các phương pháp phân tích vi sinh vật

CÁC PHƯƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH VI SINH VẬT
1. Phương pháp nuôi cấy
2. Phương pháp trên cơ sở kỹ thuật sinh học
phân tử
3. Phương pháp trên cơ sở miễn dòch học


PHÂN TÍCH VSV BẰNG
PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY
• Phương pháp đổ đóa (pour plate)
• Phương pháp cấy bề mặt (spread)
• Phương pháp MPN (most probable number)
• Phương pháp nuôi cấy kỵ khí


PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA
• Mục đích sử dụng trong đònh lượng VSV
• Kỹ thuật
– Môi trường agar được đun chảy và làm nguội đến
45±1oC
– Cấy tối đa 1ml dòch mẫu hay dòch pha loãng vào đóa
petri trống vô trùng (Þ 9 – 10cm)
– Đổ 10-15ml môi trường vào đóa
– Lắc ngược và xuôi chiều kim đồng hồ
– Đặt đóa lên mặt phẳng ngang cho môi trường đông đặc
– Ủõ ngược đóa, trong điều kiện và thời gian xác đònh


PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA
• Ưu điểm

– Cấy được thể tích mẫu lớn (1ml)
– Xác đònh được các VSV cần dinh dưỡng tiếp xác từ
nhiều phía
– Cho phép đếm được mật độ VSV cao, khoảng 150 300 khuẩn lạc
Nhược điểm

- Không đònh lượng được những VSV quá nhạy nhiệt
- Không xác đònh được hình dạng khuẩn lạc nhất đònh
- Khó làm thuần một dòng VSV


PHƯƠNG PHÁP CẤY BỀ MẶT
• Môi trường phải được chuẩn bò trên đóa
trước 1-2 ngày để khô mặt
• Phương pháp
– Cấy 0,1 – 0,3ml vào đóa môi trường (đóa Þ 90mm)
Cấy tối đa 1ml vào đóa môi trường (đóa Þ 140mm)
– Trải đều mẫu lên bề mặt môi trường bằng que
trang tam giác
– Để ở nhiệt độ phòng 15-20 phút cho khô mặt
– Lật ngược đóa để ủ


PHƯƠNG PHÁP CẤY BỀ MẶT
• Ưu điểm
– Đònh lượng được các VSV nhạy nhiệt
– Có thể nhận dạng đựơc dạng khuẩn lạc đặc trưng
– Dễ dàng làm thuần chủng VSV mục tiêu
Nhược điểm

- Chỉ cấy đựơc thể tích mẫu nhỏ (nếu dùng đóa
thông thường Þ90-100mm)
- Chỉ cho phép đếm được số lượng khuẩn lạc thấp


PHƯƠNG PHÁP MPN
(MOST PROBABLE NUMBER)

• Khái niệm

– Còn gọi là phương pháp pha loãng tới hạn
– Giá trò kết quả nhận được là số lượng VSV mục tiêu có
xác suất cao nhất theo nguyên tắc thống kê
– Giá trò MPN là giá trò có xác xuất cao nhất

• Hệ thống MPN
– Gồm 3 hoặc 5 lần lặp lại ở mỗi nồng độ
– Lặp lại ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp
– Chọn các độ pha loãng sao cho trong hệ thống có cả ống
dương tính và ống âm tính
– Kết quả MPN có độ chính xác cao nhất khi số ống dương
tính và âm tính trong hệ thống tương đương nhau


PHƯƠNG PHÁP MPN

Chia theo số lượng ống trong hệ thống

- Hệ thống 9 ống: mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần
- Hệ thống 15 ống: mỗi độ pha loãng lặp lại 5 lần

Nguyên tắc
- Dựa trên kết quả đònh tính VSV mục tiêu ở các lần lặp lại
trên cùng một độ pha loãng và ở các độ pha loãng khác nhau
- Vi sinh vật mục tiêu phải có những biểu hiện đặc trưng trên
môi trường nuôi cấy lỏng như
Sự tạo hơi: Coliforms, E. coli …
Sự đổi màu: S. aureus

Đặc điểm
Cho phép đònh lượng được mật độ VSV thấp trong thể tích mẫu lớn


HỆ THỐNG MPN
Hệ thống 15 ống

• Hệ thống 9 ống

10ml môi trường
nồng độ thường
(đơn)


HỆ THỐNG MPN
10ml môi trường
nồng độ đôi

10ml môi trường
nồng độ đơn
(thường)

ÑÒNH LÖÔÏNG F. COLIFORM BAÈNG PP MPN
1ml

1.1

1.2 1.3

1.4

1.5

2.1

2.2 2.3

2.4

2.5

3.1 3.2 3.3

3.4

3.5

10-1
1ml

10-2

1ml

10-3

10ml LSB


ÑÒNH LÖÔÏNG F. COLIFORM BAÈNG PP MPN(tt)
1.1

1.2 1.3

1.4

1.5
1.1

10ml EC

1.2

1.5

Endo/EMB

2.2 2.3
2.2

3.3

1.1
Indol
Keát quaû 2,0,0  = 4,5 MPN/g

1.2

2,0,0 4,5
MPN/g


Công thức tính chỉ số MPN
MPN / g =

∑t m
j

j

∑g
×∑
(t

j
j

−g j ) ×m j

• Trong đó:
– ∑ gj : số lượng ống dương tính trong dãy dã chọn
– ∑ tjmj :Khối lượng mẫu trong dãy đã chọn

– ∑ (tj-gj)mj Khối lượng mẫu trong tất cả các mẫu
âm tính.


GIỚI HẠN TIN CẬY

Trong đó:

∑ gj : số lượng ống dương tính trong dãy dã chọn
∑ tjmj :Khối lượng mẫu trong dãy đã chọn
∑ (tj-gj)mj Khối lượng mẫu trong tất cả các mẫu âm tính.
t: Số ống trong hệ thống


CHỈ SỐ MPN CƠ BẢN
• Là chỉ số tra được từ bảng kết quả MPN có số
lượng mẫu trong từng dãy lặp lại như sau:
1g hoặc 1ml mẫu
• - Dãy 1:
0,1g hoặc 0,1ml
• - Dãy 2:
0,01g hoặc 0,01ml
• - Dãy 3


CÔNG THỨC CHUYỂN ĐỔI
KẾT QUẢ MPN
• Cs =

M x F/V0 x Vs

Cs: là khả năng lớn nhất của vi sinh vật có trong
thể tích Vs
M : chỉ số MPN tra từ bảng đối với độ pha lỗng cơ
bản V0
F : nghịch đảo hệ số pha lỗng tương ứng với độ
pha lỗng thấp nhất của dãy
Vs: Thể tích chuẩn được chọn để biểu thị mật độ vi
sinh vật
• Nếu tính kết quả là MPN/g thì Vs = 1


PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC
• Kích thước lổ lọc 0,47µm hay 0,22µm
• Đường kính và hình dạng màng lọc phụ thực
vào đường kính phểu lọc
• Đường kính màng thường là 45mm


THIEÁT BÒ LOÏC NHIEÀU PHEÅU
(MULTIFOLDER)


CÁC BỘ PHẬN CỦA THIẾT BỊ LỌC VSV


PHƯƠNG PHÁP LỌC VSV
• Phểu lọc, giá đở màng lọc phải được vô
trùng sau mỗi lần lọc
• Mật độ VSV trong dòch lọc thích hợp:

<150 khuẩn lạc/màng
• Thể tích dòch lọc trong 1 lần: 50 -100ml
• Nếu thể tích dòch lọc nhỏ hơn thì phải pha
loãng bằng dd pha loãng hay nước cất vô
trùng


PHƯƠNG PHÁP MÀNG LỌC
• Ưu điểm
– Xác đònh được mật độ VSV cụ thể trong một thể
tích mẫu lớn: 10ml, 100ml …
Nhược điểm
- Không thích hợp cho việc phân tích các mẫu
thực phẩm rắn


KHUẨN LẠC VSV TRÊN MÀNG
LỌC

1A

1B

1C

1D

E. coli trên môi trường ID

2A

2C
.
Coliforms

2B

2C
trên môi trường ID


PHƯƠNG PHÁP MÀNG
PETRI-FILM
• Cải biên từ phương pháp đếm khuẩn lạc
trên đóa
• Thích hợp cho việc phân tích mẫu tại hiện
trường
• Không phải bảo quản hay vận chuyển mẫu
Nhược điểm
- Chỉ áp dụng hạn chế ở một số chỉ tiêu
dể nuôi cấy
- Chỉ cấy được thể tích mẫu nhỏ


PHƯƠNG PHÁP ĐĨA PETRI FILM

Đặt mẫu lên màng Petrifilm

Dàn đều mẫu trên màng

Ủ Petrifilm, đếm trực tiếp hoặc phân lập


Xanh: E. coli
Ñoû: Coliforms