Một số ứng dụng của sinh học phân tử trong chẩn đoán và điều trị bệnh di truyền

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền
Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NỐNG LÂM TP.HCM
Bộ MÔN
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
I. KHẢI QUẮT
CHUNG
ìĩằ. 03 Ể£
Trong y học hiện đại, môn sinh học phân tử (SHPT) đóng vai trò hàng
đầu giúp hiểu biết được cơ chế sinh bệnh và từ đó ứng dụng vào việc chẩn
đoán và chữa bệnh. Trong đề tài này, chúng tôi nêu một số thí dụ về việc
xử dụng những hiểu biết thu được từ ngành khoa học này trong việc chữa
trị một số bệnh di truyền
Sơ

lược

về

sinh

học

phân

tử.

Định nghĩa một cách tóm tắt, SHPT là ngành khoa học khảo cứu ở mức độ
phân tử (molecular level) cấu trúc (structure) của sinh vật ; và nhất là cơ
chế hoạt động và điều tiết (regulation), sự tác dụng hỗ tương (interaction)
của các phân tử này.

SHPT nhắm vào việc tìm hiếu ở mức độ phân tử sự liên hệ giữa các cơ
quan của một sinh vật, cũng như sự liên hệ giữa các sinh vật với nhau (thí
\
dụ, cơ chế sinh sản và di truyền), và sự thích ứng của sinh vật với môi
trường chung quanh.
Từ "sinh học phân tử" đã được xử dụng từ những năm 1930, nhưng
ngành khoa học này chỉ bắt đầu được chú ý đến nhờ những thành công
trong việc nghiên cứu về DNA như là đơn vị cơ bản của sự di truyền, nhất
là GVHD
nhờ việc :khám phá cấu trúc trong không gian của DNA . Với những tiến
bộ về kỹ thuật trong những năm gần đây, với sự đóng góp đắc lực của các
DH06SH - NHÓM
máy tính, SHPT trở thành ngành "mũi nhọn" của sinh học và y học.

ĐỖ Phong Lưu
Nguyễn Thị Hoa Thùy


/5
p)Inside a
nerve cell
0

n

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền
Sinh
học phân
tử trong chẩn
đoán bệnh

II. MÔT SỎ BÊNH
DI TRUYỀN
THƯỜNG
GĂPdi: truyền

Lysosome

ells in children with Tay-Sachs disease

hildren with Tay-Sachs lack Hex-A, so the GM2 proliíerates to such
degree that
1) aBệnh
Tay-sachs
it
eventually
(ills the cell. gradually shutting dovvn the Central nervous System.
Hex-A ereyme is not present......GM2 accuirailates... ...and in tirne chokes of
the cells.

s

Cells in healthy children

:

**ỊỈắ
t
ấ1
PEI
»*

(
ế
*
Ế
4
iw ị t i
<

Đây là một bệnh di truyền, thường gặp ở người châu Ầu, do thiếu gen
mã hóa tống hợp enzym hexozaminidaza A. Đây là một enzym ưa acid
nằm trong tiêu thể, có tác dụng phân hủy gangliozid GM2. Gangliozid

4

44m

GM2 làT glycolipid thành phần chính của vỏ bao myelin thần kinh.Do
không có enzym phân hủy,glycolipid này tích lũy và ứ đọng gây ra

44

ị

hiện tượng chậm phát triển, rối loạn tâm thần, mù lòa, tai biến ngập

Diagrams
nottoscale

tl’I
OÔ

UC
I&

W
.*
M
'M
V

H
SI
O
N


30URCES: Un&erslty Hospitals; The National ty-Sachs ỉ Allied Dlseases Assodatio*; healthllne.com; boMistifhwrks.com

REID BROWNI THE PLAIN DEALER

Hình 1&2 : Cơ chế của bệnh Tay-sachs

2 ) Bênh Huntington :

Vào thời Trung cổ, điệu múa giật ( chorée ) một đặc trưng của

bệnh Huntington, bị coi là vũ điệu của Saint-Guy. người ta kết tội bệnh
nhân là bị qủy ám, qủy nhập và đưa họ lên giàn thiêu. Tới thế kỷ 17, ở
Salem. Mỹ, người ta vẫn kết tội họ là phù thuỷ và giết họ. Phải chờ tới
năm 1872, một người Mỹ, ông George Huntington, mô tả bệnh này
một cách khoa học, người ta mới biết đây là một chứng bệnh về thần

kinh.


Sinh
Sinh
học
học
phân
phân
tửtử
trong
trong
chẩn
chẩn
đoán
đoán
bệnh
bệnh
di di
truyền
truyền
thời gian dài, căn bệnh di truyền bất trị này
Ngày nay, Tuy
các nhiên
nhà suốt
thầnmộtkinh
bệnh học đã biết đích xác nguyên

vẫn đuợc xem là

nhân

một

thảm

kịch

Huntington. Huntington là một bệnh

gia

đình,

một

di truyền của hệ thần kinh trung

điều

đáng

xấu

và

bệnh

điệu

múa

giật

của

bệnh

uơng, thường biểu hiện ở tuổi từ 25

hổ

đến 55. Não dần dần bị thoái hóa
gây nên các triệu chứng ban đầu nhu

;

The gene'i DNA il Ironiloled into amino otidi
whi(h (orm the abnormal hưntingtin protein.

nhân được đem
5 '
, •'

*'

■ 31

•

giấu đi, cả thầy

' * \ \ u ỉ l' \ "polor lip

Ponibl

cử động vô thức và rối loạn thăng

thuốc

bằng. Khi bệnh nặng lên, các chức

không biết. Mãi

năng sống nhu ngôn ngữ và đi lại có

đến

cũng

năm

1958,

thế bị sút giảm. Bệnh Huntington bị cho là có liên quan đến phiên bản
khiđộtca sĩ người
biến của protein huntingtin gây phá hủy
xác định
Mỹ chưaWoody
RNAmô não.Nhưng hiện

polymeras
được chức năng của protein huntingtin
"bình thường" Guthie
ở ngườiquakhông
đời, bị
e II
bệnh.

nguyên nhân cái

Các nhà nghiên cứu thuộc Trường ĐH Milan, Italia
thấy
chết phát
đượchiện
công
protein huntingtin kiểm soát việc sản sinh yếu tố hướngbốthần thì
kinh của
côngnão
GC-box TATA Ịoík*, dop&mlnệ Dỉ rệpệptọr gene

(BDNF), thiết yếu đế duy trì loại tế bào não bị chết
trong
chúngđimới
biết bệnh
Những bệnh nhân có protein huntingtin đột biến không thế sản
rõ Huntington.
hơn vê bệnh này.
sinh được lượng BDNF thích hợp, dẫn đến thoái hóa não. Từ trước đến nay,
người ta cho rằng bệnh Huntington là do hoạt tính độc của protein đột biến.
Nghiên cứu này đã cho thấy có hiện tượng mất chức năng bình thường.

Sự gia tăng hàm lượng BDNF có thế có lợi cho bệnh nhân Huntington.
Các nhà nghiên cứu đang tìm ra các thuốc bắt chước hoạt động của protein
huntingtin bình thường, làm tăng sản sinh BDNF đế điều trị bệnh.


Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền

Hi'nh 5: Co’ chế cuả bệnh Himtington

2)aBệnh
) BệnhThaỉassemia
Thalassemỉa là: gì?
Thalassemia là bệnh lý thiếu máu di truyền thường gặp nhất tại Việt
nam và các quốc gia vùng Đông Nam Á, Địa Trung Hải. Bệnh có nhiều
thế lâm sàng; thế bệnh nặng thì bệnh nhân cần phải truyền máu suốt đời và
ảnh hưởng tới tuổi thọ.
b )Nguyên nhân bệnh
Thalassemia?

heme
a Chain

Hemoglobin

là

protein

trong hồng cầu có chức năng red blood cell
\\ Chain

vận chuyển oxy cho các bộ
phận của cơ thể. Hemoglobin
a Chain

shape of the
polypeptide molecule


Hc

:
■ ■ ■
Only one base ditĩei^s from the sequence
1 of ttie normal hemoạlobin allele. ..
Transcription
mRNA

Tianslation

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền
Sinh
trong
chẩn
di truyền
u J học
3 ) Bệnh
thiếuphân
máutửhồng
cầu
hìnhđoán

liềmbệnh
:

f ...causing the GAG codon in normal hemoglobin
to be replaoed by a GUG ODdon.. .

1 .. .which in tum causes
1 ; glutamate to be replaoed
f by valine.

gồm có hai dạng protein là chuỗi alpha globin và beta globin. Neu bất
thường xảy ra trên phần alpha globin, bé bị thiếu máu dạng alpha
Thalassemia. Trường hợp bất thường nằm trên chuồi beta globin, trẻ bị
dạng beta Thalassemia.
Đây là bệnh lý di truyền do sự thiếu hụt tổng hợp một chuồi globin
trong huyết sắc tố của hồng cầu. Hồng cầu bệnh nhân không bền, bị phá
huỷ sớm làm bệnh nhân bị thiếu máu và ứ sắt.
c ) Các biếu hiện bệnh :
Bệnh khởi phát âm thầm, từ từ. Đen một lúc nào đó, người bệnh bị
thiếu máu,
nhợt,máu
màuhồng
xanhcầu
lục,hình
mu bàn
tổ nâu,
to,
Bệnh da
thiếu
liềmtay

là nhiễm
do độtsắcbiến
gen lách
trên rất
NST
đôithường
khi gan
Mỗigen
đợtmã
tanhóa
máuchuồi
thì cóHbB):
sốt, da
vàng,
nướcA-T
tiếubằng
sẫm, cặp
láchT-to
(độtto.biến
thay
thế cặp
thêm.
Neu
xương
sẽ thấy
có hiện
tượng
rối loạn
A làm
chochụp

bộ 3 X-quang
mã hóa axit
Glutamic
(XTX)
bị biến
đối thành
bộ 3loãng
mã
xương.
Bệnh nhân
nếutrong
là trẻ gen
em thì
sẽ chậm
hóa Valin
(XAX)
HbB,
làm lớn.
biến đổi HbA —> HbS . HbS ở
trạng thái
khử
kém máu,
hòa tan
kếthồng
tủa tạo
hồng
có dạng
Neu
xétôxi
nghiệm

ta sẽvàthấy
cầu nên
không
đều,cầu
to nhỏ
khác hình
lưỡi
liềm,
có cầu
thời dẹt,
gianởtồn
tạinhạt,
ngắngọi
dẫnlàđến
nhau,
hồng
giữa
hìnhthiếu
bia. máu.
Hồng cầu lưới tăng, sức
bền thấm thấu của hồng cầu và bilirubin máu t ăng, đôi khi có hiện
tương
is determined
by
Normal hemoglobin

Sickỉe ccll

bạch cầu tăng

ị
ị
H ình 6 : Hồng cầu bị biến dạng
trong bệnh Thalassemia


Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền
Hình 8 : Cơ chế gây đột biến hồng cầu hình liềm

Hình 9 : Hồng cầu hình liềm

Genetic Modulation of Sickle Cell Dĩsease
Hemostasís/Coagulation

Intlammation/Oxidant
L selectin, 02, cytokines

Normal hemo^rlobin

lnjury

Sickle cell hemoglobin

eNOS,
adhesĩon
molecules
(ICAMS,VCAMS,
integrĩns, selectins),
grovvth factors

Sickle RBCs/Retĩculocytes
HbF, alpha thalassemia, membrane

Hình 10: Hồng cầu hình liềm gây nghẽn mạch máu


Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền

4 ) Bênh loan dưỡng cơ Duchenne và Becker :
structure of a Skeletal Muscle

Perimysium

Bone

Blood vessel

Muscle fiber

/

Tendon

Epimysium

Endomysium

Fascicle

Hình 11 : câu tạo cua một bó cơ

Chứng loạn dưỡng cơ Duchenne và Becker là một rối loạn về di truyền đặc trưng
bởi sự thoái hóa và suy yếu dần dần bát đầu từ những thay đối vi mô ở các cơ.
Một khi các cơ thoái hóa dần theo thời gian, sức mạnh của các cơ của người bệnh
sẽ bị suy giảm theo.

Chứng loạn dưỡng cơ Duchenne (tiếng Anh viết tắt là DMD) được một bác sĩ
chuyên khoa thần kinh người Pháp tên là Guillaume Benjamin Amand Duchenne
mô tả lần đầu tiên trong thập niên 1860. Chứng loạn dưỡng cơ Becker (tiếng Anh
viết tắt là BMD) được đặt theo tên của một bác sĩ người Đức Peter Emil Becker là
người đầu tiên mô tả biến thể của bệnh DMD này trong thập niên 1950.

Ở chứng loạn dưỡng cơ DMD, các em bé trai bát đầu cho thấy những dấu hiệu cơ


Stop
43 44 55

*
43 1 55

Sinh
Sinhhọc
họcphân
phântửtửtrong
trongchẩn
chẩnđoán
đoánbệnh
bệnhdiditruyền
truyền

Deletion
exons 4554 người
-Ị43
■y/—
55Vnhân
Mãi cho
đến thập
biết đươc
về nguyên
- 43
44niên 1980,
44 gì nhiều
55ta vẫn chưa
gây ra bất kỳ dạng nào của chứng loạn dưỡng cơ. Đến năm 1986, các nhà nghiên
cứu đã xác định được một gien mà khi bị biến dị - 44AON1
một tình trạng còn được gọi là
sự đột biến - sẽ gây ra chứng DMD. Đến năm 1987, loại protein có trong giẽn này
đã được xác định và đặt tên là dystrophin.

Cảc gien có chứa những mà hay là công thức cúa chất protein là những thành
phân sinh học rất quan trọng tronc) tất cá mọi hình thức cúa sự sống. Chứng loan dường cơ DMD xáy ra khi
ln-frame
Out-of-frame
một gien đặc biệt nào đó
trên nhiem sắc thê’ X không sản sinh ra được
loai protein dystrophin. Chứng BMD
dystrophin
những đột biến khác nhau
trong cùng một gien gây ra. Nhữngdystrophin

người bị chứng BMD cũng cỏ một ít dystroph

"1

transcript
missing exons 45-

transcript
BMDtype
dystrophi

Truncated
dystrophin
Toàn bô cơ

BMD-like phenotype

Bó sơi cơ

Nature Reviews I Genetics

Màng sơi cơ

chấtloạn
dystrophin)
Hình 13 : cơ chế (vị
gâytríbệnh
dưõng Duchenne và Decker
Protems
5 ) Hội chửng X không bền :

Màng tẽ
bào cơ
Đây là bệnh di truyền
chậm
phát triển

tâm thần hay gặp nhất ở người Capcaz,
ngoài ra có cả ở người Nhật, Trung Quốc,
Các cơ do những bó sợi (các tê bào) cấu
ấn Độ, châu Phi. Bệnh di truyền liên thành,
kết
Một
giới tính, liên quan đến vùng không được
phiên dịch 5' của exon 1 của gen FMR-1 (Fragile X Mentaĩ Retardation
Khi một trong những protein này, dystrophin, bị
1).
thiêu,
chứng
loạn
dưỡng
cơ
Duchenne sề xảy ra; khi
Dystrophin


Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền
FMR1 (íragile X mental retardation 1) is the gene that contains the
genetic iníormation for how to synthesize FMRP (íragile X mental
retardation protein). Fragile X syndrome occurs when FMRP is missing.
The FMR1 gene is located in the DNA on the X chromosome. The

speciíic location is given as Xq27.3.That means it is on the X
chromosome (X), it is on the long arm (q) and it is at the far end (27.3).
Genetic iníòrmatỉon in humans is stored in an odd way. Buried within
the iníbrmation that is actually used is lots of iníòrmation that is not
used.
Imagine that you went to the library and íound that in the chapter you
were interested in, many of the pages contained random letters. You
photocopied the entire chapter, including the pages that contained no
useíul information. Before you left the library, you tossed all the pages
with random letters in a recycling bin and only took home the pages with
words you could read.
In a similar way, our genes are interspersed with spacers called
introns. These introns may play an important role but do not contain
iníormation that will be used to make a protein.

DNA
Control
Kegion

Exon

IntronExon

Intron

Exon

To make a protein, we Tirst make a copy of the DNA (mRNA). That
mRNA will used as a pattern for assembling a protein. When we copy the
DNA

into

mRNA,

we

initially

copy

both

these

introns

iníormation we are going to actually use (exons). The introns must be

and

the


5' Unlrdnsldted
AC1 It^Hon FMftA

i

ị --1

T
l*nirdnsldt<
*d
Rqdon

FMffb

tử trong
di truyền
SinhSinh
học học
phânphân
tử trong
chânchẩn
đoánđoán
bệnhbệnh
di truyên

**

— — —---

edited out beíbre the mRNA's can actually be used to coordinate the
synthesis of proteins.

DMA
Control Exon
Rcgion

Intron E)con

In tron

txon

ntron

An RNA copy ĩs mađe of the OMA.
I n Iti a I
mRM /\

copy

The Introns are eciiteci out.
Cdited mDMA
copy
Used to assemble 3 protein

The FMR1 gene itselí takes up 38,000 base pairs of DNA. But as
shown in the drawing below, most of the gene is made up of introns
(indicated by the yellow color). Only a small part of the information in the
gene (the black exons) will be used to make the FMRP. The edited mRNA
has only 4000 of the original 38,000 bases.
The location of the mutation that sets in motion íragile X syndrome
is near the beginning of the FMR1 gene. In this location, there is normally
a series of about 30 repeats of CGG. In individuals with the premutation,
there are from 55-200 of these repeats. Persons with the full mutation have
more than 200 of the CGG repeats.

G ỊÌ A T T C

c

c . ....
(_

—

GJ ÀÃT TC

GfA A T
TC :

G AAT TT

)

■

Probo

SinhSinh
học học
phânphân
tử trong
tử trong
chẩnchẩn
đoánđoán

bệnhbệnh
di truyền
di truyền

G?A A T
T c

ni

G jA
ATTC)

ì Môt
pháp
di diđược gọi là
Các DNA
lạ số
sẽ phương
được cắt tại
nhữngphát
vị tríhiẽncác
đặc hiệu biển
trên DNA
truyền ở mửc phân tử

những vị trí ghi nhận hay vị trí giới hạn (recognition sites/restriction sites).
1. Điên di protein (protein electrophoresis) :
Ví dụ: Ớ Escherichia coli (một loại vi khuấn có trong ruột) có một enzyme
_Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc sự khác biệt củacoc
chỉ một amino acid

K<’|>-

lnlrci
giới hạn EcoRI ghi nhận một đoạn DNA có trình tự GAATTC. Mồi
khi bắt
trongphân tủ’ protein xảy ra do đột biến trên DNA sẽ có thế gây ra một /sựỹ
cyỉoslm*

•Ucrlinr-

<(.')

B

r<

*

.)

_!—L

\

gặp đoạn này ở trên
thì trong
EcoRI
sẽ tích
cắt của
giữaprotein.

vị trí G và A dẫn đến việc
khácDNA
biệt nhẹ
điện
Mptliyl Quup

Tr dn*-ldt*
*Cocie

tạo thành các
đoạndiDNA
giới
lpwin 1)
-Điện
protein
đãhạn.
được dùng đế phát hiện các biến dị amino
acid

trên hàng trăm loại protein người. Tuy nhiên các đột biến thay base nhưng
A

P r e rn ul a t ion

——

Các đoan
lổn hon

không làm đổi nghĩa của codon và các đột biến làm thay đối amino acid
r
K\j»rlivd

Abnnrmdl DMA
MiiUNon
Mclhvkniun

fiill

ícoRI

0.5 Kllotv*«:-s

▼

Các đoan
nhó hon

nhưng không làm thay đối điện tích của protein sẽ không thế phát hiện

B

được bằng phương pháp này. Vì những lý do đó điện di protein chỉ cho

Rgure 3 Tnnucleotide expanston responsible for fragile X syndrome [tes in an unexpressed part
of
the
Xlinked gene FMR1. The gene ilselt (lop) divides its code into 17 exons spread over 38 kilobases.
Ils

tirst
and lasl exons include regions transcrlbed ínto messenger RNA that are not represented in the
linal
translated proteln. In turn, the 5' untranslated region (in exon 1) includes a sequẽnce of CGG
repeats

Hình phép
: cắt phát
DNAhiện
bằng
chỉenzyme
khoảnggiói
mộthạn
phầnEcoRI
ba các đột biến xảy ra trên các codon

của DNA. Các đột biến xảy ra trên các đoạn DNA không mang mã cũng
Đe có thế quan sát được các đoạn DNA giới hạn có chiều dài khác nhau
2. Phát hiên đôt biến ỏ’ mức DNA :
người ta đã
thực hiện kỹ thuật gồm các bước sau
1. Sự đa hình trong chiều dài các đoạn DNA giói hạn (Restriction
Fragment
Length
Polymorphism:
RFLPs):digestion)
(1) Xử lí bằng
enzyme
giới hạn (restriction
Trước tiên DNA được chiết tách tù’ các mẫu mô, thường là tù’ máu. Sau đó DNA

Nỗ lực đầu tiên trong việc phát hiện các biến dị di truyền ở mức độ
được cho tiếp xúc với một enzyme giới hạn như EcoRI. Quá trình này sẽ tạo ra
DNA
đựoc
thực
hiện
thông
quachiều
vai dài
trò khác
của nhau.
các enzyme của vi khuẩn được
trên một
triệu
đoạn
DNA
với các
gọi là(2)các
enzyme
giới hạn (restriction endonuclease/restriction enzyme). Các
Điện
di
enzyme này được sản xuất bởi nhiều loại vi khuẩn khác nhau nhằm mục đích
Những đoạn này được đem điện di ở trên gel theo một quy trình tương tự’
ngăn
nhập tuy
của nhiên
các DNA
bằng DNA
cách cắt

những
DNA
như chặn
điệnsựdixâm
protein
cáclạđoạn
di nhỏ
chuyên
trên
geìnày.
phụ thuộc vào

Naturc Revlevvs I Neuroscienc*

kích thước chứ không phụ thuộc vào điện tích. Các đoạn DNA ngắn hơn sẽ di
chuyên
nhanh
hơn
Hình
17-18:
Co’
chếtrên
gâygel.
bệnh và hậu quả


" 9m
^*

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền

(3) glutamic
Tách
trúc
xoắnphóng
kép acid
chấtcấuđồng
xạ. được
Màng mã
thấmhóasẽ trên
đượcgene
cho bằng
tiếp codon
xúc vớiGAG.
hàng Trong
ngàn
là
acid.
♦ - *• *bằng
1 vịAmino

Binh thường

Bênh
hồng
cầu
hinh liềm

probe
có hoạt
xạ. Trong

những
điều
kiệnvalin,
nhất mã
địnhhóaquátrên
trình
bắtbằng
cặp
bệnh hồng
cầutính
hìnhphóng
liềm acid
này được
thay
bằng
gene
Sau đó các đoạn DNA được chuyến từ cấu trúc xoắn kép thành cấu trúc mạch
Mst
Mst
Msf II theo
bổ IIsung
các II
probe
cácđoạn
đoạnDNA
DNACCTNAGG
đặc hiệu tương
ứng
codonnguyên
GTG. tắc

Enzym
gióiII giữa
hạn Mst
ghi và
nhận
(N nghĩa
T-om-g
đơn bằng cách cho tiếp xúc với dung dịch kiềm.
£ CÃOAG GAU...
CỞ OÃO OAG CỈT GAG OAG... )
sẽ
chỉcó
có thế
một ghi
vài kb
là1xảy
enzyme
này
nhận bất cứ1 loại base
I 1 ra. Do
AA
ASnào
ss của DNA tại vị trí đó). Như
Pro Glu Glu
Pro GluGlu ProGlu Glu
DNA
Mst II vậy nó sẽ cắt đoạn DNA bình
Mst IIthường tạikbvị(4)
—định
tríCố

này
cũng
như ở các vị trí giới hạn
1.3- đặc hiệu (thường chỉ có một hoặc
nên probe sẽ xác định được các đoạn DNA
tưong tự’ nằm ở hai bên vị trí này. Ket quả
II sẽvịtạotríra hai
Đế làCốMstđịnh
của đoạn
các DNA,
đoạn
hai OAG...
đoạn). CCTOTG
Đe có thế
sát được
( cở GAO
OAGquan
CCT OACr
GAG... 1vị trí đã xảy ra quá trình lai giữa các probe
một đoạn có chiều dài 1100 bp và một đoạn có chiều
200 bp.
Ở cácchuyển
DNA
nàydài
người
thấm
và các đoạn DNA đặc hiệu, màng lai sẽ đượcDNA
cho tiếp
xúc
với taphim

X quang,
mang đột biến thay GAG bằng GTG làm Mst II không
được màng
đoạn giói
tù' ghi
gel nhận
rắn
phóng xạ phát ra từ các đoạn dò sẽ tác động chúng
lên phim
tạo
raqua
cácmột
vệt sẫm màu,
hạn đó nữa nên đoạn DNA đột biến không được
cắt
ở
vị
trí
giữa,
do
đó
chỉ
tạo
nitrocellulose
(Southern
được gọi là các band. Phương pháp này được như
gọi là phương
pháp phóng
xạ tự’
ra một đoạn DNA có chiều dài 1300 bp. Trong

điện
di
đoạn
ngắn
hơn
sẽ sẽ
di
transíer).
này trình
bây giờ
chụp (autoradiogram).(hình 4) Như vậy sự biến
dị xảyMàng
ra trong
tự của
chuyến xa hơn ở trên gel nên hai đoạn DNA có kíchhàng
thước
khác nhauDNA
(1100 và
ngàn
DNA tại những vị trí giới hạn đặc hiệu sẽ dẫnchứa
đến tính đa
hìnhđoạn
trong chiềuphân
dài
1300 bp) có thể phân biệt với nhau dễ dàng trên
màng
lai
nhờ
các
probe

mang
bố cùng
theo một
trậtloại
tự enzyme
tương tự như vị
của các đoạn DNA giới hạn (RFLPs) khi được cắt bởi
DNA của gene beta - globin. Trong trường hợp
này chúng
RFLPsở đã
phát
trí của
trênchogelphép
và được
giới hạn đặc hiệu. Hiện tượng này
OjO)
hiện trực tiếp đột biến gây bệnh.(hình
gọi ralàsự đa
màng
Southern
đã tạo
dạng thấm
trong chiều
dài

~SSh
4.1-kb

3.3-kb

của (Southern
các đoạnBlot).
DNA mà khi điện di
chúng
gel, đoạn
chuyếnDNA
lên
(5)
Xáctrênđịnh

òổổổcỊ)

cacncảulrũc
xoán
DMA

kép

màng
hiệulai và dùng các probe đặc hiệu

cùa

TTiAm
k&n
BỔ
sung
probe

rrvvvg

các

CA hOAil tỉnh phcrtg

T>òp
vói
phim

trên
đặc

XÚC

có hoạt tính phóng xạ để phát hiện
Neu người ta nhìn tất cả các
thì có thế đánh giá được các biến dị
đoạn này một lần trên màng lai
này.
sẽ khó phân biệt chúng với nhau
do sổ lượng các đoạn DNA trên

đó quá lớn. Vì vậy để có thể
X
Hình bên: Hình phóng xạ tự’ chụp cho thấy vị trí của 1 band 4,lkb và 1 band
nhận định sự có mặt của các
3,3kb. Mỗi dãy đại diện cho một thành viên trong gia đình trong gia hệ trên hình
đoạn DNA đặc hiệu người ta
phóng xạ tự’ chụp
dựa vào nguyên tắc bố sung.
Một mẫu dò (probe) đặc hiệu

được tạo ra Quay
nhờ kỹ
kếtbệnh
hợphồng
(recombinant
DNA)
mangbình
mộtthường
đoạn
trở thuật
lại vớiDNA
trườngtáihợp
cầu hình liềm,
ở người
mạch đơntại
DNA
vị tríđặc
thứhiệu
6 của
cóchuỗi
chiềupolypeptide
dài khoảng vài
globin
ngàn
bêta
bp trong
và được
cấuđánh
trúc dấu
của phân tủ' Hb

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền
kết hợp giữa các enzyme và các probe khác nhau, hàng ngàn vị trí đa hình đã
được phát hiện trên genome của người. Sự đa hình này được sử dụng làm công
cụ trong việc định vị nhiều gene bệnh quan trọng như gene gây bệnh u xơ thần
kinh type I (neuro-íĩbromatosis type I), bệnh Huntington, bệnh xơ nang (cystic
íìbrosis) v.v... 2. Sự đa hình trong số lượng của các đoạn lặp (Variable Number
of Tandem Repeat Polymorphism: VNTR) Phương pháp xác định các RFLP chỉ
cho phép phát hiện các biến dị có mặt hoặc không có mặt ở một vị trí hạn chế
trên DNA. Các biến dị này được gọi là sự đa hình của các vị trí giới hạn (
restriction site polymorphism: RSPs). trong trường hợp này mỗi biến dị chỉ có
thể có 2 allele do đó cũng dẫn đến sự hạn chế khi khảo sát các biến dị di truyền.
Sự đa dạng sẽ tăng lên nếu như biến dị có thế tạo ra nhiều allele hơn, những
biến dị như vậy được thấy ở các DNA tiểu vệ tinh (minisatellites). Biến dị di
truyền ở đây được tính thông qua số lượng của các đoạn lặp trên một vùng nhất
định. Một vùng DNA tiếu vệ tinh có thế lặp 2, 3 lần hoặc lên đến trên 20 lần
lặp. Sổ lượng này thay đổi rất lớn từ người này qua người khác tạo ra nhiều biến
dị di truyền trong quần thể vì vậy chúng được gọi là số lượng dao động của các
đoạn lặp nối tiếp (variable number of tandem repeats: VNTRs). Các VNTR
được phát hiện bằng kỹ thuật tương tự kỹ thuật dùng đế phát hiện các RFLP.
DNA sẽ được xử lý bằng một loại enzyme giới hạn, các đoạn DNA sau đó được
Pro Gtu Glu

Pro Val Glu Pro Glu Glu

điện di, tách xoắn và chuyến qua màng thấm. Tuy nhiên trong khi sự đa hình
Hình 5: cẳt gene beta - lĩlobin bàng enzym giới hạn Mst II
của các vị trí giới hạn chỉ cho phép phát hiện các biến dị dựa vào sự có mặt
hoặc vắng mặt của các vị trí giói hạn (chỉ có 2 aĩlele) thì các VNTR cho phép

phát hiện các biến dị thông qua sự khác nhau về số lượng của các đoạn lặp giữa
Trong thực tế hiện nay đã có nhiều phương pháp hịêu quả hơn để đánh giá
hai vị trí giới hạn (có thế có > 2 allele). (hình )
đột biến gây bệnh hồng cầu hình liềm. Tuy nhiên phương pháp này vẫn còn hữư
ích trong việc xác định nhiều loại biến dị và các đột biến gây bệnh khác. Hiện
nay người ta đã biết được hàng ngàn cnzymc giói hạn, mồi cnzymc ghi nhận
một đoạn DNA đặc hiệu. Thêm vào đó hàng ngàn loại probe khác nhau đã được
tổng họp, mồi probe đại diện cho một đoạn ngắn DNA của người. Bằng cách


Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền

lỉình 6: Tính da hình trong số lượng cua các doạn lặp (VNTRs)

Giống như những vùng DNA tiếu vệ tinh, các DNA vi vệ tinh
(microsatellite) cũng có những biến dị trong chiều dài do kết quả của sự khác
nhau trong số lần lặp. Mỗi vi vệ tinh chỉ có từ 2, 3 hoặc 4 nucleotide và chúng
được gọi là các đoạn lặp ngắn (short tandem repeat: STR). Mỗi đoạn lặp ngắn
như vậy có thế lặp đi lặp lại hàng trăm lần. số lần lặp của các DNA vi vệ tinh có
sự khác biệt rất lớn giữa người này với người khác và giữa hai nhiễm sắc thế
tuông đồng. Tính chất đa hình của các đoạn lặp ngắn (short tandem repeat
polymorphism: STRP) khác với các VNTR ở kích thước của đoạn lặp và
chúng được phân lập không phải thông qua các vị trí giới hạn nằm cạnh các
đoạn lặp mà thay vào đó là bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction:
phản ứng tống hợp dây chuyền nhò' enzyme polymerase). Tính đa hình về số
lượng của các VNTR và của các vi vệ tinh rất hữu ích trong việc lập bản đồ
gene. Đặc biệt là các DNA vi vệ tinh vì trong genome chúng có mặt nhiều hơn,
phân bố đều hơn và cũng dễ đánh giá hơn trong phòng thí nghiệm. Do các đặc
tính này mà các DNA vi vệ tinh trở thành các đa hình được chọn lựa trong hầu
hết các nghiên cứu đế lập bản đồ gene.

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền
Việc

sử

dụng

các

RFLP

và

VNTR mặc dù có ích nhưng phụ
thuộc nhiều vào kỹ thuật dòng hóa
(cloning) và kỹ thuật chuyến và cố

DNA ban đầu

3*
Làm nguôi xuòng 55ục

^

định DNA lên màng thấm. Những

Dưa nhiệt dộ
lén 72°c

kỹ thuật này có một số hạn chế nhất

Kèo dải pfimer

định: (1) việc dòng hóa thường đòi
hỏi nhiều thời gian (trung bình là 1
tuần hoặc hơn); (2) việc thực hiện
kỹ thuật Southern blot đòi hỏi một
lượng lớn DNA tinh khiết, thường
là phải nhiều microgram (đế có
được

số

lượng

này

thường

cần

khoảng lml máu tươi). Kỹ thuật
PCR cho phép nhân một đoạn DNA
đặc hiệu ngắn (có chiều dài khoảng
vài ngàn kbhoặc ngắn hơn) nhân
lên một cách nhanh chóng thành
hàng triệu bản sao giống hệt nhau
(hình 7) tạo điều kiện thuận lợi cho

Minh

7: Khuếch đạ: DNA bàng
kỳ thuật PCR

việc phát hiện các biến dị di truyền ở mức DNA hiệu quả hơn rất nhiều so với
các phương pháp cố điển.
Quá trình thực hiện PCR đòi hỏi các thành phần sau:
(1) Hai đoạn mồi (primer), mỗi đoạn mồi là một đoạn DNA có từ 15 đến 20
base được gọi là oligonucleotide (oligo có nghĩa là "một vài"). Các primer này
tương ứng với trình tự của DNA nằm ngay ở các doạn dược quan tâm như
đoạn chứa một đột biến gây bệnh hoặc chứa một đa hình của đoạn lặp DNA vi
vệ tinh. Các primer này được tổng hợp nhân tạo trong phòng thí nghiệm.


Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền
(2) DNA polymerase, đây là một loại enzyme hằng định với nhiệt độ được
trích chiết tù’ vi khuân Thermus aquaticus. Xúc tác cho quá trình nhân đôi của
DNA, trong kỹ thuật PCR quá trình này được gọi là quá trình kéo dài primer
(primer extension).
3) Một lượng lớn các nucleotìde tự’ do
(4) DNA từ một cơ thể sinh vật cần nghiên cứu, do kỹ thuật PCR rất nhạy nên
lượng DNA cần thiết có thế rất nhỏ. Đầu tiên DNA của genome được đun nóng
lên ở nhiệt độ tương đối cao (95°c hoặc hơn) đế tách xoắn làm hình thành các
chuỗi đơn. Sau đó các DNA này được cho tiếp xúc với một lượng lớn các
primer, những primer này sẽ lai với các DNA của genome theo nguyên tắc bố
sung khi được làm lạnh tới nhiệt độ khoảng tù’ 35oC tới 65oC. DNA lại được
đun nóng tới nhiệt độ trung gian 70 đến 75oC. Trong điều kiện có nhiều
nucleotide tự do, một chuỗi đơn DNA mới sẽ được tổng hợp ở nhiệt độ

này dưới sự xúc tác của DNA polymerase bắt đầu từ đoạn primer. Các
DNA mới được tổng hợp sẽ có cấu trúc xoắn kép với đầu 5' mang primer
được kéo dài bởi các nucleotide theo nguyên tắc bố sung dưới sự xúc tác
của enzyme DNA polymerase.
Chuỗi xoắn kép DNA này lại được đun nóng ở nhiệt độ cao trở lại
đế tách xoắn. Chu kỳ nóng lạnh này được lập đi lập lại nhiều lần cho phép
các DNA mới được tổng họp đóng vai trò như các khuôn mới đế tổng họp
thêm các DNA mới và số lượng của các bản sao tăng lên theo lũy thừa của
2. Khi chu kỳ này được lập đi lập lại tù' 20 đến 30 lần sẽ tạo ra hàng triệu
bản sao của DNA ban đầu.


Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền
Tóm lại PCR là một quá trình bao gồm ba bước cơ bản:
(1) Tách cấu trúc kép DNA bằng nhiệt độ cao
(2) Lai với đoạn primer ở nhiệt độ thấp
(3) Kéo dài đoạn primer ở nhiệt độ trung gian. Ket quả là tạo ra các
đoạn DNA hoàn toàn giống nhau về trình tự .
Mồi chu kỳ chỉ đòi hỏi vài phút hoặc ít hơn cho nên từ 1 DNA ban
đầu có thể khuyếch đại thành hàng triệu bản sao chỉ trong vòng vài giờ.
Do tính đơn giản của kỹ thuật nên các máy PCR đã được chế tạo đế thực hiện
công việc này một cách tự’ động. Khi DNA được khuếch đại, chúng sẽ được
phân tích theo những hướng khác nhau. Kỹ thuật PCR có nhiều thuận lợi hơn
các kỹ thuật cổ điển do:
1) Có thể được sử dụng với một lượng DNA ban đầu hết sức nhỏ với đơn vị
9
-12
tính là nanogram (10 g) hoặc picogram (10 g), số lượng DNA này có thê thu
được từ các vết máu khô đã nhiều năm, trên một sợi tóc hoặc thậm chí từ mặt
sau của một con tem được dán bằng nước bọt là đủ cho việc phân tích.

(2) Không đòi hỏi quá trình dòng hóa (cloning), do đó PCR cho kết quả
nhanh hơn so với các kỹ thuật cũ.
(3) PCR cho phép tạo ra một lượng lớn DNA tinh khiết nên không cần phải
sử dụng các probe có hoạt tính phóng xạ đế phát hiện các đoạn DNA mang đột
biến mà dùng các probe không có hoạt tính phóng xạ đánh dấu bằng phương
pháp hóa học an toàn hơn.
Tuy nhiên PCR cũng có những bất lợi nhất định:
(1) Việc tống hợp các primer đòi hỏi phải có sự hiểu biết về trình tự của
đoạn DNA nằm cạnh đoạn DNA cần khảo sát. Khi không có những thông tin về
trình tự’ của đoạn đó bắt buộc phải sử dụng các kỹ thuật khác.


Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền
(2) Do kỹ thuật PCR hết sức nhạy nên rất dễ bị nhiễm DNA từ các nguồn
khác trong phòng thí nghiệm.
(3) PCR rất khó áp dụng với các đoạn DNA dài hơn 1 đến vài kb nên kỹ
thuật này không thế được sử dụng đế phát hiện các đột biến mất đoạn gene lớn
hơn đoạn DNA trên. Trong trường hợp này phải sử dụng kỹ thuật Southern
blotting đế thay thế. Do những ưu việt của kỹ thuật PCR, nên hiện nay PCR
được sử dụng phố biến trong chẩn đoán các bệnh di truyền, trong pháp y và
trong di truyền học tiến hóa. PCR đã thay thế cho kỹ thuật Southern blotting
trong nhiều lãnh vục và hiện nay thường được dùng đế phân tích các RFLP và
VNTR.
4. Xác định trình tự’ của DNA (DNA sequencing)
Trong nhiều nghiên cứu di truyền, một mục tiêu chính là xác định cho được
trình tự của các base trên toàn bộ hoặc một phần của gene. Việc xác định trình
tự của DNA cho phép tìm hiểu bản chất của đột biến gene, chức năng của gene,
mức độ tương tự của gene với các gene khác đã biết.
Một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để xác định trình tự của DNA là
phương pháp dideoxy (dideoxy method) do Frederick Sanger đưa ra. Phương

pháp này được thực hiện bằng cách sử dụng các dide-oxynucleotide chấm dứt
chuỗi (chain-terminating dideoxynucleotide). Đây là các nucleotide có cấu trúc
tương tự như các deoxyribonucleotide bình thường khác chỉ khác ở chỗ chúng
thiếu mất một nhóm hydroxyl trong cấu trúc. Sự khác biệt này trong cấu trúc
làm cho phân tử này không thể tạo thêm liên kết phosphodiester với các
nucleotide tự do. Như vậy mặc dù các dideoxynucleotide có the gắn vào một
chuỗi DNA đang được tống hợp nhưng sau nó không có thêm nucleotide nào
gắn vào thêm được nữa và chấm dứt quá trình nhân đôi ngay tại vị trí đó. Người
ta sử dụng 4 loại dideoxynucleotide khác nhau, mỗi loại sẽ bố sung với các
deoxyribonucleotide A, T, G, hoặc c.


Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền

DNA polymerase

Primer

d ATP*d CTP
d GTP d TTP
<^

ATP

ddCTPdl

Hỗn hợp
phán
ửng
[ddTTP

Mạch đơn DNA có trình
tự chưa biết dược sứ
dụng như
bán khuôn

Đoạ
n

Chuyển
sang
trình
tự của
khuôn

Phim X quang
Trinh tự cúa mạch
DNA mới da dược
đọc
Q Trình tự
biết
T cúa primer

dâ

Hình : Kỹ thuật xác định trình tự nucleotide của DNA bằng cách sử dụng phuong pháp
dideoxy

Trình tự của một chuỗi đơn DNA nào cần đọc trình tự sẽ đựơc trộn với các primer
được đánh dấu bằng các chất hoạt tính phóng xạ, DNA polymerase, các

nucleotide thông thường và một loại dideoxynucleotide. Primer sẽ lai với một vị
trí tương ứng trên chuỗi đơn DNA theo nguyên tắc bổ sung và DNA polymerase


Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền
sẽ giúp bố sung tiếp các nucleotide như trong kỹ thuật PCR. Dideoxynucleotide sẽ
gắn vào chuỗi DNA đang được tống hợp khi có nucleotide tuông ứng theo nguyên
tắc bố sung. Tuy nhiên khi điều này xảy ra thì quá trình tổng hợp chuồi DNA
cũng bị ngừng lại
ơ bất kỳ một vị trí nhất định nào, hoặc sẽ có một nucleotide bình thường hoặc
một dideoxynucleotide có thế được thêm vào một cách ngẫu nhiên. Quá trình này
cho phép cho phép tạo nên các đoạn DNA với chiều dài khác nhau, mỗi đoạn đều
kết thúc bời cùng một loại dideoxynucleotide. Những đoạn DNA có thể phân lập
theo chiều dài bằng điện di như trình bày ở phần trên.
Bốn loại phản ứng khác nhau được thực hiện cho 4 loại nucleotide, các đoạn thu
được từ mỗi loại phản ứng sẽ được chạy điện di bên cạnh nhau trên cùng một gel
đế vị trí của các đoạn có the so sánh được với nhau. Vì mỗi band ứng với một
chuỗi DNA tận cùng bởi 1 loại base duy nhất nên trình tự của DNA có thế được
đọc bằng cách quan sát thự tự’ của các band trên gel sau khi sử dụng kỹ thuật
phóng xạ tự chụp (các primer có hoạt tính phóng xạ sẽ chỉ vị trí của các đoạn
DNA trên phim). Trong mỗi quá trình phản ứng như vậy có thể đọc được trình tự
của vài trăm cặp base.(hình trên)
Tuy nhiên cách đọc trình tự của DNA theo cách này tương đối chậm, khó khăn và
dễ sai sót. Gần đây kỹ thuật đọc trình tự’ DNA tự’ động (automated DNA
sequenced) sử dụng hệ thong phát hiện màu huỳnh quang (íluorescent), hóa chất
phát sáng (chemiluminescent) hoặc hệ thống đo màu (colorimetric) đang được
phát triển. Việc sử dụng các primer hoặc dideoxynucleotide được gắn huỳnh
quang giúp cho phương pháp này trở nên phố biến.
Một mạch khuôn DNA được đọc trình tự’ bằng cách sử dụng phương pháp tương
tự bước kéo dài primer trong kỹ thuật PCR. Mỗi một trong 4 dideoxynucleotide

khác nhau được gắn với một loại màu huỳnh quang chophép phát ra một phổ ánh
sáng riêng. Các đoạn DNA đã được gắn huỳnh quang sau phản ứng tổng hợp sẽ
được điện di trên gel polyacrylamide rất mỏng rồi sau đó được kích thích bằng


0 o00 o0'
ooooooo'
ooooooooo
0 0 0 0 00000
0
oooo
oooo
0
0
o ooo ooo
ooooooooo
ooooooooo
0
oooooo0 o
0

/ nucleotide
/ trên chip
DNA

Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền

một
chùm
laserchip)

. Ánh sáng phát ra được ghi nhận qua một camera kỹ thuật sổ
5. Chip
DNAtia(DNA
camera)
đế chuyến
thành
và phát
chuyến
Chip (digital
DNA hoặc
DNA
microarray
là các
một tínkỹhiệu
thuậtđiện
mớitử để
hiệnthành
các ảnh.
đột Ánh
biến
này
được với
phân
thành xác
dạngdựa
đồ trên
thị trong
mỗitích
một
đặc hiệu

tốctích
độ để
rất chuyển
nhanh, chính
cơ sở đó
phân
độtloại
biếnnucleotide
bằng vi
khác
tính. nhau được mô tả bằng một đỉnh màu khác nhau, trình tự của các đỉnh màu
này xuất
trên đồ
cho DNA,
phép đọc
tự của đoạn đóng
DNA.vai
Mộttròđoạn
500 dò
bp
Đế sản
cácthịchip
các trình
oligonucleotide
của khoảng
các đoạn
của
64 đuợc
ngườimáy
khác nhau có thế được phân tích trên cùng một gel trong vòng từ 2

(probe)
, „ , 2
đến 4 giờ.
cài lên một phiên kính nhỏ. Môi phiên kính nhu vậy với diện tích khoảng lcm có

thể chứa pháp
từ hàng
trăm
đến tự
hàng
oligonucleotide
Các đánh giá tính chất
Phưong
đọc
trình
tự ngàn
độngloại
cũng
được thực khác
hiện nhau.
cho việc
oligonucleotide
nàycác
gồmđoạn
các DNA
có trình
tự bìnhtính
thường
các của
DNAđon

có trình
đa hình của
lặp ngắn
(STRP),
đa và
hình
nucleotide (singletự mang
các đột polymorphism:
biến
nucleotide
SNP) và các dạng đa hình khác
gây bệnh
biết.
DNA
củađộng
một khác
đối tượng
đượcđược
gắn điện
huỳnh
và ống
cho
Một
hướngđãđọc
trình
tự tự'
là các nào
mẫuđóDNA
di quang
trong các

lai với
oligonucleotide
phiến
xác định
lai với
thuỷ
tinh các
rất nhỏ
được gọi là trên
các ống
maokính
dẫn đế
(capillary)
chứ xem
khôngchúng
phải trên
gel
oligonucleotide bình
thườngống
haynày
độtrất
biến.
Mầuvàlailượng
đượcnhiệt
phân tỏa
tíchratrên
máy
tính
polyacrylamide.
Vì những

mỏng
trong
quávi trình
đế xác
của đổi
hay mang
thể nào
điện
di định
rất ítDNA
nên việc
đọc tượng
trình là
tụ’bình
diễn thường
ra rất nhanh,
kỹ loại
thuậtđột
nàybiến
chocụphép
đọc
(hìnhtự
dưới:
hoạmẫu
mộtchỉ
chip
DNA.).
trình
của Sơ
600đồ

bpminh
của 96
trong
vòng 15 phút.
Ngoài ra một kỹ thuật mói là sử dụng sắc ký khối phố (mass spectroscopy), đây là
một kỹ thuât có độ phân giải cao trước đây dùng đế phân tích protein. Sự phát
DNAgắn
huỳnh
triển của kỹ thuật MALDI-TOF (matrixassisted
laser
desorption/ionization timequang cúa đối

of-flight) cho phép phân tích hàng trăm mẫu DNA
tượng trong vài phút. Hiện nay đây là
ACCTTG
kỹ thuật thu
hút nhiều sự quan tâm trong việc sử dụng đế đọc trình tự DNA.
TGGAAC

Bằng cách
sửcúa
dụng
DNA
đối vi tính và các kỹ thuật tự động đã làm tăng khả năng đọc trình
tượng lai với

tự của
DNA
và đã cho phép đọc được trình tự’ của toàn bộ 3 tỷ bp trong genome
probe

có chứa
của doạn
người.DNA bổ
sung


Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền
Các oligonucleotide được đặt trên con chip, sau đó cho tiếp xúc với DNA được
gắn huỳnh quang của một đối tượng. Quá trình lai xảy ra nếu có một
oligonucleotide có trình tự nucleotide bố sung với trình tự DNA của đối tượng. Ví
trí phát huỳnh quang trên chip sẽ đánh dấu vị trí của đoạn oligonucleotide trên
chip
Một ứng dụng khác của chip DNA là là xác định xem gene có biếu hiện (nghĩa là
được phiên mã) ở trong một mẫu mô nào đó không (ví dụ như từ một khối u).
Người ta chiết mRNA từ mô rồi dùng nó làm bản khuôn để tạo thành các đoạn
DNA theo nguyên tắc bố sung. Sau đó đoạn này được đem lai trên phiến kính với
các oligonucleotide đại diện cho nhiều loại gene khác nhau. Tín hiệu lai dương
tính ở tại vị trí nào đó trên phiến kính chứng tỏ gene đó được biếu hiện trên mẫu
mô.

ĨV. CHẨN ĐOẢN BÊNH DI TRUYỀN

Trước đây, đế chân đoán các tật bệnh di truyền chủ yếu dựa vào xét nghiệm, chấn
đoán của y học lâm sàng, phân tích chung về phả hệ, do vậy nhiều bệnh di truyền
không chấn đoán được. Ngày nay, di truyền y học đã sử dụng các phương pháp và
kĩ thuật hiện đại đế chẩn đoán chính xác các tật, bệnh di truyền, như sử dụng đánh
dấu di truyền, các enzim chấn đoán bệnh, kĩ thuật chọc ối chấn đoán trước khi
Các probe

sinh, kết hợp với các phân tích hoá sinh nước ối, chuẩn đoán bằng DNA

oligo-phôi thai
trong máu mẹ, PCR, real-time PCR, kỹ thuật cắt đoạn đa dạng (RFLP),phương
pháp Southern Blot,...
/.

Chấn đoán trước sinh

a) Mục tiêu và lợi ích của chấn đoán trước sinh
Mục tiêu chính của chẩn đoán trước sinh (prenatal diagnosis) là cung cấp
cho các gia đình có nguy cơ các thông tin cần thiết đế họ có thể lựa chọn trong
quá trình mang thai.
b) Những lợi ích của chấn đoán trước sinh


Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền
- Tái khắng định cho các gia đình có nguy cơ yên tâm khi kết quả chấn đoán
bình thường.
- Cung cấp thông tin về nguy cơ đối với các cặp vợ chồng mà nếu không
có những thông tin như thế họ sẽ không dám mang thai.
- Chuẩn bị về mặt tâm lý cho cặp vợ chồng trước việc ra đời một đứa trẻ
khuyết tật.
- Giúp các nhà chuyên môn lên kế hoạch can thiệp trong cuộc đẻ, quản lý
và săn sóc sức khỏe cho trẻ sau khi đã chấn đoán trẻ mắc bệnh di
truyền.
- Cung cấp thông tin về nguy cơ đối với các cặp vợ chồng mà việc chấm
dứt thai kỳ là một vấn đề có thể phải đặt ra.
c) Các test trong chuân đoán trước sinh :
Gồm có test sàng lọc (screening test) và test chẩn đoán (diagnostic tests):
V Test sàng lọc :
Là test có độ chính xác không lớn nhưng giá thành thấp, dễ thực hiện, do đó

cho phép thực hiện trên một lượng lớn cá thể. Một kết quả bất thường của test
sàng lọc sẽ chỉ định cho các test chuân đoán tiếp theo.
Ví dụ : Theo đánh giá anpha - Fetoprotein (AFP) trong máu mẹ vào tuần thứ
15 của thai kỳ đế sàng lọc các trường họp bất thường ống thần kinh của thai nhi.
V Test chẩn đoán :
Test chẩn đoán được sử dụng để chẩn đoán xác định các trường hợp nghi ngờ
mang bất thường.
Ví dụ : Thực hiện test chẩn đoán bằng nuôi cấy tế bào nước ối đối với những
sản phụ từ 35 tuổi trở lên để phát hiện các trường hợp thai nhi mắc trisomy.


Sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh di truyền
d) Kỹ thuật chân đoán trước sinh hiện nay

4 Theo TS. Trần Văn Khoa, Trưởng Phòng Công nghệ gen và Di truyền tế
-

bào, hiện nay có nhiều phương pháp khả thi chấn đoán sớm như: siêu âm, test
sàng lọc bộ ba (trỉple test)... là những phương pháp không mang tính can thiệp,
nhưng chẩn đoán muộn (sau 12 tuần) và có độ đặc hiệu thấp. Đặc điểm của hai
phương pháp này chủ yếu phát hiện các bất thường về hình thái, nguy cơ nhiễm
bệnh của thai nhi nhưng không phát hiện được các dị tật bâm sinh do đột biến
gen.

4 Đối với các phương pháp can thiệp như: chọc hút nước ối, nuôi cấy tế bào
-

nước ối,... có thế gây ra một số tai biến như: sấy thai, rò dịch ối, nhiễm trùng dịch
ối... và nguy cơ tử vong ở thai nhi có thế lên tới 1% nếu tiến hành phương pháp
chọc ối này.

4 Các nhà khoa học thuộc Trung tâm Nghiên cún sinh, y, dược học (Học viện
-

Quân y) vừa nghiên cứu thành công phương pháp chẩn đoán trước sinh từ tuần thứ 7
của thai kỳ bằng ADN phôi thai trong máu mẹ.
•

Đe tài này đã đạt giải nhất “Hội nghị
Khoa học-Công nghệ Tuổi trẻ Học
viện Quân y năm 2007"diễn ra ngày
15/12 tại Hà Tây.

•

Các nhà khoa học đã tiến hành
nghiên cứu trên 89 bà mẹ mang thai
từ 6 - 36 tuần ở độ tuổi từ 19 - 43.
Vơl 5 ml mau, nhom nghiên cưu đã Thai nhi bị dị tật do đột biến gen. (Ảnh: Trung tâm
,

,

_
_ Nghiên cứu sinh, y, dược học).

tách huyêt tương, tách chiêt ADN
bằng phương pháp thuỷ phân, làm tủa, làm sạch sau đó hoà tan
ADN trong nước. Sau đó, các nhà khoa học kiểm tra nồng độ
ADN thu được và phân tích thu được ADN của con.