Nghiên cứu kỹ thuật bảo quản tinh hầu cửa sông (crassostrea rivularis) trong nitơ lỏng ( 1960c

Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

điểm, chất lượng cao và có tính
ổn định.
PHÀN
1. MỞKhông
ĐÀU những thế với phương pháp bảo
quản này
cònnhững
cho phép
nuôinghề
đảmnuôi
bảo động
nguồnvậtnguyên
liệu cho
quáNam
trìnhđang
sản
Trong
nămngười
gần đây
thân mềm
ở Việt
xuấtxugiống,
dàng
trong
quánhu
trình
biệtđặc

có sản
ý nghĩa
quan
có
hướngdễphát
triển
mạnh,
cầuvận
tiêuchuyển
thụ vàxa,
xuấtđặckhẩu
thân mềm
trọngcao
nhằm
cung
cấplàm
tinh
vụ triến
cho những
tạota.ra giống hầu
tăng
đã góp
phần
tăngphục
sự phát
kinh tế nghiên
thuỷ sảncứu
của lai
nước
mới cóTrong

chất lượng.
quản vật
tinhthân
còn mềm
giúp hai
lưu mảnh
giữ nguồn
phầnchotrong
số các Bảo
loài động
vỏ thìgen,
hầu góp
là loài
giá
công
tác tế
bảocao.
tồn Thịt
đa dạng
thuỷ
và nhiều
lợi ích
trị
kinh
hầugiống
không
đơnsảnthuần
là thức
ăn khác.
cho các ngư dân vùng ven

Việt
hầu sử
cho Hầu
đến
biển màỜ nó
cònNam,
đượcphương
biết đếnpháp
như lun
một giữ
loại giống
thực phẩm
có dụng
giá trịnitơ
dinhlỏng
dưỡng.
naythể
vẫnănchưa
công
bố phơi
nào. Do
cứu vỏ
ứnghầu
dụng
phương
nàybột
là
có
sống,cónấu
chín,

khô vậy
hay nghiên
đóng hộp.
dùng
nung pháp
vôi làm
rất cần
thiết,
của nuôi
phương
nàynhững
sẽ đáp
nguồn
phấn
hoặc
làmthành
thức công
ăn chăn
gia pháp
súc. Vì
giáứng
trị như
vậytinh
nêntrùng
nhu hầu
cầu
phục
vụ ngày
nhữngcàng
mụclớn.

đíchTuy
trên.nhiên do tình trạng khai thác quá mức nguồn lợi hầu
về
hầu
Vì nguồn
những nước
lý do bị
đóảnh
trong
phạmcủa
vi nền
của công
đề tàinghiệp
thực tập
tốtđại
nghiệp,
được lợi
sự
tự nhiên,
hưởng
hiện
thì nguồn
đồngđang
ý vàcó
giúp
đỡ cơ
củacạn
cô kiệt,
hướng
tôi tái

tiếnphát
hànhtriến
thựcnguồn
hiện đề
này
nguy
khảdẫn
năng
lợi tài:
hầu“ ởNghiên
một số cứu
địa
kỹ thuậtđãbảo
hầukhó
Cửa
(Crassosírea
nitơgiống
lõng
phương
trở quản
thành tinh
vấn đề
có Sông
thể thực
hiện được.rivularis)
Việc thu trong
gom con
(-196°C)”.
trong
tự nhiên không đủ đáp ứng cho nhu cầu nuôi.

Mục tiêu nghiên
Với cứu
thành công của đề tài KC06-14NN (2001-2004), Viện nghiên cứu
Cửa
Nuôi Bước
trồng đầu
Thuỷxây
sản dựng
I đã kỹ
xây thuật
dựng bảo
hoànquản
chỉnhtinh
quyhầu
trình
sảnSông
xuất, (Cmssostrea
có thể chủ
rivuỉaris)
trong nitơ
lỏng
(-196°C).
động
về nguồn
giống
nhưng
lại khó có thể đáp ứng đủ con giống quanh năm vì
Nội dung
cứuhầu cái biến động qua các tháng (Hà Đức Thắng, 2005). Vì vậy để
tỷ lệnghiên

hầu đực,
Nghiên
cúnquá
đặctrình
điểm
dịch
hầuphương
Cửa Sông
quanhân
các chỉ
chủ động
trong
sảnsinh
xuấthọc
continh
giống
bằng
phápthông
thụ tinh
tạo
tiêuviệc
nhưbảo
hoạtquản
lực, nguồn
mật độ,tinh
pH.trùng hầu là hết sức càn thiết.
thì
Xác
tỷ những
lệ pha biện

loãng,pháp
chấtbảo
chống
và đang
nồng thu
độ chất
chống
Mộtđịnh
trong
quảnđông
đã và
hút sự
quanđông
tâm phù
của
hợp trong
bảo quản
tinhxuất
hầu Cửa
Sông
trong
(-196°C).
các
nhà chọn
và sản
giống
hiện
naynitơ
là lỏng
phương

pháp bảo quản tinh trùng
phápgiới
làmviệc
lạnhbảo
phùquản
hợp trong
bảo trong
quản tinh
trong Xác
nitơ định
lỏng.phương
Trên thế
tinh hầu
nitơ hầu
lỏngCửa
đã Sông
được
trong nitơ
nghiên
cúnlỏng
từ (-196°C).
lâu (Lanna, 1971; Hughes, 1973; Staeger, 1974; Zell và ctv.,1979;
Van der Horst và ctv.,1985; Bougrier và Rabenomanana, 1986...). Những kết
quả được công bố cho thấy bảo quản bằng phương pháp này có rất nhiều ưu

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 21

Trướng ĐHNN Hà Nội

Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp
PHÀN 2. TỐNG QUAN

2.1.

Đặc điếm sinh học của hầu Cửa Sông

2.1.1.

Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại Thiel (1931) thì vị trí phân loại của hầu Cửa Sông như
sau:
Ngành động vật thân mềm: Moỉlusca
Lớp
Bộ

hai
cơ

mảnh
lệch

vỏ:
:

Bivalvia

Anỉsomyarya

Họ hầu : Ostreidae
Giống hầu: Crassostrea
Loài hầu Cửa Sông: Crassostrea rivuỉaris
2.1.2.

Đặc tính phân loại

Vỏ to, dầy, dài, chắc, biến đổi có khi gần hình tròn, hình bầu dục, hình tam
giác... vỏ phải hơi phang dẹp và nhỏ hơn vỏ trái, mặt vỏ có nhiều lớp vẩy mỏng
mầu vàng nâu hay tím sẫm. Hầu 1-2 tuổi các tấm vẩy thường phang mỏng và
giòn. Hầu càng nhiều tuổi các tấm vẩy càng dầy, chắc, mặt ngoài vỏ mầu xám
tím hoặc nâu. Mặt trong vỏ mầu trắng, dây nề nâu tím đen.
vết cơ khép vỏ rất to, mầu vàng nhạt hình dạng không nhất định, phần lớn
hình quả trứng hay bầu dục nằm phía trong lưng, vỏ trái to dầy và lõm sâu. Mặt
trong mầu ngà.
2.1.3.

Đặc điểm sinh học

Phân bố: hầu Cửa Sông (Crassostrea rivuỉaris) là loại hầu phân bố rất
rộng rãi ở nước ta. Hầu hết các cửa sông có vật bám là thấy có hầu Cửa Sông,
chúng thường hình thành những bãi hầu rất lớn có khi dài hàng chục cây số như
ở sông Bạch Đằng, sông Chanh và các sông lân cận. Vi vậy hầu Cửa Sông là loại
hầu chiếm sản lượng chủ yếu ở nước ta. Sản lượng hàng năm có thể tới hàng

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 3

Trướng ĐHNN Hà Nội

Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

trăm tấn cả vỏ. Khai thác hầu Cửa Sông là nghề sống chủ yếu của nhân dân các
bãi hàu.
Trong các loài hầu nuôi trên thế giới, hầu Cửa Sông cùng với hầu ống là
hai loại hầu lớn hơn cả, con to nhất của hầu Cửa Sông tới hơn 40cm. Hầu Cửa
Sông sống trong vùng nước lợ, tính thích ứng với độ muối rộng, có khi sống
được ở trong nước có độ muối từ l-30%o nhưng thích hợp nhất là 10-23%o.
Chúng có thể phân bố từ tuyến triều cao cho tới độ sâu lOm, nhưng nhiều nhất
và thường lớn nhất ở phạm vi 5-7m. Hiện tượng quần tập rất phổ biến, chúng
thường kín vật bám và nhiều khi bám chồng chất lên nhau từng cụm lớn tua tủa
như lưỡi mai. Có khi thiếu vật bám chúng bám lên các vỏ hầu đã chết, trên một
vỏ hầu dài 15cm có tới 30 con bám, trung bình lớn từ 5-20cm. Vì vậy, ngư dân
thường gọi bằng nhiều dị tên khác nhau, thí dụ như “hầu rùng” là loại bám chi
chít dầy khắp rạn đá lớn, “hầu lỗ” là loại hầu bám trên các hòn đá, hầu “lưỡi
mai”, “hầu rơi” loại bám trên các vỏ hầu thành cụm, “hầu bạ” to thường bám đơn
độc.
Phương thức sống: ở giai đoạn ấu trùng, chúng sống phù du, ấu trùng hầu
có khả năng bơi lội nhờ hoạt động của tiêm mao. Ờ giai đoạn trưởng thành, hầu
sống bám trên các giá thể (sống cố định) trong suốt đời sống của chúng.
Thức ăn và phương thức bắt mồi: thức ăn của ấu trùng bao gồm vi khuẩn,
sinh vật nhỏ, mùn bã hữu cơ, tảo sillic, trùng roi có kích thước dưới lOpm. Âu
trùng có thể sử dụng vật chất hoà tan trong nước và các hạt vật chất hữu cơ. Khi
trưởng thành thức ăn của chúng chủ yếu là thực vật phù du và mùn bã hữu cơ.
Các loài tảo thường gặp là tảo Silic như: Melosira, Coscirìodiscus, Cycloteỉla,
Skeỉetonema...

Phương thức bắt mồi của hầu thụ động theo hình thức lọc. Cũng như các
loài Bivavia khác, hầu bắt mồi trong quá trình hô hấp nhờ vào cấu tạo đặc biệt

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 4

Trướng ĐHNN Hà Nội


Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

của mang. Khi hô hấp nước mang theo thức ăn đi qua bề mặt mang, các hạt thức
ăn sẽ giữ lại ở mang nhờ các tiêm mao và dịch nhờn được tiết từ tiêm mao. Các
hạt thức ăn có kích thước nhỏ sẽ được dịch nhờn của tiêm mao cuốn dần về phía
miệng, còn các hạt thức ăn quá lớn tiêm mao không giữ được sẽ bị dòng nước
cuốn đi khỏi bề mặt mang, sau đó được tập chung ở mép màng áo và bị màng áo
đẩy ra ngoài. Mặc dù hầu bắt mồi thụ động nhưng với cách thức bắt mồi như
vậy, chúng chỉ có thể chọn lọc theo kích thước thức ăn. Quá trình chọn lọc được
thực hiện 4 lần theo phương thức trên: lần 1 xẩy ra trên bề mặt mang, lần thứ 2
xay ra trên đường vận chuyển, lần 3 xẩy ra trên xúc biện, lần thứ 4 xẩy ra tại
manh nang tiêu hoá. Tại dạ dầy, thức ăn được tiêu hoá một phần nhờ các men
như: Amylase, Lactase, Glipase, Maltase, Protease. Các thức ăn không thích hợp
được đẩy xuống ruột và ra ngoài qua hậu môn.
Các nhân tố tác động tới hoạt động bắt mồi của hầu là thuý triều, lượng
thức ăn, các yếu tố môi trường (nhiệt độ, độ muối...).
Sinh trưởng: nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của hầu.
Ở vùng nhiệt đới, nhiệt độ ấm áp nên tốc độ sinh trưởng của hầu rất nhanh và
quá trình sinh trưởng diễn ra quanh năm. Ờ vùng ôn đới, quá trình quá trình sinh
trưởng chỉ diễn ra vào mùa xuân - hè, còn mùa thu đông gần như không sinh

trưởng. Sự sinh trưởng của hầu còn phụ thuộc vào mật độ, nếu mật độ hầu cao
thì hầu chậm lớn.
Tốc độ sinh trưởng của hầu cũng khác nhau và tuỳ theo vùng phân bố do
điều kiện môi trường nước của từng vùng khác nhau và do đặc trưng riêng của
từng loài (yếu tố di truyền). Một đặc điểm nổi bật của hầu vùng nhiệt đới là quá
trình sinh trưởng nhanh trong 6-12 tháng đầu tiên và sau đó chậm dần.
Sinh sản: hầu Cửa Sông là loài động vật đã phân tính rõ rệt con đực và con
cái riêng biệt, không có trường hợp trứng và tinh trùng cùng hình thành trên một

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 5

Trướng ĐHNN Hà Nội


Giai đoạn phát triển
Trứng thụ tinh
Thể cực hứ nhất

Thòi gian

Kích thước (jim)

30 phút
Lê Thị Hồng Minh TS 50
1 giờ

50
50-60

Khơú luận tốt nghiệp

Thể cực thứ 2

1 giờ 30 phút
50-60
BảngTuy
2.1.
Bảng
Quá
2.2.
trình
Sảnquá
lượng
phát
triển
một
phôi,
số loài
trùng
nuôi
hầu
chính
(25~28ƠC)
cá thể.
vậy
trong
trình
phát
dụcấuhầu
có

sự
biến
tính,(năm
tỷ lệ1999)
đực cái thay đổi
Phân cắt lần 1
2 giờ
60
theo mùa vụ khác nhau theo từng địa điểm. Trong tự nhiên, tỷ lệ hầu cái là 40Phân cắt lần 2
2 giờ-2 giờ 30 phút
60
68% và hầu đực chiếm từ 21-61% (trong các tháng 4 đến tháng 10). Tỷ lệ này
Giai đoạn phôi nang
5-10 giờ
60-70
giảm thấp từ 0-16% (hầu cái) và 38-90% (hầu đực) trong các tháng từ 11 đến
Áu trùng Verliger
12 giờ
70
tháng 4 năm sau. Hầu con có thế tham gia lần đầu rất sớm sau 6-7 tháng tuổi
Âu trùng đỉnh vỏ thẳng
24 giờ
70
kích thước đạt 40-5Omm là đã phát hiện thấy có sản phẩm sinh dục và có khả
Àu trùng đỉnh vỏ lồi
8-10 ngày
150-180
năng tham gia sinh sản lần đầu. Khi hầu bố mẹ tham gia sinh sản, tráng và tinh
Àu trùng có điểm mắt
17-20 ngày

200-250
trùng được
vào Dương
môi trường
nước,làquá
ấu
Hầu phóng
Thái Bình
(c.gigas)
loàitrình
hầu thụ
bản tinh
địa và
củaphát
Nhậttriển
Bảncủa
nhưng
Âu trùng có chân bò
20-22 ngày
220-250
trùng
diễn ưu
ra điếm
trong vượt
nước.trội
Trong
sản đã
việc
phóng
trùngvàkích

với
những
hầu quá
Thái trình
Bình sinh
Dương
sớm
đượctinh
di nhập
trở
Àu trùng bám
22-25 ngày
270-300
thích hầu
trứng.
Sứctrọng
sinh sản
rất lớn.sản
Đólượng
là sự hầu
thíchThái
nghi Bình
với
thành
loài cái
hầuđẻnuôi
quan
trên của
thế hầu
giới.là Tổng

Tênđiều
loài
Sản
lượng
(nghìnấutấn)
trứng,tấn,
thụ năm
tinh 1990
ngoài,
trùng
biến
vì 2003
vậy
Dươngkiện
nămsống.
1950Hầu
đạt đẻ
150000
là 1,2
triệutrải
tấn,quacho
đếnthái
năm
Hầu Thái Bình Dương
(c.gigas)
3600 sinh sản này phụ thuộc rất nhiều
quần
đẻ rấtbình
nhiều
trứng.

đã
đạt đàn
4,38hầu
triệuthường
tấn. Trung
hàng
nămSức
tốc độ tăng sản lượng đạt 7,8% và có
Hầu Châu Mỹ (C. vỉrginica)
59
vào
kích tăng
thước
cá thể.
thể càng
sản2004).
càng cao. Nhiệt độ cũng ảnh
xu
hướng
mạnh
trongCánhững
năm lớn
tiếp sức
theosinh
(FAO,

hưởng
rất lớnđến
tới năm
sức sinh

của hầu,
là yếu
quan
và trựchầu
tiếplà
Hầu khác (Crassostrea
spp)Tính
25đứngđộđầu
2000sản
(FAO,
2004)nhiệt
thế tốgiới
về trọng
sản lượng
ảnh hưởng
thích
hợpsản
cholượng
sinh sản
Hầu Philippin (C. iredaỉea)
19
Trung
Quốc tới
đạtsức
3,3sinh
triệusản.
tấn.Nhiệt
Đứngđộthứ
2 về
hầu thường

là Nhậttrong
Bản,phạm
đồng
vi 28-30°C.
Tuổi
hưởng
sức sinh
của
nhóm
hầu.
Ngu
ôn:
Đứcnghệ
Thăngnuôi
(2005)
thời
đây cũng
là không
nước có
cóảnh
công
nghệtớisinh
sản sản
nhân
tạo
vàHà
công
hầu
Saulượng,
khi nhất

thụcông
tinh,
trứng
hình
tròndẫn
đồng
thời
mộtgiống
mànghầu
trong
suốt,
tế
2.2. triển
Sản
và
công
nghệ
sản ra
xuất
trên
thế
phát
sớm
thếnghệ
giới nuôi
và
luôn
đầu
về sinh
lượng

nhưng
từ năm
1980
bào nay
chất
bắt
đầu lưu
động
tế bào hiện
tiêu biến.
Mộtcòn
giò’bằng
sau 5,6%
thể cực
nhất của
và
gióisản
và lượng
Việt
Nam
đến
hầu
liênnhân
tục giảm,
nay chỉ
sảnthứlượng
thể cực
thứlượng,
2 xuấtcông
hiện,

saunuôi
đó trứng
bắt nghệ
đầu quá
phân cắt,
2.2.1.
Sản
nghệ
và công
sản trình
xuất giống
hầu sau
trênlần
thếphân cắt
Trung
Quốc.
thứ 6 thành
64 tế có
bàosản
thì lượng
phôi bắt
giailượng
đoạnnăm
phát 2000)
triển. Sau
đó
giới
Các nước
hầuđầu
lớnbước

tiếp vào
theocác
(sản
là: Hàn
phôi tiếp
tụcnay
phát
triển
ấu hơn
trùng
bánh
ấunhưng
trùng
cóCác
điểm
ấusốtrùng
trên
thế thành
giới
có
loài
hầu
mới
chỉnước
cómắt,
một
loài
Quốc
- Hiện
208000

tấn;
Pháp
- 135000
tấn200
và
Mỹxe,
- 50000
tấn.
Đông
Nam
chân
chuyến
đoạn
bám
chúng
không
khả năng
giábò
trị
kinh
tế được
đưasang
vào giai
sản
xuất
công
nghiệp.
Ácó
tuy
có và

rấtkhi
nhiều
điều
kiện
thuận
lợi,
nhưng
lại hoàn
khôngtoàn
quan
tâm còn
tới nghề
nuôi
bơi lội,
dạng của có
chúng
tương
giống
hầu trưởng
hầu.
Chỉ hình
có Philippin
nghềđãnuôi
hầuđốigốc
địa với
phương
có sản thành,
lượng chúng
12000 chỉ
tấn

có khả năng
trong đời.
(1999).
Thái bám
lan một
và lần
Malaixia
cũng bắt đầu nuôi hầu, nhưng sản lượng không
đáng kể. Theo FAO (2006) sản lượng hầu năm 2002 đạt 4,33 triệu tấn, năm 2004
đạt 4,6 triệu tấn, tốc độ sản lượng trong giai đoạn này là 3,1%.

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 867

Trướng ĐHNN Hà Nội


Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

Cũng giống như bất cứ đối tượng nuôi khác, đối với hầu nuôi theo phương
pháp công nghiệp thì công tác sản xuất giống đóng vai trò then chốt, nó giúp
người nuôi chủ động giống trong khi việc vớt giống từ tự nhiên gặp nhiều bất lợi
và không chủ động.
Đe có thể xây dựng được quy trình sản xuất giống nhân tạo thì trong suốt
thế kỷ XX đã có rất nhiều nghiên cứu về đặc điểm sinh học của hầu cũng như
các nghiên cún về thức ăn cho các loài thân mềm. Với nhiều nghiên cứu khác
nhau đến năm 1991 Uting và Spencer đã xây dựng hoàn thiện sơ đồ cung cấp tảo
trong quá trình ương nuôi các loài động vật thân mềm, điều này giải quyết khó
khăn của các trại sản xuất, góp phần đem lại nhiều thành công trong sản xuất

giống hầu nhân tạo.
Năm 2004 Helm và Bourne đã thành công trong việc đưa ra quy trinh sản
xuất hầu Thái Bình Dương. Năm 2006 Rico và cộng sự đã nghiên cứu công thức
trộn hỗn hợp tảo làm thức ăn cho hầu c.gigas trong điều kiện hầu bố mẹ được
ương ở 19°c, cung cấp thức ăn 6% trọng lượng cơ thế. Khi tham gia sinh sản kết
hợp tỷ lệ 3 đực 6 cái, đảm bảo 50 tinh trùng/ trứng. Thu được tỷ lệ ấu trùng 98%
khi sử dụng thức ăn là C.caỉcitrans và Forma pumilnm.
Đỉnh cao của phương pháp sản xuất giống nhân tạo là thu hầu giống đơn.
Theo Cross và Kingzett (1992) thì sau khi nuôi ấu trùng hầu đến giai đoạn hậu
ấu trùng đỉnh vỏ lồi thì dùng LHG kích thích hầu xuống đáy mà không cần vật
bám, hoặc dùng bột vỏ hầu, bột vỏ điệp kích thước 300-500pm. Với phương
pháp này chúng ta có thể thu được con giống đơn phục vụ cho nghề nuôi hầu
bằng khay hoặc bằng túi.
Cùng với việc nghiên cún sản xuất giống hầu thì các nghiên cún về công
nghệ nuôi cũng được tiến hành. Kết quả của các nghiên cứu này đã cho ra đời
nhiều phương thức nuôi khác nhau như: nuôi treo trên mặt đáy, nuôi trên đá,

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 9

Trướng ĐHNN Hà Nội


Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

nuôi trên cọc, hình thức nuôi treo, nuôi trên bè, nuôi treo trên dây, và hình thức
nuôi hầu rời.
2.2.2. Sản lượng, công nghệ nuôi và công nghệ sản xuất giống hầu ở
Việt Nam

Ớ Việt Nam nghề nuôi hầu vẫn còn rất mới mẻ, nuôi hầu mới chỉ bắt đầu
từ những năm cuối thế kỷ XX. Sản lượng hầu nuôi ở nước ta rất thấp chủ yếu là
đánh bắt ở tự nhiên, công nghệ nuôi hầu cũng rất đơn giản phần lớn là dựa vào
con giống tự nhiên, sau đó quản lý vùng bãi triều và thu hoạch.
Năm 2001-2003 Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I đã tiến hành thử
nghiệm thành công sản xuất giống nhân tạo hầu biến (C. gigas) bằng công nghệ
của Australia. Tuy nhiên việc nuôi hầu giống lên hầu thương phẩm chưa thu
được kết quả vì hầu bị chết hàng loạt (Đồng Xuân Vĩnh, 2004).
Năm 2001-2004 đề tài KC06-NN14 của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng
Thuỷ sản I đã xây dựng thành công quy trình sản xuất giống hầu (trên cả 3 đối
tượng hầu: c.rỉvularis, c. belchery, c.ỉugubris). Quy trình sản xuất giống hầu
hoàn toàn chủ động trong tất cả các khâu (Hà Đức Thắng, 2005).
Hiện nay Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản I cũng đang triển khai đề
tài KC.06.18/06-10 “Nghiên cún công nghệ sản xuất giống và nuôi thương phẩm
hầu Thái Bình Dương (C. gigas) phục vụ xuất khẩu”. Thành công của đề tài sẽ
mở ra những hướng phát triển mới cho nghề nuôi hầu ở nước ta.
2.3.

Những yếu tố chính ảnh hưỏng đến tinh trùng trong quá trình bảo
quản
lạnh

2.3.1. Dung dịch pha loãng
Dung dịch pha loãng còn được các nhà nghiên cún gọi là extender, có tác
dụng duy trì trạng thái vô hoạt, không làm tinh trùng chuyển động trước khi sử
dụng, kéo dài thời gian sống tiềm sinh của tinh trùng (Bates và ctv., 1996).
Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 10

Trướng ĐHNN Hà Nội

Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

Graybill và Horton (1996) cho rằng việc tìm được extender thích hợp là
bước đầu tiên của quá trình bảo quản tinh và extender được định nghĩa như sau:
“extender là một dung dịch của muối vô cơ hoặc hữu cơ, có tác dụng bảo vệ sự
sống của tế bào tinh trùng trong thời gian bảo quản”. Extender thường bao gồm
hỗn hợp các chất vô cơ và chất hữu cơ giống như tinh trùng đồng thời thoả mãn
các điều kiện sống của tinh trùng ngoài cơ thể, ngoài đảm bảo chất dinh dưỡng
giống tinh tươi của cá cần đặc biệt chú ý tới các yếu tố pH, áp suất thẩm thấu, tỷ
trọng, độ nhớt, nhiệt độ, tỷ lệ các chất điện giải và không điện giải.
2.3.2.

Ảp suất thẩm thấu

Áp suất thẩm thấu của dung dịch bảo quản tương đương áp suất thẩm thấu
của tinh trùng nghĩa là tinh trùng phải sống trong môi trường đắng trương có như
vậy tinh trùng mới giữ nguyên hình thái, tiến hành trao đổi bình thường. Các
dung dịch ưu trương hoặc nhược trương đều có hại cho tinh trùng làm tinh trùng
trương phồng hoặc teo lại và chết nhanh chóng (Đỗ Văn Thu, 2000).
2.3.3.

Tỷ trọng môi trường

Tỷ trọng của dung dịch bảo quản tương đương tỷ trọng của tinh dịch đế
tránh tình trạng tinh trùng bị lực đây Ascimet làm thay đôi hình thái môi tinh
trùng.
2.3.4.

pH

pH của dung dịch bảo quản tương đương pH của tinh trùng, vì quá trình
trao đổi chất của tinh trùng liên quan đến hàng loạt enzym. Các enzym này xúc
tiến các phản ứng hoá học trong một giới hạn pH nhất định (Đỗ Văn Thu, 2000).
2.3.5.

Tỷ lệ các chất điện giải và không điện giải

Đe giữ thăng bằng về áp lực thẩm thấu và ổn định pH cho tinh trùng trong
dung dịch bảo quản phải có các chất điện giải. Các ion điện giải, đặc biệt các
anion của các acid gây hại đến màng tinh trùng vì vậy phải có các chất không

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 11

Trướng ĐHNN Hà Nội


Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

điện giải ngăn ngừa tác động có hại của các ion, tránh hiện tượng làm mất điện
tích trên bề mặt tinh trùng gây hiện tượng tụ dính ở tinh trùng (Đỗ Văn Thu,
2000).
Milovanov (1962) nhận thấy trong dung dịch bảo quản nếu tăng hoá trị của
các cation thì có hại cho tinh trùng. Muối có cation +2 (Ca, Mg, Ba) làm tinh
trùng bị tụ dính, muối có cation +3 và +4 (Al, Fe) làm tinh dịch bị đông đặc và
chết nhanh. Theo Popov (1968) cation có hoá trị +1 (Na, K) và +2 (Ca, Mg) có

tác dụng như nhau. Đối với anion thì có tương quan thuận, muối có hoá trị -2 tác
động lên tinh trùng tốt hơn hóa trị -1, nghĩa là anion cùng hoá trị thì tác dụng lên
tình trùng giống nhau. Theo Popov (1968), dung dịch bảo quản dùng muối có
anion hoá trị 2, 3, 4 so với hoá trị 1 làm tăng sức sống của tinh trùng. Theo
Dương Đinh Long dùng Natri - bicarbonat vừa có tác dụng điều chỉnh pH vừa
cung cấp một lượng nhỏ C02 vào môi trường, ức chế hoạt động của tinh trùng
(Trích qua Đỗ Văn Thu, 2000).
2.3.6. Độ nhớt
Độ nhớt của dung dịch bảo quản phải tương đương với tinh dịch đế tránh
tình trạng sức căng mặt ngoài tác động lên màng bọc tinh trùng và ma sát nội
phân tử qua lớn khi tinh trùng vận động ( Đỗ Văn Thu, 2000).
Do đặc điểm sinh học của mỗi loài là khác nhau lên dung dịch bảo quản
cũng có thể khác nhau, việc tìm ra dung dịch phù hợp với từng loài là rất cần
thiết. Horton và Ott (1976) đã chỉ ra một số extender đơn giản gồm các thành
phần NaCl, NaHCƠ3 và Lectihin cho kết quả bảo quản thành công. Dung dịch
bảo quản được điều chỉnh và phát triển dựa trên đặc điểm sinh lý, hoá cơ bản của
tinh dịch vì vậy chúng có thành phần tương đối giống nhau (Rao Gopal, 1989).
Một số nghiên cứu cho biết thành phần đơn giản của extender như sau: NaCl,

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 12

Trướng ĐHNN Hà Nội


Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

KC1, CaCl, NaHCC>3, NaHPƠ4, MgS04 có thể không hoặc có các chất dinh
dưỡng như glucose, íructose, lòng đỏ trứng gà, leccithin, glycine.

2.3.7.

Tỷ lệ pha loãng

Tỷ lệ pha loãng khác nhau dẫn đến nồng độ tinh trùng trong mẫu khác nhau.
Theo Smimov (1974) mật độ tinh trùng trong tinh dịch pha loãng ảnh hưởng lên
kết quả đông lạnh, khi pha loãng tinh dịch có cùng tỷ lệ, tinh dịch nào có nồng
độ tinh trùng cao khả năng đông lạnh kém hơn tinh dịch có nồng độ thấp.
Platanov (1978) cho rằng nồng độ tinh trùng ảnh hưởng đến tốc độ đông lạnh và
sự phục hồi sức sống của tinh trùng trong quá trình giải đông (Trích qua Đỗ Văn
Thu, 2000). Tỷ lệ pha loãng giữa tinh trùng và extender ở các loài là khác nhau.
Ở cá tỷ lệ này có thể thay đổi từ 1:1 đến 1:20, khi tỷ lệ pha loãng lớn hơn 1:20
thường cho hoạt lực tinh sau giải đông thấp hơn (Chamberyon Zohan, 1990;
Gwo và ctv., 1991). Đối với tinh trùng hầu Thái Bình Dương theo nghiên cứu
của Bougrier (1986) tỷ lệ pha loãng tốt nhất là 1:12,5 và 1:15. Tuy nhiên một số
nghiên cứu cho ràng tỷ lệ pha loãng là tương đối rộng, việc lựa chọn sao cho phù
hợp với từng loài là cần thiết.
2.3.8.

Chất chống đông và nồng độ chất chống đông

Chất chống đông đóng vai trò như chất bảo vệ giúp tinh trùng sống sót
trong và sau quá trình đông lạnh, hạn chế tối đa ảnh hưởng sốc nhiệt đến tinh
trùng trong quá trình làm lạnh và giải đông. Trong một số nghiên cứu nếu không
có chất chống đông, nguyên sinh chất của tinh trùng có hiện tượng kết dính lại
và tế bào bị phá huỷ, ngay cả khi đã có extender tinh dịch nguyên sinh chất và túi
tinh cũng không bảo vệ được tinh trùng khi làm lạnh quá thấp. Một số chất
chống đông hay sử dụng để bảo quản tinh là: Glycerol, Ethylene Glycol (EG),
Propylen Glycol, Dimethyl Sulíoxide (DMSO), Methanol, Dimthyl Acetamide
(DMA). Trên thực tế nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh trong quá trình

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 13

Trướng ĐHNN Hà Nội


Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

bảo quản tinh trùng của nhiều loài thuỷ sản thì DMSO là chất chống đông cho
kết quả tốt hơn cả. Chất này thuộc nhóm chất có phân tử lượng nhỏ, nhanh
chóng thấm qua màng vào tế bào, đẩy một phân tử nước ra ngoài, giúp nguyên
sinh chất của tinh trùng không bị phá huỷ trong quá trình đông lạnh.
Trong 3 chất Glycerol, Methanol, DMSO thường được sử dụng trong bảo
quản tinh hầu, DMSO được coi là hiệu quả nhất nhưng bản thân nó lại gây độc
nhất cho tế bào. Kobina Yankson và John Moyse (1991) khi bảo quản tinh của 4
đối tượng hầu (c.tulipa, c.gigas, c.iredalei, C.cucullata) chỉ dùng DMSO với 4
nồng độ 5%, 10%, 15%, 20%. Cho biết kết quả tốt nhất khi bảo quản tinh hầu
c.gigas là DMSO 10%, còn 3 đối tượng hầu còn lại thì DMSO 15% là thích hợp
nhất. Nhiều tác giả khi nghiên cứu về bảo quản tinh trùng đều cho rằng tiêu
chuẩn để đánh giá ngưỡng thích hợp của chất chống đông cũng như nồng độ chất
chống đông phụ thuộc vào từng loài khác nhau.
2.3.9.

Nhiệt độ và thời gian cân bằng nhiệt

Nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sức sống và khả năng vận
động của tinh trùng. Nhiệt độ cao hay thấp đều có hại cho tinh trùng. Sự vận
động của tinh trùng và nhiệt độ môi trường có liên quan đến nhau. Khi nhiệt độ

tăng cao dần thì sức hoạt động của tinh trùng cũng tăng thêm.
Thời gian cân bằng nhiệt là thời gian đế chất chống đông thấm sâu vào tinh
trùng đồng thời giảm các tác nhân lạnh đối với tinh trùng vì vậy sau khi pha
loãng tinh dịch cần làm lạnh đều từ từ đến 4°c (Tierch và Wayman, 2000).
Hyvarien (1983) và Pironen (1993) chỉ ra rằng thời gian cân bằng tốt nhất không
quá 1 phút trong khi Bayness và Scott (1987) lại kết luận thời gian cân bằng tốt
nhất dài từ 15-30 phút nhưng có thể thay đối tuỳ thuộc vào loại chất chống đông
và nồng độ chất chống đông. Nếu nồng độ chất chất chống đông cao, thời gian
cân bằng lâu là rất độc đối với sự phát triển phôi sau này (Shafer, 1981). Dưới

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 14

Trướng ĐHNN Hà Nội


Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

những điều kiện đó protein trong tế bào có thể bị biến chất và sức sống của tinh
trùng sau giải đông sẽ giảm, càng tăng thời gian cân bằng mức tổn thương càng
lớn, sức sống tinh trùng giảm nhanh chóng và tuổi thọ rút ngắn lại.
2.3.10.

Tốc độ hạ nhiệt

Trong quá trình đông lạnh tinh dịch từ nhiệt độ thấp sang lạnh sâu -196°c
giai đoạn đầu nếu khoảng cách nhiệt độ lớn dễ gây hiện tượng sốc nhiệt, giảm
sức sống hoặc gây chết hàng loạt tinh trùng. Vì vậy giai đoạn đầu nên giảm từ từ
để tinh trùng không bị sốc nhiệt (Bart, 2000). Theo một số giả thuyết, trong quá

trình hạ nhiệt tinh dịch, sự đông lại của phần nguyên sinh chất ở hai dạng: dạng
rắn ở thế kết tinh và dạng rắn ở thể thuỷ tinh. Dạng rắn ở thể thuỷ tinh, chất
nguyên sinh rắn lại không bài tiết được nước, các phân tử nước là nguyên nhân
làm phá vỡ tế bào. Khi đông lạnh tinh dịch thì sự nguy hiểm do tác động làm
lạnh đã giảm bớt từ thời điểm bắt đầu từ 0°c cho nên rút ngắn thời gian tinh dịch
ở trạng thái lỏng trong khoảng nhiệt độ dưới 0°c là cần thiết, lúc này làm lạnh
nhanh nhẩy vọt qua thời kỳ tới hạn của sự kết tinh hoá mạnh hình thành sự rắn
của dạng thuỷ tinh. Có nhiều phương pháp làm lạnh trước khi chuyển vào nitơ có
thể làm trên đá khô, trong máy làm đá hoặc trên hơi nitơ lỏng. Hiệu quả hơn là
làm lạnh theo chương trình cài đặt trên phần mềm (Cryogentic). Bougrier (1986)
bảo quản tinh hầu Thái Bình Dương bằng cách làm lạnh trên hơi nitơ lỏng 5cm
trong 3 phút sau đó được chuyển vào nitơ lỏng. Còn Adam và ctv., (2004) lại
làm lạnh tinh hầu Thái Bình Dương sử dụng máy làm lạnh (Kryo-10 Serie II) với
chương trình hạ nhiệt từ 0°c tới -80°c, giữ ở -80°c trong 10 phút sau đó bảo
quản trong nitơ lỏng. Nhiều nghiên cứu về bảo quản tinh cho thấy rằng tốc độ
làm lạnh được xem là tốt nhất theo chương trình của Steyn và Van Vuren (1987)
với các bước hạ nhiệt như sau:
Bước 1: Hạ từ 4°c xuống -4°c, tốc độ hạ nhiệt 4°c/phút.

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 15

Trướng ĐHNN Hà Nội


Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

Bước 2: Hạ từ -4°c xuống -80°c, tốc độ hạ nhiệt 1 l°c/phút.
Một số nghiên cứu áp dụng :

Hạ từ 0°c xuống -10°c, tốc độ hạ nhiệt l°c/phút.
Hạ từ -10°c xuống -15°c, tốc độ hạ nhiệt 2°c/phút.
Hạ từ -15°c xuống -25°c, tốc độ hạ nhiệt 3°c/phút.
Hạ từ -25°c xuống -80°c, tốc độ hạ nhiệt 7-8°C/phút.
Tốc độ hạ nhiệt ảnh hưởng rất lớn đến kết quả bảo quản vì vậy cần tìm chu
trình hạ nhiệt phù hợp với đối tượng nghiên cứu.
2.3.11.

Phương pháp giải đông

Stoss và Holtz (1983) cho rằng tốc độ giải đông có thể là một trong những
yếu tố quyết định sự thành công của bảo quản tinh. Trong điều kiện bảo quản ở
nitơ lỏng tinh trùng đang ở trạng thái kết dính dưới dạng thuỷ tinh thể, giải đông
không đáp ứng nhu cầu về mặt sinh học, cơ học sẽ giảm hoạt lực của tinh trùng,
đặc biệt hình thái acrosome của tinh trùng. Ket quả giải đông

phụ thuộc vào

nhiệt độ, thời gian giải đông, tỷ lệ pha loãng cũng như kích thước

viên hoặccọng

chứa tinh dịch. Một số công trình nghiên cún so sánh kết quả giải đông trong
khoảng thời gian như nhau cho thấy phương pháp làm tan giá bằng nước ấm
20°c tốt hơn trong không khí, tốc độ tan giá nhanh thu được tỷ lệ hoạt lực tinh
trùng cao hơn (Durbin và ctv.,1982). Khi bảo quản tinh hầu Thái Bình Dương,
Adam (2004) cho rằng giải đông ở nhiệt độ khoảng 20°c trong thời gian từ 1520 giây cho tỷ lệ thụ tinh cao.
2.3.12.

Các yếu tố khác

Ngoài các yếu tố trên để đánh giá đúng kết quả cần đảm bảo thao tác thu
mẫu, cần gieo tinh theo tỷ lệ hợp lý giữa số lượng trứng và tinh, lượng trứng
nhiều hoặc ít đều ảnh hưởng không tốt. Chất lượng trứng, điều kiện môi trường
trong quá trình ương ấp cũng là nhân tố ảnh hưởng tới kết quả.

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 16

Trướng ĐHNN Hà Nội


Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

Nguyên lý chung của một quy trình đều thực hiện qua các buớc sau: thu mẫu
tinh, đánh giá chất lượng tinh, lựa chọn dung dịch bảo quản, lựa chọn chất chống
đông và nồng độ chất chống đông, tỷ lệ pha loãng với dung dịch bảo quản, thời
gian cân bằng, kỳ thuật đóng cọng, phương pháp làm lạnh, phương pháp giải
đông, phương pháp thụ tinh.
2.4.

Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh hầu trên thế giói và ở Việt
Nam

2.4.1.

Tinh hình nghiên cứu bảo quản tinh hầu trên thế giói

Cùng với sự ra đời của công nghệ sản xuất giống nhân tạo, thì song song đó

các phương pháp bảo quản tinh trùng của các loài cũng được nhiều nhà khoa học
tiến hành nghiên cứu. Mục đích của những nghiên cứu này chủ yếu hướng tới
việc lưu giữ nguồn tinh trùng phục vụ cho sản xuất, cho bảo tồn nguồn gen đối
với một số loài quý hiếm và một số phục vụ các nghiên cứu khoa học về lai tạo
giống (Beaumont và Hoare, 2003).
Bắt đầu từ những năm 70 của thế kỷ XX, một số công trình nghiên cứu về
bảo quản tinh trùng hầu đã được công bố rộng rãi. Với những kỹ thuật khác nhau
các nghiên cún cũng đưa ra đựơc một số kết quả nhất định tuy nhiên vẫn chỉ
dừng ở mức khiêm tốn và theo thời gian kỹ thuật bảo quản tinh ngày càng hoàn
thiện hơn và cho các kết quả khả quan hơn. Tiersch và ctv.,(2000) đã đề xuất quy
trình bảo quản tinh đối với các loài thuỷ sản bao gồm: thu mẫu tinh, đánh giá
chất lượng tinh trùng, pha loãng tinh với extender và chất chống đông, kỹ thuật
đóng mẫu, chạy chương trình hạ nhiệt, chuyển mẫu tinh vào lưu giữ, giải đông
và tiến hành thụ tinh với trúng. Mỗi bước đều ảnh hưởng trực tiếp tới chất lượng
tinh bảo quản, nếu như không hoàn thành một trong những khâu đó thì có thế
dẫn đến sự thất bại của toàn bộ quy trình kỳ thuật.
Công bố đầu tiên về bảo quản tinh hầu phải kể đến là nghiên cứu của
Lannan (1971), đối tượng nghiên cứu là hàu Thái Bình Dương (C. gigas), sử
Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 17

Trướng ĐHNN Hà Nội


Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

dụng nước biển và chất chống đông DMSO 20%. Tỷ lệ thụ tinh ở hai mẫu lần
lượt là 7,0% và 9,3%. Các kỹ thuật này được phát triển hoàn thiện hơn bởi các
nhà khoa học như: Huges (1973) bảo quản lạnh tinh trùng hầu C.virginica với

nước biển và chất chống đông DMSO 5%, 10%. Sau khi được pha loãng (tỷ lệ
1:1) với dung dịch bảo quản được lưu giữ ở nhiệt độ thấp. Hwang và Chen
(1973) đã nghiên cún bảo quản tinh trùng hầu c.gigas, dung dịch bảo quản là
nước biển, 2 chất chống đông (DMSO, Glycerol) với 6 nồng độ khác nhau
(3,3%; 5%; 6,6%; 7,5%; 15%; 20%) sau đó bảo quản trong nitơ lỏng, vẫn trên
đối tượng hầu C.gigas, Staeger (1974) một lần nữa thí nghiệm sử dụng dung dịch
bảo quản là nước biến, 2 chất chống đông (DMSO, Glycerol) nồng độ 20%, tỷ lệ
pha loãng 1:1, bảo quản ở -170°c. Tuy nhiên những nghiên cứu này vẫn chưa
thu được kết quả tốt từ tý lệ thụ tinh của tinh trùng được bảo quản lạnh.
Vào năm 1979, với phương pháp nghiên cún của Zell và cộng sự trên hầu
C.vỉrginicia đã cho kết quả khá tốt, tỷ lệ thụ tinh từ 78-91% với tinh trùng được
bảo quản lạnh. Sử dụng chất bảo quản gồm NaHCO + glycine + DMSO 8%, tỷ
lệ pha loãng 1:6 sau đó làm lạnh xuống -80°c rồi bảo quản trong nitơ lỏng.
Năm 1986, Bougrier thí nghiệm trên hầu c.gigas. Tinh hầu sau khi thu
được, pha loãng với dung dịch bảo quản, tỷ lệ (1:5; 1:10; 1:12,5; 1:15; 1:17,5;
1:20 ). Công thức của dung dịch bảo quản được sử dụng là: DCSB4 (pH 8.5) +
DMSO 10%. Sau khi được đóng cọng, làm lạnh trên hơi nitơ lỏng 5cm trong 3
phút thì được chuyển vào bảo quản trong nitơ lỏng (-196°) trong thời gian không
quá 3 ngày. Giải đông ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ket quả cho thấy tỷ lệ pha
loãng 1:12,5 và 1:15 cho kết quả tốt hơn hắn, tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng sau khi
bảo quản ở 3 ngày đạt 92%.
Nghiên cứu của Kobina Yankson và John Moyse (1991) trên 4 đối tượng
hầu (c.tuỉipa, c.gigas, c.iredaỉei, C.cucullata) nhằm tìm ra nồng độ DMSO

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 18

Trướng ĐHNN Hà Nội


Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

thích hợp cho từng loài. Thí nghiệm được tiến hành như sau: tinh dịch được trộn
với chất bảo quản (dung dịch bảo quản được sử dụng gồm có DMSO với 4 nồng
độ 5%, 10%, 15%, 20% + nước biển chứa 0,6% glycine) trong ống nhựa vô
trùng và được làm lạnh khoảng 30 phút trong đá. Sau đó hạ nhiệt từ 0°c đến 70°c rồi bảo quản trong nitơ lỏng, giải đông ở 55°c trong 20 giây. Kết quả thu
được cho thấy tỷ lệ thụ tinh cao nhất là 93% của tinh hầu c.gigas khi sử dụng
DMSO 10%; 78,3% cho C.cucullata với DMSO 15% và 71,4% với DMSO 15%
cho c.tulipa, đối với c.iredalei DMSO tối un là 15%.
Trong báo cáo của Adams và cộng sự (2004) đã nghiên cứu sự ảnh hưởng
của các điều kiện bảo quản tới chất lượng của tinh trùng hầu Thái Bình Dương
('c.gỉgas). Với thí nghiệm sử dụng chất chống đông DMSO pha loãng ở các tỷ lệ
và sử dụng 0,45M Trehalose cho kết quả là: sử dụng kết hợp DMSO với một
mình Trehalose thì khả năng thụ tinh của tinh trùng tốt hơn khi chỉ sử dụng một
mình Trehalose. Nồng độ DMSO là 5%; 7,5%; 10%; 12,5% cho khả năng thụ
tinh trùng cao hơn ở nồng độ 2,5%; 15%. Neu nhúng trực tiếp lọ đựng tinh trùng
sau khi đã được pha loãng với chất bảo quản vào trong nitơ thì khả năng thụ tinh
của tinh trùng rất thấp. Khả năng thụ tinh của tinh trùng bảo quản lạnh trong nitơ
lỏng đạt 80%.
Theo Dong và cộng sự (2005) nhằm đánh giá khách quan các chất bảo
quản đối với việc bảo quản các mẫu tinh trùng hàu Thái Bình Dương, thí nghiệm
sử dụng tốc độ làm lạnh 5°c/phút tới -30°c và 45°c/phút tới -80°c trước khi
nhúng tinh trùng trong nitơ lỏng. Với các chất bảo quản là DMSO, Methanol,
Polyethylen Glycol, Propylen Glycol (P-Glycol). Qua thí nghiệm thấy được khi
sử dụng một mình Polyethylen Glycol (2%) không có hiệu quả như DMSO,
Methanol và Propylen Glycol (P-Glycol) khi sử dụng các cách thức tương tự.

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 19

Trướng ĐHNN Hà Nội


Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

Sau khi giải đông hoạt lực của tinh trùng đạt 70% và khả năng thụ tinh là 98%
tốt nhất là ở Methanol 6%.
Báo cáo Tervit cùng cộng sự (2005) nghiên cứu bảo quản tinh hầu Thái
Bình Dương với các chất bảo quản là Ethylene Glycol (10%), DMSO (15%),
Methanol và Propylen Glycol. Với Ethylene Glycol (10%) và DMSO (15%) cho
kết quả tốt nhất với việc bảo quản, khả năng thụ tinh sau giải đông lần lượt là
51% ± 8% và 45,1% ± 8,3%. Propyĩen Glycol cho kết quả thấp hơn, còn MeOH
cho kết quả thụ tinh bằng không.
Dong cùng cộng sự (2005) đã so sánh chất lượng của tinh trùng được bảo
quản lạnh sâu từ hầu đực tứ bội và hầu đực lưỡng bội (đối tượng là hầu Thái
Bình Dương). Nghiên cứu sử dụng chất bảo quản là DMSO và Propylen Glycol
kết quả thu được là ở phần lớn các thí nghiệm của tinh trùng hầu tứ bội có dưới
10% tinh trùng hoạt động và tỷ lệ thụ tinh dưới 5%. Khả năng thụ tinh cao nhất
của tinh trùng hầu lưỡng bội thu được là 96%, của hầu tứ bội là 28%.
Nasicimento và cộng sự (2005) đã nghiên cứu ảnh hưởng từ độc tố của các
chất bảo quản DMSO, Propylen Glycol, Methanol tới giao tử và ấu trùng hầu
Thái Bình Dương. Ờ Methanol nếu thời gian tiếp xúc tăng độ độc với giao tử từ
càng tăng thì tăng độc tố đối với cả giao tử và ấu trùng. Methanol độc nhất đối
với giao tử, Propylen Glycol độc nhất đối với ấu trùng.
Với kết quả đạt được trong những năm qua cho thấy kỹ thuật bảo quản tinh
hàu ngày càng phát triển. Các tác giả với những cách thức khác nhau đã thành
công trong việc chứng minh tính khả thi của việc áp dụng tinh trùng bảo quản lạnh
sâu trong sản xuất và góp phần không nhỏ vào việc bảo tồn đa dạng sinh học.

2.4.2.

Tinh hình nghiên cứu bảo quản tinh hầu ở Việt Nam

Cho đến năm 2000 ở Việt Nam chưa có tài liệu nào công bố kết quả nghiên
cứu bảo quản tinh trong nitơ lỏng trên các đối tượng thủy sản. Chỉ đến những

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 20

Trướng ĐHNN Hà Nội


Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

năm gần đây việc nghiên cứu bảo quản tinh trùng một số loài đã bắt đầu đuợc
triển khai và thu đuợc một số kết quả nhất định. Hồ Kim Diệp và cộng sự (2002)
đã thành công với quy trình bảo quản tinh trùng một số loài cá nuớc ngọt nhu cá
chép, cá trắm cỏ, bỗng... Nguyễn Minh Thành và cộng tác viên (2003) với quy
trình bảo quản tinh cá tra trong nitơ lỏng với thời gian bảo quản 7-21 ngày.
Hầu chua phải là đối tuợng nuôi phố biến nên cho đến nay các nghiên cứu
trên đối tuợng này là rất hạn chế. Theo kết quả nghiên cứu của tác giả Hà Đức
Thắng và cộng sự (2005) thì khả năng hoạt động của tinh trùng không còn sau 810 giờ. Tuy vậy khả năng thụ tinh rất kém nếu bảo quản trong thời gian quá lâu,
trong phạm vi 2-3 giờ đầu khả năng thụ tinh cao hơn. Ớ nhiệt độ cao hơn 30°c
tinh trùng hoạt động yếu trong thời gian ngắn, khả năng duy trì hoạt động kém
và không có khả năng thụ tinh. Hiện nay ở Việt Nam vẫn chua có công bố nào
về bảo quản tinh trùng hầu trong nitơ lỏng.

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 21

Trướng ĐHNN Hà Nội


Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

PHÀN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu
3.1.

Địa điếm và thòi gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: nghiên cứu được tiến hành tại Viện Nghiên cứu

Nuôi trồng Thuỷ sản 1 - Từ Sơn - Bắc Ninh và Trung tâm giống Hải sản
miền bắc - Cát Bà - Hải Phòng.
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 2 đến tháng 8 năm 2009.
3.2.

Đối tượng nghiên cứu
Hầu Cửa Sông: Crassostrea rivularis
Nguồn hầu được thu thập từ khu vực bãi nuôi ven sông Chanh, Yên

Hưng, Quảng Ninh. Hầu bố mẹ trong giai đoạn sinh sản, có kích cỡ trung
bình trên 0,5kg.
3.3.

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.3.1.

Vật liệu nghiên cứu

- Máy Cryogenic CL - 863 có cài đặt chương trình.
- Bình nitơ lỏng (-196°C).
- Kính hiển vi Olympus.
- Máy đo pH.
- Buồng đếm hồng cầu Haematocymeter.
- Lam kính, la men.
- Một số hoá chất và dụng cụ càn thiết khác.
3.3.2.

Phương pháp nghiên cứu

3.3.2.

ỉ. Chuân bị mâu tinh hầu trước khi bảo quản

- Kiếm tra giới tính hầu bố mẹ: hầu bố mẹ có sản phẩm sinh dục chín
thành thục (được kiếm tra ngẫu nhiên ở một số con) trước khi làm thí nghiệm
được cọ rửa và khử trùng bằng cồn 70°. Sau đó dùng búa và dao mở miệng hầu,
chỉ tách một tấm vỏ. Dùng khăn, giấy thấm khô bề mặt thân mềm. Dùng dao mổ

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 22

Trướng ĐHNN Hà Nội


Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

rạch lấy một phần nhỏ sản phẩm sinh dục rồi hoà với nước biển đưa soi trên kính
hiển vi nếu mẫu là sản phẩm sinh dục cái thì chúng là trứng có hình quả lê hoặc
hình tròn không hoạt động, nếu mẫu là sản phẩm sinh dục đực thì chúng là các
tinh trùng kích thước nhỏ và hoạt động, trúng có đường kính lớn hơn tinh trùng
rất nhiều.
- Phương pháp thu mẫu tinh hầu: sau khi đã xác định được các cá thể đực,
cái. Những con cái được giữ nguyên. Con đực được thấm khô lần nữa sau đó
dùng kéo cắt bỏ phần mang, dùng panh kẹp và dao mổ, xi lanh khéo léo hút lấy
sản phẩm sinh dục sao cho không bị lẫn phần nội tạng. Tinh thu xong trong quá
trình vận chuyển tránh ánh sáng mặt trời trực tiếp chiếu vào, tốt nhất nên đế
trong hộp có đá lạnh.
33.2.2.

Đánh giá sơ bộ chất lượng tinh hầu

- Quan sát bằng mắt thường:
+ Mầu sắc tinh dịch.
- Quan sát bàng kính hiến vi:
+ Xác định hoạt lực tinh trùng: xác định hoạt lực tinh trùng theo
phương pháp của Milovanov (1962), Chemiean (1991): nhỏ l-5pl tinh dịch lên
lam kính, cho thêm 1 giọt nước biển để kích hoạt tinh trùng. Nhanh chóng đậy
một lamen lên giọt tinh dịch sao cho giọt tinh dịch được dàn đều ra 4 cạnh. Quan
sát hoạt động của tinh trùng qua kính hiển vi có độ phóng đại 400 lần, tinh trùng
có 3 hình thức vận động: tiến thẳng, xoay vòng, lắc lư. Chất lượng tinh trùng
được đánh giá bằng tỷ lệ % tinh trùng có hoạt động tiến thẳng trên tống số tinh
trùng trên vi trường quan sát.
+ Xác định mật độ tinh trùng: theo phương pháp của Milovanov (1962),
Chemian (1991), mật độ tinh trùng được kiểm tra bằng buồng đếm hồng cầu

Haematocymeter dưới kính hiển vi có độ phóng đại 400 lần. Tinh dịch được pha

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 23

Trướng ĐHNN Hà Nội


Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

loãng trong ống pha loãng hồng cầu với bội số pha loãng nhỏ nhất là 1:1000, lắc
đều và bỏ vài giọt tinh dịch pha loãng ban đàu trong ống hút, sau đó cẩn thận nhỏ
một giọt vào buồng đếm hồng càu đã chuẩn bị sẵn. Đem tinh trùng trong các ô đếm
(4 ô ở 4 góc và một ô ở giữa, mỗi ô trung bình có 16 ô nhỏ, mỗi ô nhỏ có diện tích
l/400mm2 và độ sâu 1/1 Omm). Đốm theo đầu, từng hàng một, hết hàng này đến
hàng kia theo hình chữ chi. Những tinh trùng nằm trên cạnh nhỏ chỉ đếm 2 cạnh
(thường là cạnh trên và bên phải). Neu tinh trùng tụ thành đám phải đếm lại.
Công thức tính mật độ tinh trùng:
N X R X 4000 X 1000
D = --------------------------------80

Trong đó:

D: mật độ tinh trùng ( xl09tt/ml)
N: tổng số tinh trùng trong 80 ô đếm
R: hệ số pha loãng

- Đo độ pH: pH của tinh dịch được đo bằng máy pH metter (Metter 220),
nhúng đầu cực của máy đo vào tinh dịch, đọc kết quả khi kết thúc quá trình đo.

33.2.3.

Bố

trí

thỉ

nghiệm

Thí nghiệm chọn tỷ lệ pha loãng phù họp
Thí nghiệm được tiến hành với 2 tỷ lệ pha loãng 1/6 và 1/9.
Cách tiến hành: tinh được lưu giữ phải là tinh có chất lượng tốt, hoạt lực
cao. Dung dịch bảo quản được chuẩn bị gồm có chất chống đông DMSO chiếm
10% và nước biển đã khử trùng theo tỷ lệ 1/6 và 1/9. Sau đó dùng pipet hút tinh
vào cọng tránh không để bọt khí. Cọng mẫu có thể tích 0.25ml được hàn kín
(dùng kéo hơ trên ngọn lửa đèn cồn rồi kẹp lại), sau đó đem cân bằng nhiệt trong

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 24

Trướng ĐHNN Hà Nội


Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

đá khô khoảng 5-10 phút. Sau khi cân bằng nhiệt xong, thấm khô và đưa vào
buồng làm lạnh của máy Cryogenic CL - 863, sau đó chạy chương trình làm lạnh
của Yankson & Moyse (hạ từ 4°c đến -70°C).

Ket thúc chương trình làm lạnh, mẫu tinh được nhanh chóng đưa vào các
Canister trong bình chứa nitơ lỏng (-196°C) đế bảo quản. Các mẫu được bảo
quản trong nitơ lỏng sau 1 tuần được đem ra giải đông, cho thụ tinh, đánh giá tỷ
lệ thụ tinh để tìm ra tỷ lệ pha loãng phù hợp.
Thí nghiệm chọn chất chống đông phù họp
Thí nghiệm được tiến hành với 3 chất chống đông (DMSO, Methanol,
Glycerol) chiếm 10% tổng thể tích.
Cách tiến hành: tinh sau khi thu được pha loãng với nước biển và tỷ lệ pha
loãng thích hợp đã được xác định dựa vào thí nghiệm 1. Sau đó pha loãng với
từng chất chống đông trên. Rồi bảo quản tinh trong nitơ lỏng sử dụng chương
trình của Yankson & Moyse, sau 1 tuần và 1 tháng tiến hành giải đông, cho thụ
tinh đánh giá kết quả. Chất chống đông được chọn là chất cho tinh trùng có hoạt
lực sau giải đông cao và tỷ lệ thụ tinh cao.
Thí nghiệm chọn nồng độ chất chống đông phù họp
Thí nghiệm tiến hành vớí 3 nồng độ chất chống đông khác nhau (5%, 10%,
15%).
Cách tiến hành: dựa vào kết quả của 2 thí nghiệm trên đã xác định được tỷ lệ
pha loãng và chất chống đông phù hợp để sử dụng cho thí nghiệm 3. Mầu tinh
cũng được bảo quản theo phương pháp hạ nhiệt của Yankson & Moyse như 2 thí
nghiệm trên.
Thí nghiệm bảo quản lạnh tinh hầu trong nitơ lồng theo 2 cách khác nhau
Cách 7: phương pháp làm lạnh sử dụng theo chương trình của Yankson và
Moyse (các cọng mẫu được làm lạnh theo chương trình hạ nhiệt từ 4°c đến

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 25

Trướng ĐHNN Hà Nội


Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

-70°c, sau đó mẫu đuợc chuyển vào các Caniter trong bình nito lỏng).
Cách 2: phương pháp làm lạnh bằng hơi nitơ (các mẫu được đặt cách bề
mặt nitơ lỏng 7cm trong 5 phút sau đó được chuyển vào các Caniter trong bình
nitơ lỏng).
3.3.3.

Kiểm tra kết quả bảo quản

3.3.3.1.

Giải đông

Tiến hành giải đông theo phương pháp của Waymann và Tierch (1998):
giải đông trong nước ấm 40°c với thời gian 8-10 giây, sau đó thấm khô cọng
mẫu và cắt 2 đầu cọng kiểm tra hoạt lực tinh trùng và thụ tinh với trứng.
3.3.3.2.

Thu trứng, thụ tinh, xác định tỷ lệ thụ tinh

Trứng được thu từ những con cái còn sống được đếm cho vào bình ấp sao
cho mật độ ấp là 30 trứng/mĩ. ứng với mỗi bình thì cho thụ tinh với một công
thức thí nghiệm. Đối với các thí nghiệm có lô đối chứng thì dùng tinh tươi tiến
hành song song.
Trứng vừa thu xong, nhanh chóng lấy tinh bảo quản từ bình nitơ ra giải
đông và cho thụ tinh ngay với trứng. Tuỳ theo nhiệt độ môi trường, theo dõi sự
phát triển của phôi để tính tỷ lệ thụ tinh. Trứng sau khi được thụ tinh được ấp
trong bình nhựa có sục khí. Sau 2-3 tiếng thì tiến hành kiếm tra tỷ lệ thụ tinh (ở

thời điếm này nếu trứng được thụ tinh thì có sự phân chia tế bào rõ ràng).
Số trúng thụ tinh
Tỷ lệ thụ tinh (%) = 100 X —----------------------——7----—--------------------- -—
Số trứng trong mẫu lấy ngẫu nhiên trong bình ấp
3.3.4.

Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý, tính toán trên phần mềm Ecxel và được phân tích bằng
ANOVA một nhân tố.

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 26

Trướng ĐHNN Hà Nội


Lê Thị Hồng Minh TS 50

Khơú luận tốt nghiệp

Chuẩn bị vật liệu thí nghiệm

Thu mẫu tinh

Kiểm tra chất lượng tinh trùng

Chuẩn bị
extender và
chất
chống đông

Hoạt
lực
Mật độ
pH

Pha loãng
(tinh+Extender+chất
chổng
đông)
Kiêm tra hoạt lực tinh trùng

Cân bằng
nhiệt ớ
4-6°C

Đóng và hàn cọng

Làm lạnh

Bảo quản trong nitơ lỏng

Giải đông kiểm tra hoạt lực

Tiên hành thụ tinh, kiêm tra tỷ
lệ thụ tinh
So’ đồ 3.1. Tóm tắt quy trình bảo quản tinh dài hạn

Khoa: Chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản 27

Trướng ĐHNN Hà Nội


Chỉ số

SỐ
mẫu
Hoạt lực tinh trùng (%)
15
Lê
Lê Thị
Thị Hồng
Hồng Minh
Minh TS
TS 50
50
Mật độ tinh trùng ( xl09tt/ml)
15
pH
Tỷ lệ pha loãng

1/6
1/9
ĐC

Min

Ma
Trung bình
x

89
80
100
169,
177,
173,4
2
8
15
7,6
7,9
7,7
- Phàn đầu: PHÀN
có dạng4.hình
càuQUẢ
KẾT
VÀ
THẢO
LUẬN
Thu trứng
Tỷ lệ thụ tinh (%)
Hoạt
lực đuôi:
tinhquả
trùng
sauhình sợi
-4.1.
Phàn
có dạng
Kết

Khơú
Khơú luận
luận tốt
tốt nghiệp
nghiệp

giải
đông (%)
4.1.2.
Kết
bảođiếm
quảnsinh
tinhhọc
hầucủa
Cửa
Sông
nitơ Sông
lỏng ở 2 tỷ lệ
4.1.1.
Mộtquả
số đặc
tinh
dịchtrong
hầu Cửa
39,44 ± 9,50
59,1 ±5,9
loãng
(Crassostrea
Tinh tươi

Giải đôngpha
tinh
59,44 ± 10,14
74,4 ± 5,3
bảo
khác
nhau
rivularis)
88,89 ±4,17
88,3 ± 3,4
Tỷ
lệ pha
loãng
một những
yếu tố đặc
rất quan
trongchất
quálượng
trình tinh.
bảo quản
Mầu
sắc là
một làtrong
điếm trọng
đánh giá
Tinh tinh
hầu
trùng.
lệ phatốtloãng
kháclànhau

tinh sữa.
trùngQua
trongquá
mẫutrình
cũngthu
khác
có chấtTỷlượng
thường
tinh thì
có mật
mầuđộtrắng
mẫunhau
và
Thụ tinh
Thụ tinh
từ
đó sát
ảnhcho
hưởng
kếthầu
quả có
bảomầu
quản.
Nhiều
đã tiếp
chỉ ra
tỷ lệtrắng
pha
quan
thấytớitinh

trắng
sữa nghiên
chiếm cứu
đa số,
đórằng
là mầu
loãng
giữa ra
cáccòn
loàicólàmầu
tương
đối xanh,
rộng vi
vậyđục
việcdolựanhững
chọn mẫu
tỷ lệđó
phacóloãng
saotạng,
cho
ngà, ngoài
trắng
trắng
lẫn nội
Bảng
4.1.
Một
đặc
học
của

tinh
Cửa
phù
hợp
với
loài
là số
rất
cầnđiếm
thiết.
Dựa
vào
kết
quả
nghiên
cứu đã được công
những
mẫu
lẫntừng
tạp
như
vậy
chúng
tôi
bỏsinh
đi
không
dùng
đểhầu
bảo

quản.Sông
bố trước đây trên nhiều đối tượng hầu chúng tôi tiến hành bố trí thí nghiệm bảo
Đem mẫu trứng đế ấp
quản tinh hầu Cửa Sông ở hai tỷ lệ pha loãng là 1/6 và 1/9. Dung dịch bảo quản
là nước biển đã khử trùng, chất chống đông sử dụng là DMSO 10% nhàm tìm ra
được tỷ lệ pha loãng phù hợp.
Một tuần sau khi bảo quản tiến
Tỷhành
lệ thụgiải
tinhđông, kiểm tra hoạt lực tinh trùng,
cho
thụtrùng
tinh và tính tỷ lệ thụ tinh. Ket quả thu được được trình bầy ở bảng 4.2.
tt: tinh
BảngQua
4.2.kết
Ảnh
tỷ thấy
lệ pha
loãng
tinhtốt.
trùng
saubình
1 đạt
quảhưởng
bảng của
4.1 ta
hoạt
lực đến
tinhchất

trùnglượng
hầu đều
Trung
tuần
lưu
giữ
đồ đạt
3.2. 80%
Tóm tắt
thí
nghiệm
89% nhỏ nhất Sơ
cũng
cho
thấy
tinh thụ
đều tinh
đáp ứng được yêu cầu về bảo
quản. Ớ đây chúng tôi chỉ kiếm tra hoạt lực của những mẫu tinh không lẫn tạp
chất còn những mẫu tinh bị lẫn tạp chất đều bị bỏ không dùng đế bảo quản. Mật
độ tinh trùng hầu Cửa Sông trung bình đạt 173,4x1 o9 tinh trùng/ml và dao động
trong khoảng 169,2xl09-177,8xl09 tinh trùng/mĩ. Một số nghiên cứu cho ràng
mật độ tinh trùng phụ thuộc vào tuổi, mùa vụ sinh sản và chế độ nuôi vỗ. Độ pH
trung bình của tinh hầu Cửa Sông đạt 7,7 dao động từ 7,6 đến 7,9.
Hình
thái4.2
ngoài
củathế
tinh
trùng

hầuở Cửa
gồmloãng
2 phần:
đầu, nhau
phần về cả
Từ
bảng
ta có
nhận
thấy
hai Sông
tỷ lệ pha
cóphần
sự khác
đuôi.lực tinh trùng lẫn tý lệ thụ tinh. Tỷ lệ pha loãng 1/9 có hoạt lực và tỷ lệ thụ
hoạt

29
30
Khoa:
Khoa: Chăn
Chăn nuôi
nuôi và
và nuôi
nuôi trồng
trồng thuỷ
thuỷ sản
sản28

Trướng

Trướng ĐHNN
ĐHNN Hà
Hà Nội
Nội