )

hi
ỏ g (Thin layer chromography)
g i)

Danh mục các bảng, biểu
g

Bảng 2.1. C

i ườ g

i

yx

h ẩ

Bảng 2.2. M i ường nuôi c y vi sinh vật ki
Bảng 3.1. Kế q

sàng ọ ự hi

Trang

h

21
ịnh

22

g Streptomyces 155.21

29

Bảng 3.2. Kết qu th ho

h h g i h

t biến l n 1

31

Bảng 3.3. Kết qu th ho

h h g i h

t biến l n 2

33

Bảng 3.4. Kết qu lên men các d ng ch ng, biến ch ng tốt nh t ở
Bảng 3.5. Kết qu th

h hưở g H ến kh

i ường MT2dd

g hiết kháng sinh

Bảng 3.6. Kết qu biện gi i m t số ỉnh carbon c a khung 2-amino-1,4,6,9-

35
38
46

tetramethyl-3H-phenoxazin-3-one trong ch t KS2

Bảng 3.7. Nồ g

ức chế tối thi u c a Actinomycin X2 trên m t số vi khuẩn

50


Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Hình

Trang

Hình 1.1. M t số c u trúc h g i h hường dùng hiện nay
Hình 3.1. Bi

3

ồ th hiện ho t tính kháng khuẩn c a các d ng ch ng khi chọn

30

ồ th hiện sự h y ổi ho t tính kháng khuẩn trên B. subtilis và

32

lọc ngẫu nhiên
Hình 3.2. Bi
P. mirabilis

t biến lẩn 1

ồ th hiện sự h y ổi ho t tính kháng khuẩn trên B. subtilis và

Hình 3.3. Bi
P. mirabilis

34

t biến lẩn 2

Hình 3.4. Hình nh vòng vô khuẩn c a các d ng ch ng, biến ch ng trên B.

36

subtilis và P. mirabilis khi lên men chìm
ồ th hiện ho t tính kháng khuẩn các d ng ch ng, biến ch ng

Hình 3.5. Bi

37

trên B. subtilis và P. mirabilis khi lên men chìm
Hình 3.6. Kết qu hiệu su t tách kháng sinh khi s dụng pH khác nhau với dung

38

môi etyl acetat
Hình 3.7. S

ồ phân lập các kháng sinh sinh tổng h

ư c t Streptomyces

39

155.21
Hình 3.8. S

ồ TLC h

Hình 3.9. H h

h

và KS2 (q é ớ

ồ

ỏ g ở ướ

Hình 3.10. S

ư

Hình 3.11. S

( ướ

ỏ gx

ị h

g UV 440 nm
h

h

g 443

)

i h hiế

hi h
h

h

h

ư c

40

KS1

41

ẫ

42

h ố h )
ậ

ư

g

ồ HPLC x

ị h

i h hiế

h

KS1 ( ướ

g h

43

ồ HPLC x

ị h

i h hiế

h

KS2 ( ướ

g h

43

)

Hình 3.12. S
hiệ 442

ớ

ồ HPLC ị h

h g i h ổ g h
hiệ 443

n FR2 và các ch t kháng sinh phân lậ

)

Hình 3.13. H h

h hổ UV

h

A i

y i D

h

KS2 và khung 2-

45

amino-1,4,6,9-tetramethyl-3H-phenoxazin-3-one
Hình 3.14 C

g hứ

A i

ycin D

46


ĐẶT VẤN ĐỀ
ướ

Cùng với sự phát tri n c a xã h i, mô hình bệnh tật c
d ng thì vai trò c

h g i h

g iều trị g y

g y

g

g ư c nâng cao.

Kháng sinh là nhóm ho t ch t có tác dụng sinh học r t m h

ư c tổng h p

hay bán tổng h p t vi khuẩn, x khuẩn, vi n m hoặc t m t số thực vật bậc cao [1],
[6]. Ngày nay, với sự phát tri n m nh mẽ c a sinh học hiệ

i cùng sự h tr c a

nhiều ngành khoa học khác giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụ g h g i h
nh ng thành tựu rực r

C

gười không chỉ tìm kiếm nh ng ch ng vi sinh vật sinh

kháng sinh t tự nhiên mà còn c i t o chúng bằng nhiề
thuật di truyền, công nghệ gen g y
[1], [6]... Ch

ế

y

hát hiệ

hư

g h

[7]. Và trong số
Streptomyces s n xu

hư g hỉ có 1-2%

tiêu chuẩn ứng dụng trong y học [1], [6],
g

kho ng 60% là do x khuẩn t

h yếu do chi

hi x khuẩn lớn, gồm nhiều vi sinh vật có kh
g hư

D

g

g i h ổng h p các kháng sinh ch a

sinh tổng h p kháng sinh, m t số loài có kh
nhiễm trùng khuẩn Gr(-),

g

ư c kho ng 17.000 ch t kháng sinh có nguồn gốc

h g i h)
Đ y

hư

ị h hướng, chọn dòng gen sinh tổng h p

t biế

t vi sinh vật và kho ng 60.000 ch t kháng sinh bán tổng h
(kho ng 600-1200 ch

ư c

hi x khuẩ

y

g ư

ước ta tập

trung nghiên cứu.
Qua nh ng nghiên cứ

u cho th y ch ng Streptomyces 155.21 do b môn

Vi sinh - Sinh học cung c p có ho t tính kháng sinh m nh và ổ
nhiều tiề

g trong thực tế [2], [9] nên chúng tôi chọ

ịnh, phổ r ng và có

ề tài: "Nghiên cứu sinh tổng

h p kháng sinh t Streptomyces 155.21" với các mục tiêu:
1. Nghiên cứu c i t o giống he hướ g

g i h ổng h p kháng sinh c a

ch ng Streptomyces 155.21.
2. Chiết tách, phân lập m t số ho t ch t chính c a ch ng Streptomyces 155.21.

1


Chƣơng I. TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về kháng sinh
1.1.1. Định nghĩa
V i e i (1889)

ề cậ

sự kháng gi a các sinh vật sống
1942 W

ến t ch t kháng sinh - “

i i i ” với

ghĩ

b o vệ cho b n thân vật ch [8], [33] S

ị h ghĩ ch t kháng sinh - “

i i i ”

h ng ch

m

ư c t o ra

bởi các vi sinh vật, nó chống l i sự phát tri n hoặc tiêu diệt chọn lọc các vi sinh vật
34]. Xét về mặt t ng

“

sống) –

ng, bao gồm c các thuố

l i h

ghĩ q
g

i i i ”

ghĩ

h g i h(

= kháng, bios = sự

g hư E OH

ư c tính chuyên biệt trên vi sinh vật gây bệ h

iv

c tính th p ở mức liều

iều trị [14], [34].
The

ị h ghĩ

ới nh t: Kháng sinh là các h p ch t có nguồn gốc tự nhiên

hay tổng h p, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt chọn lọ
g hư) ở nồ g

các tế

ối với

VSV (

g hư

th p [6].

1.1.2. Phân loại
Có nhiều cách phân lo i KS: hư h
dụng, theo c u trúc hóa họ

T

g

h

i theo nguồn gố

he

i theo c u trúc hóa họ

hế tác
ư c xem là

khoa học và thông dụng nh t [6].
1.1.2.1. Phân loại theo cấu trúc hóa học

- Nh

β-Lactam: penicillin, ampicillin, amoxicillin, cephalosporin các thế hệ ...

- Nhóm aminoglycosid: streptomycin, gentamicin, kanamycin, neomycin...
- Nhóm polypeptid: colistin, bacitracin, polymyxin...
- Nhóm tetracycline: tetracyclin, oxytetracyclin, chlotetracyclin,..
- Nhóm phenicol: chloramphenicol, thamphenicol,...
- Nhóm macrolid: erythromycin, spiramycin, tylosin,... và các kháng sinh g n giống
macrolid: lincomycin, virginiamycin...
- Nhóm sulfamid: sulfaguanidin, sulfacetamid, sulfamethoxazol...
- Nhóm quinolone: acid nalidixic, flumequin, norfloxacin... [6], [14]

2


Khung kháng sinh β-Lactam

Penicillin G

Ampicillin

Amoxyciliin

R=

R=

R=

Tetracyclin

Hình 1.1: M t số c u trúc h g i h hường dùng hiện nay
1.1.2.2. Theo tác dụng kháng khuẩn
* Dự v
hi

v


h h y
ồ g

Nồ g

iệ
ứ

hế ự h


vi h ẩ với h g i h: ự v
h ẩ

Nồ g

iệ

MIC:

ồ g

vi h ẩ
h ẩ

ứ

hế ối

ối hi

hế ối hi
i

ồ g

ối hi

h
M C:

h

h

g 24h

i

ồ g

h

1 KS

h

gứ

y
h

gi

99 9% ư

g

g h yế ư

g:

vi h ẩ
- Kh g i h iệ

h ẩ : M C/MIC ~ 1 v

ễ

g

ư

M C

penicillin, cephalosporin, aminosid, polymyxin…
- Kh g i h
g h yế ư

h ẩ : M C/MIC > 4 v
g: e

y i

h

he i

3

ư

ồ g

i …[32]

ằ g ồ g

M C

h ư

Sự phân biệt này chỉ

g ối vì b t kỳ h g i h

g

dụng kìm khuẩn và diệt khuẩn tùy theo nồ g

kháng sinh T y hi

kháng sinh chỉ có tác dụng diệt khuẩn ở nồ g

r t cao trong máu (có th g y

hoặc tai biến) thì chỉ ư c s dụng với mụ

h

h ẩn ở liều th

- Kháng sinh diệt khuẩn phụ thu c nồ g
ư c trong máu. Hiệu lực c a nh
hư: h

i

gy

i

h

f

: tố
(

c tính

h

diệt khuẩn phụ thu c nồng

g h g i h

q i

ối với nh ng

y hường r t nhanh chóng
ng trên vi khuẩn Gr-), nhóm

polypeptid, sulfamid và diaminopyrimidin
Ý ghĩ : Chỉ c n c p kháng sinh 1-2 l n trong ngày
- Kháng sinh diệt khuẩn phụ thu c thời gian: hiệu lực diệt khuẩn phụ thu c thời
gian vi khuẩn tiếp xúc kháng sinh ở nồ g

h y ằng nồ g

g h g i h

thi u (MIC). Hiệu lực diệt khuẩn c a nh
h

lớ h

ức chế tối

y hường x y ra chậ

hư:

β-lactam, nhóm glycopeptid, nhóm quinolon, nhóm rifampicin.
Ý ghĩ : hi ổng liều thành nhiều liều nhỏ trong ngày [6], [32].

1.1.3. Cơ chế tác dụng
1.1.3.1. Tác dụng lên thành tế bào vi khuẩn
T t c các tế bào sống (vi khuẩ v

ng, thực vật) ều có màng tế bào có c u

ều bị tiêu h y bởi ch

trúc lipid phức t

g Như g h

ng vật, tế bào vi khuẩn có áp su t thẩm th u bên trong tế

h

với tế bào
chúng còn

có thành tế bào bên ngoài màng tế bào. Thành tế bào này có c u t o t

ch t

peptidoglycan (= mucopeptid hay murein) gồm nhiều dây polysaccharid thẳng dọc và
nh ng

n ngang tetrapeptid. Polysaccharid gồm nhiều phân t

ường mang amin:

N-acetyl-glucosamine (NAG) và N-acetyl-muramic (NAM) (chỉ có ở vi khuẩn) [6],
[14].
- Tiến trình hình thành thành tế bào b t
D-alanin. S

u bằng sự chuy n ổi L-alanin thành

2 D-alanin kết h p với nhau. Cycloserin ức chế c h

y

h gi i

n

g ến c vi khuẩn Gr+ và Gr- [6], [14].
- Tiếp ến D-alanin dipeptid nối với 2 hoặc 3 acid amin khác và 1 ường N-

acetyl-muramic acid
peptid này l i cặp

t o thành ường tetrapeptid hoặc pentapeptid. Tiếp theo, các
i với m t ường mang amin khác là N-acetylglucosamin. Toàn b
4


c u trúc này l i kết h p với 1 phân t mang lipid là isoprenyl phosphat rồi di chuy n
y h

t tế bào ch t ra ngoài màng tế bào. T i
chu i e i g y

i

i

g

g ết h p với h

kéo dài thành

n tiến trình này bằng cách g n với isoprenyl

phosphat t o phức h p vô dụ g V

y i

hoặc pentapeptid thành chu i

bên ngoài màng tế bào [6], [14].

- Giai

h

g

n sự di chuy n ường tetrapeptid

n cuối là hình thành dây ngang gi a các dây peptidoglycan bằng cách

nối D-alanin c a 1 chu i với diaminopimelic acid c a chu i kế cận nhờ enzym
transpeptidase. Penicillin ức chế giai

n này do c u trúc c a nó giống D-alanyl-

alanin (1 vị trí trên peptidoglycan mà enzym g n vào). [14]
1.1.3.2. Tác dụng lên màng tế bào (màng bào tương)
- Màng này có nhiệm vụ bao bọ v

g

h ị h ư

Nó có tính th m chọn lọc, iều hòa sự trao ổi với
ều có các yếu tố hư

ng vật và tế bào vi khuẩ

g

với thành tế bào.

i ường bên ngoài. C tế bào
ei

i i

hư g i i

a vi

khuẩn là phospholipid [14].
- Kháng sinh thu c nhóm polypeptid (colistin, polymyxin,...) và poly-ene (ch t
kháng n m) g n kết trên các ch t hóa học riêng biệt làm xáo tr n chứ
g

khiến các ch

g hẩm th u

g hư Mg2+, K+, Ca2+ thoát ra ngoài (tác dụng hư m t

ư

ch t tẩy lo i Cation) [6], [14].
1.1.3.3. Tác dụng lên sự tổng hợp acid nucleic và các chất trao đổi trung gian
- Sự h
m

h

i ADN b

u bằng ph n ứng tách hai chu i ADN ra, m i chu i là

g n các nucleotid thích h p theo nguyên t c bổ sung. ADN-polymerase

xúc tác sự tổng h p các liên kết gi a các nucleotid; ADN gyrase giúp nới các ADN
trong quá trình tổ h p và t o thành các vòng xo n.
- Sự phiên mã là quá trình tổng h p ARN do ADN làm khuôn theo nguyên t c
bổ sung nhờ enzym ARN-polymerase và ion Mg2+.
- Quá trình tổng h p acid nucleic b

u t việc tổng h p acid folic rồi thành

purin nhờ vào m t số enzym: Dihydroteroat synthetase, dihydrofolat reductase...
- Quinolone (acid nalidixic, norfloxacin,...) ức chế m nh sự tổng h p ADN
trong gi i

h

i

ức chế ADN gyrase.

- Rifampicin ức chế tổng h p ARN do ức chế ARN-polymerase.
5


- Sulfamid ối kháng c nh tranh với PABA (p-aminobenzoic acid) m t tiền
ch

i f i (

tổng h

ng vật dùng folat có sẵn trong thực phẩm còn vi khuẩn

tự tổng h p folat). PABA kết h p với pteroic acid hoặc glutamic acid

t o

pteroylglutamic acid (PGA), ch t này giố g hư 1 coenzym trong sự tổng h p purin và
i i

PGA

amin v

g

i

1 h n c a phân t vitamin 12

D

i

q

ến sự tổng h p acid

hi hiếu PABA sẽ gây thiếu purin, acid nucleic. Ðiề

y

g

ư c PABA thì ề kháng với sulfamid và t i

gi i thích t i sao các vi khuẩn tự tổng h

sao thymin, purin, methionin và m t số acid amin khác l i ối kháng với hiệu qu
sulfamid. Sulfamid chỉ có tác dụng kìm khuẩn.
- Trimethoprim ức chế

ihy

f

e

dihydrofolat thành tetrahydrofolat (d ng ho

e

g

q

h

h y n hóa

ng c a acid folic). [6], [14], [15].

1.1.3.4. Tác dụng lên quá trình tổng hợp protein của tế bào vi khuẩn
ư c mã hóa

Quá trình này x y ra thông qua việc gi i mã thông tin di truyề
trên mARN Ð

vị chứ

g

a quá trình này là ribosom. Khác với tế bào

ng vật

vị 30S và 50S. [6]

(ribosom 80S), tế bào vi khuẩn có ribosom 70S, gồm 2 ti

- Kháng sinh aminoglycosid (streptomycin, gentamicin, kanamycin..) g n chặt
vị 30S, phong bế ho

với ti

i

sự tiếp cận c a t-ARN

g

h hường c a phức h p khởi

u, c n trở

n gen, hình thành các protein không có chứ

g

g g n vào ti

vị 30S và phong bế sự kết h p

- Kháng sinh chloramphenicol g n với ti

vị 50S, ức chế enzym peptidyl

- Kháng sinh tetracyclin
c a tARN với mARN.

transferase không cho amino acid g n vào chu i polypeptid.
- Kháng sinh macrolid (erythromycin, azithromycin...) tranh giành vị trí g n ở
ribosome v

g

n vị trí dịch chuy n các acid amin. [4], [6], [14]

1.1.4. Ứng dụng của chất kháng sinh
1.1.4.1. Ứng dụng trong y học
Có r t nhiề
mà

gười

h g i h

ư c phát hiện và ứng dụng trong y học, nhờ có KS

hống chế và lo i bỏ ư c nhiều bệnh nguy hi

hư ịch h ch (s

dụng streptomycin, tetracyclin, cloramphenicol, sulfamethoxazol…), t
cloramphenicol, te

y i … ết h

iện gi i) hư
6

gh

(s

…[4], [6], [14].

dụng


ư c chỉ ị h

M t số kháng sinh
hư: y

niêm m
ĩ h vự

m

i

g iều trị các bệnh n m trên da, tóc,

h ei i B

i i … Kháng sinh iều trị

g ư c nghiên cứu và phát tri n trong y họ

[26], doxorubicin m t kháng sinh chiết xu t t

g hư

hư actinomycin D [20],

S. seucetius [24], [25]...

1.1.4.2. Ứng dụng trong nông nghiệp
Trong nông nghiệ

KS

(cycloheximid) hoặc thuố

iề h

Các KS có nhiề ư
h y

ư c s

dụng làm thuốc tr

sâu, thuốc diệt cỏ

i h ưởng cho cây trồng [8], [13], [30].

i m so với thuốc hóa họ

hư:

ụng nhanh, dễ phân

h ặc hiệu cao, chỉ tiêu diệt m t hoặc m t số loài sâu nh

ịnh nên không

h hưở g ến các VSV có ích khác. S dụng KS trong b o vệ thực vậ
dụng nhiều trên thế giới và d n thay thế các ch t hóa họ

c h i [25].

n xu t trên quy mô công nghiệ h

Nhật B

g ứng

10 h t KS dùng trong b o

vệ cây trồ g hư: lasticidins (do S. griseochromogenes t o ra) [18], kasugamycin (do
)

S. kasugaensis t

tiêu diệt Piricularia oryzae gây ra bệnh vàng lùn. [19]…

1.1.4.3. Ứng dụng trong chăn nuôi
KS ư

g

phòng và trị bệ h h

hư g i e vi i i

ng vậ

h a viêm

phổi c p ở trâu bò. M t số KS ư c s dụ g hư h ng bổ sung thứ

g h

nuôi (monenzin, thiopeptin,... ) [13]
1.1.4.4. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm
g h p s dụng kháng sinh

Thực phẩ

g hời gian b o qu n (tylosin,

nizin, pimaricin...)
1.2. Đại cƣơng về xạ khuẩn
1.2.1. Một số đặc điểm

X khuẩn (Actinomycetes) thu c nhóm VK thật (Eubacteria), là vi khuẩn Gram
ư

g

h

i n thành hệ s i phân nhánh, có tỷ lệ G+C lớ h

r ng rãi trong tự hi
g

Ch g

g

55%

h

ốr t

ước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí c

h t mà VK và n m mốc không phát tri

ư c [6], [8].

* Khuẩn l c
x

Kh ẩ

x

h ẩ

h ẩ

hườ g h

ậ h
x x

h
g

x

h ẩ

gv i
7

h

i

i g ẽ Kh ẩ

g h

g

h y

g

g


ẻ
ch

ế g

ỏ

he h h h

g x . Các s n phẩm trong q

hư: kháng sinh, enzym, vitamin, acid h

h

,…

h

ổi

ư c tích lu trong sinh

khối c a tế bào x khuẩ h y ư c tiết ra trong MT. [6], [8], [13]
* Khuẩn ty
T

MT ặc, hệ s i c a x khuẩn phát tri n thành 2 lo i:
v

- M t lo i c m s

i ường gọi là hệ s i

h t (HSCC) (khuẩ

y

h t-

g i h ư ng.

substrate mycelium) với chứ

- M t lo i phát tri n trên bề mặt th ch gọi là hệ s i khí sinh (HSKS) (khuẩn ty khí sinh
g i h

- aerial mycelium) với chứ
Nhiều lo i chỉ có hệ s i

chỉ có hệ s i h

i h Khi

n.

h

hư g

g

i ( hư hi Sporichthya) l i

HSKS v a làm nhiệm vụ sinh s n v a làm nhiệm vụ

i h ư ng [6], [8].
* C u t o c a x khuẩn
X khuẩn là vi khuẩn Gr(+). Thành tế bào c a x khuẩn có kết c u d g ưới,
dày 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng c a khuẩn ty, b o vệ tế bào. Thành tế
bào gồm các lớp: peptidoglycan bao gồm các gốc N - acetyl glucozamin liên kết với N
- acetyl muramic acid bởi các tetrapeptid, ngoài ra có th có thêm L- DAP, meso-DAP,
G y i …[6], [13]
Trong nguyên sinh ch t c a x khuẩn chứa mezoxom và các th ẩn nhập (các
h t polyphosphat: hình c u, b t màu với thuốc nhu m sudan II và các h t
polysaccharid b t màu với dung dịch lugol).
T y hi

i m khác biệt c a x khuẩn so với các sinh vật prokaryote ở ch

chúng có tỷ lệ G + C r t cao trong ADN, lớ h

55%

g hi

ở VK tỷ lệ này chỉ

là 25- 45%. [6], [14].
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp kháng sinh
* Điều kiện nuôi cấy
- Nhiệ

: Nhiệ

nh hưởng lớ

ế q

h i h ưởng, phát tri n và kh

g ổng h p ch t kháng sinh ở x khuẩn. H u hết phát tri n tốt ở 18-32°C, tối thích
ở kho ng 22-30°C [6], [14].

8


- H

i ường: Sinh tổng h p ch t kháng sinh phụ thu c r t lớn vào pH môi

ường. pH thích h p cho sinh tổng h

h g i h hường là 7,5-8, pH acid hay base

ều ức chế quá trình sinh tổng h p [6], [12]
- Đ thông khí: X khuẩn là vi khuẩn hiếu khí có nhu c
h hưởng quyế

yếu tố thông khí có

ị h

h

g h

D

i h ổng h p ch t kháng sinh [6], [11].

g i h ổng h p ch t kháng sinh còn phụ thu c vào tuổi

- Tuổi giống: Kh

ư ng bào t c a x khuẩn. Tuổi c a x khuẩn cho hiệu su t cao nh t là

sinh lý và ch

48 giờ Lư ng giống c y truyền kho ng 2-10%. [11], [12]

* Thành phần môi trường lên men
- Nguồn carbon: carbon là nguyên tố có mặt ở h u hết các ch t trong tế bào x
g hư

khuẩ

g

ghĩ h g

ổi ch t, do vậy các h p ch t carbon có ý

n phẩ

g i h ưởng và hình thành ch

h g i h Đối với x khuẩn,

hường là tinh b t, ngoài ra còn s dụng các lo i ườ g hư:

nguồn carbon thích h

glucose, fructose, maltose,..[5], [11].
i : i

- Nguồ

h h h

i h ư ng không th thiế

h i h ưởng và hình thành kháng sinh c a x khuẩn. Nguồ
hư

s dụng là các h p ch t t thực vậ

ậ

ư

g Ng ồ

i
i

ư c trong quá
h

v

hường
ối

amoni, nitrat,...[5], [10], [11]
h

- Nguồ
sinh. Nồ g
pha tổng h

h v

: h pho là yếu tố iều chỉnh sinh tổng h p ch t kháng
g ổng h p acid nucleic trong tế bào, rút ng n

phospho cao sẽ
v

é

i h

i h ư ng [5], [11].

- Các nguyên tố vi ư ng: là m t trong nh ng thành ph n không th thiế
g

i ườ g

e

h y ổi

g

kh

ư c

g i h ổng h p kháng sinh

c a nhiều ch ng x khuẩn [5], [10].
1.2.3. Đặc điểm xạ khuẩn chi Streptomyces
Streptomyces làm m t chi thu c b Actinomycetales, với hệ s i i h ư ng
h

h h
C

mọ
i hi

ường kính t 0,5-2,0 m.

hi ứ

i diện chi này có HSKS và HSCC phát tri n phân nhánh. S i
v

h t. Bề mặt khuẩn l

h ỵ ước.
9

h t

hườ g ư c ph bởi HSKS d ng ph n,


he h i hư

X khuẩn chi Streptomyces sinh s n vô tính bằng bào t
h

n và tự n y chồi T

g h

u s i khí sinh hình thành cuống sinh bào t với hình

d ng khác nhau tùy loài: thẳ g ư n sóng, xo n, có móc, vòng. Màu s c c a khuẩn l c
và hệ s i khí sinh khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces và

i ường nuôi c y.

Các loài x khuẩn thu c chi Streptomyces là VK vi khuẩn Gr+, hiếu khí, dị
ư ng các ch t h

g

X khuẩn chi này có kh

ức chế VK, vi n m, các tế

g hư vi

v

o thành số ư ng lớn các KS

ng vật nguyên sinh. [5], [11]

1.2.4. Phân loại chi Streptomyces
Có nhiều khóa phân lo i chi Streptomyces hư h
hư

Gauze... Khóa phân lo i Streptomyces thu
Shi i g v G

ie

ề xu

1970 [29]

g

h

i c a Waksman,

h Streptomyces quốc tế (ISP)

ư c s dụng r

i

phân lo i

g ư c áp dụng

phân lo i

ặ

x khuẩn thu c chi này. Khóa phân lo i này dự

g

i m:

- Màu s c khuẩn l c.
y

- Màu c a khuẩ

h t.

- S c tố melanoid, s c tố hòa tan.
- Hình d ng chu i bào t .
- Bề mặt bào t .
g i

- Kh
Mặt khác

hụ nguồn hydratcarbon.

ĩ h ậ x

ịnh trình tự ge

v

Streptomyces [27], [36].
1.2.5. Đặc điểm xạ khuẩn Streptomyces 155.21
X khuẩn Streptomyces 155.21 ư c B môn Vi sinh – Sinh họ
họ Dư c Hà N i phân lập t

v

T ườ g Đ i

ư c b o qu n trong iều kiện thích h

N

2010, khi nuôi c y ịnh danh theo khóa phân lo i ISP c a Nonomura [27] C
H i

h y 9/14 ặ

i m c a ch ng x khuẩn Streptomyces 155.21 giống với

ch ng x khuẩn Streptomyces flavescens [9]. C
th y hi g y
g

v

g he

ghi

ứu trên, tác gi nhận

t biến nhân t o bằng ánh sáng UV 254 nm thì ho
(kho ng 20% so với d ng ch

g

h h g i h

u). Kháng sinh sinh tổng h p t

Steptomyces 155.21 có phổ r ng trên c Gr(+) và Gr(-)

g

nh nh t là trên

ch ng Bacillus pumilus và Proteus mirabilis. M i ường lên men bề mặ
10

g

g hư


dịch th tốt nh t có các thành ph n là tinh b t (nguồn C), NO3- (nguồn N) và các

khoáng ch

h

hư K P Mg S

The

ết qu phân lậ

, kháng sinh sinh tổng

h p t Streptomyces 155.21 có tính acid, bền ở pH 3, tan tốt trong dung môi h
hư MeOH E OA [9]. Tiếp tục nghiên cứ

2012 Ph

H y

h

thêm m t số tính ch t c a kháng sinh t Streptomyces 155.21 hư
ch y là 217,3°C; phân t

ư ng dự kiế

hiệ

ổ sung
nóng

1254 3 vC [2].

Theo công bố trong bằng sáng chế số US4340725 c a Fusao Timita và các c ng
sự (1984)

h

ậ

ư c ho t ch t DC-38-V có ho t tính kháng khuẩn m nh và diệt

g hư H t ch t DC-38-V có m t số ặ

tế

v ); hiệ

i

hư

: C27H26O9 (MW=494

nóng ch y 245±2ºC; tan tốt trong dung môi DMSO, pyridin; ít tan trong
20

methanol, aceton, ethyl acetat...; góc quay cực [α]D

=-246°±10° (C=0,5,

DMSO).[35]
Theo Kolomiets và c ng sự (1997), ch ng x khuẩn Streptomyces flavescens
GV1 có tác dụng trong việc b o vệ giố g ư

h

t khỏi sự xâm h i c a ch ng n m

Fusarium oxysporum và Botrytis cinerea ở rễ [21]. C

g he Kolomiets và c ng sự
ư c nghiên cứu cho

(1999), ch ng x khuẩn Streptomyces flavescens GV1 tiếp tụ
th y thành ph n kháng sinh ch yếu là các polyen như h

he

[22].

T các nghiên cứu trên có th th y ư c tri n vọng lớn khi nghiên cứu ch ng
x khuẩn Streptomyces 155 21
phòng, ch a bệnh ở thực vậ

sinh tổng h p kháng sinh phục vụ trong công tác
g hư

gười.

1.3. Cải tạo giống và lên men
1.3.1. Cải tạo giống
Quá trình c i t o giố g
vào lên men, s n xu

h

C 2 hư

g h

ư c các ch ng có ho t tính cao và ổ

ị h ư

i t o giống

* Chọn lọc ngẫu nhiên
Các VSV có sự biến dị tự nhiên theo các t n số h
th có ho t tính KS m h h

h

g

10-20% so với các cá th khác.

Chọn lọc nh ng biến ch ng ngẫ

hi

c nh nhằm l y nh ng ch ng phát tri n và STH tốt nh
[6], [11].
11

ng c a nh

g iều kiện ngo i

ở kế th a thế hệ ước.


* Đột biến nhân tạo
Có 3 h

h

g y

t biến nhân t o:

- Tác nhân hóa học: hydroxylamin, ethylenimin, nitroso–guanidine, HNO2...
:

- Tác nhân vậ

h

g UV i X i

- Tác nhân sinh họ :

t biến do hiệ

ư ng thiế

e i

h y

hân

ổi gen.

sinh học biế

h

Sau khi bị x lý với
KS (

t biến, ph n lớn các VSV chết. Các cá th sống

ổi nhiễm s c th

sót sẽ có sự biế
g

h yee

h y ổi các tính tr ng dẫ
g h

t biến âm tính) hoặ
hi

Tiến hành sàng lọc ngẫ

ến m t (gi m) kh

g i h KS (

chọn biến ch ng tốt nh

t biế

ư

g

h)

nghiên cứu. [6], [11].

1.3.2. Lên men sinh tổng hợp KS
L

e

q

h

ổi ch t sinh họ

c a VSV nhờ xúc tác c a các enzym với mục

ư c tiến hành do ho
h

g

ng sống

g ư ng và các h p

ch t trung gian c n thiết cho chúng.
dụ g h i

Trong công nghệ KS s

hư

g

h

e

h h:

* Lên men bề mặt
- Đặc điểm: VSV ư c nuôi c y trên bề mặt mặt MT dịch th hoặc MT bán r n.
i h ư ng c

VSV h p thu các ch

i ường và s dụng O2 c

h p trên bề mặ MT Như vậy yêu c u bề mặt MT ph i

h

g h

hô

r ng và không quá sâu (5-10

cm).
- Ưu điểm:

gi n, dễ thực hiệ

ư

g hiết bị th p.

- Nhược điểm: mặt bằng lớn, hiệu su t th p, khó tự

ng,

giới hóa, chi phí

vị s n phẩm cao.

cho m
D

e

ề mặt không ứng dụng trong s n xu t công nghiệp mà chỉ áp

dụng trong nghiên cứu c i t o giống trong phòng thí nghiệm. [6], [11].
* Lên men chìm
- Đặc điểm: VSV ư c nuôi c y và phát tri n trong toàn b MT lỏng. Giống
i h ư

dùng trong lên men là tế

g ồng hóa vật ch t cao. Vì vậy
lệ giống so với MT

e

g

g ở gi i

n phát tri n m nh và có kh

ước khi lên men ph i tiến hành chế t o giống. Tỷ

hường dùng 1-10%.
12


e

Quá trình

h y ổi

iều kiệ

ổi ch t, t o bọt trên bề mặ Đ

các thành ph n trong MT, các s n phẩ
iều kiện tối ư

h

ự phát tri n c

VSV

số biện pháp: dùng dung dị h ệ

MT hư H

uc

ổ

gq

h

e

gười

ồ g
mb o

ư

t

ịnh pH, thêm các ch t phá bọt...[6], [11]

- Phân loại:
+ Lên men mẻ (

e gi

ưởng thành trong m t hệ thố g

n, lên men chu kỳ): Lên men dịch th , VSV
g với ườ g

(pha lag-pha tiềm phát, pha log- h
ổi ch t thứ c

phẩ

v

y h a, pha cân bằng, pha suy tàn). KS là s n

hườ g ư c b
h

sang pha cân bằng, hoặc mu

T

g

u tổng h p t cuối pha log kéo dài

ốt thời gi

e

h

g

ng hay

xy ( ưới d ng khí nén), ch t phá bọt (nếu c n),

bổ sung gì vào MT, tr việc cung c
ch

g i h ưở g hường gồm 4 pha

iều chỉnh pH. [11]
+ Lên men có bổ sung: Lên men có bổ sung là hình thức cái tiến c a lên men
u lên men, các thành ph n ức chế việc t o ra s n phẩ

mẻ. Khi b

(glucose, các h p ch

i

) ư

ư v

với nồ g

th

v

ổi thứ c p

ư c bổ sung vào hệ

thống trong suốt quá trình lên men.[11], [14].
+ Lên men bán liên tục: Trong quá trình lên men, việc rút bớt dịch lên men và
g h

bổ
gi

x

MT i h ư ng không x y ra liên tụ

ịnh.
+ Lên men liên tụ : Q

v

h
ư

ịnh kỳ sau nh ng kho ng thời

xe

e
hư

ồng thời

h

e MT i h ư
y

g ư c bổ sung liên tục

ồng th tích dịch lên men. Quá trình này

t hệ mở. [11], [12], [14].

- Ưu điểm: MT dinh ư ng s dụng m t cách triệ
tiết kiệm mặt bằng s n xu t, dễ

giới hóa, tự

, hiệu su t lên men cao,

ng hóa, chi phí cho m

vị s n

xu t th p, có th tri n khai trên quy mô lớn. [6], [11].
- Nhược điểm: yêu c u ph i có thiết bị chuyên dụng (thiết bị chịu áp lực...) nên
hi h

ư ớn.
Ngày nay, lên men mẻ và lên men có bổ

công nghiệp s n xu t KS.

13

g ư c ứng dụng phổ biến trong


1.4. Chiết tách, tinh chế
ổi ch t thứ c

KS là s n phẩ

ết thúc quá trình lên men KS có

th nằm trong sinh khối hoặc trong dị h
g hư hiều t p ch
kết tinh với nồ g

D

e

ồng thời có nhiều s n phẩm phụ,
h

n ph i chiết tách và tinh chế

tinh khiết cao.Trong công nghiệ

hườ g

ư c s n phẩm

g

hư

g h :

)

tách l y

lọc, chiết, h p phụ, cô và s c ký.
1.4.1. Chiết xuất
hư

Chiết xu t là m

g h

g

DM (

h yh nh

m t ch t hay m t nhóm ch t t h n h p c n nghiên cứu. [6], [11]
 Với KS ngo i bào tồn t i trong dung dị h
lỏng với

hư

g h

e

gười ta dùng phép chiết lỏng -

hiết:

( hiết m t l n).

- Chiế

- Chiết lặp (chiết nhiều l n).
- Chiế

gư c dòng.

 Với KS n i bào: tiến hành chiết r n - lỏng. Nguyên t c c

hư

g h

y

ựa

vào sự khuếch tán c a KS vào DM chiết.

1.4.2. Tách và tinh chế
h

Tách s n phẩm là m

ến nh ng h n h

t h n h p phức t
Đối với h n h

hư

ồng nh

chuy n m t ch t t

h

gi

g hư
y

g h

g h

g h
h

h

học, vật lý, hóa lý nhằ

h

i

h i g ư c t ng ch t.

h y n pha, dùng m t DM thích h p
Phư

g h

gồm: chiết, thẩm th u, s c

ký. [1], [6], [14]
g

Quá trình tách s
sự phân chia các thành ph
s c

q

gi i

h

: ư h nh

tách t ng thành ph n khỏi m t h n h p. Dựa vào
h

v

h i h
h

hiện ch t c n tách.
Có các lo i s c ký sau:
 S c ký gi y
 S c ký lớp mỏng

14

ĩ h h

ĩ hv
h

h

ng. Quá trình tách
gq

h

ĩ hv

h


Tiến hành trên m t b n mỏng (th y tinh hay kim lo i)
lỏng h p phụ d ng b t mịn. Ch

hường dùng là silicagel lo i h t mịn.

Ưu điểm: Nhanh (15-30 phút), trang thiết bị ư
với ị h ư

gv

hườ g ư

g ối

ị h ư ng. Tách nhiều h n h

g

h

g ẵn m t lớp ch t

gi n, dễ kết h
ư

ịnh tính

g ối phức t p. SKLM

ố ư ng các thành ph n có trong KS.

 S c ký lỏng trên c t
Ch t h p phụ hoặc ch t làm nề

h

h

ĩ h ư c nhồi trong ống c t hình trụ,

nhờ vậy mà có th khai tri n nhiều hệ DM khác nhau liên tụ
chế h

Thườ g

g

tinh

ư c KS tinh khiết.

Hóa chất nhồi cột: cellulose, oxid nhôm, silicagel...
Dung môi: các hệ DM dùng cho s c ký lớp mỏng và s c ký gi y ều có th s dụng.
Dựa vào kết qu

h

h

h h h n KS bằ g SKLM

ch y SK lỏng trên c t thích h p. Ngoài ra, các yếu tố hư
h t nhồi
Phư

g

h h

g h

n c n thu l y
iện di mao qu

g

lựa chọn DM

h hước c

h hước

h hưở g ến quá trình.

g ư c s dụ g

tinh s ch KS.

1.5. Nghiên cứu cấu trúc KS bằng đo phổ
Trong nghiên cứ STH KS

gười

hường s dụ g

hư

g h

hổ

nghiên cứu c u trúc KS.
1.5.1. Phổ hồng ngoại
h p thụ

Nguyên tắc: Trong phân t khi có nhóm nguyên t
v

h y ổi tr g h i

g ư ng

ng thì t o nên m t d i h p thụ trên phổ IR. Có mối ư

g

quan gi a nhóm nguyên t và d i h p thụ nên có th dựa vào sự có mặt c a d i h p thụ
nhận biết m t nhóm chứ

[1], [6]

1.5.2. Phổ tử ngoại
g ư ng các bức x ánh sáng vùng UV -

Nguyên tắc: Dựa trên sự h p thụ

h y ổi mứ

VIS bởi các phân t c a ch t nghiên cứ

g ư

g iện t (E0, E1,

E2...). Gi a c u trúc hóa học và quang phổ h p thụ có mối quan hệ chặt chẽ, chỉ có
nh ng phân t
chuy n t tr g h i
h

h

iện t dễ bị kích thích mới h

h

g ư ng

n lên tr ng thái bị kích thích (phân t có nối

ị tố N, S, O...). [1], [6]
15

h

g

i i

h p,


1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
Phổ c

g hưởng t h t nhân là m t k thuậ ư việ
hư

h p ch t h

g h

iệ

gx

ịnh c u trúc các

nh t trong phân tích và biện gi i toàn b phổ.
hư g hy

K thuật NMR có th nghiên cứu nhiều nguyên t

v

hổ biến

nh t.
Nguyên lý:
- Phổ c

g hưởng t h t nhân là sự phát sinh các tín hiệu NMR x y ra do sự phụ thu c

ườ g

tín hiệu theo t

ường H hay t n số μ c a t

- Nếu h t nhân nguyên t có t
ường sẽ dẫ

ến h p thụ

h ư

ường biến thiên.

ặt trong m t t

g ư ng c a t

ườ g

hi h y ổi t

ường biến thiên, và xu t hiện phổ NMR

- Nh ng h t nhân nguyên t có khối ư ng là số lẻ và nh ng h t nhân có khối ư ng là
hư g ố thứ tự nguyên t là số lẻ thì có moment t và cho tín hiệu c ng

số chẵ

hưởng h t nhân.
- Nh ng h t nhân nguyên t có khối ư ng và số thứ tự là số chẵn thì không có
moment t và không cho tín hiệu NMR.
- Vị trí c a tín hiệu c
t ở vùng lân cậ q

g hưởng t proton trong phổ NMR phụ thu c vào mậ

iện

h

 Biện giải phổ NMR: thông qua việc phân tích các yếu tố sau:
g hưởng): c a phổ 1H-NMR nằm

- Đ chuy n dịch hóa học (vị trí c a tín hiệu c
trong kho ng t 0-12ppm
- Tư

g

i -spin: cho biết số ư ng H ở nguyên t C bên c nh và mối ư

quan lập th c a các nguyên t H với h
c a tín hiệu c

g hưởng; Tỷ lệ ườ g

T

g

g

gười ta quan tâm tới: Đ i b i

c a các v ch tín hiệu; Hằng số ư

g

spin-spin.
- Diệ

h ưới tín hiệu: cho biết số ư

 Phổ 13C-NMR: Về g y
tín hiệu c

g hưởng là 13C Th g

g ư

g ối c a proton cho tín hiệu. [14].

g giố g hư 1H-NMR hư g ở

y h t nhân cho

chuy n dịch hóa học t 0-200ppm.

1.5.4. Khối phổ
Nguyên tắc: Khối phổ là k thuậ
i

o trực tiếp tỷ số khối ư

gv

iện tích c a

( /z) ư c t o thành trong pha khí t phân t hoặc nguyên t c a mẫu. Dùng
16

h

iện t

g ư ng yếu hoặc trung bình (50-100eV)

ở chân không cao (10-6

Hg) T

gq

b n phá phân t h u

h ó ch t h

ị ion hóa và bị phá

ư c c ng h p với các ion) thành m nh. Các tín hiệ

v (hoặ

các ion sẽ th hiện bằng m t số v h ( i )

ườ g

h

ư

ư

g ứng với

khác nhau tập h p thành m t

khối phổ ồ.
h

Nó cung c
ịnh c

v

g i

ịnh tính (khối lư ng phân t , nhận d ng các ch t) xác

ị h ư ng các ch t.

1.6. Phân loại, xác định tên xạ khuẩn bằng kỹ thuật gen
ở ra kh

Ngày nay nh ng tiến b trong sinh học phân t
hiệu trong phân lo i học và nghiên cứ

g ứng dụng h u

ng vi sinh vật. M t trong nh ng cách tiếp
y

cận phân lo i học với k thuật sinh học phân t hiệu qu nh t hiệ

thuật

phân tích acid nucleic [14].
K thuật phân tích acid nucleic liên quan ch yế
trúc acid nucleic, mối ư

gq

ế

h

h

h hước, c u

về trình tự acid nucleic thông qua gi i trình tự ADN

và lai ADN. Việc nghiên cứu phát sinh loài dựa trên phân tích chu i 16S ADN
g e

i nh ng kết qu quan trọng trong việc phân lo i vi khuẩn và x khuẩ
hư h

là vì trình tự nucleotid c a gen 16S rADN h
h ực

ge

y

ghĩ

ặ

g

ư g h

ự

v
Đ

ổi gi a các loài,

i [1] [14] Đ có th phân tích

chu i 16S rADN c n ph i tiến hành hai k thuật quan trọng nh
gen PCR và gi i trình tự ADN [14]. Việ

h

hàng triệu hoặc nhiề h

n ADN hay ARN nghiên cứu. Có nhiều

hư

g h

h

h

h

với mẫ

ị h

ặc hiệ

h

i

nh y v
ư

x

ị h

h ặc hiệ
h

Phư

Kết qu x

hé x

ịnh và tên khoa học

ịnh trình tự ADN

h

hé x

học c a các ch ng vi sinh vật. [1], [5], [14].

17

g ố ư ng g p
i he

h

y Phư

g

h hước s n phẩm c a ph n ứng
h

g h

ếu s n phẩ
ư

ị h ư c trình tự ADN c a s n phẩm PCR. Việ x

tự ADN sẽ h

hé

phân tích nguồn ADN khuyế h

gi n nh t là s dụ g iệ

PCR. Có th x
x

ối với

ge

thuật nhân

PCR ư c lai

i thông tin nhiều nh t là
ị h ư c sai khác c a trình

ối ư ng vi sinh vật nghiên cứu.

ịnh mối liên hệ tiến hoá và dịch tễ