NUÔI CẤY VÀ TẠO RỄ CÂY HOÀN NGỌC (Pseuderanthemum Bracteatum) TRONG ĐIỀU KIỆN IN-VITRO ĐỂ THU NHẬN BETULIN- HỢP CHẤT THỨ CẤP

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-------------------------------------------

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG KHANH

NUÔI CẤY VÀ TẠO RỄ CÂY HOÀN NGỌC
(Pseuderanthemum Bracteatum)
TRONG ĐIỀU KIỆN IN-VITRO ĐỂ THU NHẬN
BETULIN- HỢP CHẤT THỨ CẤP

CHUYÊN NGÀNH: SINH LÝ THỰC VẬT

Mã số: 60 42 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. BÙI VĂN LỆ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2011


LỜI CẢM ƠN
Luận văn này hoàn thành là nhờ sự giúp đỡ và hỗ trợ từ các thầy cô, các bạn và
các em trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên TPHCM và phòng thí nghiệm Nuôi
Cấy Mô trường Đại Học Mở TPHCM. Do đó tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:
Thầy Bùi Văn Lệ đã trực tiếp ướng dẫn, gợi ý đề tài và chỉ dẫn tận tình cho tôi
trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Thầy Bùi Trang Việt, Thầy Nguyễn Du Sanh, cô Võ Thị Bạch Mai và các thầy cô
bộ môn Sinh Lý Thực Vật đã giảng dạy, cung cấp kiến thức và kỹ năng trong suốt
thời gian học tập.

Bạn Nguyễn Thành Hải đã giúp đỡ và hỗ trợ cho tôi những kinh nghiệm làm việc
quý báu.
Các em Từ Thêu Anh, Nguyễn Hoàng Phong .. đã hỗ trợ tôi trong quá trình thực
hiện đề tài.
Ba mẹ đã hỗ trợ trong suốt mỗi bước đi của tôi trong cuộc sống.
Chồng và các con đã hỗ trợ tôi nhiều để yên tâm học tập và thực hiện đề tài.


i

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ..................................................................................................................... 1
PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 2
1.1. CÂY HOÀN NGỌC ..................................................................................................... 2
1.1.1. Vị trí phân loại ........................................................................................................... 2
1.1.2. Nguồn gốc và sự phân bố .......................................................................................... 3
1.1.3. Đặc điểm về hình thái ................................................................................................ 3
1.1.4. Thành phần hoá học................................................................................................... 3
1.1.5. Công dụng.................................................................................................................. 5
1.2. HỢP CHẤT THỨ CẤP VÀ BETULIN ....................................................................... 7
1.2.1. Giới thiệu sơ lược về hợp chất thứ cấp...................................................................... 7
1.2.2. Ứng dụng công nghệ tế bào trong thu nhận hợp chất thứ cấp ................................. 11
1.2.2.1. Tầm soát (screening) và chọn lọc (selection), tối ưu hóa môi trường nuôi cấy
(medium ptimization) ........................................................................................................ 11
1.2.2.2. Biệt hóa tế bào ...................................................................................................... 12
1.2.2.3. Cố định tế bào (Immobilized cells) ...................................................................... 14
1.2.2.4. Gợi kích thích (Elicitation) ................................................................................... 14
1.2.2.5. Công nghệ về con đường biến dưỡng................................................................... 15
1.2.3. BETULIN ................................................................................................................ 16
1.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT ĐỂ THU NHẬN HỢP CHẤT THỨ CẤP......... 17

1.3.1. Các hệ thống tế bào in vitro ..................................................................................... 17
1.3.3.1. Mô sẹo .................................................................................................................. 17
1.3.3.2. Biện pháp làm tăng sản lượng các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào ......... 18
Tối ưu hoá điều kiện môi trường ....................................................................................... 18


ii

• Môi trường ....................................................................................... 18
• Nhiệt độ, pH, ánh sáng, nồng độ oxy .............................................. 18
PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 20
2. Vật liệu và phương pháp................................................................................................ 20
2.1. Vật liệu ....................................................................................................................... 20
2.1.1. Địa điểm và thời gian thực hiện thực hiện đề tài..................................................... 20
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................................. 20
2.1.3. Mẫu cấy ................................................................................................................... 20
2.1.4. Môi trường nuôi cấy ................................................................................................ 20
2.1.4.1. Môi trường chung ................................................................................................. 20
2.1.4.2. Các loại môi trường .............................................................................................. 21
2.1.5. Điều kiện nuôi cấy ................................................................................................... 21
2.1.6. Dụng cụ kỹ thuật...................................................................................................... 21
2.1.7. Dụng cụ và trang thiết bị và hóa chất nuôi cấy ....................................................... 23
2.2 Phương pháp ................................................................................................................ 24
2.2.1. Khử mẫu .................................................................................................................. 24
2.2.2. Bố trí thí nghiệm ...................................................................................................... 25
2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch canxi
hypocloric với các nồng độ khác nhau .............................................................................. 25


iii

2.2.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự phát triển chồi từ đoạn đốt thân dưới ảnh hưởng của
sự kết hợp 2 chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA và BA........................................... 26
2.2.2.3. Thí nghiệm 3: Tăng sinh rễ từ những chồi thu được trên đoạn đốt thân .............. 26
2.2.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ thân non và lá non cây in vitro 27
2.2.2.5. Thí nghiệm 5: Tái sinh rễ từ mô sẹo thân non cây hoàn ngọc ............................. 27
2.2.2.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA lên khả
năng tạo chất thứ cấp betulin trong thân cây in vitro hoàn ngọc....................................... 28
2.2.2.7. Phân tích hàm lượng betulin thu được trong các giai đoạn .................................. 29
2.2.2.8. Phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch………………………………...30
2.2.3. Phương pháp thu nhận số liệu ................................................................................. 31
2.2.4. Bố trí thí nghiệm ...................................................................................................... 31
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 32
3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch canxi
hypocloric với các nồng độ khác nhau .............................................................................. 32
3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự phát triển chồi từ đoạn đốt thân dưới ảnh hưởng của sự
kết hợp 2 chất điều hòa sinh trưởng thực vật NAA và BA ............................................... 34
3.3. Thí nghiệm 3: Tăng sinh rễ từ những chồi thu được trên đoạn đốt thân .................... 37
3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ thân non và lá non cây in vitro ...... 40
3.5. Thí nghiệm 5: Tái sinh rễ từ mô sẹo thân non cây hoàn ngọc ................................... 46
3.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BA lên khả năng
tạo chất thứ cấp betulin trong thân cây in vitro hoàn ngọc ............................................... 48


iv

3.7. Phân tích hàm lượng betulin thu được trong các giai đoạn ........................................ 50
3.8. Vòng vô khuẩn: thân cây in vitro hoàn ngọc được chiết bằng dung môi ethanol 96o
với tỷ lệ 1g trọng lượng khô / 100ml ethanol 96o.............................................................. 54
3.9. Hình thái giải phẫu mẫu rễ và thân cây hoàn ngọc in vitro phát sinh từ mô sẹo

thân .................................................................................................................................... 55
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................... 59
Kết luận.............................................................................................................................. 59
Kiến nghị………………………………………………………………………………....59


vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1: Các nghiệm thức được sử dụng trong khảo sát sự phát sinh chồi từ đoạn đốt thân
sau khi khử mẫu đạt ........................................................................................................... 21
Bảng 2: Các nghiệm thức được sử dụng trong khảo sát sự tạo mô sẹo từ đoạn đốt thân và
lá in vitro của cây hoàn ngọc ............................................................................................. 22
Bảng 3: Các nghiệm thức được sử dụng trong khảo sát ảnh hưởng của NAA trong qua
trình tái sinh rễ từ mô sẹo thân cây hoàn ngọc .................................................................. 22
Bảng 4: Các nghiệm thức được sử dụng trong khảo sát ảnh hưởng của BA trong quá trình
tái sinh cây con từ mô sẹo thân in vitro cây hoàn ngọc ..................................................... 23
Bảng 6: Hàm lượng betulin thu được ................................................................................ 29
Bảng 7: Tỉ lệ mẫu bị nhiễm và tái sinh sau các thời gian và nồng độ chất khử trùng khác
nhau ................................................................................................................................... 32
Bảng 8: Tỉ lệ mẫu tạo chồi từ đoạn đốt thân cây hoàn ngọc trên các môi trường khác nhau35
Bảng 9: Hàm lượng betulin trong các cơ quan cây hoàn ngọc.......................................... 38
Bảng 10: Ảnh hưởng của các nồng độ 2,4-D kết hợp với BA lên sự tạo mô sẹo từ thân
non cây hoàn ngọc in vitro ................................................................................................ 41
Bảng 11: Ảnh hưởng của các nồng độ 2,4-D kết hợp với BA lên sự tạo mô sẹo từ lá non
cây hoàn ngọc in vitro ....................................................................................................... 43
Bảng 12: Chiều dài rễ và số rễ chính của cây in vitro được nhân sinh khối ở các môi
trường khác nhau ............................................................................................................... 46
Bảng 13: Sự tăng sinh cây con in vitro .............................................................................. 48

viii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 1: Tỷ lệ sống và tái sinh đoạn đốt thân cây hoàn ngọc ........................................ 33
Biểu đồ 2: Tỷ lệ mẫu tạo chồi từ đoạn đốt thân cây hoàn ngọc ........................................ 35
Biểu đồ 3: So sánh hàm lượng betulin trong các cơ quan cây hoàn ngọc in vitro và ngoài
tự nhiên .............................................................................................................................. 39
Biểu đồ 4: Sự tạo mô sẹo từ thân non cây hoàn ngọc in vitro ........................................... 41
Biểu đồ 5: Sự tạo mô sẹo từ lá non cây hoàn ngọc in vitro ............................................... 43
Biểu đồ 6: Chiều dài rễ và số rễ chính được biệt hóa từ mô sẹo thân non in vitro ........... 47
Biểu đồ 7: Sự tăng sinh cây con in vitro từ mô sẹo ........................................................... 49
Biểu đồ 8: Biểu đồ betulin thu được trong các giai đoạn .................................................. 51


v

DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Cây hoàn ngọc trồng trong chậu tại Đà Nẵng ........................................................ 2
Hình 2. Sơ đồ: Con đường sinh tổng hợp các sản phẩm chuyển hóa bậc hai ở tế bào thực
vật ....................................................................................................................................... 8
Hình 3. Mối quan hệ giữa các chất nhất cấp và chất thứ cấp ở thực vật .......................... 10
Hình 4. Lông rễ được tạo thành trong nuôi cấy rễ cây Atropa belladonna ...................... 13
Hình 5. Khung cơ bản của betulin ..................................................................................... 16
Hình 6: Mẫu cấy ................................................................................................................ 20
Hình 7: Các đoạn đốt thân cây hoàn ngọc sống và tái sinh ............................................... 34
Hình 8: Các đoạn đốt thân cây hoàn ngọc không nhiễm nhưng không tái sinh ................ 34
Hình 9: Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA lên sự phát sinh chồi từ đoạn đốt thân cây hoàn
ngọc ................................................................................................................................... 36
Hình 10: Cây con phát triển sau 12 tuần nuôi cấy............................................................. 37

Hình 11: Mô sẹo hình thành từ đoạn thân non phát triển tốt............................................. 42
Hình 12: Mô sẹo hình thành từ đoạn thân non bị hóa nâu ................................................ 42
Hình 13: Mô sẹo hình thành từ lá in vitro cây hoàn ngọc ................................................. 44
Hình 14 : Rễ được biệt hóa từ mô sẹo thân non cây in vitro ............................................. 47
Hình 15: Cây con in vitro tái sinh từ mô sẹo sau 8 tuần nuôi cấy ..................................... 49


vi

Hình 16: Cây con in vitro tái sinh từ mô sẹo sau 12 tuần nuôi cấy ................................... 50
Hình 17: Đối chứng – dung môi ethanol 96o ..................................................................... 54
Hình 18: Vòng kháng khuẩn do betulin ............................................................................ 54
Hình 19: Hình giải phẫu rễ cây.......................................................................................... 55
Hình 20: Hình giải phẫu thân non cây hoàn ngọc ............................................................. 56


1 

 

Tổng quan tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ
¾ Loài người biết dùng lá và rễ cây làm thuốc từ thời kỳ xa xưa. Y học dân gian cổ
truyền của các dân tộc cũng có nhiều kinh nghiệm trong việc dùng lá, thân và rễ
cây hoàn ngọc để chữa nhiều bệnh trong đó có công dụng chữa những rối loạn do
nhiễm khuẩn đường tiêu hóa. Các nhà khoa học cũng có nhiều công trình nghiên
cứu về tác dụng chữa bệnh của cây hoàn ngọc ngoài tự nhiên nhưng nghiên cứu
các điều kiện nuôi cấy cây hoàn ngọc in-vitro và sinh tổng hợp betulin, hợp chất
thứ cấp có hàm lượng cao trong cây thì rất hạn chế.

¾ Loại dùng trong chữa bệnh trong dân gian miền Nam: có hình lá xoan nhọn, ngắn,
màu xanh nhạt, thân đứng, cao khoảng 0.5-1m, có tên khoa học là
Pseuderanthemum palatiferum (Nees), Radlk, thuộc họ Ôrô (Acanthaceae)[4].
Tiến sỹ Trần Công Khánh cho biết, đã có nghiên cứu, sơ bộ xác định trong lá hoàn
ngọc có chứa Sterol, coumarin, đường khử, carotenoid và acid hữu cơ. Thuốc này
được ghi nhận trong dân gian, nhưng mới sử dụng điều trị bệnh trong thời gian
gần đây, nên chưa được đúc kết kinh nghiệm, cần có thời gian và các phương pháp
nghiên cứu khoa học kiểm chứng mới có thể đưa ra kết luận cụ thể.
¾ Loại dùng chữa bệnh trong dân gian miền Trung: cây hoàn ngọc đỏ còn có tên cây
xuân hoa lá hoa (Pseuderanthemum bracteatum), là cây bụi, cao từ 0,6 - 1,5m,
sống nhiều năm. Khi còn non, thân trơn nhẵn, mầu hơi vàng hồng, lá đơn, nguyên,
mọc đối, cuống lá dài, phiến lá hình mũi mác[23].
¾ Nhằm chứng minh vai trò kháng khuẩn của cây hoàn ngọc đỏ và tìm kiếm những
cây thuốc có thể thay thế kháng sinh trong điều trị nhiễm khuẩn do đó đề tài được
nghiên cứu.
Vậy cây hoàn ngọc đỏ (tía) có khả năng kháng khuẩn so với các chất kinh điển như thế
nào, liệu nguyên liệu nuôi cấy in-vitro từ cây hoàn ngọc có tác dụng như cây trồng tự
nhiên hay không, điều này cần được khảo sát và nghiên cứu. Hợp chất thứ cấp cụ thể cần
quan tâm là betulin. Có thể điều chỉnh tăng hàm lượng betulin trong nuôi cấy mô không,
đây là điểm cần khảo sát.
 


2 

 

Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

CÂY HOÀN NGỌC ĐỎ

1.1.1. Vị trí phân loại [4]:
Ngành

:

Magnoliophyta

Lớp

:

Magnoliosida

Bộ

:

Lamiales

Họ

:

Acanthaceae (họ Ô rô)

Chi

:

Pseuderanthemum

Loài

:

Pseuderanthemum bracteatum .

Tên khoa học: Pseuderanthemum bracteatum.
Tên thông thường: cây hoàn ngọc, cây tú linh, cây con khỉ.

 

Hình 1. Cây hoàn ngọc trồng trong chậu tại Đà Nẵng

 

 


3 

 

Tổng quan tài liệu

1.1.2. Nguồn gốc và sự phân bố:

Phần lớn là cây thân thảo, cây bụi nhiệt đới. Họ này có thể được tìm thấy trong các
rừng rậm và rừng thưa, trên các bụi cây hay trên các cánh đồng và thung lũng ẩm ướt,
ven biển và trong các khu vực biển, đầm lầy.
Cây mọc phổ biến ở một số tỉnh đồng bằng sông Hồng: Thái Bình, Nam Định,
Hưng Yên, Hải Dương.... [22].
1.1.3. Đặc điểm về hình thái:
Cây hoàn ngọc đỏ còn có tên cây xuân hoa lá hoa, là cây bụi, cao từ 0,6 - 1,5m, sống
nhiều năm. Khi còn non, thân trơn nhẵn, mầu hơi vàng hồng, lá đơn, nguyên, mọc đối,
cuống lá dài, phiến lá hình mũi mác. Những lá non, ở ngọn có mầu nâu hoặc hơi vàng đỏ,
phủ một lớp lông rất mịn. Lá già màu xanh, mặt trên xanh đậm, mặt dưới xanh nhạt. Cụm
hoa dạng bông, mọc ở kẽ lá hay đầu cành, tràng hình ống, màu tím nhạt [23].
1.1.4. Thành phần hoá học:
Dựa theo công bố của doanh nghiệp Bảy Nga (Trà hoàn ngọc túi lọc) cho thấy
chiết xuất từ rễ cây hòan ngọc trắng (Pseuderanthemum palatiferum) (7 năm tuổi - DN
trồng tại Tây Ninh) đã phân lập được 4 triterpene có hoạt tính sinh học có giá trị cao
như: Lupeol, lupenone, betulin, axid pomolic. Tiếp tục nghiên cứu về thành phần hóa
học của rễ cây hoàn ngọc, phân lập được thêm một triterpene có hoạt tính có tên
epifriedelanol và một hợp chất mới được gọi tắt là HN5 - 7NTN. Hai hợp chất lupeol và
betulin chiếm hàm lượng tương đối cao trong mẫu rễ cây đã được thử hoạt tính kháng vi
sinh vật kiểm định, họat tính chống oxy hóa và độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư
biểu mô KB, ung thư gan HepG2 và ung thư vú MCF7 tại Viện Hóa học - Viện KH
&CN Việt Nam [23].

 


4 

 

Tổng quan tài liệu

Bảng 1: Hàm lượng một số nguyên tố đa vi lượng trong lá hòan ngọc
(Pseuderanthemum palatiferum)
Chất

Hàm

khoáng

lượng

khóang

lượng

đa

(mg/100g

vi

(mg/100g lá

lượng

lá tươi)

lượng

tươi)

Ca

875,5

Fe

38,75

Mg

837,6

Al

37,50

K

587,5

V

3,75

Na

162,7

Cu

0,43

Mn

0,34

Ni

0,19

Chất Hàm

Hàm lượng các nguyên tố đa lượng (Na, Ca, K, Al, Mg và Fe) trong lá cây hòan ngọc rất
cao (40-900 mg/100g lá tươi) so với các cây khác. Đặc biệt hàm lượng Fe là 38,75mg,
cao gấp 2 lần lượng Fe của con vẹm (24mg ), gấp 3 lần gan heo (13mg), 4 lần đậu nành
(11mg) và gần bằng lượng Fe trong củ Tam Thất (48,6mg ). Không phát hiện kim lọai
nặng như Cd, Pd, Cr. Đáng chú ý là hàm lượng vanadi đạt khá cao (3,8mg).
- Kết quả phân tích cho thấy giá trị dinh dưỡng khóang của cây hòan ngọc đặc biệt là
các nguyên tố Ca (875,5mg), K(587,5mg) và Fe (38,75 mg).
- Kết quả phân tích thành phần acid amin cây hòan ngọc cho thấy caid amin tự do và
liên kết đều có đủ các acid amin không thay thế với hàm lượng tổng số đạt khá cao (7511365mg%) gần giống như lá chè xanh (1315mg%) và cao hơn so với lá vối (545mg%).
 


5 

 

Tổng quan tài liệu

Đặc biệt, hàm lượng isoleucin và leucin rất cao (25-150mg% và 46-85mg%). Đó là các
acid amin giữ vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp protein cơ bắp và chống mỏi mệt
cho cơ thể. Thiếu chúng cơ thể sẽ bị sụt cân nhanh. Lá cây hòan ngọc còn giàu valin
(29-1001mg%).Thiếu acid amin này, sự phối hợp các chuyển động của cơ bắp bị rối
lọan và yếu đi. Valin còn ảnh hưởng đến họat của tuyến tụy - một tuyến tiêu hóa quan
trọng.
-Các acid amin còn là nguyên liệu tạo nên một số nội tiết tố và các chất có họat tính
sinh học. Alamin với hàm lượng cao trong lá cây hòan ngọc là nguyên liệu tổng hợp
coenzym A, acid pantotenic, carnosin, anserin...[22]
Kết quả kiểm tra độc tính cấp của dịch chiết lá hòan ngọc khô dùng làm trà tại Viện
kiểm nghiệm, Bộ Y tế công bố lá hòan ngọc không độc và có tác dụng kháng khuẩn
đối với vi khuẩn gram âm và gram dương ở đường tiêu hóa và kháng nấm [23].
- Các nghiên cứu về hoàn ngọc đỏ (Pseuderanthemum bracteatum) chưa rõ ràng hãy còn
đang được nghiên cứu, chỉ dùng phổ biến chữa bệnh trong dân gian miền Trung và có
những công dụng gần giống như hoàn ngọc trắng (Pseuderanthemum palatiferum)
1.1.5. Công dụng:
Khoa học hiện đại đã đánh giá vai trò vô cùng to lớn của betulin trong vai trò của dược
chất chống bệnh sốt rét, chống viêm nhiễm và hơn nữa là nguồn nguyên liệu quý để
tạo ra biệt

dược

chống

bệnh

HIV

–

AIDS.

- Các nhà khoa học của Mỹ ở đại học Minnesota và Nga ở đại học Irkutsk đã phát
hiện ra cơ chế ức chế sự họat động của HIV và độc tính của nó đối với nhiều dòng tế
bào ung thư khác nhau. Theo đó, betulin có khả năng ức chế HIV thâm nhập vào tế bào
T bằng cách phong tỏa gp41 - một protein tối cần thiết của HIV giúp cho virus truyền
bệnh

vào

tế

bào lành.

- Ngoài ra, betulin có khả năng giết chết nhiều loại tế bào ung thư do kích thích cơ
chế phá hủy tế bào bệnh. Betulin được chuyển hóa thành acid betulinic là một hợp chất
 


 

6 

Tổng quan tài liệu

quý hiếm có khả năng ức chế khối u và ức chế HIV rất hiệu quả so với một số thuốc
khác hiện đang được dùng để điều trị các bệnh trên.Trong điều trị bệnh gan, betulinic
được sử dụng như một loại thuốc cần có nhằm bảo vệ tế bào gan bình thường khỏi bị

tổn thương bởi các tác nhân khác nhau. Cũng như vậy, các bệnh nhân được chỉ định áp
dụng liệu pháp hóa hay phóng xạ trị liệu được khuyến khích dùng thuốc chức betuline.
Các sản phẩm thức ăn chức năng chứa betuline có khả năng tăng cường hệ miễn dịch
cho cư dân sống trong môi trường ô nhiễm và kéo dài tuổi thọ trong môi trường bình
thường.
Hoàn ngọc đỏ (Pseuderanthemum bracteatum) có thể dùng để trị các bệnh viêm ruột cấp
mạn tính, thuộc thể hàn: đau bụng, quặn bụng, sôi bụng, đầy hơi, đi ngoài phân sống nát,
trĩ, đi ngoài ra máu. Ngoài ra còn có tác dụng cầm máu vết thương, lấy lá tươi, rửa sạch,
giã nát đắp và băng chặt vào chỗ vết thương chảy máu. Song song có thể dùng lá tươi giã
nát vắt lấy nước uống, hoặc sắc lá khô để uống khi bị chảy máu. Có thể dùng riêng hoàn
ngọc đỏ với liều 20 - 40g/ngày, sắc uống trị các bệnh đường ruột nói trên. Hoặc phối hợp
với một số vị thuốc khác, như hoàn ngọc đỏ 16g, nam mộc hương 12g, hậu phác 12g, trần
bì 10g, thương truật 10g, sắc uống, ngày một thang. Uống liền 3 tuần lễ [23].
 

 


7 

 

1.2.

Tổng quan tài liệu

HỢP CHẤT THỨ CẤP VÀ BETULIN

1.2.1. Giới thiệu sơ lược về hợp chất thứ cấp
Ở thực vật có những chất đóng vai trò quan trọng trong việc cấu trúc nên cơ thể,

những chất đó được gọi là những hợp chất sơ cấp. Gồm có các polysaccharide, đường,
protein và chất béo. Ngoài những chất đó ra, còn có những hợp chất khác có nồng độ ít
hơn gọi là các hợp chất thứ cấp, gồm có alkaloid, terpenoid, phenolic, steroid và
flavonoid. Các chất này rất đa dạng về cấu trúc và kích thước, và được tìm thấy trong rất
nhiều loài thực vật khác nhau, mỗi loài có một dẫn xuất khác nhau. Cho đến nay, người ta
đã tìm thấy gần 100.000 các hợp chất thứ cấp ở thực vật khác nhau, và hàng năm một số
lượng lớn các chất mới được phát hiện thêm. Nguồn gốc của các chất thứ cấp là các điểm
cuối cùng của quá trình biến dưỡng, với chức năng ít chuyên biệt (Harborne 1978,
Harborne & Tomas-Barberan 1991) [7].
Tại sao cây lại sản xuất những hợp chất này đến nay chưa rõ hết được. Trong
nhiều trường hợp, thực vật tạo ra các hợp chất thứ cấp để chống lại các nhân tố vô sinh và
hữu sinh tác động lên nó. Trong các trường hợp khác, hợp chất thứ cấp không có chức
năng thật sự và hiện diện như là kết quả của sự ngẫu nhiên trong quá trình phân kỳ tiến
hóa của các tính trạng không có tính chất rõ rệt cho sự tồn tại.
Lượng hợp chất thứ cấp được tạo ra thường rất nhỏ. Nhưng chúng có họat tính
sinh học rất mạnh ngay cả khi chúng được sản xuất thấp hơn 1% trọng lượng mô thực
vật. Do đó, những hợp chất này có khả năng gây độc đối với những loài ăn cỏ. Senecio
vulgaris là một ví dụ về loài cỏ gây độc. Hoa của nó có chứa các alkaloid senecionine và
seneciphylline và các N-oxide, các hợp chất này gây độc đối với 1 số loài động vật ăn cỏ.
Các hợp chất thứ cấp có thể được sản xuất trong các loại tế bào đặc biệt như tế bào
tuyến tiết, lông tơ biểu mô, v.v… nơi mà chúng được tiết ra có chức năng như các chất
xua đuổi hay dẫn dụ. Một trong những chức năng dễ nhận thấy nhất ở các chất thứ cấp đó
là có vai trò sinh hóa trong cơ chế bảo vệ cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh và xâm
hại.
 


8 

 

Tổng quan tài liệu

Nhiều hợp chất tự nhiên của thực vật đặc biệt quan trọng đối với con người do các ứng
dụng y học của chúng: 25% tất cả các loại thuốc của chúng ta lấy từ thực vật. Một số
trong chúng được sử dụng ở lượng lớn (đã có những thời điểm lượng quinine và quinidin
thương mại vượt mức 200,000 kg/năm) trong khi những hợp chất khác rất ít và có lượng
tiêu thụ thương mại toàn cầu khoảng vài kg. Ở trường hợp thứ hai, giá mỗi kilogram có
thể đến hàng triệu đô la, chẳng hạn như các loại thuốc chống ung thư như vincristin,
vinblastin và taxol. Các quá trình phân tách và tinh sạch những hợp chất này có thể rất
phức tạp và tốn thời gian, đặc biệt khi hợp chất chỉ có ở lượng rất nhỏ. Thỉnh thoảng hợp
chất thứ cấp không sử dụng như thuốc mà sử dụng như tiền chất ban đầu để sản xuất các
loại thuốc. Ví dụ như việc sử dụng saponin (triterpenoid glycoside như yamogenin từ
Dioscorea spp, khoai mỡ) dùng để tổng hợp các hợp chất giống progesterone như thuốc
ngừa thai, sử dụng các alkaloid thực vật như opiate (gồm cả heroine) và cocaine như
narcotic và cannabinoid từ cannabi như một chất giảm đau và giảm căng thẳng. Nhiều
hợp chất tự nhiên của thực vật có cấu trúc phức tạp mà việc tổng hợp hóa học chưa khả
thi về mặt kinh tế (Farnsworth 1988, Farnsworth & Soejarto 1991, Kinghorn & Balandrin
1993).
Để đáp ứng những nhu cầu đối với các hợp chất khác nhau, thực vật thỉnh thoảng
được thu thập trong tự nhiên hay được thuần và nuôi trồng. Tuy nhiên, việc nuôi trồng lại
phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, khí hậu và những điều kiện không kiểm soát được có
thể đe dọa chất lượng thuốc và nguyên liệu làm thuốc khi được sản xuất theo cách này.
Cũng vậy, việc sản xuất sản phẩm tự nhiên của thực vật trong các hệ thống này bị hạn
chế bởi sự tích trữ tự nhiên của các loài thực vật, mặc dù việc lai giống và chọn lọc thỉnh
thoảng cải thiện điều đó. Với nhiều lí do, do đó, những hệ thống sản xuất thay thế trong
những điều kiện kiểm soát nhất định đang là mục tiêu quan tâm.
Hình 2.Sơ đồ: Con đường sinh tổng hợp các sản phẩm chuyển hóa bậc hai ở tế bào thực
vật (Shutler, 1981) [9].

 


9 

 

Tổng quan tài liệu

Chlorophyll + CO2 + ánh sáng 
Quang h p 
Carbohydrat 

Chu trình pentose phosphat 

Phosphoenolpyruvat 

Acid shikimic 

Acid pyruvic 

Alkaloid 

Acid amin 
Acid 
tropic 

Acetyl CoA 

Acid amin 

Acid citric 

Alkaloid tropic 
Acid cinnamic 

Malonyl‐CoA 

Acid béo 

Flavonoid 

H p ch t 
phenylpropanoid 

Polyacetylen 

Polyketid

Lignin 

Ch t béo 
Mustard 

H p chât 
phenolic 

Acid mevalonic

 

Terpenoid 

Steroid 

Carotenoid 


 

10 

Tổng quan tài liệu

Mối quan hệ giữa hợp chất sơ cấp và thứ cấp được mô tả như hình dưới:

Hình 3. Mối quan hệ giữa các chất nhất cấp và chất thứ cấp ở thực vật (Dörnenburg H
and Knorr D (1996)) [5]

 


11 

 

Tổng quan tài liệu

1.2.2. Ứng dụng công nghệ tế bào trong thu nhận hợp chất thứ cấp
Nuôi cấy tế bào thực vật với qui mô lớn từ lâu đã được xem là một nguồn tiềm

năng trong việc sản xuất các hợp chất thứ cấp. Các mô tế bào nuôi cấy qui mô lớn được
xem là thích hợp và ổn định hơn so với lấy từ cây nguyên vẹn. Bởi vì khi trồng trọt, cây
phụ thuộc nhiều vào khí hậu, đất đai, cách canh tác… nên chất lượng không kiểm soát
được. Đặc biệt khi thương mại thì với đòi hỏi phải có số lượng nhiều và ổn định. Giá
thành các chất thứ cấp hiện nay là khá cao, ví dụ ajmalcine bán với giá 37.000USD/kg,
paclitaxel được bán với giá 200.000 USD/kg. Điều này cho thấy tiềm năng để nuôi cấy tế
bào sản xuất hợp chất thứ cấp là rất lớn (Verpoorte et al., 1998) [11]
Các phương pháp nhằm tăng cường sản lượng hoạt chất thứ cấp:
1.2.2.1. Tầm soát (screening) và chọn lọc (selection), tối ưu hóa môi trường nuôi cấy
(medium optimization)
Trong nhiều năm qua, có nhiều phương pháp khác nhau nhằm tăng cường sản
lượng hoạt chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật. Phương pháp đầu tiên phỏng theo
mô hình nuôi cấy vi sinh vật là tối ưu hóa môi trường nuôi cấy giống như sản xuất thuốc
kháng sinh vậy. Phương pháp này bao gồm việc tầm soát và chọn lọc các dòng tế bào có
khả năng sản xuất hoạt chất cao và tối ưu hóa môi trường nuôi cấy. Một vấn đề đối với
phương pháp này đó là các dòng tế bào có khả năng sản xuất hoạt chất cao thường không
ổn định (Ohta & Verpoorte 1992) [11]. Tuy nhiên, đối với một số loài thực vật, bằng kỹ
thuật tầm soát trên diện rộng (extensive screening) vẫn có thể chọn được những dòng tế
bào ổn định sản xuất lượng hoạt chất cao, chẳng hạn như trường hợp tế bào cây Coptis
japonica sản xuất berberine (Sato et al 1982, Verpoorte et al. 1991) [11].
Các hợp chất thứ cấp thường tích lũy trong quá trình nuôi cấy in vitro ở giai đoạn
cuối của chu trình tăng trưởng giai đoạn sự tăng trưởng chậm lại và các nguồn
carbohydrate và nitrogen đủ để chuyển sang con đường biến dưỡng thứ cấp. Sự tích lũy
này có thể được tăng cường hay ức chế bởi thành phần môi trường nuôi cấy, trong đó

 


12 

 

Tổng quan tài liệu

quan trọng là nồng độ của nguồn nitrogen vô cơ, phosphate và carbon tự nhiên, các chất
điều hòa sinh trưởng và giai đoạn nuôi cấy.
Tối ưu môi trường nuôi cấy bằng cách thay đổi các thành phần môi trường và số
lần cấy chuyền là một cách tương đối dễ thực hiện cũng cho hiệu quả đối với việc tăng
sản xuất hợp chất thứ cấp. Đối với nuôi cấy tế bào cây Tabernaemontana divaricata, khi
thay auxin 2,4-D bằng NAA trong môi trường nuôi cấy sau 5 lần cấy chuyền giúp làm
tăng được hàm lượng alkaloid. Tuy nhiên nếu cấy chuyền nhiều hơn nữa, hàm lượng
alkaloid sẽ giảm và ổn định sau 10 lần cấy chuyền (Sierra et al. 1992). Thông thường, với
phương pháp này người ta có thể làm tăng từ 10-20 lần sản lượng hoạt chất (Verpoorte et
al., 1999) [11]. Tuy nhiên có một điểm đáng lưu ý là đối với phương pháp này, để cho có
thể tăng cường sản lượng sau những lần cấy chuyền thì ngay từ ban đầu mẫu cấy phải tạo
được một ít các hợp chất mong muốn. Nếu không có sản phẩm tạo thành chẳng hạn như
morphine, hyoscyamine, và vinblastine thì cho dù cấy chuyền đến 20 lần cũng vẫn là
không có gì (Verpoorte et al., 1999) [11].
1.2.2.2. Biệt hóa tế bào
Do một số hợp chất không tạo thành bằng phương pháp trên nên những năm gần
đây nhiều phương pháp khác được áp dụng. Một trong số đó là phương pháp nuôi cấy các
tế bào biệt hóa. Theo lý thuyết, các hợp chất thứ cấp là một dạng của sự biệt hóa. Ở thực
vật, có mối liên hệ rất rõ ràng về biệt hóa tế bào và biến dưỡng hợp chất thứ cấp. Cấu trúc
lông rễ và hoa là những ví dụ rất điển hình về mối liên hệ này. Thông thường, các chồi và
rễ in vitro được tạo thành nhờ vào sự kết hợp các nồng độ auxin và/hoặc cytokinin khác
nhau. Kết quả là mẫu nuôi cấy có thể tạo được cùng loại hợp chất thứ cấp giống cây
nguyên vẹn và nếu đặt trong môi trường tối ưu thì có thể cho hàm lượng cao hơn.
Một thành công trong phương pháp này mà được nhiều người chú ý đó là chuyển
gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes (Doran 1997). Loài vi
khuẩn sống trong đất này có khả năng xâm nhiễm vào tế bào thực vật, chuyển gen tạo

auxin vào tế bào thực vật kích thích sự tạo lông rễ (hairy roots) (Hình 4).
 


13 

 

Tổng quan tài liệu

Hình 4. Lông rễ được tạo thành trong nuôi cấy rễ cây Atropa belladonna (Yun et al.
1992)
Ưu điểm của lông rễ khi so sánh với rễ bình thường là lông rễ có thể tăng trưởng
trong môi trường mà không cần dùng đến hormone. Lông rễ cũng tạo ra các hợp chất thứ
cấp tương tự cây mẹ. Một ví dụ cho thành công này về thu nhận tropane alkaloids sản
lượng cao thông qua nuôi cấy rễ và lông rễ mà không cần nuôi cấy huyền phù tế bào
(Oksman-Caldentey & Arroo 1999). Điều lý thú nữa là khi sử dụng A. Rhizogenes, ngoài
tạo lông rễ còn dùng để chuyển một gen mới vào cho tế bào thực vật. Như trong trường
hợp lông rễ cây Atropa belladonna tạo thành còn có enzyme chuyển hyoscyamine thành
scopolamine (Yun et al. 1992, Hashimoto et al. 1993). Một điểm khó khăn trong phương
pháp này đó là khó nuôi cấy các cơ quan biệt hóa ở quy mô lớn. Ví dụ như để nuôi cấy
lông rễ ở quy mô lớn phải cần dùng đến bioreactor, thường gặp vấn đề nhiễm và giá
thành cao.
Sự biệt hóa này có thể làm huyền phù tế bào kết thành cụm và phân hóa thành rễ
bất định, phôi và chồi bất định. Đây sẽ là nguồn nguyên liệu cho chuyển gen. Các rễ và
chồi được chuyển gen có thể tạo ra từ rễ và thân của cây hai lá mầm bị làm vết thương
với vi khuẩn A. tumefaciens.
Mặc dù các phương pháp trên được sử dụng rộng rãi trên nhiều đối tượng thực vật
nhưng hiện nay cũng còn có nhiều vấn đề cần giải quyết. Việc tầm soát (screening)

 


14 

 

Tổng quan tài liệu

không phải luôn luôn là thành công, trong khi đó các dòng tế bào được chọn lọc thường
không ổn định khi không còn yếu tố chọn lọc nữa. Khi thay đổi thành phần môi trường và
điều kiện nuôi cấy, năng suất không luôn luôn tăng đáng kể mặc dù đã sử dụng các dòng
tế bào biệt hóa để cải thiện, và một điều nữa là các mô đã biệt hóa thì khó nuôi cấy ở qui
mô lớn.
1.2.2. 3. Cố định tế bào (Immobilized cells)
Phương pháp cố định tế bào giúp cho các tế bào tiếp xúc với nhau tạo thành khối
tế bào lớn hơn. Đối với một số trường hợp nuôi cấy tế bào thực vật, phương pháp này
giúp làm tăng sản lượng hợp chất, có lẽ nhờ một số lượng nhất định các tế bào biệt hóa.
Cố định tế bào thường được dùng bằng alginate, trong một hộp xốp PUR, hoặc cố định
“tự nhiên” bằng cách cho tế bào phát triển thành cụm (Hulst & Tramper 1989,
Doernenburg & Knorr 1995)
1.2.2. 4. Gợi kích thích (Elicitation)
Các con đường biến dưỡng hợp chất thứ cấp có thể được tăng cường khi tế bào
thực vật được đặt trong môi trường nuôi cấy có các stress vô sinh và hữu sinh, ví dụ như
thiếu các chất dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy khắc nghiệt hoặc bổ sung các elicitor có
nguồn gốc từ dịch chiết vi sinh vật. Các elicitor là những hợp chất có khả năng cảm ứng
con đường đáp ứng chống lại các yếu tố xâm nhiễm. Và được sản xuất các hợp chất đặc
biệt như phytoalexin. Callus là một loại mô được tạo ra từ mô bị tổn thương, chúng
thường đáp ứng lại các kích thích bên ngoài bằng các phản ứng sinh hóa phòng vệ.
Những tế như vậy dễ dàng tạo ra phytoalexin. Phytoalexin đóng vai trò như chất truyền

tín hiện để cảm ứng hàng loạt các con đường biến dưỡng tổng hợp các hợp chất thứ cấp
khác. Tuy nhiên việc cảm ứng này bị hạn chế ở một số con đường biến dưỡng. Nhiều hợp
chất được quan tâm không nhạy cảm với cảm ứng bằng elicitor như quinine, morphine
and vinblastine.
Nói cách khác, một số hợp chất bị tác động bởi elicitor như anthraquinone trong
nuôi cấy tế bào cây Cinchona (Wijnsma et al. 1985), và sanguinarine trong nuôi cấy tế
 


15 

 

Tổng quan tài liệu

bào cây Eschscholtzia californica (Schumacher et al. 1987, Collinge & Brodelius 1989,
Brodelius et al. 1989) và cây anh túc (Eilert et al. 1985, Kurz et al. 1987).
Những hợp chất được tạo ra thông qua elicitor có hàm lượng cao (thường từ 310% trọng lượng khô). Các elicitor có thể là các peptide, oligosaccharides, glycopeptides
hoặc lipids (Ebel & Cosio 1994, Ebel 1998, Hahn et al. 1993). Những elicitor vô sinh
như các ion kim loại nặng. Trong số các elicitor được biết đến nhiều có jasmonate (và
methylester của nó). Jasmonate từng được biết đến trong việc làm tăng hàm lượng taxol
trong nuôi cấy tế bào thông đỏ (Mirjalli & Linden 1996).
Một vấn đề đối với việc sử dụng elicitor đó là chỉ một số hợp chất là có thể được
cảm ứng, còn một số hợp chất mong muốn khác thì không.
1.2.2. 5. Công nghệ về con đường biến dưỡng
Trong phần lớn các trường hợp được đề cập trên thì không có trường hợp nào tạo
ra được dòng tế bào cho hàm lượng hợp chất cao và ổn định để có thể dùng trong thương
mại và sản xuất. Do đó, những phương pháp mới vẫn tiếp tục nghiên cứu. Công nghệ về
con đường biến dưỡng hợp chất thứ cấp là một trong phương pháp mới trong những năm
gần đây (Verpoorte et al. 1998, Verpoorte & Alfermann 1999) [11].

Những năm qua, với hệ thống chuyển gen nhờ Agrobacterium và súng bắn gen,
người ta đã chuyển được nhiều gen mới vào thực vật. Bên cạnh đó, nhiều gen thực vật
cũng được dòng hóa, cho phép nghiên cứu về con đường biến dưỡng giúp tăng năng suất
cao. Công nghệ về con đường biến dưỡng được thực hiện theo nhiều cách. Cách thu71
nhất là làm tăng dòng cacbon hướng đến sản phẩm tạo thành. Cách thứ hai là chặn con
đường cạnh tranh với sản phẩm mong muốn. Cách thứ ba là chặn con đường dị hóa
(catabolism).
Nếu hoàn toàn tổng hợp hóa học các chất thứ cấp là điều không thể thực hiện được
và cũng không kinh tế. Chỉ có cách kết hợp các phương pháp hóa học và sinh học để sử
dụng tế bào hoàn thành các giai đoạn khó tổng hợp. Nói một cách khác, các enzyme được
phân lập từ tế bào nuôi cấy sẽ được đưa vào môi trường không có tế bào.