Tài liệu Phương Pháp Phân Tích Vi Sinh Vật Trong Nước potx

Chương 5

PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT TRONG NƯỚC
VÀ THỰC PHẨM
1. PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU THỰC PHẨM
1.1 Kế hoạch lấy mẫu
Mật độ các vi sinh vật trong thực phẩm được qui địnhgiới hạn với một số lượng nhật định
tuỳ theo từng nhóm vi sinh vật cần phân tích và yêu cầu của từng đối tượng thực phẩm cũng như
các luật về vệ sinh an toàn thực phẩm. Đối với các vi sinh vật gây bệnh thông thường yêu cầu
không được hiện diện trong một khối lượng thực phẩm xác định. Số lựơng vi sinh vật được xác
định trong thực phẩm có thể khơng bao giờ phản ánh chính xác số lượng vi sinh vật thực tế có
trong mẫu, vì thế một khoảng giới hạn theo thông lệ được thiết lập để nhận biết các mẫu thực
phẩm đạt hay không đạt yêu cầu vi sinh vật. Thông thường các khoảng giới hạn mật độ vi sinh vật
trong thực phẩm được xác định bằng các khoảng như sau: Khoảng chấp nhận khi mật độ vi sinh
vật nằm dưới một thông số chấp nhận (m), khoảng sát mép giới hạn khi mật độ vi sinh này lớn hơn
giới hạn chấp nhận nhưng nhỏ hơn giới hạn trên (M). Khoảng không chấp nhận khi mật độ này cao
hơn giới hạn trên M. Giới hạn M thường cao hơn ít nhất 10 lần so với thơng số giới hạn m. Ví dụ
tổng số vi sinh vật trong sản phẩm trứng được thanh trùng Pasteur có yêu cầu như sau:
n = 5, c = 2, m = 5 x 104, M = 106
Trong đó n là số mẫu thử nghiệm, c là số mẫu được phép nằm trong khoảng sát mép giữa m
và M.
Kế hoạch lấy mẫu loại 2 được dùng cho các thử nghiệm phân tích vi sinh vật gây bệnh.
Theo kế hoạch này, số mẫu được lấy có thể 5,10, 20, 25 hay nhiều hơn để phân tích định tính
nhằm phát hiện có hay khơng có sự hiện diện các vi sinh vật trong khối lượng mẫu thử nghiệm như
trên. Sẽ không chấp nhận nếu có một trong số các mẫu trên có sự hiện diện của các vi sinh vật gây
bệnh (n = 5,10,20 hay nhiều hơn, c = 0 và n = 0). Số lượng mẫu thử phụ thuộc vào mối nguy hiểm
của từng loại thực phẩm nếu có sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh. Thực phẩm có mối nguy
hiểm cao là những loại thực phẩm không qua gia nhiệt trước khi sử dụng hay những thực phẩm có
tính nhạy cảm cao, ví dụ thực phẩm dành cho người già và trẻ em …
Lấy mẫu cho việc phân tích Salmonella:
Số lượng đơn vị mẫu để phân tích Salmonella phụ thuộc vào các yếu tố đặc trưng của từng

loại thực phẩm, có thể chia thành 3 nhóm thực phẩm chính như sau:
- Nhóm thực phẩm dùng cho các đối tượng nhạy cảm với Salmonella nhưng khơng qua q
trình chế biến trước khi sử dụng, ví dụ thực phẩm dành cho người già, dành cho người bệnh hay
dành cho trẻ em. Trong nhóm này số lượng đơn vị mẫu phải lấy khoảng 60 đơn vị mẫu.
- Nhóm thực phẩm dành cho người trưởng thành. Số lượng đơn vị mẫu được lấy thường là
30 đơn vị.
- Nhóm thực phẩm mà trong chế biến q trình có qua giai đoạn có thể tiêu diệt Salmonella.
Bước chế biến này có thể diển ra trong quá trình sản xuất hay chế biến tại gia đình. Trong nhóm
này, số lượng mẫu được lấy thường là 15 đơn vị.
Mỗi đơn vị mẫu được lấy ít nhất 100g, thông thường được lấy nguyên một đơn vị sản phẩm.
Đơn vị mẫu được lấy ngãu nhiên sao cho mẫu đó đại diện cho cả lơ sản phẩm. Trong trường hợp
phải tách mẫu vào trong các vật dụng lấy mẫu phải luôn lấy một mẫu kiểm chứng để đảm bảo điểu
kiện bảo quản mẫu tương tự với điều kiện khi lấy mẫu. Nếu một đơn vị sản phẩm không đủ khối

53


lượng mẫu cần thiết, như trong trường hợp đơn vị sản phẩm được đóng gói nhỏ hơn 100g, khi đó
mỗi đơn vị mẫu phải lấy nhiều hơn một đơn vị sản phẩm.
Tại phịng thí nghiệm, các chun viên phân tích sẽ lấy đại diện 25g (hay khối lượng theo
yêu cầu phân tích) từ các đơn vị mẫu để phân tích Salmonella. Trong trường hợp số đơn vị sản
phẩm nhiều hơn số đơn vị mẫu, các đơn vị sản phẩm sẽ được tổ hợp một cách vơ trùng và phân
tích viên sẽ lấy đại diện khối lượng mẫu phân tích.
1.2 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản
Giá trị của kết quả được phát hành bởi các phịng thí ngiệm phân tích phụ thuộc rất nhiều
vào phương pháp và qui trình lấy mẫu. Kế hoạch lấy mẫu được áp cho từng trường hợp cụ thể để
mẫu được mang vể phịng thí nghiệm phản ánh đúng tình trạng sản phẩm cần phân tích. Trong các
nhà máy sản xuất, thông thường mẫu được lấy với một khối lượng nhỏ tại nhiều thời điểm và cơng
đoạn khác nhau trong q trình sản xuất, khơng nên lấy một khối lượng lớn mẫu tại cùng một vị trí
hay một cơng đoạn. Có thể tập trung lấy mẫu tại công đoạn thành phẩm nhiều hơn, nhưng trong

một số trường hợp cần thiết có thể tập trung lấy mẫu tại một vài cơng đoạn trọng yếu trong q
trình sản xuất.
Dụng cụ lấy mẫu và thùng chứa mẫu: Thường sử dụng các bình nhựa có nắp bằng nhơm
hay bằng chất dẻo, báo bao nylon để chứa mẫu. Không nên sử dụng các bình bằng thuỷ tinh để
chứa mẫu bởi vì có thể bị vở gây nhiễm mẫu hay gây tại nạn cho người phân tích.
Dụng cụ lấy mẫu thường làm bằng các loại chất liệu khác khác nhau như vật dụng dùng để
lấy mẫu đông lạnh là các khoan tay đã được vô trùng, hay các dao được rửa trong các dung dịch
tẩy trùng. Không nên lấy vào các mảng băng. Sử dụng các thìa, kéo … để cho mẫu vào trong bình
chứa. Đối với các thực phẩm đã đóng gói, lấy mẫu từ các gói lớn từ đó lấy ra các đơn vị bao gói
nhỏ hơn.
Mẫu phải được lấy ít nhất khoảng 100-250g cho mỗi mẫu tuỳ theo các yêu cầu phân tích,
phải lấy tại nhiều vị trí trên sản phẩm hay trong cùng một công đoạn sao cho một khối lượng nhỏ
mẫu cũng đại diện cho sản phẩm đó.
Đối với các loại mẫu thịt hay cá, nơi nhiễm vi sinh chủ yếu là trên bể mặt, vì thế có thể sử
dụng các dụng cụ lấy mẫu bể mặt để quét trên bể mặt sản phẩm hay cắt mẫu trên bể mặt với độ dày
khoảng 2-3mm.
Vận chuyễn và bảo quản mẫu: Các mẫu sau khi lấy được bảo quản một các độc lập với
nhau trong các thùng bảo quản mẫu, làm lạnh bằng các bao nước đá. Nước đá phải khơng được tan
chảy trong suốt q trình vận chuyển mẫu đến phịng thí nghiệm. Tại phịng thí nghiệm mẫu được
chuyển vào trong tủ đơng hay được phân tích ngay trong thời gian có thể.
Nếu khơng thể phân tích ngay, mẫu phải được bảo quản ở –20 oC cho đến khi phân tích.
Nếu các mẫu khơng thể bảo quản đơng, thì phải bảo quản trong tủ lạnh 0-4 oC khơng được quá 36
giờ. Các loại thực phẩm như đồ hộp, thực phẩm có độ ẩm thấp, hay thực phẩm khó hư hỏng có thể
bảo quản ở nhiệt độ phịng cho đến khi phân tích.
1.3 Rã đơng trước khi phân tích
Phải sử dụng kỹ thuật rã đông trong điểu kiện vô trùng trước khi phân tích mẫu. Trong
trường hợp phải phối trộn mẫu trước khi phân tích, mẫu phải được rã đơng trong các dụng cụ chứa
như khi mang đến phịng kiểm nghiệm. Tránh các trường hợp chuyển mẫu sang các bình chứa thứ
hai khi rã đơng. Thơng thường nhiệt độ rả đông là 2-5oC trong khoảng 18 giờ, nếu cần phải rã đơng
nhanh có thể thực hiện ở 45oC trong vịng 15 phút. Khi rã đơng ỡ nhiệt độ cao, phải liên tục lắc

bình chứa mẫu để tăng tốc độ rã và nhiệt độ của mẫu được đồng nhất.

54


1.1

Đồng nhất mẫu
Sự phân phối của các vi sinh vật trong mẫu khơng đồng đều nhau. Để đảm bảo tính đồng
nhất trong các mẫu phân tích, các mẫu lỏng được lắc kỹ trước khi phân tích. Các mẫu rắn được lắc
hay đão trộn bằng các dụng cụ chuyên dùng trong điều kiện vô trùng. Sau khi đảm bảo mẫu được
đồng nhất, lấy một lượng mẫu xác định để phân tích tùy theo yêu cầu của từng chỉ tiêu cụ thể, ví
dụ đối với các chỉ tiêu định lượng trong 1 gam, khối lượng mẫu trích ra để phân tích là 10g, đối
với các chỉ tiêu định tính như Salmonella khối lượng mẫu trích ra là 25 gam …
1.2

Cân mẫu
Cân một lượng mẫu xác định để phân tích tuỳ theo từng chỉ tiêu yêu cầu như trên, cân chính
xác khối lượng mẫu nhất định, sai số của phép cân này là ±0.1g. Lượng mẫu trích để phân tích
được cho vào trong các bình chứa bằng nhựa hay các bao nhựa vơ trùng.
2. LẤY VÀ BẢO QUẢN MẪU NƯỚC
Tiêu chí của việc lấy mẫu là mẫu phải đại diện mức cao nhất của nước cần phân tích. Để
đạt được mục đích này, người lấy mẫu cần phải tuân thủ các qui định và qui trình trong việc lấy
mẫu và phân tích.
2.1 Dụng cụ chứa mẫu
Các dụng cụ lấy mẫu nhằm để phân tích vi sinh vật là những chai lọ đã đã được súc rửa cẩn
thận, tráng lại lần cuối cùng bằng nước cất và khử trùng trước khi sử dụng đế lấy mẩu. Có thể sử
dụng các túi nhựa đã được khử trùng để làm dụng cụ chứa mẫu.
Khử chlorin và độc tính kim loại trong mẫu nước
Thêm một nhân tố có tính khử vào trong trong các chai lọ dùng đẩ chứa mẫu để khử

chlorin hay các halogen khác. Trong trường hợp khơng có các tác nhân khử trong các lọ lấy mẫu,
sau khi thu những mẫu nước có chứa chlorin các chai lọ lấy mẫu khơng được đóng nắp. Nhân tố
khử thường được sử dụng đế khử chlorin trong nước là sodium thiosulphate, chất này trung hoà và
khử các các haologen trong nước nhằm ngăn cản sự tác động của chúng lên các vi sinh vật trong
mẫu trong thời gian vận chuyển. Sự loại bỏ các nhân tố tác động lên vi sinh vật trong quá trình vận
vận chuyển và bảo quản mẫu để sau khi phân tích quả số lượng vi sinh vật phản ánh đúng mật độ
của chúng ngay khi lấy mẫu.
Hàm lượng sodium thiocianate được cho vào trong các lọ sao cho sau khi lấy mẫu chúng
phịng thích vào trong nước với nồng độ 100mg/l. Trong chai lấy mẫu có thể tích 120ml thêm vào
0,1ml dung dịch Na2S2O3 10% sẽ trung hoà hết chlorin trong mẫu với nồng độ 15mg/l. đối với
nước uống hàm lượng chất khử chlorin có thể sử dụng thấp hơn, khoảng 0,1ml dung dịch Na 2S2O3
nồng độ 3% trong lọ chứa 120ml mẫu. Nồng độ chất khử này phóng thích vào trong mẫu nước là
18ml/l sẽ trung hoà nổng độ chlorin trong mẫu là 5ml/l. Trong trường hợp mẫu nước được khử
trùng với hàm lượng chlorin cao, nồng độ các chất cho vào trong các lọ lấy mẫu phải đạt 100ml/l.
Các tác nhân khử chlorin được cho vào trong các lọ lấy mẫu trước khi khử trùng. Có thể sử dụng
phương pháp khử trùng ướt hay khử trùng khô đối với các dụng cụ lấy mẫu. Ngày nay có các túi
lấy mẫu chứa sằn các tác nhân khử chlorin được bán tại các của hàng vật tư phịng thí nghiệm.
Trong trường hợp mẫu nước chứa các kim loại như đồng, kẽm và các kim loại nặng … với
hàm lượng cao hay nước thải, trong các dụng cụ lấy mẫu phải cho vào các tác nhân khử độc tính
của các kim loại này. Tác nhân này đặc biệt cần thiết khi thời gian vận chuyển mẫu trên 4 giờ.
Chất khử độc tính của kim loại nặng được sử dụng là muối sodium của EDTA
(ethylenediaminetetraacetic acid) với hàm lượng phóng thích vào trong mẫu là 372ml/l. EDTA

55


được điều chỉnh vể pH 6,5 trước khi dùng. EDTA cũng được cho vào trong các dụng cụ lấy mẫu
trước khi khử trùng, hàm lượng cho vào là 0.3ml dung dịch EDTA 15% đối với chai lấy 120ml
mẫu. Có thể kết hợp sodium thiocianat với EDTA trong cùng một dụng cụ lấy mẫu.
Qui trình lấy mẫu

Mẫu được lấy vào trong các dụng cụ lấy mẫu, không được lấy đầy chai mà mà phải chừa
một khoảng không trong chai chứa mẫu để đảm bảo mẫu được trộn đều bằng cách lắc trước khi
phân tích. Mẫu được lấy phải đại diện cho nước được thử nghiệm, phải sử dụng các biện pháp vô
trùng để tránh các trường hợp mẫu bị nhiễm từ bên ngoài hay nhiễm chéo giữa các mẫu với nhau.
Trong quá trình lấy mẫu, giữ chặc chai cho đến khi nước đầy chai, giữ các nút hay nắp chai không
được nhiễm trong khi lấy mẫu. Sau khi lấy đầy mẫu phải nút miệng chai ngay.
Cách thực lấy mẫu được tiến hành như sau:
- Lấy mẫu từ các nguồn là sông, suối, hồ chứa bằng cách cầm chai lấy mẩu trong tay, gần
vị trí đáy chai, đưa cổ chai hướng xuống dưới và đưa sâu vào dưới mặt nước. Xoay nhẹ để cổ chai
hơi nghiên lên bề mặt nước và miệng chai hường về phía dịng chảy. Trong trường hợp khơng có
dịng chảy như nước trong hồ hay trong các bồn chứa phải tạo ra một dòng chảy nhân tạo bằng
cách xoay chai theo hướng nằm ngang và đẩy chai di chuyển về phía theo hương miệng chai.
Trong trường hợp lấy mẫu khi đi trên thuyền, mẫu phải được lấy ở phía trước mũi thuyền. Nếu
khơng thể lấy bằng cách thức này, có thể buộc một vật nặng vào bên dưới đáy chai rồi đưa từ từ
vào trong nước. Trong mọi trường hợp đều tránh chai lấy mẫu tiếp xúc với bờ hay đáy của suối hai
bồn chứa.
- Có các dụng cụ đặc biệt cho phép mở nắp và lấy mẫu bên dưới mặt nước được sử dụng để
lấy các mẫu nước sâu trong các hồ hay các bồn chứa. Có rất nhiều bình lất mẫu sâu hoạt động theo
nhiều cách khác nhau như phổ biến nhất là bình lấy mẫu ZoBell-J-Z. Các dụng cụ lấy mẫu nước tự
động theo yêu cầu ngày nay cũng đã được bán tại các của hàng vật tư phịng thí nghiệm.
- Lấy mẫu nước sinh hoạt: Nếu lấy mẫu nước từ các vòi của hệ thống cấp nước dịch vụ,
chọn những vòi cấp nước trực tiếp từ các đường ống chính, khơng nên lấy từ các thùng hay bồn
chứa. Mở vòi nước thật lớn và để chảy ra ngoài từ 2-3 phút, trong thời gian này nhằm đề rửa sạch
hệ thống vòi nước trước khi lấy mẫu, giảm vòi nước để lấy mẫu vào trong các bình chứa. Trong
một số trường hợp cần phải làm sạch vòi trước khi lấy mẫu, dung dịch sodium hypochorite được
cho chảy qua vòi trước khi lấy mẫu, sau khi khử trùng, phải mở nước vịi cho chảy khồng 2-3
phút trước khi lấy mẫu vài chai. Không lấy mẫu từ các dịng nước chảy tràng bên ngồi vịi. Để
ngăn ngừa các dịng nước chảy tràn từ bên ngồi vịi vào trong mẫu, có thể dùng dụng cụ phễu lọc
để ngăn ngừa các dịng nước tràn từ bên ngồi vào trong bình chứa mẫu. Cũng có thể loại bỏ sự
nhiễm từ bên ngồi do các dịng nước chảy tràn, cho nước nóng chảy qua vịi khoảng hai phút, làm

lạnh từ 2-3 phút sau đó lấy mẫu vào bình.
Nếu lấy mẫu nước từ các giếng bơm tay, bơm nước để rửa vòi giếng khoảng 5 phút trước
khi lấy mẫu. Nếu giếng đào được trang bị máy bơm, cũng trực hiện tương tự như trên sau khi khời
động máy. Trong trường hợp các giếng đào khơng có trang bị máy bơm, mẫu được lấy trực tiếp từ
giếng bằng cách buộc chai lấy mẫu vào một vật nặng ở bên dưới đáy. Phải thật cẩn thận để tránh
sự nhiễm bẩn từ vật nặng hay nước trên bề mặt giếng.
Trong trường hợp lấy mẫu nước uống, phải lấy mẫu ở giai đoạn cuối của quá trình sản xuất,
các vị trí phân phối mẫu nước uống phải được chọn lọc để đảm bảo sự tích lũy có hệ thống trong
suối mỗi tháng. Phải xem xét thật kỹ càng vị trí của hệ thống phân bổ mẫu, ngay cả tại các điểm
chiết để đảm bảo chất lượng vi sinh vật thơng qua tồn bộ hệ thống để đảm bào rằng khơng có các
vị trính nhiểm vi sinh vật hay nhiểm chéo do qua trình tiên tục của hệ thống như hiện tượng bể ống
hay giảm áp lực trong qua trình khử trùng hay một nguyên nhân nào đó khác. Vị trí lấy mẫu có thể

56


là vịi nước cơng cộng, các nơi kinh doanh ngành thực phẩm, nhà hàng hay giếng nước các nhân
… Nhưng đặc biệt quan trọng khi lấy mẫu tại các mạng lưới cung cấp nước cho cộng đồng. Sự lấy
mẫu, kế hoạch cũng như tầng suất và vị trí lấy mẫu phải được lên chương trình có sự tham vấn của
các chuyên gia vệ sinh y tế công cộng, và ngành cấp nước.
- Lấy mẫu tại các nguồn cấp nước: Mẫu được lấy trực tiếp từ các từ sông, suối, lạch, ao,
các giếng hay các hồ chứa sao cho chúng đại diện cho nguồn nước cung cấp cho con người sử
dụng. Mẫu không nên lấy quá gần bờ hay quá xa nơi đặt ống bơm nước, cũng không nên lấy mẫu
quá sâu hay quá cạn so với vòi ống bơm. Mẫu được lấy càng gần miệng ống bơm, càng đại diện
cho nguồn chất lượng của nguồn cấp nước.
Kích cở mẫu: Thể tích mẫu phải đủ để đáp ứng các yêu cầu phân tích tại phịng thí nghiệm.
Thể tích mẫu phải lấy không được nhỏ hơn 100ml.
Mẫu sau khi lấy phải ghi đầy đủ và chính xác về ký hiệu, tên và các dữ liệu được mơ tả.
Khơng tiến hành phân tích các mẫu không đầy đủ các dữ liệu yêu cầu.
Thời gian và nhiệt độ bảo quản mẫu:

Nếu có thể, phân tích các chỉ tiêu vi sinh ngay sau khi lấy mẫu để tránh những sự thay đổi
không lường trước được. Nếu mẫu khơng thể phân tích ngay trong vịng 1 giờ sau khi lấy mẫu,
phải bảo quản trong các thùng lạnh trước khi vận chuyển đến các phịng thí nghiệm. Nếu kết quả
phân tích có liên quan đến pháp luật, phải sử dụng một phương tiện vận chuyển đặc biệt để chuyển
mẫu đến phịng thí nghiệm trong khoảng thời gian 6 giờ với một qui trình bảo quản đặc biệt.
Nhiệt độ bảo quản nước uống, nước suối, hay nước bị ô nhiễm là dưới 10 oC và thới gian
vận chuyển không quá 6 giờ. Bảo quản trong tủ lạnh tại các phịng thí nghiệm cũng khơng dược
q 2 giờ. Trong điều kiện bắt buộc không thể vận chuyển mẫu về phịng thí nghiệm nhanh hơn 6
giờ, phải xem xét đến việc trang bị các phương tiện phân tích ngay tại vị trí lấy mẫu hoặt sử dụng
qui trình ủ chờ. Tuy nhiên các yêu cầu như trên khó được đáp ứng. Trên thực tế các chỉ tiêu yêu
cầu thới gian vận chuyển và bào qu ản không quá 24 giờ. Khơng chấp nhận các mẫu khi gởi đến
phịng thí nghiệm bằng đường bưu điện và không được bảo quản theo các yêu cầu. Thời gian và
nhiệt độ bảo quản mẫu phải được lưu trữ đế sau khi phân tích dùng vào việc xử lý số liệu.
3. ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ
3.1. Định nghĩa
Vi sinh vật hiếu khí: là nhưng vi sinh vật phát triển để hình thành khuẩn lạc trong điều kiện
có sự hiện diện của ôxy phân tử.
Số đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu – colony forming unit) là số khuẩn lạc xuất hiện trong
mơi trường nụơi cấy. Số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc cho phép ước đoán được số lượng vi
sinh vật trong một đơn vị khối lượng thực phẩm.
3. 2. Nguyên tắc
Để xác định số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng thực phẩm bằng phương
pháp đếm số lượng khuẩn lạc phải qua quá trình đồng nhất, pha loãng mẫu thành các nồng độ xác
định. Chuyển một thể tích xác định các độ pha lỗng đã đồng nhất vào trong môi trường nuôi cấy.
Các khuẩn lạc được hình thành trong mơi trường sau khi ủ được xem như là chúng hình thành từ
một tế bào đơn lẻ.
Tuỳ theo các yêu cầu cụ thể trong việc phân tích, các đĩa môi trường sau khi cấy mẫu được
ủ ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian khác nhau. Theo yêu cầu của các tiêu chuẩn của nhiều quốc

57

gia, chỉ tiêu này được ủ ở 30oC trong khoảng thời gian khoảng 3 ngày. Tuy nhiên một số yêu cầu
khác có thể ủ ở nhiệt độ 20 - 22oC trong cùng thời gian trên.
Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa, căn cứ vào độ pha loãng cũng như thể tích cấy
để qui về tổng số vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng mẫu thực phẩm. Chỉ tiêu tổng số vi sinh
vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về khía cạnh vi sinh vật, qua đó đánh giá
khả năng hư hỏng, cũng như thời hạn bảo quản các sản phẩm thực phẩm. Tổng số vi sinh vật hiếu
khí cịn là chỉ tiêu đánh giá mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản thực phẩm, nước
uống hay các sản phẩm khác.
3.3. Mơi trườnng và vật liệu phân tích
- Mơi trừơng Plate Count Agar có pH 7.0 ± 0.2. Mơi trường được phân phối vào trong các bình
thuỷ tinh hay trong các ống nghiệm. Hấp khử trùng ở 121 oC trong 15 phút. Bảo quản ở trong tủ
lạnh từ 2–8oC. Trước khi sử dụng môi trường phải được đun chảy và làm nguội ở 45 oC trong
bể điều nhiệt.
- Dung dịch pha loãng saline pepton water: gồm 8.5 gam NaCl và 1.0gam pepton. Dung dịch
được phân phối vào trong các bình chứa 0.5-1.0 lít và phân phối vào trong các ống nghiệm với
thể tích chính xác 9.0ml sau khi khử trùng
3.4 Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích- Dùng các dụng cụ như kéo, kẹp đã được khữ trùng cân
chính xác 10.0g mẫu vào trong bao PE. Tất cả các điều kiện làm việc và thao tác phải tiến hành
trong điều kiện vô trùng. Thêm vào lượng mẫu này 90 ml dung dịch pha loãng Saline Pepton
Water. Sau khi đồng nhất nhận được dung dịch mẫu có độ pha loãng 10 -1.- Đồng nhất mẫu bằng
máy dập mẫu, thời gian dập mẫu phụ thuộc vào tính chất cơ lý của mẫu, nhưng không quá 2,5
phút. - Dịch mẫu ngay sau khi đồng nhất được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipet
vô trùng chuyển 1 ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng Saline Pepton
Water , tránh tiếp xúc pipet với dung dịch pha loãng, đồng nhất mẫu trong ống nghiệm bằng máy
lắc hoặc dùng pipet vô trùng khác hút đảo dịch mẫu lên xuống 5 -10 lần. Dùng pipet đó chuyển 1
ml dịch mẫu vào ống thứ hai chứa 9 ml dung dịch pha lỗng. Tiếp tục như vậy sẽ có các dung dịch
mẫu với các độ pha loãng 10 -2; 10-3; 10-4; …cho đến khi có đủ các nồng độ pha loãng cần thiết. 3.5.
Cấy mẫu

Chọn hai hay ba độ pha loãng liên tiếp sao cho trong 1 ml chứa 25-250 tế bào vi
sinh vật để cấy. Dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml dịch mẫu pha loãng đã chọn vào giữa đĩa petri
vơ trùng. Mỗi nồng độ cấy ít nhất vào 2 hay 3 đĩa. Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10-15 ml môi
trường Plate Count Agar đã được đun chảy và để ổn định ở 45 oC.Trộn đều dịch mẫu với mơi
trường bằng cách lắc trịn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3-5 lần ngay sau
khi đổ môi trường. Đặt các đĩa trên mặt phẳng ngang cho agar đông đặc.
Lật ngược và ủ
o
các đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 30.0±1.0 C (hay yêu cầu nhiệt độ khác) trong thời gian 72 giờ.
Trong một số yêu cầu, nhiệt độ ủ đĩa và thời gian ủ có thể thay đổi.3.6. Đếm kết quả
Đếm tất cả số các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25
đến 250 để tính kết quả. Số lượng tổng số vi sinh vật trong 1 gam mẫu được tính như sau:
A=
Trong đó:

N
(cfu/g)
n1 x V1 x f1 + … + ni x Vi x fi
A: số lượng vi sinh vật trong 1 gam mẫu
N: tất cả các khuẩn kạc đếm được trên các đĩa đã chọn.
ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha lỗng thứ i
V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong 1 đĩa.

58


fi: độ pha lỗng tương ứng.
Ví dụ trong một trường hợp phân tích mẫu cụ thể nhận được kết quả như sau:
Nồng độ pha loãng
Kết quả: Đĩa 1

Đĩa 2
A=

235 + 246 + 26
2 x 1 x 0,001+ 1 x 1x 0.0001

10-3
235
246

10-4
26
21

≅ 2.4 x 105(cfu/g)

Các kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí thường được biểu diển dưới dạng số mũ cùa cơ số
thập phân.
Trường hợp có các vi sinh vật mọc loang, tính mỗi vết loang là 1 khuẩn lạc. Nếu số khuẩn
lạc loang chiếm hơn 1/3 đĩa thì phải ghi nhận điều này và đánh dấu kết quả nhận được.
Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa >250, ví dụ ở nồng độ 10 -5 số đếm
lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2.5 x 10 7 CFU/g. Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm
được trên 1 đĩa <25, ví dụ ở nồng độ 10-1 số đếm nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2.5 x102 CFU/g.
4. XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ COLIFORMS VÀ COLIFORM PHÂN BĂNG PHƯƠNG PHÁP
ĐẾM KHUẨN LẠC
4.1. Định nghĩa
Coliforms là nhóm vi sinh vật chỉ thị vì số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm,
nước hay các loại mẫu môi trường được dùng như dấu hiệu chỉ thị khả năng hiện diện của các vi
sinh vật gây bệnh khác. Các nhà nghiên cứu đều cho thấy rằng với số lượng cao của coliform trong
thực phẩm thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác cao. Tuy nhiên mối liên hệ

giữa vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật chỉ thị cịn có nhiều tranh cãi.
Coliform tổng số là nhóm vi sinh vật hiếu khí tuỳ nghi, thuộc nhóm vi khuẩn gram âm,
khơng sinh bào tử, có hình que, lên men lactose và sinh hơi từ nguồn carbon này trong vòng 24-48
giờ ờ nhiệt độ 37oC.
Khi nâng cao nhiệt độ ni cấy lên 44 oC có thể phân biệt Coliform phân với nhóm
Coliform tổng số và nhóm khơng phải Coliform. Coliform được định nghĩa như sau: Coliform
phân là nhóm vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tuỳ ý, thuộc nhóm vi sinh vật gram âm, khơng sinh bào
tử và có khả năng lên men lactose và sinh hơi trong khoảng thời gian nuôi cấy 24-48 giờ ở nhiệt
độ 44oC.
Nhóm Coliform phân là một phần của hệ vi sinh ruột đường ở người và các động vật máu
nóng khác, các nhóm vi sinh vật sau được liệt vào nhóm Coliform phân: Escherichia; Klebsiella,
Citrobacter và Enterobacter. Nhóm vi sinh vật này được sử dụng như yếu tố chỉ thị mức độ vệ sinh
trong quá trình chế biến, bảo quản và vận chuyển thực phẩm, nước uống và môi trường. Các đặc
điểm sinh hoá khác nhau để phân biệt các thành viên trong nhóm coliform phân như sau:
4.3. Nguyên tắc
Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường thạch chọn lọc. Sau khi ủ ở 37,0 + 1,0 oC 24 48 giờ, đếm số lượng khuẩn lạc Coliforms điển hình. Xác định lại bằng các phản ứng đặc trưng.
Môi trường chọn lọc cho Coliform là môi trường chứa lactose, đây nguồn carbon duy nhất, đồng
thời trong mơi trường cịn chứa muối mật là tác nhân chỉ chọn lọc cho vi khuẩn gram âm, chứa các
tác nhân chỉ thị các dấu hiện điển hình khi vi sinh vật trao đổi các thành phần trong môi trường

59


như neutral red, hay crystal violet. Khẳng định các dòng vi khuẩn cho hình dạng khuẩn lạc điển
hình băng các môi trường canh chọn lọc như Brilliant green bile lactose.
Để chọn lọc đối với các nhóm Coliform phân nhiệt độ nuôi cấy là 44 oC trong 24-48 giờ.
Đếm các khuẩn lạc đặc trưng cho Coliform phân, ngoài việc khằng định khả năng sinh hơi từ
lactose bằng các môi trường canh cịn được khằng định khả năng tạo indol trong mơi trường canh
chứa trypton ở 44oC.
Để tránh các trường hợp không phát hiện được số lượng tế bào Coliform bị tổn thương hay

suy yếu trong quá trình chế biến hay bảo quản thực phẩm, khi tiếp xúc với môi trường chọn lọc
chùng sẽ bị chết hay không thể phát triển thành khuẩn lạc, một môi trường không chọn lọc nhưng
không chứa một nguồn carbon khác được sử dụng như Trypton Soy Agar. Môi trường này được
cho vào sau khi cấy mẫu và ủ nhiệt độ 20-25oC (nhiệt độ phòng) trong thời gian 1-2 giờ nhằm khôi
phục những tế bào bị suy yếu trước khi cho môi trường chọn lọc vào đĩa.
Số lượng Coliform hay Coliform phân được xác định bằng số lượng khuẩn lạc điển hình
đếm được, hệ số xác nhận và độ pha loãng mẫu trước khi cấy vào đĩa.
4.4. Môi trường
- Tryptone Soya Agar (TSA) được chuẩn bị trong các bình hay chai thuỷ tinh, khử trùng ở
nhiệt độ 121oC trong 15 phút bằng nồi hấp. Bảo quản ở nhiệt độ 4-8 oC. Trước khi sử dụng, môi
trường được đun chảy và làm nguội ở 45oC trong bể điều nhiệt.
- Violet Red Bile Agar (VRB) được chuẩn bị vô trùng trong các chai thuỷ tinh,đun chảy và làm
nguội ở nhiệt độ 45oC trong bể điều nhiệt trước khi sử dụng. Có thể sử dụng các mơi trường khác
như Desoxycholate agar cũng được chuẩn bị như trên.
- Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL) được phân phối vào trong các ống nghiệm, mỗi
ống 10ml và có ống Durham đặt ngược bên trong. Khử trùng ở 121 oC trong 15 phút. Sau khi khử
trùng phải đảm bảo khơng có bọt khí trong các ống Durham ngược.
- E.C broth: được chuẩn bị tương tự như môi trường BGBL.
- Canh trypton: được phân phối vào trong các ống nghiệm, mỗi ống 5ml. Môi trường khử
trùng ở 121oC trong 15 phút.
- Thuốc thử Kovac’s hay Ehrlish
4. 5. Qui trình phân tích
Chuẩn bị mẫu:
Q trình chuẩn bị mẫu tương tự như phần định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí. Nhưng
q trình pha lỗng mẫu sao cho trong 1ml dung dịch pha loãng chứa khoảng <100 tế bào
Coliform.
Cấy mẫu và đổ môi trường
Cấy chuyển 1 ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri, mỗi nồng độ cấy ít nhất vào hai
đĩa petri, chọn 2 nồng độ pha loãng liên tiếp để cấy sao cho sau khi ủ mỗi đĩa xuất hiện dưới 100
khuẩn lạc.

Cho vào mỗi đĩa đã cấy mẫu khoảng 5ml môi trườngTSA đã được đun chảy và ổn định
trong bể điều nhiệt ở 45oC, trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc trịn đĩa petri xi và
ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3-5 lần ngay sau khi đổ mơi trường và để ổn định ở nhiệt độ
phịng trong 1-2 giờ nhằm phục hồi các tế bào bị tổn thương hay các tế vào bị suy thối do q
trình chế biến. Đổ thêm 10-15 môi trường VRB lên trên môi trường TSA. Chờ cho môi trường
trong đĩa đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37.0 + 1.0oC trong 24 -48 giờ.
Đếm kết quả
Chọn các đĩa có số đếm từ dưới 100 khuẩn lạc Coliforms để tính kết quả. Khuẩn lạc
Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm và có đường kính > 0.5 mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng
tủa của muối mật.

60


Giai đoạn xác định
Trong trường hợp phân tích các mẫu thực phẩm có chứa các nguồn carbon khác khơng phải
lactose, để tránh các trường hợp vi sinh vật sử dụng các nguồn carbon trong mẫu để lên men và có
biểu hiện hình dạng khuẩn lạc tương tự Coliform, giai đoạn khẳng định là cần thiết. Qui trình
khẳng định được tiến hành như sau: chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ đã đếm với các hình dạng
khác nhau, cấy chuyển sang các ống có chứa mơi trường khẳng định. BGBL được sử dụng khi
khẳng định Coliform tổng số, E.C được sử dụng để khằng định Coliform phân. U các ống nghiệm
BGBL đã cấy ở nhiệt độ 37.0 + 1.0oC và các ống nghiệm E.C broth ở 44oC trong thời gian 24-48
giờ. Kết quả dương tính khi vi khuẩn phát triển và sinh hơi trong môi trường nuôi cấy, hơi tạo ra
được giữ lại trong các ống Durham ngược hay tụ lại trên bề mặt ống nghiệm. Tỉ lệ xác nhận là tỉ số
giữa khuẩn lạc cho kết quả dương tính với số khuẩn lạc khẳng định.
Trong trường hợp khẳng định Coliform phân, các khuẩn lạc sinh hơi trong môi trường E.C
broth được thử nghiệm indol ở 44oC. Tỉ lệ dương tính chỉ được tính cho các khuẩn lạc có khả năng
sinh hơi và phản ứng indol dương tính.
Báo cáo kết quả
N

A(coliform/coliform phân) =

xR

(cfu/g(ml))

n1v1f1 + … + nivifi
Trong đó:

N : tổng số khuẩn lạc đếm được
ni : số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãng
v : Thể tích cấy vào mỗi đĩa
fi : Độ pha lỗng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm
R : Tỉ lệ xác nhận
Kết quả coliform hay coliform phân được làm tròn chẵn chục và được biểu diện dưới dng
s m cú c s thp phõn.
5. định tính ESCHERICHIA COLI trong thc phm
5. 1 Phạm vi áp dng
Phơng pháp này (tham chiu theo TCVN 5287, tái bản lần th 2, năm 1994) đc áp dng cho
tt cả các loại thc phm (đc bit là thc phm thy sản đông lạnh) đ xác định s hin din ca
Escherichia coli.
5.2 Định ngha
Escherichia coli là dạng Coliform c ngun gc t phân, phát trin đc 440C, sinh Indol, sinh axit,
không sinh acetoin và không s dng citrat làm ngun Cacbon. Escherichia coli đc phát hin do
khả năng lên men lactose và sinh hơI 440C, c kt quả nghim pháp IMViC ++ --.
5.3.Nguyên tắc
Phơng pháp này dng đ định tính và kt lun phát hin hay không phát hin E.coli trong mt
khi lng mu xác định.
Cy mu vào môi trng tăng sinh (BGBL), phân lp trên môi trng phân lp (EMB) và khẳng định
bằng các th nghim sinh ha ph hp (nghim pháp IMViC) .

5.4. Dịch pha loÃng và môi trng:
- Dung dịch Saline Pepton (SPW)
- Brilliant green bile lactose broth (BGBL)

61


- Th¹ch Eosin Methylene Blue Lactose agar (EMB)
- Canh Methyl Red Voges Proskauer (MR-VP)
- Canh Tryptone (hoỈc peptone)
- Th¹ch Simmons Citrat
- Thuc thư Methyl red 0.2%
- Dung dÞch KOH 40%
- Thuc thư -naphtol 5%
- Thuc thư Kovac’s
5.5. Thit bÞ chÝnh
- Tđ m 37.0 + 1.00C.
- Tđ m 44.0 + 0.50C.
5.6. Quy trình
Chun bị mu:
Chun bị mu và pha loÃng tơng t nh định lng Coliforms
Tăng sinh:
Cy 1ml dịch mu c nng đ 10-1 vào ng nghim c cha 10ml môi trng tăng sinh (BGBL),
44.0 + 0.50C/24 gi.
Phân lp
Sau 24 gi, chn ng nghim c phản ng dơng tính (làm đc môi trng và sinh hơi), cy sang
môi trng phân lp (EMB), đ 37.0 + 1.00C/24 gi.
Nhn d¹ng khun l¹c E.coli: Trên môi trng EMB: khun lạc màu tím, ánh kim, tròn, b đu, đng
kính khoảng 0.5mm.
Khẳng định

Những khun lạc nghi ng đc thc hin qua các th nghim sinh ha (thc hin nghim pháp
IMViC)
Chn ít nht 2 khun lạc đin hình hay nghi ng môi trng phân lp, cy chuyn sang môi trng
rắn không chn lc (TSA) , 37.0 ± 1.0OC trong 18-24 gi.
Thư nghiƯm sinh ha
C¸c thư nghim sinh ha đc dng đ khẳng định E.coli nh bảng dới đây
TT
Th nghim sinh ha
Kt quả
1
Indol
+
2
Methyl red
+
3
Voges Proskauer
4
Khả năng s dng citrat
Báo cáo kt quả
Phát hin hay không phát hiƯn E.coli trong 10g mu.
6. ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI TRONG THỰC PHẨM
6.1 Định nghĩa
E.coli là loài vi sinh vật thuộc nhóm Coliform phân, có hình que, gram âm, di động, có khả
năng lên men và tạo acid và sinh hơi từ đường lactose ở 44 oC hay nhiệt độ thấp hơn, có khả năng
sinh indol ở 44oC và 37oC, có phản ứng Voges Proskauer âm tính, khơng có khả năng sử dụng
citrate như nguồn car bon duy nhất.
Trong một số phương pháp kiểm nghiệm thực phẩm, có những định nghĩa phân biệt số
lượng E.coli khẳng định và số lượng E.coli giả định. Số lượng E.coli giả định được coi là những

62


Coliform phân, chúng có phản ứng Indol dương tính, khơng tiến hành khẳng định các phản ứng
khác.
E.coli còn được gọi là faecal coli, chúng hiện diện thường xuyên trong ruột người và các
loài động vật. Chúng phân bố rộng khắp trong tự nhiên, mặt dù có nguồn gốc từ phân, nhưng sự
hiện diện của chúng với một số lượng nhỏ trong thực phẩm khơng có nghĩa là thực phẩm đó bị
nhiễm phân. Sự hiện diện của vi sinh vật trong thực phẩm, nước uống là dấu hiệu chỉ thị sự kém
chất lượng về mặt vệ sinh.
Khi xâm nhiễm một liều lượng lớn vào trong cơ thể ngưới và động vật, E.coli là loài phổ
biến nhất gây viêm nhiễm đường tiểu, thỉnh thoảng có thể tìm thấy chúng gây lở lt và tạo mủ,
nhiễm trùng máu và có thể tìm thấy vi sinh vật này gây viêm não.
Cho đến nay người các nhà khoa học đã tìm được ít nhất 4 loài gây bệnh đường ruột cho
người. Theo phân loại của Gorbach chúng được chia thành: enterobathogenic (EPEC);
enterotoxigenic (ETEC), enteroinvasive (EIEC), và verotoxigenic (ETEC). Các kiểu huyết thanh
của các dòng E.coli gây bệnh được liệt trong bảng 26.3
6.2 Nguyên tắc
Cấy một thể tích xác định các nồng độ pha lỗng thích hợp lên môi trường chọn lọc. Sau
khi ủ ở 44oC trong khoảng thời gian 24 giờ, đếm các khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng của
Coliform. Xác nhận các khuẩn lạc đã đếm bằng các phản ưng sinh hoá. E. coli có các phản ứng
sinh hố đặc trưng như sau: indol dương tính, methyl red dương tính; Vogesproskauer âm tính và
citrat âm tính.
6.3Mơi trường
Tryptone soya agar ( TSA ) (chuẩn bị tương tự phần coliform)
Violet red bile agar ( VRB ) (chuẩn bị tương tự phần coliform)
Escherichia coli broth (EC broth): được phân phối trong các nghiệm, mỗi ống chứa 10ml,
cho vào bên trong ống durham ngược, hấp khử trùng bằng nồi hấp và làm nguội từ từ để khơng
cịn các bọt khí trong ống durham. Bảo quản các ống môi trường ở nhiệt độ 2-8 oC cho đến khi sử
dụng.

Lactose tryptone lauryl sulphate broth (LST Broth ): (Chuẩn bị tương tự như EC broth).
Tryptone broth (chuẩn bị tương tự phần coliform)
Thuốc thử Kovac’s
MR-VP broth: phân phối vào trong các ống nghiệm, mỗi ống 5ml. Hấp khử trùng bằng nồi
hấp. Bảo quản 2-8oC cho đến khi sữ dụng.
Simmon citrate: được chuẩn bị như là như là các môi trường thạch nghiêng trong các ống
nghiệm. Môi trường sau khi pha chế có màu xanh lục.
6.4 Qui trình cấy mẫu
Chuẩn bị và cấy mẫu:Tương tự như phần chuẩn bị mẫu cho kiểm nghiện coliform và
coliform phân.
Đọc kết quả: Chọn các đĩa có từ 10 - 100 khuẩn lạc. Đối với những đĩa có số khuẩn lạc
nhiều thì kích thước các khuẩn lạc thường nhỏ và không rõ. Đếm những khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ
sậm và có đường kính lớn hơn 0.5 mm, xung quanh có vùng tủa của muối mật.
Giai đoạn xác định: Đối với mỗi dạng khuẩn lạc, chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ cấy chuyển
sang canh thang EC. U ở 44.0± 0.5oC trong khoảng 24 giờ, kết quả dương tính khi vi sinh vật có
khả năng sinh sinh hơi trong mơi trường, được biểu hiện bằng bọt khí được giữ lại trong các ông
durham hay đọng lại trên bề mặt mơi trường.
Chọn các ống canh thang EC có sinh hơi để cấy chuyển sang các môi trường sau: canh
thang Tryptone, canh thang MRVP, simmoncitrate. U các môi trường trên ở 44,0± 0.5oC trong

63


khoảng 24 giờ. Thử phản ứng indol, methylred; vogesposkauer, citrate (xem phần thử nghiệm các
phản ứng sinh hoá). Tỉ lệ xác nhận số lượng khuẩn lạc thử nghiệm cho kết quả đúng là E.coli bằng
tỉ số giữa số lượng khuẩn lạc xác nhận ban đầu và số lượng khuẩn lạc cho kết quả là E.coli.
Số lượng E.coli được tính như sau:
N
Số CFU E.coli =

xR

nxVxf
N: số lượng khuẩn lạc coliform đã đếm
V: thể tích mẫu cấy vào đĩa
n: số lượng đĩa cấy cho một mẫu
f: độ pha loãng của mẫu
R: tỉ lệ xác nhận của E.coli
Có thể tính số lượng E.coli giả định bằng cách tính tỉ lệ số lượng khuẩn lạc cho phản ứng
indol dương tính, cơng thức tính tương tự như trên.
Báo cáo kết quả: Kết quả E.coli được thể hiện bằng số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc
E.coli trong một gram hay mililitre mẫu.
Các phương pháp khác dùng trong định lượng E. coli:
Ngồi phương pháp ni cấy theo qui trình như trên, E.coli cịn được định lượng bằng
phương phương pháp màng lọc nuôi cấy trên các môi trường chuyên biệt hay phương pháp MPN.
Đến nay có những phương pháp màng lọc có thể phân biệt được số lượng E.coli trong tổng số
coliform. Các phương pháp miễn dịch học hay sinh học phân tử có thể phân biệt các lồi E.coli gây
bệnh với các lồi khơng gây bệnh khác.
Trong đó:

7. ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS BẰNG
PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC
7.1Định nghĩa
Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tuỳ nghi, có hình cầu, gram dương,
có phản ứng đơng huyết tương dương tính do chúng tiết ra enzyme coagulase. Ngồi ra cịn các
đặc điểm như có phản ứng Dnase, phosphatease dương tính, có khả năng lên men và sinh acid từ
mannitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S. aureus đều nhạy với novobiocine, có khả năng
phát triển trong mơi trường chứa đến 15% muối NaCl.
Một số dịng S. aureus có khả năng gây tan máu trên mơi trường thạch máu, vòng tan máu
phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều có vịng tan màu hẹp so với đường kính của khuẩn lạc.

Hầu hết các vi sinh vật này đều sản sinh sắc tố vàng. Nhưng các sắc tố này ít thấy khi q trình
ni cấy cịn non, sắc tố này thường thấy rõ sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Sắc tố được
tạo ra nhiều hơn khi trong mơi trường có hiện diện của lactose hay các nguồn carbohydrate khác
mà vi sinh vật này có thể bẻ gảy và sử dụng chúng
Hầu hết các dòng thuộc lồi này có thể tổng hợp enterotoxin. Ngồi ra các lồi S.
intermedius, và S.hyicus cũng có thể tạo enterotoxin, nhưng hai lồi này có phản ứng coagulase âm
tính. Độc tố được sản sinh chỉ khi vi sinh vật phát triển trong mơi trường có nhiệt độ trên 15 oC, độc
tố được sản sinh nhiều nhất khi chúng phát triển trong nhiệt độ 35-37oC.
S. aureus phân bố khắp nơi, nhưng chủ yếu phân lập được từ da, màng nhầy của người và
động vật máu nóng. Trong thực phẩm vi sinh vật được nhiễm vào chủ yếu qua con đường chế biến

64


có các cơng đoạn tiếp xúc trực tiếp với người. Nều có sự hiện diện với mật độ cao của sinh sinh vật
này trong thực phẩm cho thấy điều kiện vệ sinh của q trình chế biến kém, kiểm sốt nhiệt độ
trong các công đoạn chế biến không tốt.
7.2 Nguyên tắc
Cấy trang một lượng mẫu xác định trên bề mặt môi trường thạch chọn lọc. Sau khi ủ, đếm
số khuẩn lạc có những đặc điểm đặc trưng và khơng đặc trưng của Staphyloccocus aureus. Xác
nhận các khuẩn lạc đã đếm bằng phản ứng coagulase và các phản ứng đặc trưng khác. Kết quả
được xác định bằng số lượng khuẩn lạc đã đếm, thể tích cấy, độ pha lỗng và hệ số xác nhận.
7.3 Môi trường
Môi trường thạch máu
Các thành phần cơ bản của mơi trường được hồn tan trong nước, đun cho đến khi các
thành phần hoà tan hoàn toàn. Khử trùng ở nhiệt độ 121 oC trong 15 phút. Làm nguội môi trường
đến 45-50oC trong bể điểu nhiệt. Thêm vào 5% thể tích máu cừu hay bê non dưới 5 tháng tuổi đã
được loại bỏ các sợi máu hay máu được thêm chất chống đơng citrat. Hồn tan đều máu vào trong
môi trường. Phân phối vào trong đĩa petri. Mơi trường phải được pha chế trước ít nhất 2 ngày
trước khi sử dụng để kiểm tra khả năng bị nhiễm. Môi trường thạch máu không nên đổ quá dày để

có thể nhận rỏ các vịng tan máu.
Mơi trưìơng thạch Baird Parker:
Mơi trường này có chứa lịng đỏ trứng tươi và potassium tellurite, đây là hai thành phần
không chịu nhiệt, vì thể phải bổ sung vào mơi trường sau khi khử trùng và làm nguội đến khoảng
60oC. Sau khi bổ sung đầy đủ các thành phần, môi trường được phân phối vào trong đĩa petri. Sau
khi pha chế đĩa môi trường phải có màu vàng đục.
Huyết tương thỏ (thử phản ứng đông huyết tương)
Huyết tương thỏ được cố định với 0.1% EDTA hay cố định trong sodium oxalate. Phân
phối vào trong các ơng nghiệm nhỏ, mỗi ống 0,.3 ml. Có thể thử phản ứng này trên lam kính.
7.4 Tiến hành
Xử lý và pha loãng mẫu: Cân 10,0± 0,1 gram mẫu trong túi vơ trùng, thêm 90 ml dung
dịch pha lỗng, đồng nhất bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây. Chuẩn bị dãy pha lỗng thích hợp
tùy theo mức nhiễm của từng loại mẫu sao cho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa BP sau khi ủ
có khoảng <100 khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa.
Cấy mẫu: Cấy 0,1ml mẫu ngun hoặc đã pha lỗng vào đĩa mơi trường Baird Paker Agar,
nếu mật độ S.aureus trong mẫu thấp có thể cấy 1ml dung dịch pha loãng phân phối vào 3 đĩa môi
trường BP, dùng que cấy tam giác trang đều trên bề mặt cho đến khi khô mặt. Thực hiện tương tự
như trên với môi trường thạch máu. Lật ngược đĩa, ủ ở 37.0 oC± 1.0oC trong thời gian 24-48 giơ đối
với môi trtường Baird Parker, 24 giờ với môi trường thạch máu.
Đọc kết quả: Sau 24 giờ, trên môi trường Baird Paker Agar, khuẩn lạc Staphyloccus aureus có
đường kính khoảng 0.5 - 1mm, lồi, đen bóng có vịng sáng rộng khoảng 1 - 2 mm bao quanh. Đánh
dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm như trên và tiếp tục ủ đến 48 giờ. Sau 48 giờ
khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1 - 1.5 mm, màu đen bóng, lồi, có vịng trắng đục hẹp
và vòng sáng rộng khoảng 2 - 4 mm bao quanh. Có một số dịng S. aureus cho khuẩn lạc khơng
đặc trưng (khơng tạo các vịng quanh khuẩn lạc như miêu tả trên). Cần đếm và đánh dấu cả hai
dạng khuẩn lạc.
Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ S. aureus cho khuẩn lạc bóng lống, đục, lồi có
màu xám hay vàng nhạt. Đường kính khuẩn lạc khoảng 1-2 mm. Hầu hết S.aureus có vùng tan
huyết, tuy nhiên một số dịng có khơng có vịng tan huyết này.
7.5 Khẳng định

65


Trên môi trường BP: Cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng từ môi
trường Baird Parker vào môi trường TSA. ủ ở 37,0 oC ± 1,0oC trong 24 giờ. Cấy vi khuẩn từ môi
trường TSA vào các ống nghiệm chứa huyết tương đã rã đông, ủ ở 37,0 ± 1,0oC. Theo dõi kết quả
phản ứng đông huyết tương sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 24 giờ. Tính tỉ lệ khẳng định trên
các khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng.
Thực hiện tương tự với các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu.
Kết quả phản ứng:
- Dương tính: Có khối đơng huyết tương hình thành. Mọi mức độ đơng kết đều được coi là
dương tính.
- Âm tính: Khơng có khối đơng, hỗn dịch vẫn đồng nhất như ống khơng cấy.
Ngồi S. aureus, chỉ có S. intermedius và một số ít S. hyicus cho phản ứng đơng huyết
tương dương tính. Khơng giống như S. aureus và S. intermedius, đa số loài S. hyicus subsp hyius
cho phản ứng dương tính chậm và yếu. S. intermedius và S. hyius subsp hyius có phản ứng dương
tính nhưng có khuẩn lạc nhỏ khơng đặc trưng trên mơi trường Baird Parker Agar, khơng có vịng
tan máu và khơng sinh sắc tố trên mơi trường thạch máu.
7.6Tính kết quả
Số lượng S.aureus trong mẫu được tính như sau:
10
Số S. aureus [CFU/g(ml)] =
(Nt x Ht +Na x Ha)
F1 + F2
Trong đó:
F: độ pha lỗng
Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng
Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưmg
Số khuẩn lạc đặc trưng cho kết quả ĐHT dương tính

Ht =
Số khuẩn lạc đặc trưng
Số khuẩn lạc không đặc trưng cho kết quả dương tính
Ha =
Số khuẩn lạc khơng đặc trưng

8. PHƯƠNG PHÁP MPN ĐỊNH LƯỢNG S. AUREUS
Phương pháp này được dùng để định lượng S.aureus trong các mẫu có mật S. aureus thấp
và có mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao, khó có thể xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
Dung dịch mẫu được pha loảng theo hệ số thập phân với ba độ phaloãng liên tiếp sao cho trong
chuỗi pha lỗng này sau khi cấy vào các mơi trường canh vừa cho các kết quả âm tính vừa cho kết
quả dương tính, thường sử dụng các độ pha loảng 10-1; 10-2,10-3.
Tuỳ theo mức độ yêu cầu của kết quả phân tích, có thể sử dung phương pháp MPN với hệ
thống:
3 ống mổi ống cấy 1ml dung dịch pha loãng 10-1
3 ống mổi ống cấy 1ml dung dịch pha loãng 10-2
3 ống mổi ống cấy 1ml dung dịch pha loãng 10-3
Hay hệ thống
5 ống mổi ống cấy 1ml dung dịch pha loãng 10-1
5 ống mổi ống cấy 1ml dung dịch pha loãng 10-2
5 ống mổi ống cấy 1ml dung dịch pha loãng 10-3

66


Môi trường canh được sử dụng là Mannitol Salt Broth hay Tryptose Soy Broth có 10%
muối NaCl. Sau khi cấy, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 48±2 giờ. Chọn các ống dương tính, khi có các vi
sinh vật phát triển làm đục canh trường để phân lập trên môi trường BP, các đĩa môi trường BP
được ủ ở 37oC trong 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường BP để xác nhận S.
aureus. Các đĩa cho kết quả S. aureus dương tính được đối chiếu với các ống nghiệm trong hệ

thống các dãy cấy ban đầu. Tra bảng MPN để có kết quả định lượng S. aureus trong mẫu.
9. PHÁT HIỆN SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM
9.1 Định nghĩa
Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, có khả năng di động (trừ S.
gallinarum và S.pullorum ), sinh acid từ glucose và mannitol nhưng không lên men sacharose và
lactose, không sinh indole và không phân giải ure. Hầu hết các chủng đều sinh H2S ( trừ S. typhi).
Cho đến nay giống Salmonella có hơn được phát hiện có hơn 2300 serotypes. Các serotype
này được chia theo hệ thống của Kaffmann – White dựa trên công thức kháng nguyên O (kháng
nguyên somatic) và kháng nguyên lông H (flagella). Trong số các serotype trên, có một số
serotype được đặc tên như Enteritidis, Typhi, Paratyphi, Typhimurium … hầu hết serotype khơng
có tên được biểu diển dưới dạng cơng thức kháng nguyên.
9.2 Nguyên tắc
Phương pháp được mô tả sau đây nhằm định tính Salmonella, kết quả được báo cáo là có
hay khơng có Salmonella trên lượng mẫu được kiểm nghiệm. Để đạt hiệu quả cao, quy trình kiểm
tra Salmonella bắt buộc phải qua giai đoạn tiền tăng sinh. Điều này cần thiết vì Salmonella thường
có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương nặng qua quá trình chế biến và sự tồn tại một số
lượng lớn các loại vi khuẩn khác thuộc họ Enterobateriaceae, các dòng này cạnh tranh và ức chế sự
phát triển của Salmonella. Bốn giai đoạn cần tiến hành để phát hiện Salmonella: tiền tăng sinh,
tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Việc khẳng định dựa trên các kết quả thử nghiệm sinh
hóa phù hợp đạc trưng cho Salmonella spp.
9.3 Dung dịch pha lỗng và mơi trường ni cấy
- Nước peptone đệm (Buffered peptone water)
- Canh Rappaport-Vassiliadis soya pepton
- Canh Selenite Cystein broth
- Thạch Xylose lysine desoxycholate (XLD)
- Thạch Brilliant green phenol red Thạch Triple sugar iron (TSI)
- Canh Urea
- Canh Lysine decarboxylase
- Canh Ornithine decarboxylase
- Canh Manitol (Phenol red broth base)

- Canh Sucrose (Phenol red broth base)
- Canh sorbitol (Phenol red broth base)
- Canh Tryptone Thuốc thử Kovac’s Indole
- Kháng huyết thanh Salmonella đa giá.
9.4 Qui trình phân tích
Tiền tăng sinh
Cân 25 g mẫu trong túi vô trùng, Thêm 225ml nước peptone đệm, đồng nhất mẫu. Thời
gian đồng nhất mẫu (15 hoặc 30 giây) tùy thuộc vào loại thực phẩm. ủ ở 37.0oC±1.0oC/18-24 giờ.
Tăng sinh

67


Trộn đều canh thang tiền tăng sinh trước khi chuyển 0,1ml sang 10ml canh thang tăng sinh
chọn lọc Rappapport-vassliadis soya pepton. Trước khi cấy mẫu, canh thang tăng sinh phải được ủ
ấm đến nhiệt độ 42oC, nhiệt độ này là yếu tố quan trong cho việc tăng sinh tối ưu. U mẫu trong bể
điều nhiệt ở 42,0oC ±0,2oC trong18-24h (có thể kéo dài thời gian ủ thêm 24 giờ nữa nếu thấy cần
thiết).
Cấy và đọc kết quả trên đĩa
Dùng khuyên cấy tròn ria dịch mẫu từ canh thang tăng sinh lên đĩa thạch XLD và thạch
Brilliant green-phenol red để tạo những khuẩn lạc riêng rẽ. ủ ở 37.0 oC±1.0oC trong khoảng 18-24
giờ.
Trên thạch XLD: Khuẩn lạc điển hình trong suốt, hơi nhuốm đỏ, tâm đen, thường có vùng
đỏ hồng bao quanh, đặc biệt khi Salmonella phát triển mạnh.
Trên thạch Brilliant green-phenol red: Khuẩn lạc điển hình trong, có vùng đỏ hồng bao
quanh.
Khẳng định
Khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella phải được kiểm tra sinh hóa và kháng huyết thanh. Từ
mỗi mơi trường phân lập (XLD hay thạch Briliant green-phenol red) cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn
lạc nghi ngờ sang mơi trường không chọn lọc (TSA). ủ ở 37.0oC ±1.0oC trong khoảng 18-24 giờ.

- Khẳng định bằng thử nghiệm sinh hóa:
Dùng các thử nghiệm sinh hóa để khẳng định Salmonella. Các thử nghiệm chính gồm
glucose, lactose, saccharose, H2S (trên thạch TSI hay KIA), urea, indol, VP, ornithine
decarboxylase (ODC), lysine decarboxylase (LDC), mannitol, sorbitol.
Thử nghiệm trên môi trường TSI hay KIA :Dùng kim cấy nhọn cấy vi sinh vật đã được làm
thuần vào trong phần nghiêng và phần sâu của môi trường. ủ ở 37.0 ±1.0oC trong khoảng 18-24
giờ. Nắp ống nghiệm không nên vặn quá chặt để duy trì tình trạng hiếu khí và tránh lượng H 2S ứ
đọng quá nhiều. Sau khi nuôi cấy, Salmonella chuyển pH của môi trường sang kiềm trên phần
nghiêng (màu đỏ) và sang acid ở phần sâu (màu vàng), có hay khơng có H 2S (xuất hiện những vệt
màu đen trong môi trường).
Thử nghiệm Lysin Decarboxylase: Cấy vi sinh vật đã được làm thuần vào môi trường
canh Lysin decarboxylase. Vặn chặt nắp và nuôi ủ ở 37.0 ±1.0oC trong khoảng thời gian 48 giờ
nhưng phải kiểm tra sau 24 giờ. Salmonella làm kiềm môi trường Lisin decarboxylase, giữ ngun
màu tím của mơi trường (phản ứng dương tính). Phản ứng âm tính khi mơi trường chuyển thành
màu vàng.
Thử nghiện Urease: Dùng kim cấy vô trùng cấy vi sinh vật đã được làm thuần vào môi
trường canh urea phenol red broth. Nuôi ủ ở 37.0±1.0oC trong khoảng 24 giờ kèm theo ống môi
trường đối chứng không cấy vi sinh vật. Salmonella cho phản ứng âm tính với mơi trường canh
urea (không chuyển sang màu đỏ).
Thử nghiệm trên môi trường Mannitol phenol red : Cấy vi sinh vật đã được làm thuần vào
canh Mannitol phenol red. Không nên vặn chặt nắp ống nghiệm. Nuôi ủ ở 37.0±1.0oC trong
khoảng 48 giờ, nhưng phải kiểm tra sau 24 giờ. Salmonella làm acid hóa mơi trường qua sự xuất
hiện màu vàng (phản ứng dương tính).
Thử nghiệm Indol: Cấy một lượng nhỏ vi sinh vật đã được làm thuần vào ống canh
Tryptone. ủ ở 37.0±1.0 oC /24 giờ. Chuyển 5 ml canh dịch sang 1 ống nghiệm khác. Thêm vào 0.2
- 0.3 ml thuốc thử Kovac’s. Hầu hết Salmonella cho phản ứng âm tính, khơng có sự xuất hiện màu
đỏ trên bề mặt môi trường nuôi cấy.
Thử nhiệm phản ứng Voges- Proskauer:
Cấy vi sinh vật đã được làm thuần vào ống
o

nghiệm chứa canh MR-VP và ủ ở 37.0±1.0 C trong khoảng 24 giờ. Chuyển 1ml sang ống nghiệm
68


có kích cở 13x100 mm. Thêm 0.6 ml (-napthol và 0.2 ml KOH 40%, lắc đều. để yên trong hai giờ.
Salmonella cho phản ứng VP âm tính (khơng có sự xuất hiện màu đỏ hồng trong ống nghiệm).
Khẳng định bằng thử nghiệm kháng huyết thanh
Thử nghiệm kháng huyết thanh phải được tiến hành song song với mẫu trắng (dung dịch nước
muối sinh lý) nhằm loại trừ khả năng ngưng kết giả. Dùng kháng huyết thanh Salmonella
polyvalent O và Salmonella polyvalent H.
9.5 Trình bày kết quả: Khơng có (hoặc có) Salmonella được phát hiện trong 25g mẫu.
9.6 An toàn Salmonella là vi khuẩn gây bệnh.
Khi làm việc với các chủng chứng dương, kiểm nghiệm viên cần thận trọng và tuân thủ các
qui định về an tồn phịng thí nghiệm để tránh nhiễm bệnh hoặc làm lây lan mầm bệnh.
10. XÁC ĐỊNH SHIGELLA TRONG THỰC PHẨM
10.1

Định nghĩa
Shigella là trực khuẩn gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, Catalase dương (trừ Shigella
dysenteriae), oxidase âm, lactose âm (trừ một vài chủng) và H 2S âm. Hầu như các chủng Shigella
không sinh hơi từ glucose. Ngoài ra hầu hết các loài thuộc giống Shigella không thể lên men và
tạo acid từ Duciltol, không có enzym lisine decarboxylase.
Giống Shigella gồm 4 lồi như sau:
Shigella dysenteriae: thuộc nhóm kháng huyết thanh A, trong đó có 10 serovar. Các dịng
trong nhóm này khơng lên men được mannitol.
Shigella flexneri thuộc nhóm kháng huyết thanh B bao gồm 6 serovar. Có thể chia thành
nhiều subserovar khác nhau, tuỳ theo sự hiện diện của các nhân tố kháng nguyên khác nhau trong
nhóm này.
Shigella boydii thuộc nhóm kháng huyết thanh C. Bao gồm 15 serovar. Tất cả các dịng
trong nhóm này đều lên men cà sinh acid từ mannitol.

Shigella sonnei nhóm kháng huyết thanh D chỉ có một serovar khác biệt. Nhóm này lên
men được mannitol.
Shigella là vi sinh vật gây nên bệnh Shigellosis, đây là một bệnh nguy hiểm có thể lan
truyền rất nhanh trong cộng đồng. Sự lan truyền phổ biết nhất là từ người sang ngưới. Những trẻ
em có điều kiện vệ sinh cá nhân kém, sống trong điều kiện thiếu thốn phương tiện vệ sinh là điều
kiện để lan tuyển dịch bệnh này. Shigella cũng được lan truyền qua đường thực phẩm và nước
uống. Nguồn nhiễm Shigella vào thực phẩm thực chủ yếu là từ nguyên liệu, từ nước, hay từ công
nhân chế biến. Các loại thực phẩm thường xuyên phân lập được Shigella là các món salad, thịt
băm thủy sản …
Liều lượng gây ngộ độ thực phẩn do Shigella rất thấp, có thể 10 tếbào/g sản phẩm củng có
nguy cơ gây ngộ độc. Vì vậy việc kiểm soát Shigella ytrong thực phẩm phải rất nghiêm ngặt, đòi
hỏi phương pháp kiểm nghiệm phải rất nhạy, các qui trình thực hiện phải kiểm sốt chặt chẻ.
10.2 Ngun tắc
Một lượng mẫu xác định được tăng sinh trong môi trường lỏng khơng chọn lọc, sau đó
được chuyển vào mơi trường tăng sinh chọn lọc, dịch khuẩn sau khi tăng sinh chọn lọc được cấy
phân lập trên ít nhất 2 đĩa môi trường thạch đĩa với mức độ chọn lọc khác nhau. Khuẩn lạc nghi
ngờ được kiểm tra bằng thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh.
10. 3. Thuốc thử và môi trường
3 Môi trường chọn lọc và không chọn lọc:
- Canh Tryotose soya

69


- Canh Gram negative
Môi trường chọn lọc:
- Thạch MacConkey
- Thạch Xylose lysine desoxycholate
- Thạch Hektoen enteric
Môi trường và thuốc thử sinh hoá:

- Thuốc thử Oxidase
- Thuốc thử catalase
- Thạch Triple sugar iron
- Mơi trường thử nghiệm tính di động
- Mannitol phenol red broth
- Duciltol phenol red broth
- Lisine decarboxylase broth
Kháng huyết thanh: bao gồm các loại huyết thanh như sau: polyvalent A; B; C; D
10.4 Qui trình phân tích tiến hành
Tiền tăng sinh
Lấy 25g mẫu cho vào túi dập mẫu, thêm 225ml canh Tryptone soya. Sau khi đồng nhất
mẫu, đo pH và nếu cần chỉnh về pH 7.0 ±0,2. Buộc chặt miệng túi và ủ ở 37.0 oC trong khoảng
thời gian 16 - 20 giờ. Có thể cho mẫu vào trong các bình tam giác, sau khi chỉnh pH ủ các bình này
trong điều kiện kỵ khí ở nhiệt độ và thời gian như trên.
Tăng sinh chọn lọc
Chuyển 0,1ml dịch tiền tăng sinh sang 10ml canh thang tăng sinh GN. ủ ở 37.0 oC trong
thời gian 16 - 20 giờ.
Phân lập:
Dùng khuyên cấy cấy từ canh thang tăng sinh lên các môi trường thạch đĩa chọn lọc. Vi
khuẩn Shigella là vi sinh vật rất nhạy cảm với điều kiện môi trường ni cấy vì thế đế có thể phát
hiện được Shigella với hiệu suất cao nhất, nên sử dụng ít nhất hai loại mơi trường phân lập khác
nhau. Có các loại mơi trường phân lập có cường độ chọn lọc khác nhau được sử dụng cho Shigella
như: Tergitol – 7 agar, XLD (Xylose lisine desoxycholate agar), Hektoen Enteric agar và MAC
(Macconkey agar). Sau khi cấy, ủ các đĩa môi trường ở nhiệt độ 37.0oC trong thới gian 24-48 giờ.
Biểu hiện của Shigella trên các môi trường phân lập như sau:
Trên môi trường Tergitol – 7 agar: môi trường sau khi pha chế có màu xanh hơi vàng nhẹ,
có màu đục sữa. Khuẩn lạc xuất hiện trên mơi trường này có màu xanh nhạt.
Trên mơi trường MacConkey agar: Khuẩn lạc có màu nâu đỏ, trong suốt.
Trên môi trường XLD: Khuẫn lạc Shigella có màu đỏ, trong suốt
Trên mơi trường Dexoxycholate citrate agar, mơi trường có màu đỏ cam, hơi đục. Khuẩn

lạc Shigella trên mơi trường này có màu đỏ nhạt.
- Trên Hektoen entric agar: Khuẩn lạc có màu xanh nhạt, trong xuốt.
10.5 Khẳng định bằng trắc nghiệm sinh hóa
Từ các khuẩn lạc nghi ngở trên mơi trường phân lập, chọn ít nhất 5 khuẩn lạc cấy lên môi
trường không chọn lọc (như TSA), ủ ở nhiệt độ 37 oC trong thới gian 20-24 giờ. Các khuẩn lạc xuất
hiện trên môi trường này được sử dụng để thử nghiệm sinh hoá và kháng huyết thanh.
Thử nghiệm sàn lọc
Các dòng được nghi ngờ là Shigella được cấy vào môi trường TSI, ủ ở 37 oC trong 24 giờ.
Shigella cho phản ứng kiềm trên mặt nghiên và acid ở phần sâu. Không sinh hơi và khơng có H 2S

70


được tạo thành trong mơi trường. Các dịng có phản ứng như trên được thử nghiệm để khẳng định
Shigella
Thử nghiệm khẳng định
Phản ứng đạc trưng của các dòng Shigella được thể hiện trong bảng sau:
TT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
11
12
13

14

Thử nghiệm sinh hoá
Phản ứng
Simmon citrate
Arginine decarboxylase
Lisine decarboxylase
Urease
Malonate
MR
+
VP
Salicine
Xylose
Cellobiose
Adonitol
Ducitol
Inositol
Bảng 1: Các phản ứng sinh hoá đạc trưng của Shigella spp

Các vi sinh vật có các phản ứng sinh hoá đạc trưng như trên được khẳng định là Shigella
spp. Để xác định loài Shigella nhiễm vào trong mẫu, các phản ứng sinh hố đạc trưng của từng lồi
như bảng sau:
Sinh gas
Glucose
Beta Galactose
Ornithin
decarboxylase
Indol
Acid from

Dulcitol
Lactose
Mannitol
Raffinose
Saccharose
Xylose

từ

S. dysenteriae
-

S. flexneri
-

S. boydii
-1

S. sonnei
-1

+/-1
-

-

+/-1

+
+

+/-2

+/-2

+/-

-

-4
-

-4
-1
+
+/-

-1
+
+/-

+3
+
+3
+3
-

1: Các dịng S.dysenteriae 1 và S.sonnei phản ứng dương tính
2: S.dysenteriae 1; S. flexneri 6 ln cho phản ứng âm tính; S.dysenteriae 2 có phản ứng dương tính
3: Phản ưng dương tính chỉ biểu hiện khi thời gian ni cấy q 24 giờ.

4: S.dysenteriae và S.flexneri 6 có thể cho phản ứng dương tính.

Phản ứng sinh hố phân biệt các lồi Shigella
Xác định bằng thử nghiệm huyết thanh kháng: Thực hiện thử nghiệm kháng huyết thanh
bằng huyết thanh đa giá A, B,C,D từ các lứa cấy trên môI trường thạch không chọn lọc. Phải tiến
71


hành các đối chứng ấm tính trên nước muối sinh lý để tránh hiện tượng ngưng kết giả có thể diễn
ra.
Trong một số trường hợp Shigella tạo thành kháng nguyên bề mặt (kháng nguyên K) có thể
làm che mất kháng nguyên O và làm cho phản ứng ngưng kết không diễn ra. Vì thế khi khơng có
biểu hiện ngưng kết, đun sôi dịch vi khuẩn trong khoảng 30 phút để loại bỏ kháng nguyên bề mặt.
Sau đó tiến hành thử nghiệm ngưng kết trở lại.
10.5 Báo cáo kết quả
Phát hiện hay không phát hiện Shigella trong 25g mẫu.
10.6
Biện pháp an tồn
Shigella là vi khuẩn gây bệnh rất nguy hiểm, có thể biểu hiện bệnh khi mật độ xâm nhiễm
rất thấp. Vì thế khi làm việc với các chủng đối chứng dương tính người phân tích cần phải thận
trọng, các mơi trường, mẫu vật sau khi nuôi cấy phải được hấp tiệt trùng trước khi rửa hay thải vào
môi trường.
11. Vibrio cholerae và Vibrio parahaemolyticus
11.1 Phạm vi áp dng
Phơng pháp này (tham chiu theo Sỉ tay ph©n tÝch vi sinh cđa FDA tái bản lần th 8 năm
1995) dng đ phát hin Vibrio cholerae và Vibrio parahaemolyticus trong thc phm. Phơng pháp
này không áp dng cho hàu (Oyster).
11.2 Nguyên tắc
Phát hin Vibrio cholerae và Vibrio parahaemolyticus trong thc phm đc thc hin bằng
cách cân 1 lng mu , nuôi trong môi trng lng chn lc. T môi trng này, cy chuyn sang môi trng

rắn chn lc. Những khun lạc ging Vibrio cholerae và Vibrio parahaemolyticus s đc th nghim
sinh ha.
11.3 Môi trng và thuc th
- Thạch Thiosulphate citrate Bile salt sucrose (TCBS agar)
- Peptone kiỊm c 1% NaCL
- M«i trng di đng
- TSA + 1,5% NaCl
- Thạch Triple sugar iron
- ONPG
- Thuc thư Oxydase
- O/129 Vibriostaticum dics containing 150 and 10 µg 2,4-diamino-6,7-di- isopropylpteridine.
- Thuc thư Cytochrome oxidase
- Arginine decarboxylase
- Lysine decarboxylase
- Fermentation: - Sucrose, lactose, mannitol
- Urea phenol red broth
- Na desoxycholate 5% (String test solution)
- KOH
11.4 Thit bÞ chính
- T m 37.0 1.0oC
11.5 Quy trình
Tăng sinh: Cân 25g mu cho vào ti vô trng, thêm vào 225ml APW. Dp mu trong 2 phĩt, đ
37.0± 1.0oC trong 16 – 18 gi .

72


Đ đa và đc kt quả trên đa: T môi trng tăng sinh, cy ria lên môi trơng thạch TCBS, trong
18-24h 37.0 1.0oC.
Trên môi trngTCBS agar:

Khun lạc V.cholera tròn, lớn c đng kính 2-3mm, màu vàng
Khun lạc V.para tròn, lớn c đng kính 3-4mm, màu xanh.
11.6
Th nghim sinh ha
T các khun lạc nghi ng trên TCBS, cy chuyn sang m«i trng TSA c bỉ sung 1.5% NaCl, đ
37.0± 1.0oC trong 12-24 gi.
Thư nghiƯm s¬ b
Thử nghiệm
Vibrio
Vibrio cholerae
parahaemolyticus
Thử nghiệm TSI
K/A - K/A - Tính di động
+
+
Oxydase
+
+
KOH
+
+
Thử nghiệm khẳng định
Thử nghiệm
Vibrio
Vibrio cholerae
parahaemolyticus
Khả năng phát triển
0% NaCl
+
6% NaCl

+
+
8% NaCl
+
10% NaCl
Tạo Acid từ :
Sucrose
+
Lactose
Maninitol
+
+
ONPG
+
ADH
LDC
+
+
Urease
+
+
Nhạy cảm với:
10 µg O/129
R
S
150 µg O/129
S
S
Thử nghiệm kháng huyết thanh với V. cholerae
V. cholerae đa giá O1 và non – O1

V. cholerae đơn giá: Inaba, Ogawa, Hikojima
non-O1 group:O139
12. ĐỊNH TÍNH LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG THỰC PHẨM
1.2 Định nghĩa
Listeria monocytogenes có hình gậy ngắn, mảnh, gram dương trong lứa cấy 20 giờ, phản
ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, chuyển động xoay tròn thành đợt trong tiêu bản giọt treo
và di động tạo hình dù trong phép thử tính di động (ở 20-25 oC). Có khả năng thủy giải esculin và
khả năng làm tan huyết (trên môi trường thạch máu. Listeria monocytogenes tạo acid từ đường
73


rhamnose, nhưng không tạo acid từ đường xylose. Cho phản ứng CAMP dương tính với
Staphylococcus aureus, và âm tính với Rhodococcus equi.
Listeria monocytogenes thường được tìm thấy trong thực ăn gia súc, trong nước, nước thải.
Đây là một vi sinh vật gây bệnh rất nguy hiểm, bệnh do chúng gây ra được gọi là Listeriosis, bệnh
này có tỉ lệ tử vong rất cao, đối với người lớn tỉ lệ này khoảng 30-35 %, đối với trẻ em tỉ lệ này lên
đến 70%, các biểu hiện của loại bệnh này như sau: nhiễm trùng máu, sẩy thai ở phụ nữ, viêm
màng não, gây tử vong thai nhi. Vi sinh vật này đặc biệt nguy hiểm trong các loại thực phẩm đã
qua gia nhiệt. Các qui định về an toàn vệ sinh thực phẩm thường không cho phép sự hiện diện của
Listeria monocytogenes trong 25g thực phẩm qua gia nhiệt nhưng cho phép 100 cfu/g đối với thực
phẩm phải gia nhiệt trước khi sử dụng.
12.2 Ngun tắc
Qui trình định tính Listeria monocytogenes được thực hiện qua quá trình tăng sinh hai giai
đoạn. Mẫu được cân vào trong túi chứa vô trùng, đồng nhất mẫu với môi trường tăng sinh sơ cấp.
Sau khi ủ 24 giờ, dịch nuôi cấy được chuyển vào môi trường tăng sinh thứ cấp và nuôi ủ tiếp 24
giờ nữa. Hiện nay đã có qui trình cải tiến của qui trình trên, chỉ sử dụng quá trình tăng sinh một
giai đoạn nhưng thời gian tăng sinh vẩn kéo dài 48 giờ. Qui trình tăng sinh một giai đoạn được
thực hiện khi các mẫu có mật độ vi sinh vật nhiễm vào nhỏ. Trong khi đó qui trình tăng sinh hai
hai giai đoạn nên sử dụng trong việc phân tích các mẫu có mật độ vi sinh vật lơn.
Trong một số trường hợp có thể yêu cầu định lượng hay bán định lượng mật độ vi sinh vật này

trong mẫu.
Sau giai đoạn tăng sinh, canh khuẩn được chuyển sang giai đoạn phân phân lập trên môi trường
chọn lọc đặc trưng. Khằng định các khuẩn lạc nghi ngờ bằng các đặc tính hình thái, sinh lý và sinh
hố và miễn dịch bằng các thử nghiệm đặc trưng.
Chủng vi sinh vật khác được dùng để đối chứng và thử nghiệm
Listeria monocytogenes
Listeria innocua
Staphylococcus aureus, dung huyết β yếu
Rodococcus equi.
12.3 Môi trường và thuốc thử
Giai đoạn tăng sinh:
Canh tăng sinh sơ cấp LBI (Listeria enrichment broth I): được chuẩn bị trong các bình chứa
lớn để đồng nhất với mẫu.
Canh tăng sinh thứ cấp LBII (Listeria enrichment broth II): được chuẩn bị trong các ống
nghiệm, mỗi ống 10ml.
Môi trường EB (enrichment broth): là môi trường cải biên từ môi trường LB được sử dụng
trong qui trình tăng sinh một giai đoạn.
Mơi trường phân lập : Oxford agar được chuẩn bị trên các đĩa.
Các môi trường và thuốc thử dùng trong các thử nghiệm sinh hoá:
Thạch máu (Blood Agar): nên sử dụng máu cừu hay máu của bê non dưới 5 tháng tuổi để
pha chế môi trường.
Mơi trường thạch mềm dùng trong thử tính di động: Môi trường BHI được bổ sung 3-5g
agar/lit. phân phối vào trong các ống nghiệm, mỗi ống 5ml.
Rhamnose phenol red broth và Xylose phenol red broth.
Thuốc thử catalase
Thuốc thử oxydase
12.4 Dụng cụ và thiết bị

74

Tủ ấm: 25oC, 30.0oC, và 37oC .
Phiến kính giọt treo.
12.5 Tiến hành thử nghiệm
Tăng sinh: Lấy 25 gam mẫu, thêm vào 225ml môi trường tăng sinh LBI. Đồng nhất mẫu 30
giây. ủ 30oC trong thới gian 24 giờ, chuyển 0,1 ml LBI sang 10 ml LBII, ủ 30C trong 24giờ
Qui trình tăng sinh một giai đoạn: Cân 25 gam mẫu, thêm vào 225 ml canh EB. Canh EB
phải được làm ấm ở 45oC nếu mẫu thử là các sản phẩm của sữa và 30 oC đối với các sản phẩm khác
trước khi cho vào mẫu. Đồng nhất mẫu 30 giây. U 30oC trong 48 giờ
Phân lập:Dùng tăm bông vô trùng thấm dịch mẫu từ ống tăng sinh, cấy trang sang 1/2 đĩa
môi trường Oxford agar, từ những vệt cấy này dùng que cấy vòng ria sang 1/2 đĩa còn lại. ủ ở
37oC
/24 - 48 giờ. Trên môi trường Oxford agar khuẩn lạc Listeria spp. đặc trưng, có màu xám hay
nâu được bao quanh bởi vòng đen, khuẩn lạc lõm, nhỏ, khoảng 1mm
Khẳng định
Thử khả năng tan huyết: Chọn khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường thạch Oxford cấy
chuyển sang môi trường thạch máu. ủ 37 0C 24-48 giờ. Trên môi trường thạch máu khuẩn lạc L.
monocytogenes được bao quanh bởi vòng tan huyết hẹp do hiện tượng dung huyết dạng β. Trước
khi tiến hành phép thử khẳng định L.monocytogenes, Chuyển khuẩn lạc nghi ngờ
L.monocytogenes sang môi trường canh thang không chọn lọc, ủ 25oC trong khoảng 20 giờ.
Thử catalase:Listeria monocytogenes catalase dương tính.
Nhuộm gram:Listeria spp. Gram dương.
Thử khả năng di động phương pháp giọt treo: Listeria spp. chuyển động nhào lộn trong
canh trùng ủ ở 25oC.
Thử tính di động trong ống nghiệm: Cấy vi trùng bằng cách đâm sâu vào thạch mềm trong
ống nghiệm. ủ 25oC trong khoảng 40 giờ hoặc lâu hơn. Kiểm tra sự phát triển xung quanh đường
cấy đâm sâu. Listeria spp. di động tạo hình chiếc dù cách bề mặt thạch vài mm
Khả năng biến dưỡng đường: ủ các ống canh trùng thử khả năng lên men đường ở 37 oC
trong vòng 7 ngày. Kết quả dương tính (màu vàng) thường quan sát được trong vịng 24 - 48 giờ.
L.monocytogenes lên men đường rhamnose nhưng không có khả năng lên men đường xylose.

Chủng kiểm tra

L. monocytogenes

S. aureus

R. equi

L. innocua

75


Sơ đồ thử phản ứng CAMP
Thử phản ứng CAMP: Trên đĩa thạch dùng để thử phản ứng CAMP, cấy một đường cấy
mỏng chủng S.aureus song song và cách 4 cm với đường cấy của chủng R.equi. Cấy chủng nghi
ngờ Listeria ở giữa, gần nhưng không chạm vào hai đường cấy trên. Một đĩa có thể cấy một hoặc
nhiều dịng vi khuẩn nghi ngờ L.monocytogenes. Cấy chủng dương và L.innocua. ủ ở 37oC trong
khoảng 20-36 giờ. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vùng cộng hưởng tan huyết ngay tại ranh
giới của chủng thử và S.aureus hoặc R.equi. Phản ứng CAMP dương tính với R.equi sẽ tạo vùng
dung huyết rộng (5 – 10 mm) và có hình dạng đầu mũi tên. Phản ứng dương tính giữa
L.monocytogenes với S.aureus thường tạo vùng tan huyết hẹp (khoảng 2mm) có dạng hình trịn.
L.monocytogenes cho phản ứng CAMP dương tính với S.aureus và âm tính với R.equi, kết qủa
phản ứng CAMP có thể rất khác nhau giữa các chủng L.monocytogenes, L.innocua có phản ứng
CAMP âm tính với cả hai lồi S.aureus và R.equi.
12.6 Kết quả:Báo cáo phát hiện hoặc không phát hiện L.monocytogenes trong 25 g mẫu.
12.7 Biện pháp an toàn: L.monocytogenes là nguyên nhân gây ra một số bệnh đặc biệt nguy hiểm.
Nhân viên đang mang thai, người suy yếu hệ miễn dịch,... không nên trực tiếp làm việc với các vi
sinh vật này.Khi tiến hành thử nghiệm Listeria, các thao tác phải hết sức cẩn thận. Tốt nhất, nên

phân khu vực dành riêng cho các hoạt động thử nghiệm Listeria. Các sản phẩm hau dụng cụ sau
khi nuôi cấy phải được hấp tẩy trùng khươc khi rửa hay loại bỏ
13. XÁC ĐỊNH ENTEROCOCCUS TRONG THỰC PHẨM
13.1

Định nghĩa
Enterococcus là vi khuẩn có hình cầu, hay hình oval kéo dài, gram dương, thường tụ tập
thành từng đôi hay từng chuổi. Chúng không di động, không sinh bào tử, một số dịng có tạo vỏ
nhầy. Hầu hết các lồi thuộc nhóm này sống hiếu khí tuỳ nghi như ng phát triển tốt trong điều kiện
kỵ khí. Enterococcus phát triển trong môi trường nuội cấy, các vi sinh vật khác sẽ bị ức chế do có
sự tạo thành bacteriocine.
Khi ni cấy trong mơi trường có cơ chất azide tetrazolium, khuẩn lạc hình thành có màu
hồng đến màu đỏ đậm do có sự khử triphenyl tetrazolium chloride. Để đảm bảo các khuẩn lạc hình
thành trên mơi trường chọn lọc có hình hình dạng đặc trưng, các khuẩn lạc này phải khơng nằm
q gần nhau.
Enterococcus khơng có enzym catalase, và khơng các cytochrom C (phản ứng oxydase âm
tính) chúng có thể phát triển được trong mơi trường có 6.4% muối NaCl ở pH 9.6 khi nuôi cấy ở
nhiệt độ 45oC. Theo phương pháp này, các lồi thuộc nhóm Enterococcus thuộc nhóm D được phát
hiện, các lồi này bao gồm: Enterococcus faecalis; E. faecicum, E.avium và E.durans.
Các đặc điểm sinh hố quan trọng được thể hiện như sau:
Lồi
E.faecalis
E.faecicu
m
E.durans

Phát triển được ở
10oC
44oC

ADH

+
+

+
+

+
+

+

+

+

Có khả năng sinh acid từ các nguồn carbohydrate
Mannito Sorbitol
Sucrose
arabinos Adonotol
l
e
+
+
+
+
v
+
+

-

76

-

-

-

-


E.avium

v*

+

-

+

+

+

v

+

v: phản ứng không ổn định (variable)

E. faecalis: đây là vi sinh vật thường xuyên được tìm thấy trong ruột già của người, chúng
được coi là nhân tố chỉ thị ô nhiễm phân. Thỉnh thoảng tìm thấy vi sinh vật này trong ruột gà
nhưng ít khi tìm thấy trong động vật khác. Chúng có thể phát triển được trong mơi trường có
0.03% potassium tellurite.
S. faecicum: chúng thường hiện diện trong ruột lợn và các vật khác. Đây là một trong
những vi sinh vật gây hư hỏng các sản phẩm như jambon và thịt nguội. Không thể phát triển trong
môi trường có có 0.03% potassium tellurite. Đây là lồi vi sinh có khả năng kháng kháng sinh cao
nhất so với các lồi khác trong nhóm Enterococcus.
S. durans: thường được tìm thấy trong sữa và các sản phẩm của sữa, khơng tìm thấy trong
các mẫu bệnh phẩm.
S. avium: hiện diện trong ruột gà và một số động vật khác. Vi sinh vật khơng tìm thấy trong các
mẫu bệnh phẩm.
13.2 Ngun tắc
Sự hiện diện của Enterococcus được coi như là một nhân tố chỉ thị chất lượng vệ sinh của
thực phẩm. Số lượng Enterococcus được xác định bằng cách cấy một lượng mẫu biết trước lên bề
mặt môi trường chọn lọc cho Enterococcus, sau khi ủ đếm các khuẫn lạc đặc trưng, khẳng định các
khuẩn lạc đã đếm bằng các thử nghiệm sinh hoá. Trong trường hợp nghi ngờ các vi sinh vật bị
thương tổn trong quá trình chế biến hay bảo quản, cấy mẫu vào trong môi trường không chọn lọc,
ủ ở 37oC trong 2 giờ, sau đó phủ một lớp mơi trường chọn lọc lên trên. Cac đĩa môi trường sau khi
cấy được ủ ở 44oC trong khoảng 48 giờ.
13.4 Môi trường và thuốc thử
- Enterococcus agar được chuẫn bị trên các đĩa petri, làm khô bề mặt trước khi sử dụng.
- Tryptose soy agar
- Brain heart infusion chứa 6.5% NaCl được phân phối vào trong các ông nghiệm, mỡi ống
5ml.
- Brain heart infusion có pH 9.6 được phân phối vào trong các ông nghiệm, mỡi ống 5ml
- Thuốc thử catalase (H2O2)

- Thuốc thử oxydase: N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine
13.5 Thiết bị
- Tủ ấm 37oC
- Tủ ấm 44oC
13.6
Phương pháp thực hiện.
Chuẩn bị mẫu: Mẫu được chuẩn bị và pha loãng thành các nồng độ phù hợp bằng dung
dịch pha loãng sao cho sau khi cấy 0.1 ml vào đĩa sẽ xuất hiện 100-150 khuẩn lạc.
Cấy mẫu: cấy 0.1 ml lên bền mặt môi trường chọn lọc Enterococcus agar , trang đều khắp
bề mặt đĩa bằng que trang tam giác.
Trong trường hợp nghi ngờ các vi sinh vật trong mẫu bị yếu hay thương tổn do quá trình
chế biến và bảo quản, cấy 1ml mẫu vào trong đĩa petri trống, đổ 5-6ml môi trường tryptose soy
agar đã được làm nguội trong bể điều nhiệt đến 45 oC, lắc để mẫu phân tán đều vào trong môi
trường, ủ ở 37oC trong khoảng 2 giờ. Đổ 10-12ml môi trường enterococcus agar lên trên mặt.
Lật ngược đĩa petri và ủ ở 44oC trong khoảng thới gian 2 ngày.
Đếm tất cả các khuẩn lạc có màu hồng đến màu đỏ đậm, có thể có một vịng khơng màu
xung quanh khuẩn lạc, kích thước các khuẩn lạc này khoảng 0.5-3mm, khơng đến các khuẩn lạc
khơng có màu.
77