PHưƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH vật một số vấn đề THưỜNG gặp TRONG QUÁ TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH vật

PHƢƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT &
MỘT SỐ VẤN ĐỀ THƢỜNG GẶP TRONG QUÁ
TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH VẬT


Nội dung

PHẦN 1: Phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật
PHẦN 2: Các vấn đề thường gặp trong quá trình
phân tích VSV


PHẦN 1
PHƢƠNG PHÁP KIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT


Cấy mẫu

Đổ 12 – 15 ml PCA (Plate count agar) đã
đƣợc làm nguội 45 – 47oC. Trộn đều dịch mẫu với
môi trƣờng

Đếm tất cả các đĩa có số KL nằm
trong khoảng
15 – 300 CFU
(Đọc thủ công hoặc đọc bằng máy đếm khuẩn lạc)
4

Ngày thứ 3

Lật ngƣợc đĩa và Ủ ở 30±1oC/72±3h

Đọc & báo
cáo

Chuyển 1ml mẫu ở mỗi độ pha loãng vào 2 đĩa
petri vô trùng

Ngày thứ 1

10 gram mẫu + 90 gram SPW. Đồng nhất mẫu
trong máy dập mẫu trong 30s

Chuẩn bị mẫu

TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ
ISO 4833: 2003 / TCVN 4884:2005


TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ
ISO 4833: 2003 / TCVN 4884:2005



V ( n1  0,1n 2 ) d

∑ C: tổng số khuẩn lạc đếm được ở tất cả các đĩa PCA
V: Số ml dịch mẫu được cấy chuyển.(1ml)
d: nồng độ pha loãng đầu tiên cấy vào đĩa.
n1 : số đĩa có 10 -300 khuẩn lạc ở nồng độ pha loãng đầu
n2 : số đĩa có 10 - 300 khuẩn lạc ở nồng độ pha loãng sau

5

Tính toán & báo cáo kết quả

N 

C


ĐỊNH LƢỢNG COLIFORMS
ISO 4832: 2006 / TCVN 6848:2007

Đổ 12 – 15 ml VRB (Violet red bile agar) đã
đƣợc làm nguội 45 – 470C. Trộn đều dịch mẫu với
môi trƣờng, để yên chờ đông đặc
Đổ thêm 5ml

VRB đã đƣợc làm nguội 45 – 470C.

Ngày thứ 1

Chuyển 1ml mẫu ở mỗi độ pha loãng vào 2 đĩa
petri vô trùng

Cấy mẫu

Chuẩn bị mẫu

10 gram mẫu + 90 gram SPW (Saline peptone water).

Đồng nhất mẫu trong máy dập mẫu trong 30s

Lật ngƣợc đĩa và Ủ ở 37±10C trong 24±2h
(Sữa và các sản phẩm từ sữa ủ ở 300C/24h ± 3h)
6

Nuôi Ủ

Để yên chờ đông đặc


a

b
A

7

.C.F

b là số khuẩn lạc cho kết quả dƣơng tính
A là số khuẩn lạc khẳng định (thƣờng là 5)
C là số khuẩn lạc nghi ngờ trên đĩa
F: là hệ số pha loãng

Ngày thứ 3

Phản ứng dƣơng tính khi có khí trong ống
Durham

Khẳng định khuẩn lạc nghi
ngờ

Chọn 5KL cấy sang môi trƣờng BGBL
(Brilliant green bile lactose), ủ 300C/37±10C
trong 24±2h

Đọc & báo cáo

Chọn đĩa 10 -150 để đếm. Khuẩn lạc đặc
trƣng: màu đỏ tía, xung quanh khuẩn lạc có
vùng kết tủa đỏ và có đƣờng kính bằng 0,5
mm hoặc lớn hơn.

Ngày thứ 2

ĐỊNH LƢỢNG COLIFORMS
ISO 4832: 2006 / TCVN 6848:2007


Cấy mẫu

Đổ 12 – 15 ml TBX (Tryptone-bile-glucuronic
medium) đã đƣợc làm nguội 45 – 47oC. Trộn đều
dịch mẫu với môi trƣờng

Chọn đĩa có 15 -150 để đếm.
Khuẩn lạc đặc trƣng màu xanh dƣơng
8

Ngày thứ 2
hoặc 3

- Lật ngƣợc các đĩa, ủ ở nhiệt độ 440C/21h ± 3h.
- Nếu nghi ngờ vi khuẩn bị tổn thƣơng, ủ đĩa ở
370C/4h sau đó chuyển sang ủ ở 440C/18-24h.

Đọc & báo
cáo

Chuyển 1ml mẫu ở mỗi độ pha loãng vào 2 đĩa
petri vô trùng

Ngày thứ 1

10 gram mẫu + 90 gram SPW. Đồng nhất mẫu
trong máy dập mẫu trong 30s

Chuẩn bị mẫu

ĐỊNH LƢỢNG E.COLI
ISO 16649-2:2001 / TCVN 7924-2:2008


ĐỊNH LƢỢNG E.COLI
ISO 16649-2:2001 / TCVN 7924-2:2008



V (n1  0,1n2 )d

∑C: tổng số khuẩn lạc đếm được ở
tất cả các đĩa PCA
V:
Số ml dịch mẫu được cấy
chuyển.(1ml)
d: nồng độ pha loãng đầu tiên cấy
vào đĩa.
n1 : số đĩa có 15 -150 khuẩn lạc ở
nồng độ pha loãng đầu
n2 : số đĩa có 15 -150 khuẩn lạc ở
nồng độ pha loãng sau

9

Tính toán kết quả & báo báo

N

C


Cấy chuyển 10ml mẫu ở độ pha loãng
10-1 vào 3 ống chứa10ml LSBII
và cấy 1ml ở 10-1 10-2 10-3
vào 3 ống chứa10ml LSBI

Ngày thứ 1

Cân 10 gram mẫu + 90 gram SPW. Đồng

nhất mẫu trong máy dập mẫu trong 30s

Cấy mẫu

Chuẩn bị mẫu

ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG E.COLI GIẢ ĐỊNH
ISO 7251:2005 / TCVN 6846:2007

Ủ mẫu

Ủ các ống 37±10C/24 - 48h

10


E.coli có Indole (+) (Xuất hiện màu đỏ sau khi
thêm thuốc thử Kovac’s

11

Báo cáo không phát hiện (ND), nếu 1 trong
các giai đoạn trên cho KQ âm tính.
Báo cáo dƣơng tính (POS) nếu Indole (+)
Báo cáo định lƣợng = bảng MPN

Khẳng định
Kết quả

Cấy chuyển các ống EC (+) sang môi trƣờng

Tryptone broth. Ủ 440C/24h

Ngày thứ 4- 6

Cấy chuyển các ống LSB (+) sang môi
trƣờng EC broth. Ủ 440C/24-48h

Ngày thứ 3- 4 Ngày thứ 2 - 3

ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG E.COLI GIẢ ĐỊNH
ISO 7251:2005 / TCVN 6846:2007


ĐỊNH LƢỢNG STAPHYLOCOCCI DƢƠNG TÍNH COAGULASE
ISO 6888-1:1999 / TCVN 4830-2:2005

Cấy mẫu
Đọc kết quả

Ủ mẫu

Ngày thứ 1
Ngày thứ 2-3

Chuyển 0.1ml mẫu ở mỗi độ pha loãng
vào 2 đĩa BP (BAIRD PARKER)

Chuẩn bị
mẫu

10 gram mẫu + 90 gram SPW. Đồng
nhất mẫu trong máy dập mẫu trong 30s

Trải bằng que trải vô trùng & ủ ở nhiệt
độ 37± 10C/24-48h
12

Đếm các đĩa có số khuẩn lạc ít hơn
300, khuẩn lạc điển hình của
Staphylococcus dƣơng tính coagulase
có mầu đen hoặc xám, bóng, lồi có
d=1-2,5mm, đƣợc bao quanh bởi 1
vòng trong và/hoặc 1 vòng đục




V ( n 1  0 ,1 n

∑C: tổng số khuẩn lạc có phản ứng coagulase +/các đĩa
V: Số ml dịch mẫu được cấy /đĩa.(0,1ml)
d: nồng độ pha loãng đầu tiên cấy vào đĩa.
n1 : số đĩa được chọn ở nồng độ pha loãng đầu
n2 : số đĩa được chọn ở nồng độ pha loãng sau
13

2

)d
Kết quả



C
Ngày thứ 5

N

Khẳng định

Lấy 0,1ml dịch cấy từ BHI cho vào 0,3ml
huyết tƣơng thỏ, ủ ở 37oC± 1oC/6-24h .
Coaglulase (+) nếu sự kết dính chiếm 3/4
thể tích ban đầu.

Ngày thứ 5

Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang
môi trƣờng BHI (Brain Heart Infusion
broth). ủ ở 37o C± 1oC /24h ± 2h

Ngày thứ 4

ĐỊNH LƢỢNG STAPHYLOCOCCI DƢƠNG TÍNH COAGULASE
ISO 6888-1:1999 / TCVN 4830-2:2005


ĐỊNH LƢỢNG CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
ISO 7937: 2004 / TCVN 4991:2005

lớp đầu tiên đã đông đặc
18

Lật ngƣợc các đĩa, ủ ở nhiệt độ 370C ±
1 /20±2h trong điều kiện kỵ khí.
(Tủ kỵ khí hoặc dùng Anaerocult jar
kết hợp với Anaerocult A)

Đổ môi
trường

10 - 15 mL môi trƣờng

Ủ mẫu

TSC
(Tryptose sulfite cycloserine )
-Thêm 10 mL TSC lên bề mặt đĩa khi
-Đổ

Ngày thứ 1

Chuyển 1ml mẫu ở mỗi độ pha loãng
vào 2 đĩa petri vô trùng

Cấy mẫu

Chuẩn bị
mẫu

10 gram mẫu + 90 gram SPW. Đồng
nhất mẫu trong máy dập mẫu trong 30s


1. Khi ống Durham chứa 1/4 khí và có
kết tủa đen tạo thành : dƣơng tính 
là C. perfringens
2. Khi ống LS sau ủ có kết tủa đen,
nhƣng gas có ít hơn ¼ ống dulham 
Khẳng định lại

Khẳng định bằng sinh hoá
Đọc kết quả

19

Ngày thứ 3

Chuyển nhanh 5 giọt từ môi trƣờng FTB
vào môi trƣờng Lactose suphite
bằng cách dùng pipet tiệt trùng. Ủ ở điều
kiện hiếu khí ở 46±0,500C/18-24h

Ngày thứ 4

Chọn đĩa ít hơn 150KL, đếm tất cả các
khuẩn lạc có màu đen. Chọn 5 khuẩn lạc
nghi ngờ
cấy sang ống Fluid
thioglycollate broth. Ủ dƣới điều kiện

kỵ khí ở 370C/18-24h

Ngày thứ 2

ĐỊNH LƢỢNG CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
ISO 7937: 2004 / TCVN 4991:2005


1. Khi ống Durham chứa 1/4 khí và có
kết tủa đen tạo thành : dƣơng tính 
là C. perfringens
2. Không thoả mãn điều kiện 1: âm tính
 không phải là C. perfringens

20

C

b

A

.a.F

b
A
a
F

là số khuẩn lạc cho kết quả dương tính

là số khuẩn lạc khẳng định (thường là 5)
là số khuẩn lạc nghi ngờ trên đĩa
là hệ số pha loãng

Khẳng định lại
bằng sinh hoá

ở 460C±0,50C/18-24h

Đọc kết quả

Ủ ở điều kiện hiếu khí

Ngày thứ 6

Chuyển nhanh 5 giọt dịch vào môi
trƣờng Lactose suphite mới bằng
cách dùng pipet tiệt trùng.

Ngày thứ 5

ĐỊNH LƢỢNG CLOSTRIDIUM PERFRINGENS
ISO 7937: 2004 / TCVN 4991:2005


Cấy mẫu
Đọc kết quả

Ủ mẫu

Ngày thứ 1

Chuyển 0.1ml mẫu ở mỗi độ pha loãng
vào 2 đĩa DRBC (Dichloran rose bengal
chloramphenicol)

Ngày thứ 5

10 gram mẫu + 90 gram Peptone
water 0.1%. Đồng nhất mẫu trong
máy dập mẫu trong 30s

Chuẩn bị
mẫu

ĐỊNH LƢỢNG NẤM MEN & NẤM MỐC
ISO 21527-1:2008 / TCVN 8275-1:2010

Trải bằng que trải vô trùng & ủ ở nhiệt
độ 25± 10C/3-5 ngày
23

Đếm các đĩa có số khuẩn lạc ít hơn
150, đếm và tính riêng số khuẩn lạc
nấm men, nấm mốc trên tất cả các đĩa
cấy


Cấy mẫu
Ủ mẫu

Đọc kết quả

glycerol agar)

Ngày thứ 1

Chuyển 0.1ml mẫu ở mỗi độ pha loãng
vào 2 đĩa DG18 (Dichloran 18 %

Ngày thứ 5

10 gram mẫu + 90 gram Peptone
water 0.1%. Đồng nhất mẫu trong
máy dập mẫu trong 30s

Chuẩn bị
mẫu

ĐỊNH LƢỢNG NẤM MEN & NẤM MỐC
ISO 21527-1:2008 / TCVN 8275-1:2010

Trải bằng que trải vô trùng & ủ ở nhiệt
độ 25± 10C/3-5 ngày
24

Đếm các đĩa có số khuẩn lạc ít hơn
150, đếm và tính riêng số khuẩn lạc
nấm men, nấm mốc trên tất cả các đĩa
cấy

ĐỊNH TÍNH SALMONELLA SPP.
ISO 6579:2002 / TCVN 4829:2005
Cân 25g mẫu cho vào túi PE vô trùng, thêm 225 mL

BPW (Buffer peptone water). Đồng nhất mẫu

cacao (hơn 20%): thêm vào BPW 50g/L Casein
(không sử dụng casein acid) hoặc 100g/L Skim
milk powder (bột sữa gầy) sau khoảng 2h ủ hoặc
0.018g Brilliant Green nếu sản phẩm nhiễm vi
khuẩn Gram dƣơng
Đối với những thực phẩm chua (acid) và chứa
thành phần gây chua: bảo đảm rằng pH không nhỏ
hơn 4,5 trong suốt giai đoạn tiền tăng sinh.

Ngày thứ 1

Đối với mẫu sản phẩm cacao hoặc sản phẩm chứa

Chuẩn bị mẫu & Tiền tăng sinh

trong 30giây. Ủ ở 37±10C/18h±2h


ĐỊNH TÍNH SALMONELLA SPP.
ISO 6579:2002 / TCVN 4829:2005

Trộn đều dịch mẫu sau khi tiền tăng sinh,
chuyển 0,1mL sang 10mL

RV (Rappaport

Nhiệt độ ủ rất quan trọng để tăng sinh tối ƣu.
Ủ ở 41,5oC ±1oC/24h±3h cho RV
Ủ ở 37oC±1oC/24h±3h cho MKTTn

Tăng sinh chọn lọc

Đồng thời cấy 1mL sang ống 10mL MKTTn
(Muller-Kauffmann Tetrathionate-Novobiocin)

Ngày thứ 2

Vassiliadis broth).


Sau khi tăng sinh, từ RV và MKTTn dùng
que cấy vòng, cấy ria dịch mẫu sang bề mặt môi

XLD (Xylose lysine deoxycholate agar)
BPLS (Brilliant green phenol red lactose

trƣờng
BPLS

và
sucrose agar)
Lật ngƣợc các đĩa và ủ ở 37±10C/24h±3h

Khuẩn lạc Salmonella đặc trƣng có tâm
đen, hơi nhuốm đỏ do sự thay đổi chất chỉ thị
màu trong môi trƣờng. Vùng môi trƣờng bao
quanh khuẩn lạc có màu đỏ tía (vùng này rộng
khi các khuẩn lạc mọc dày).
BPLS

BPLS:

Khuẩn lạc đặc trƣng của Salmonella
có màu hồng, môi trƣờng xung quanh có màu
đỏ.

Ngày thứ 4

XLD:

Phân lập & xác định khuẩn lạc nghi ngờ

XLD

Ngày thứ 3

ĐỊNH TÍNH SALMONELLA SPP.
ISO 6579:2002 / TCVN 4829:2005


Ngày thứ 4

Cấy làm thuần

Khẳng định sinh hoá & kháng
huyết thanh

XLD

Cấy các khuẩn lạc nghi ngờ từ mỗi đĩa môi
trƣờng XLD và BPLS sang môi trƣờng thạch
không chọn lọc TSA. Ủ ở 37 ± 10C/24h±3h

Ngày thứ 5

ĐỊNH TÍNH SALMONELLA SPP.
ISO 6579:2002 / TCVN 4829:2005

BPLS

Lấy khuẩn lạc thuần từ TSA thực hiện các phản
ứng sinh hoá sau: Indole, URE, VP, TSI,

ONPG, LDC
Lấy khuẩn lạc thuần từ TSA thực hiện các phản
ứng ngƣng kết huyết thanh: Tự ngƣng kết,
ngƣng kết kháng nguyên thân O, ngƣng kết
kháng nguyên màng nhầy Vi, ngƣng kết kháng
nguyên tiêm mao H


6
ứ
ht

y
à
g
N

Xác định kháng nguyên H: Từ khuẩn lạc trên TSA cấy vào

motility

agar và ủ ở 37o ± 1oC/24h±3h  Tiến hành thí nghiệm ngưng kết

Đọc kết quả & báo cáo kết quả

ĐỊNH TÍNH SALMONELLA SPP.
ISO 6579:2002 / TCVN 4829:2005


Tăng sinh 1
Tăng sinh 2

Từ dịch ủ của tăng sinh lần 1 và lần 2, thực
hiện cấy phân lập trên môi trƣờng TCBS
(Thiosulphate citrate bile salt sucrose agar)
và TSAT (Tryptone sucrose tetrazolium
agar). Ủ ở 37 ± 10C/24±3h

Phân lập

Lấy 1mL dịch của tăng sinh chọn lọc
lần 1 vào ống nghiệm chứa 10 mL

ASPW. Ủ ở 41,50C ±10C/18h ± 1h.

Ngày thứ 2

Ủ 37oC/6h (sản phẩm đông lạnh) hoặc
41,5oC/6h (mẫu tƣơi, khô, ƣớp muối)

Ngày thứ 2& 3

ASPW (Alkaline
saline peptone water)
Cân 25g mẫu +225g

Ngày thứ 1

ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERAE VÀ V.PARAHAEMOLYTICUS
ISO 21872-1:2007 / TCVN 7905-1:2008


Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi
trƣờng không chọn lọc có chứa 1% NaCl

(Saline nutrient agar) hoặc TSA
1%NaCl). Lật ngƣợc đĩa, ủ ở 37o C± 1oC
SNA 1%

/24h ± 3h

Nhận diện khuẩn lạc
Làm thuần

1. Khuẩn lạc Vibrio cholera điển hình trên
TCBS có đặc điểm:nhẵn trơn, màu
vàng (sucrosec dƣơng tính), đƣờng
kính 2-3mm
2. Khuẩn lạc Vibrio parahaemolytycus
điển hình trên TCBS có đặc điểm:
nhẵn trơn, màu xanh (sucrose âm tính),
tròn, đƣờng kính 2-3mm.
3. Khuẩn lạc Vibrio cholera & Vibrio
parahaemolytycus điển hình trên TSAT
có đặc điểm:nhẵn trơn, màu đỏ.

Ngày thứ 3 & 4

ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERAE VÀ V.PARAHAEMOLYTICUS
ISO 21872-1:2007 / TCVN 7905-1:2008