PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC GENE ĐỘC TÍNH CỦA VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus GÂY BỆNH TRÊN TÔM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC GENE ĐỘC TÍNH CỦA
VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus
GÂY BỆNH TRÊN TÔM

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HOÀNG PHƯƠNG
Niên khóa:

2010 – 2014

Tháng 02 năm 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC GENE ĐỘC TÍNH CỦA
VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus
GÂY BỆNH TRÊN TÔM

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. NGUYỄN BẢO QUỐC

NGUYỄN HOÀNG PHƯƠNG

Tháng 02 năm 2015

2


LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm ơn
Cha, mẹ người thân đã luôn ủng hộ và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn
Công nghệ Sinh học, cùng tất cả thầy cô đã truyền dạy kiến thức cho tôi trong suốt
những năm học vừa qua.
TS. Nguyễn Bảo Quốc đã tận tình hướng dẫn , giúp đỡ, động viên và tạo mọi
điều kiện thuận lợi cho tôi suốt thời gian làm đề tài và hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp này.
Các bạn lớp DH10SH đặc biệt là các thành viên trong phòng thí nghiệm Bệnh
học người đã giúp đỡ, động viên, chia sẻ cùng tôi trong thời gian làm đề tài vừa qua

Sinh viên thực hiện
Nguyễn Hoàng Phương

3

TÓM TẮT
Hội chứng hoại tử gan tụy cấp tính (AHPNS) là căn bệnh truyền nhiễm nguy
hiểm ở tôm nuôi. Căn bệnh này có thể được phát hiện quanh năm nhất là vào mùa hè
từ tháng 4 đến tháng 8 khi điều kiện khí hậu thuận lợi cho vi sinh vật phát triển. Gặp
điều kiện phù hợp bệnh có thể bùng phát nhanh và phát triển thành đại dịch và gây
thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi tôm. Các triệu chứng ban đầu của tôm bị bệnh
như là: lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn. Tôm bệnh thường có xu hướng tách đàn, có thể được
nhìn thấy ở mặt ao, gần bờ hay bơi lòng vòng. Tôm bị bệnh chết thường có các biểu
hiện: vỏ tôm bị mềm, xuất hiện các vết thương hoại tử, ăn mòn trên vỏ và gan tụy tôm.
Nguyên nhân gây bệnh AHPNS được cho là do nhóm vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus gây ra.
Mục đích của nghiên cứu này là phân lập và xác định vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus từ các mẫu tôm bệnh thu thập được từ các ao nuôi tôm ở một số
tỉnh miền Tây Nam Bộ. Bằng việc sử dụng phương pháp sinh hoá và PCR với các
đoạn mồi chuyên biệt cho nhóm V. parahaemolyticus như AP3, 16s-rDNA, và các
gen độc tố của nó như là ToxR, tdh, tlh, trh. Kết quả của nghiên cứu này là có một
chủng vi khuẩn V. Parahaemolyticus đã được phân lập và xác định, bên cạnh đó các
chủng vi sinh vật khác bao gồm Vibrio spp. và staphylococcus cũng đã được phát hiện
từ mẫu tôm bệnh. Kết quả nghiên cứu làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu sâu hơn
về sự biểu hiện của các gen độc nhằm xây dựng và phát triển các vaccin điều trị
V.parahaemolyticus trên tôm cũng như cho những nghiên cứu tiếp theo về sự đa dạng
của các loài vi khuẩn Vibrio ở Việt Nam

4


SUMMARY
The acute pancreatic necrosis liver (AHPNS) has been considered as one of the
most dangerous diseases in shrimp. AHPNS can be detected throughout the year, particularly
in the summer (April-August) when climatic conditions are favorable for microbial growth.

The initial symptoms of AHPNS in shrimp are not clear, but they showed lethargy,
listlessness, poor appetite. Then AHPNS based patients manifest with soft shelled shrimp,
prawns change color, liver, pancreas limp, shrink or swell. The causal agent of AHPNS
disease in shrimp has been known to be the bacteria Vibrio parahaaemolyticus producing a
potent toxin rapidly that can destroy tissue and liver dusfunction in the pancreatic digestive
system.
In this study, the bacteria Vibrio parahaemolyticus was isolated from infected
shrimp samples collected from various shrimp raising ponds at some provinces in the South
West of Vietnam. The detection of V. parahaemolyticus was conducted by using biochemical
methods and PCR with specific primers of AP3, 16S rDNA and tbe toxin genes such as ToxR
, tdh, tlh and trh. The results obtained here will be helpful for further studies involving in the
expression profiles of toxic genes in vitro and in vivo to build and to develop the vaccine
based treatment to V. parahaemoliticus on shrimp as well as for further research on the
diversity of Vibrio species in Vietnam.

MỤC LỤC
5


DANH SÁCH CÁC BẢNG

6


DANH SÁCH CÁC HÌNH

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AHPNS:

Acute hepatopancreatic necrosis disease

7


EMS:

Early Moratlity Syndrome

PCR:

Polymerase Chain Reaction

KIA:

Kligler Iron Agar

NB:

Nutrient Broth

tdh:

Themostable direct hemolysin

trh:

Themostable related hemolysin

tlh:

Themostable hemolysin

TCBS:

Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose

TSA

Tryptica Soy Agar

8


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Ngành nuôi tôm thương phẩm trên thế giới đã có từ rất lâu nhưng chỉ thực sự
phát triển vào những năm 1980, khi lần đầu tiên tôm giống được sản xuất ra với số
lượng lớn cung cấp cho người nuôi. Ngày nay, ở nhiều nơi trên thế giới, ngành nuôi
tôm thương phẩm đang gặp rất nhiều khó khăn bởi các nạn dịch bệnh nguy hiểm, có
tốc độ lan truyền rất nhanh như: bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh còi, bệnh xuất
huyết,… do bị các tác nhân như là virus, vi khuẩn, nấm,…gây ra đã và đang gây nhiều
thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi tôm. Trong đó, đối tượng gây bệnh đáng quan
tâm hiện nay đó là vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đã được chỉ ra là nguyên nhân
gây ra bệnh chết sớm (EMS) và bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPNS). Căn bệnh này
rất nguy hiểm vì tôm mắc bệnh có thể bị chết lên đến 100 % trong vài ngày. Nhiều
nước trên thế giới đã xác nhận sự hiện diện của căn bệnh này như: Australia, Ấn Độ,
Indonesia, Philippines, Đài Loan, Thái Lan,.. trong đó có Việt Nam. Căn bệnh này đã
gây ra sự giảm sút nghiêm trọng về mặt sản lượng tôm gần đây ở các nước như Việt
Nam, Ấn Độ, Bangladesh, Philippines và Trung Quốc. Tôm nhiễm bệnh do vi khuẩn
Vibrio parahaemolyticus thường có các dấu hiệu như: biếng ăn, bơi yếu, xuất hiện

những vùng hoại tử ở vỏ và mô gan. Xuất phát từ thực trạng trên, đề tài “phân lập,
xác định và đánh giá sự hiện diện các gene độc tính của vi khuẩn Vibrio
parahaemolyticus gây bệnh trên tôm” đã được thực hiện tại Tòa nhà A1, Viện nghiên
cứu Công nghệ sinh học và Môi trường - Trường ĐH Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh từ
tháng 01 năm 2014 đến tháng 02 năm 2015, nhằm mục đích phân lập và xác định
V.parahaemolyticus làm nguồn vật liệu ban đầu cho các nghiên cứu về biểu hiện của
các gen độc cũng như là cho việc xây dựng quy trình chuẩn đoán vi khuẩn này trên
tôm.

9


1.2. Yêu cầu
-

Xác định sự hiện diện của vi khuẩn Vibrio spp. trên tôm bằng các chỉ tiêu sinh

-

hóa.
Thiết lập quy trình PCR trong việc chuẩn đoán vi khuẩn V.parahaemolyticus

-

bằng việc sử dụng các đoạn mồi chuyên biệt như AP3, 16S rDNA
Xác định sự hiện diện của các gen độc như là: ToxR, tdh, tlh, trh trên chủng V.
parahaemolyticus đã phân lập được.

1.3. Nội dung thực hiện
-

Phân lập Vibrio spp. trên các mẫu tôm thu thập được.
Đánh giá các chỉ tiêu sinh hoá trên các chủng vi khuẩn Vibrio spp. phân lập

-

được.
Định danh sự hiện diện của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bằng phương

-

pháp PCR.
Xác định sự hiện diện các gene gây độc của vi khuẩn V.parahaemolyticus
bằng phương pháp PCR.

10


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Đặc điểm về giống Vibrio
Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae là những loài vi khuẩn Gram (-), hình que
thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm. Chúng không sinh bào
tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu vi khuẩn. Tất cả
những loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio đều là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, vi khuẩn
không phát triển trong môi trường không có muối (NaCl) và không sinh H2S.
 Phân loại Vibrio
Bộ: Eubacteriales
Họ: Vibrionaceae
Giống: Vibrio

Loài: V.alginolyticus; V.parahaemolyticus; V.anguillarum; V.harveyi; V. salmonicida;

V.splendidus
2.2 Lịch sử phát hiện và sự phân bố của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus
Bệnh do vi khuẩn Vibrio (Vibriosis) đã được phát hiện từ rất sớm trên các động
vật thủy sản thuộc họ giáp xác. Cho đến nay bệnh Vibriosis đã được phát hiện ở nhiều
nước trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Một nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các
loài tôm hùm châu Mỹ như: Homarus americarus, H. gammarus... và tôm hùm châu
Á như: Panulirus homarus, P. ornatus... đều có thể bị nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio
(Fisher và ctv, 1977; Phillips, 2013). Ở Việt Nam, một số nghiên cứu cho rằng nguyên
nhân gây ra bệnh đỏ thân là do tôm ăn Artemia và tảo. Từ năm 1989 đến 1990 các
nghiên cứu đã chỉ ra rằng bệnh Vibriosis, đặc biệt là bệnh phát sáng xảy ra khá phổ
biến ở các trại sản xuất tôm sú giống và ở ao nuôi tôm thương phẩm tại Việt Nam (Đỗ
Thị Hòa, 1994). Trong những năm gần đây, khi nghề nuôi tôm phát triển thì bệnh
Vibriosis đã trở nên quen thuộc với người nuôi tôm. Hằng năm, bệnh vẫn gây ra những
tổn thất lớn về sản lượng tôm. Tại Việt Nam, trong năm 2012 dịch bệnh Hội chứng
11


tôm chết sớm (EMS) ảnh hưỏng nghiêm trọng trên diện rộng. Cả nước có khoảng
100.766 ha diện tích nuôi tôm đã bị ảnh hưởng bởi dịch bệnh này (Lê Hằng và Nguyễn
Thị Bích, 2012).
Các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio chủ yếu sống ký sinh trên cơ thể động vật
thủy sản và gây ra một số triệu chứng bệnh lý nhất định. Gần đây, một số nghiên cứu
đã chỉ ra rằng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là nguyên nhân gây ra bệnh
EMS/AHPNS trên tôm nuôi (Lightner và ctv, 2012). Bệnh này xảy ra và phát triển
thành dịch phụ thuộc vào nhiều điều kiện khác nhau: tôm bị bệnh truyền nhiễm hoặc
các bệnh về dinh dưỡng, tôm bị thương hoặc điều kiện môi trường khắc nghiệt. Việc
phân lập Vibrio parahaemolyticus từ mẫu tôm bệnh không khó nhưng xác định được
vai trò của chúng trong một bệnh là điều không đơn giản và việc gây bệnh thực

nghiệm khó thành công do không tạo được các yếu tố phù hợp để bệnh bùng phát.
Trong tự nhiên, vi khuẩn Vibrio spp. có mặt ở hầu hết các môi trường nước
đặc biệt là vùng nước lợ ở cửa sông và vùng nước ngập mặn. Ion Na + là yếu tố cần
thiết cho sự phát triển của các loài vi khuẩn này, với một số loài thì ion này là nhu
cầu tuyệt đối và không thể thiếu.
2.3 Đặc điểm dịch tễ học
2.3.1 Đặc điểm phân bố
-

Địa lý: Bệnh Vibriosis có thể được phát hiện được ở mọi khu vực trên thế giới, nơi
có nghề nuôi động vật thủy sản nước lợ và nước mặn. Các khu vực tập trung nhiều
nhất như là ở châu Á, châu Phi và châu Mỹ. Từ các mẫu bệnh của ấu trùng, hậu ấu
trùng và tôm bệnh, một số loại khác nhau của giống vibrio đã phân lập được. Như ở
Philippines, Lavilla-Pitogo đã phân lập được 2 loài V.harveyi và V.splendidus
(Lavilla-Pitogo và ctv, 1990). Trong khi ở Thái Lan, V.parahaemolyticus được phát
hiện trên các mẫu tôm bệnh. Tại Việt Nam, 2 loài vi khuẩn thuộc giống này đã được

-

phân lập là V.alginolyticus và V.parahaemolyticus.
Ký chủ: Hầu hết các loài động vật thủy sản nước lợ, mặn đều có thể mang và bị ảnh
hưởng của bệnh Vibriosis như: các loài tôm he (Penaeus spp.) và tôm thẻ

12


(Metapenaeus spp.), các loài tôm hùm châu Mỹ (Homarus spp.) và tôm hùm châu Á
-

(Panulirus spp.), các loài cua biển như cua xanh, cua đá...

Giai đoạn phát bệnh: xảy ra ở hầu hết các giai đoạn phát triển của tôm như : ấu
trùng, hậu ấu trùng, ấu niên, cơ thể trưởng thành và cả cá thể bố mẹ. Nhưng tùy
vào từng loại bệnh mà vi khuẩn Vibrio spp. có thể gây bệnh mạnh ở giai đoạn này
và nhẹ hơn ở giai đoạn kia. Ví dụ: Bệnh phát sáng do Vibrio harveyi có thể xảy ra ở
nhiều giai đoạn khác nhau, nhưng tác hại nặng nhất là giai đoạn tiền ấu trùng Zoae

-

và Mysis.
Con đường lan truyền: vi khuẩn Vibrio spp. xâm nhập vào ao nuôi thuỷ sản theo một
số con đường như: nguồn nước, dụng cụ dùng, tôm bố mẹ hoặc tôm giống, thức ăn
đặc biệt là thức ăn tươi sống Artemia và chúng có thể nằm sẵn ở thành bể hay dưới
đáy ao.
2.3.2 Thời gian xuất hiện bệnh.
Thời gian xuất hiện bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. tùy thuộc theo loài và địa
điểm nuôi. Nhìn chung vi khuẩn Vibrio spp. sinh sản rất nhanh ở độ mặn 10 – 40 ppt
(phát triển mạnh nhất ở độ mặn 20 – 30 ppt), lây lan nhanh ở nhiệt độ cao (mùa hè),
phát triển tốt ở nơi có nhiều chất hữu cơ, oxy thấp và pH trong khảng 7 – 9. Trong bể
nuôi, lượng vi khuẩn Vibrio tăng theo thời gian nuôi. Mật độ vi khuẩn Vibrio spp. tăng
nhanh rõ rệt khi thời tiết thay đổi, vào các thời điểm biển động do bão, gió mùa hay áp
thấp nhiệt đới hoặc theo con nước của thủy triều (nước cường, nước ròng) (Đỗ Thị
Hòa, 1997).
2.3.3 Tác hại của bệnh
Theo thống kê của tổng cục thủy sản Việt Nam, trong 10 tháng đầu năm 2013,
dịch bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra đã được phát hiện tại 192 xã của 57 huyện
thuộc 18 tỉnh, thành phố trong cả nước. Tổng diện tích nuôi tôm xuất hiện bệnh là
5.705 ha, bao gồm 2.423 ha nuôi tôm thẻ chân trắng và 3.282 ha nuôi tôm sú. Dịch
bệnh diễn ra ở hầu hết các vùng trọng điểm nuôi tôm, trên cả 2 đối tượng nuôi chính là
tôm sú và tôm thẻ chân trắng, trong đó các tỉnh nuôi tôm ở Đồng bằng Sông Cửu Long
là bị thiệt hại nặng nề nhất (Kiều Ngọc Hà, 2013).

13


Thông thường bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra ở tôm có thể xảy ra ở dạng
cấp tính hoặc mãn tính, trong trường hợp cấp tính, tỷ lệ chết có thể lên đến 100 %.
2.3.4 Đặc điểm sinh hóa của Vibrio
Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Vibrio harveyi.

2.4 Dấu hiệu bệnh lí
2.4.1 Dấu hiệu lâm sàng
Tôm bị nhiễm vi khuẩn Vibrio spp. ở trạng thái không bình thường, lờ đờ, kém
ăn hoặc bỏ ăn. Tôm có thể được nhìn thấy ở mặt ao, gần bờ hay bơi lòng vòng. Tôm
chết bệnh thường xuất hiện các triệu chứng như : vỏ tôm bị mềm, xuất hiện các vết
thương hoại tử, ăn mòn trên vỏ và bộ phận khác của tôm.

14


Vỏ kitin của tôm khi mang vi khuẩn này có thể xuất hiện các vết thương tổn
màu nâu đen do bị ăn mòn và viêm nhiễm. Hội chứng này gọi là bệnh vỏ hay bệnh
nhiễm nâu.
Ấu trùng tôm và tôm giống khi nhiễm V. parahaemolyticus và V. harveyi sẽ có
sự phát sáng ở phần giáp đầu ngực trong tối. Sau đó sẽ kèm theo hiện tượng lắng đáy
và chết hàng loạt. Hội chứng này gọi là bệnh phát sáng trên tôm
Xuất hiện các chấm đỏ ở gốc râu ngực, ở thân hay ở các phần phụ của ấu trùng
tôm khi nhiễm V. alginolyticus. Xuất hiện vùng mờ ở phần cơ bụng, tôm bị nhiễm
bệnh thường có các biểu hiện: bỏ ăn, xuất hiện sắc tố nâu đen trên mặt lưng của phần
bụng gây nên những khoảng tối sáng khác với tôm bình thường, các cơ quan phần phụ
chuyển màu đỏ.

2.4.2 Dấu hiệu bệnh tích
Vi khuẩn Vibrio cũng có thể nhiễm ở gan tụy, ruột và một số vùng cơ của tôm.
Tuy nhiên, khi giải phẩu cơ thể tôm bệnh chúng ta không thể phát hiện được dấu hiệu
bệnh tích. Một số bệnh đặc trưng do Vibrio spp. gây ra trên tôm:
-

Bệnh phồng đuôi: Nguyên nhân chính là do số lượng thức ăn dư thừa và vật
chất khác tích tụ ở đáy ao tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển,
chủ yếu là vi khuẩn thuộc giống Vibrio mà chiếm đa số là V.parahaemolyticus

-

(Đỗ Thị Hòa, 2004).
Bệnh đỏ dọc thân: Nguyên nhân chính là do nước và đáy ô nhiễm nặng, thức
ăn thừa quá nhiều, công tác vệ sinh kém, nhiễm vi khuẩn Vibrio mà chủ yếu
là V.alginolyticus (Đỗ Thị Hòa, 2004).

2.5 Gene độc tố của V. parahaemolyticus
Gen toxR là gen điều hòa các gen độc tố, có trình tự bảo tồn đặc trưng cho
loài nên có thể được sử dụng làm gen đích để xây dựng phương pháp phát hiện nhanh
vi khuẩn Vibrio trong mẫu tôm bệnh bằng kỹ thuật PCR. Bên cạnh đó, gen tlh là gen
mã hóa một hemolysin không bền nhiệt có trình tự amino acid bảo thủ trong họ

15


Vibrionaceae, nên có tiềm năng làm vaccin điều trị bệnh thủy sản và marker chẩn
đoán bệnh do Vibrio (Nguyễn Văn Duy và ctv, 2012).
Ngoài khả năng gây bệnh trên tôm V.parahaemolyticus còn có khả năng gây
bệnh trên người do loài vi khuẩn này có các gen mã hóa cho độc tố hemolysin như

là: themostable direct hemolysin (tdh), themostable related hemolysin (trh) và
themostable hemolysin (tlh). Đây là loại độc tố làm phân giải tế bào hồng cầu và
giải phóng hemoglobin. Có nghiên cứu đã chỉ ra rằng, các gen độc tố của vi khuẩn
V.parahaemolyticus là nguyên nhân gây ra bệnh viên dạ dày cấp tính (Honda T và
Iida T, 1993).
2.6 Các phương pháp phát hiện Vibrio spp.
2.6.1 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật
2.6.1.1 Nguyên tắc
Nuôi cấy tăng sinh khối trong môi trường canh peptone kiềm, phân lập trên
môi trường phân lập đặc trưng. Quan sát chọn những khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa
cấy. Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện và ít tốn kém. Tuy
nhiên, nhược điểm của nó là mất thời gian để thực hiện.
2.6.1.2 Cách thực hiện
Lấy mẫu mô gan tụy của tôm bệnh, nghiền nhỏ và pha loãng đến nồng độ thích
hợp. Sau đó nhỏ 0.3 ml dịch mẫu lên các đĩa chứa môi trường TCBS, dàn đều khắp bề
mặt môi trường, mỗi mẫu cấy lên một đĩa. Ủ trong tủ ấm ở 30 0 C trong 24 giờ. Tách
dòng các chủng vi khuẩn mọc trên bề mặt môi trường. Tiến hành thử nghiệm các đặc
tính sinh hóa của Vibrio spp. như khả năng sử dụng các đường glucose, sorbitol,
maltose, sucrose, lactose, galactose; khả năng sử dụng Citrate như nguồn carbon duy
nhất trên môi trường Simons Citrate Agar; khả năng sinh gar của glucose, kiểm tra khả
năng lên men và oxy hóa; khả năng phân giải gelatin; khả năng sử dụng Nitrate; phản
ứng Indol hóa; khả năng sử dụng các acid amin.

16


2.6.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Karl Mullis và cộng sự
(Mỹ) phát minh năm 1985, từ đó đã tạo ra một tác động to lớn đối với các nghiên cứu
sinh học trên toàn thế giới. Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng

hợp một số lượng lớn bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên hoạt động của
enzyme polymerase. Phương pháp PCR dựa trên nguyên tắc hoạt động của DNA
polymerase trong việc tổng hợp DNA mới từ mạch khuôn. Tất cả các DNA polymerase
đều cần có những mồi, là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một
đầu của mạch khuôn DNA. Ðoạn mồi này sau đó sẽ được kéo dài dưới tác động của
DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh. Để phản ứng PCR có thể
khuyếch đại một trình tự đặc biệt nào đó thì cần phải có những thông tin tối thiểu về
trình tự đó để thiết kế các mồi tương ứng bao gồm một mồi xuôi (sense primer) và một
mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gene. Khi phản ứng xảy ra sẽ
cho hàng loạt bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi đó.
Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm
ba giai đoạn cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA khuôn mẫu được biến tính ở nhiệt
độ cao trong vòng 30 giây – 1 phút, thường là ở 94 0 C. Giai đoạn bắt cặp là giai đoạn
mà nhiệt độ được hạ thấp, cho phép các mồi bắt cặp bổ sung với khuôn. Trong thực
nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng từ 30 – 70 0 C và thời gian dao động trong
khoảng 40 giây – 1 phút. Giai đoạn tổng hợp: trong giai đoạn này, nhiệt độ được tăng
lên đến 720 C kéo dài từ 20 giây đến nhiều phút để cho DNA polymerase thực hiện quá
trình tổng hợp. Trong phản ứng PCR, chu kỳ gồm ba giai đoạn trên sẽ được lặp lại
nhiều lần, mỗi lần lặp lại sẽ làm tăng số lượng bản sao lên gấp đôi. Theo tính toán, sau
30 chu kỳ, số bản sao sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu.
Rất nhiều nghiên cứu không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều nước trên thế giới
đã sử dụng phương pháp này để phát hiện vi khuẩn V.parahaemolyticus. Các nghiên
cứu sử dụng cặp mồi ToxR như là: Nguyễn Văn Duy và ctv, 2012; Lightner và ctv,
2012; Kim và ctv, 1999 hay với 3 cặp mồi tdh, trh, tlh như là: Bej và ctv, 1999;
Honda và ctv, 1993 và gần đây nhất là nghiên cứu sử dụng phương pháp này với
cặp mồi AP3 là Kongrueng và ctv, 2014 cũng cho phép xác định loài vi khuẩn này.
17


Ngoài 2 phương pháp trên, với sự tiến bộ của khoa học công nghệ, các nhà

nghiên cứu đã phát triển một số phương pháp mới như là multiplex PCR, realtime
PCR, multipleax realtime PCR, kỹ thuật LAMP,... Các phương pháp mới này dựa trên
nguyên lí hoạt động của phương pháp PCR truyền thống nhưng lại có tính ưu việt hơn.
Ví dụ như: phương pháp realtime PCR có sự gắn kết giữa máy PCR và máy vi tính cho
phép việc xem xét mức độ biểu hiện của các gen mục tiêu hay kỹ thuật LAMP sử dụng
cùng lúc các cặp mồi chuyên biệt cho phép xác định nhanh loài vi khuẩn quan tâm
trong thời gian ngắn.
Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp realtime PCR trong việc xác định vi
khuẩn V.parahaemolyticus như nghiên cứu của Nordstrom, J. L. và ctv, 2007. Nội
dung của nghiên cứu này là xác định sự hiện diện của vi khuẩn V.parahaemolyticus
gây bệnh viêm dạ dày ở Hoa Kỳ. Bằng kỹ thuật realtime multiplex PCR sử dụng đồng
thời 3 cặp mồi là tdh, trh, tlh. Kết quả của nghiên cứu này dùng để chứng minh sự tiện
ích của phương pháp PCR và ứng dụng phương pháp này trong việc phát hiện vi
khuẩn V.parahaemolyticus trong các ổ dịch.

18


Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1 Thời gian và địa điểm
•
•

Thời gian: từ 01/2014 đến 02/2015
Địa điểm: Tòa nhà A1, Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường Trường ĐH Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh

3.2 Dụng cụ và vật liệu
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu
Các loài vi khuẩn thuộc chi Vibrio phân lập được từ các mẫu tôm bệnh thu thập

được.
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ
 Dùng cho phân lập vi khuẩn
- Tủ cấy vi sinh
- Dĩa petri
- Ống nghiệm
- Cân phân tích
- Que cấy
- Đèn cồn
- Một số vật dụng có liên quan

 Dùng cho xác định vi khuẩn
19


-

Lam – lame
Kính hiển vi quang học
Máy PCR (Master cycler Nexus, Eppendorf, Đức)
Máy điện di gel (Mupid-Exu, Nhật Bản)
Ống eppendoft (25 – 50 µl)
Máy ly tâm (Beckman Coulter, Đức)
Tủ lạnh
Các thiết bị khác có liên quan
Hình 3.1 Máy PCR

3.2.3 Môi trường và hóa chất
3.2.3.1 Môi trường và hóa chất dùng cho phương pháp nuôi cấy
 Môi trường TSA

Môi trường TSA (thành phẩn môi trường xem ở phụ lục 1) là môi trường cơ
bản đùng để nuôi cấy vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn Vibrio. Với nồng độ muối NaCl
trong môi trường là 7 % đã tạo ra môi trường phù hợp để các vi khuẩn thuộc họ vi
khuẩn Vibrio có thể sống và phát triển.
 Môi trường Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose (TCBS)

Môi trường TCBS (thành phẩn môi trường xem ở phụ lục 1) được xem như là
môi trường chọn lọc cơ bản ban đầu các chủng vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn Vibrio.
Dựa vào sự thay đổi màu sắc khác nhau của từng khuẩn lạc trên môi trường mà
việc chọn lọc các chủng vi khuẩn thuộc nhóm này bước đầu đễ dàng hơn. Tuy nhiên,
môi trường TCBS chỉ có thể phân loại vi khuẩn Vibrio thành hai nhóm: có sử dụng và
không sử dụng đường sucrose, vì vậy để có thể xác định chính xác tên của các chủng
vi khuẩn này thì cần phải làm các phản ứng sinh hóa và chạy PCR để có những kết
luận chính xác hơn.

 Dung dịch tăng sinh vi khuẩn Nutrient Broth (NB)

20


Môi trường NB (thành phẩn môi trường xem ở phụ lục 1) là môi trường lỏng

dung để tăng sinh vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn Vibtio. Việc tăng sinh vi khuẩn đóng
vai trò quan trọng trong việc lưu mẫu vi khuẩn và tạo sinh khối vi khuẩn trong quá
trình ly trích DNA từ vi khuẩn.
3.2.3.2 Môi trường và hóa chất dùng cho phản ứng PCR
-

TBE Buffer

TE Buffer
STE Buffer
Tris – HCl
EDTA
Phenol, Chlorofom, Isopropanol
Cồn
Kit PCR (TopTaqTM PCR, QIAGEN)

3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
-

Mẫu sau khi lấy từ ao lên được cho vào ống fancon và đậy nắp lại.
Cho ống dựng mẫu vào trong thùng đá trong quá trình vận chuyển.
Lưu mẫu trong tủ - 200 C

3.3.2 Phân lập
-

Mẫu tôm sau khi mang về được trữ ở - 20 0 C được rã đông bằng cách cho vào

-

tủ mát 40 C.
Đối với tôm lớn, tiến hành mổ lấy mẫu gan tuỵ còn với tôm nhỏ thì được cho

-

vào ống tube 1,5 ml chứa 1ml nước cất vô trùng, nghiền nhỏ mẫu.
Pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp

Cấy lên môi trường chọn lọc TCBS, ủ ở nhiệt độ phòng trong 24h để vi khuẩn

-

có thể phát triển.
Phân dòng các chủng vi khuẩn Vibrio spp. mọc trên môi trường TCBS
Làm thuần chủng vi khuẩn Vibrio trên môi trường TCBS, ủ ở nhiệt độ phòng

-

trong 24 – 48h để vi khuẩn phát triển
Tăng sinh vi khuẩn trong môi trường NB lỏng ở 37 0 C từ 24 – 48h.
Hút 0,8 ml dung dịch tăng sinh vi khuẩn + 0,2 ml dung dịch Glycerol cho vào
ống type 1,5 ml, trộn đều và giữ giống trong tủ - 20 0 C.

21


3.3.3 Định danh vi khuẩn
3.3.3.1 Định danh bằng các phản ứng sinh hóa
Dựa vào đặc diểm sinh hóa của vi khuẩn Vibrio, tiến hành định danh vi khuẩn
bằng một số chỉ tiêu sinh hóa sau:
-

Nhuôm Gram vi khuẩn.
Thử nghiệm KIA (Kligler Iron Agar): dùng để kiểm tra khả năng sử dụng

-

nguồn carbon là đường sucrose và khả năng sinh H 2S của vi sinh vật

Thử tính di động: sử dụng môi trường thạch lỏng để thử khả năng di động

-

của vi khuẩn.
Thử Oxydase: dùng để xác đinh sự hiện diện của hệ enzyme oxidase ở vi sinh
vật.

3.3.3.2 Định danh bằng phương pháp PCR
 Cơ sở khoa học

Có nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện vi khuẩn V.
parahaemolyticus. Phương pháp chọn lọc cơ bản cho vi khuẩn Vibrio là môi trường
TCBS. Các khuẩn lạc của vi khuẩn V. parahaemolyticus có màu lục hoặc lam trên môi
trường thạch do quá trình lên men sucrose. Kỹ thuật mới nhất là PCR. Kỹ thuật này có
thể sử dụng để phát hiện nhanh vi khuẩn V. parahaemolyticus do có sự hiện diện của
gene toxR xuất hiện trong vùng bảo tồn của vi khuẩn V. parahaemolyticus. (Kim và
ctv, 1999).

Bảng 3.1 Danh sách các cặp mồi chuyên biệt dùng cho vi khuẩn V.
parahaemolyticus
 Primer chuyên biệt dùng để phát hiện vi khuẩn V. parahaemolyticus:

Tên
Primer

Kích thước

Trình tự

sản phẩm
22

Nguồn
tham
khảo


toxR – F

5’– ATACGAGTGGTTGCTGTCATG – 3’

toxR – R

5’– GTCTTCTGACGCAATCGTTG – 3’

AP3 – F

5’– ATGAGTAACAATATAAAACATGAAAC – 3’

AP3 – R

5’– GTGGTAATAGATTGTACAGAA – 3’

368 bp

336 bp

Kim và ctv,
1999

Kongrueng
và ctv,

2014
 Các primer đặc hiệu cho các gene độc tố của vi khuẩn V. parahaemolyticus:
tdh – F 5’– GTAAAGGTCTCTGACTTTTGGAC – 3’
269 bp
tdh – R 5’– TGGAATAGAACCTTCATCTTCACC – 3’
Bej và ctv,
trh – F 5’– TTGGCTTCGATATTTTCAGTATCT – 3’
500 bp
trh – R 5’– CATAACAAACATATGCCATTTCC – 3’
1999
tlh – F
5’– AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG –3’
450 bp
tlh – R
5’ – GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC – 3’
 Quy trình tăng sinh vi khuẩn
Tăng sinh vi khuẩn Vibrio:
+ Cho vào ống nghiệm 5ml dung dịch môi trường NB.
+ Lấy một ít khuẩn lạc vi khuẩn cho vào môi trường trong từng ống nghiệm.
+ Ủ ở nhiệt độ 370 C trong 48 giờ
 Quy trình ly trích DNA từ vi khuẩn
a) Phương pháp sử dụng hóa chất
- Hút 1ml dịch tăng sinh vi khuẩn cho vào ống tube 1,5 ml, ly tâm ở 8000

vòng/phút trong 3 phút, loại bỏ dịch nuôi cấy thu lại phẩn kết tủa. Cho thêm
1 ml dịch tăng sinh vi khuẩn vào trong ống tube, ly tâm 8000 vòng/phút
trong 3 phút, loại bỏ dịch nuôi cấy, cho tiếp 1 ml dịch nuôi cấy, ly tâm 8000

-

vòng/phút trong 3 phút, loại bỏ dịch nuôi cấy, thu lại tế bào vi khuẩn.
Phần tế bào vi khuẩn được rửa trong 400 µl dung dich STE buffer (thành
phần xem ở phụ lục 2), ly tâm ở 8000 vòng / phút trong 3 phút, loại bỏ dịch

-

nổi. Lặp lại bước này 2 lần.
Hút 200 µl dung dịch TE buffer (thành phần xem ở phụ lục 2) + 100 µl dung
dịch PCI (phenol:Chloroform:Isopropanol tỉ lệ 25:24:1) vào phần kết tủa thu
được ở bước trên, vontex cho tế bào vi khuẩn và dung dịch trộn đều với
nhau, ly tâm 9000 vòng/ phút trong 6 phút..

23


-

Hút 160 µl dịch nổi phía trên cho vào ống tube 1,5 ml sạch mới, cho thêm 40
µl TE buffer + 100 µl dung dịch Chloroform, ly tâm 9000 vòng/phút trong 6

-

phút, thu dịch nổi.
Hút 160 µl dịch nổi phía trên cho vào ống tube 1,5 ml sạch mới, cho thêm 40
µl TE buffer. Cho thêm 2 µl RNase A 10 mg/µl ủ ở 37 0 C trong 15 phút. Sau đó

-

bất hoạt RNase A bằng cách ủ ở 650 C trong 30 phút.
Loại bỏ RNase A bằng cách cho thêm 100 µl Chloroform, ly tâm 9000
vòng/phút trong 6 phút, hút 160 µl dịch nổi phía trên cho vào ống tube 1,5

-

ml sạch mới.
Cho thêm vào 16 µl dung dịch CH3COONa + 480 µl cồn 700 C, ủ trong tủ - 200 C

-

trong 1 – 2 giờ.
Ly tâm 13000 vòng/phút, bỏ dịch nổi, để khô trong 10 phút ở nhiệt độ phòng

-

sau đó cho thêm 50 ul TE buffer hoặc nước cất khử ion.
Bảo quản ở - 200 C.
b) Phương pháp Boiling
Hút 1 ml dịch tăng sinh vi khuẩn cho vào ống tube 1,5 ml, ly tâm ở 8000
vòng/phút trong 3 phút, loại bỏ dịch nuôi cấy thu lại phẩn kết tủa. Cho thêm
1 ml dịch tăng sinh vi khuẩn vào trong ống tube, ly tâm 8000 vòng/phút
trong 3 phút, loại bỏ dịch nuôi cấy, cho tiếp 1 ml dịch nuôi cấy, ly tâm 8000

-

vòng/phút trong 3 phút, loại bỏ dịch nuôi cấy, thu lại tế bào vi khuẩn.
Thêm 300 µl TE Buffer, vontex để trộn đều tế bào vi khuẩn.
Cho vào nồi nước đang sôi. ủ ở 1000 C trong 15 phút.
Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.

Hút 200 µl dung dịch nổi phía trên cho vào ống tube 1,5 ml mới, cho thêm 20

-

µl CH3COONa + 600 ml Ethanol 700 C, ủ trong tủ - 200 C trong 1 – 2 giờ.
Ly tâm 13000 vòng/phút, bỏ dịch nổi, để khô trong 10 phút ở nhiệt độ phòng

-

-

sau đó cho thêm 50 ul TE buffer hoặc nước cất khử ion.
Bảo quản ở - 200 C.
c) Phương pháp sử dụng kit ly trích (Themo Scientific GeneJET
Genomic DNA Purification Kit)
Hút 1 ml dịch tăng sinh vi khuẩn cho vào ống tube 1,5 ml, ly tâm ở 8000
vòng/phút trong 3 phút, loại bỏ dịch nuôi cấy thu lại phẩn kết tủa. Cho thêm
1 ml dịch tăng sinh vi khuẩn vào trong ống tube, ly tâm 8000 vòng/phút
trong 3 phút, loại bỏ dịch nuôi cấy, cho tiếp 1 ml dịch nuôi cấy, ly tâm 8000
vòng/phút trong 3 phút, loại bỏ dịch nuôi cấy, thu lại tế bào vi khuẩn.

24


-

Hòa tan tế bào vi khuẩn thu được trong 180 µl dung dịch Digestion, thêm 20

-

µl Proteinase K, vontex và ủ ở 560 C trong 30 phút.
Thêm 20 µl RNase A, vontex và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Cho thêm 200 µl dung dịch Lysis Solution, vontex trong 15 giây. Sau đó cho

-

thêm 400 µl cồn 500 C. Vontex để trộn đều hỗn hợp.
Chuyển hỗn hợp trên vào cột lọc GeneJET Genomic DNA Purification Column.

-

Ly tâm 6000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch đi qua cột lọc.
Thêm 500µl Wash Buffer I vào cột lọc, Ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút.

-

Loại bỏ dịch đi qua cột lọc.
Thêm 500 µl Wash Buffer II vào cột lọc, Ly tâm 13000 vòng/phút trong 3

-

phút. Loại bỏ dịch đi qua cột lọc.
Chuyển cột lọc sang ống tube 1,5 ml, cho vào cột lọc 200 µl dung dịch Elution
Buffer, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Sau đó ly tâm ở 8000 vòng/phút

-

trong 1 phút.
Giữ ở - 200 C.

 Thành phần phản ứng PCR (thể tích 25 µl)

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR
STT

Tên hóa chất

Thể tích đầu

1

Primer

0,2 µl

2

Top Taq polymerase

12,5 µl

3

Template

2 µl

4

Nước cất khử ion

8,5 µl

Tổng

25 µl

 Quy trình chạy PCR

Bảng 3.3 Quy trình phản ứng PCR
Nhiệt độ

Thời gian

25

Số chu kỳ