Nghiên cứu đặc điểm gen h5 và n1 của virus cúm a h5n1 phân lập tại việt nam để tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vaccine thế hệ mới

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNCÔNG NGHỆ
SINH HỌC

NGUYỄN THỊ BÍCH NGA

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM GEN H5 VÀ N1 CỦA VIRUS
CÚM A/H5N1 PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM ĐỂ TẠO NGUỒN
NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VACCINE THẾ HỆ MỚI
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ỊT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Ng-êi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NĂM 2012




ii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện và một số kết quả cùng cộng tác
với các cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được

công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các
đồng tác giả.
Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Ngày

tháng

năm 2012

Tác giả

Nguyễn Thị Bích Nga


v

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các ký hiệu , các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình

i
ii
iii

vi
vii
viii

MỞ ĐẦU

1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

1.1.

ĐẠI CƢƠNG VỀ VIRUS CÖM

1.1.1. Virus cúm và phân loại virus cúm
1.1.2. Đặc điểm tiến hóa tạo nên các phân dòng có độc lực cao của virus
cúm A/H5N1
1.1.3 Sự hình thành genotype của virus cúm A/H5N1 trên thế giới và Việt
Nam
1.1.4 Biến đổi thành phần gen hemagglutinin (HA) tạo nên các nhóm
kháng nguyên (clade) của virus cúm A/H5N1
1.2.

ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC VIRUS CÚM A

1.2.1. Đặc tính cấu trúc chung
1.2.2. Cấu trúc hệ gen của virus cúm A
1.2.3. Chức năng các phân đoạn trong hệ gen

1.3.

CẤU TRÖC, CHỨC NĂNG CỦA HEMAGGLUTININ VÀ
NEURAMINIDASE

1.3.1.
1.3.2.
1.4.
1.5.
1.5.1.

Protein hemagglutinin (HA)
Protein neuraminidase (NA)
CÁC YẾU TỐ QUYẾT ĐỊNH ĐỘC LỰC
CÁC PHƢƠNG THỨC BIẾN ĐỔI KHÁNG NGUYÊN

Hiện tƣợng «lệch kháng nguyên»

1.5.2. Hiện tƣợng «trộn kháng nguyên»
1.5.3. Hiện tƣợng glycosyl hoá
1.6.

BỆNH CÖM GIA CẦM

1.6.1. Lịch sử bệnh cúm gia cầm
1.6.2. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 trên thế giới
1.6.3. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở Việt Nam
1.6.4. Đặc điểm của bệnh cúm gia cầm
1.6.4.1. Triệu chứng - bệnh tích ở cúm gia cầm

4
4
5
7
9
11
11
13
14
15
15
19
21
22
22
24
24
25
25
27
28
28
28


v

1.6.4.2. Triệu chứng bệnh cúm gia cầm ở người
1.6.5. Tính thích ứng đa vật chủ của virus cúm A/H5N1
1.6.6. Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A trong tế bào

29
29
31

1.6.7. Phƣơng thức lây truyền của virus cúm gia cầm
1.6.8. Sức đề kháng của virus

32
33

1.7.
1.8.

CÁC LOẠI VACXIN PHÕNG BỆNH CHO GIA CẦM

MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ VIRUS CÖM GIA CẦM A/H5N1 TẠI VIỆT
NAM
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

33
36
39

2.1.
2.2.

ĐỐI TƢỢNG

2.3.

2.4.
2.4.1.
2.4.2.

VẬT LIỆU

2.5.

QUI TRÌNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH GEN H5 VÀ N1 CỦA VIRUS
CÚM A/H5N1
CÁC PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ NGHIÊN CỨU GEN
VIRUS CÚM A/H5N1

40

Phƣơng pháp tách chiết ARN tổng số

41

Phƣơng pháp RT-PCR
Phƣơng pháp điện di kiểm tra và tinh sạch sản phẩm RT-PCR

42
42
43
43
44
45
45
45

47

2.6.
2.6.1.
2.6.2.
2.6.3.
2.7.
2.7.1.
2.7.2.
2.7.3.
2.7.4.
2.8.
2.9.
2.9.1.
2.9.2.
2.9.3.
2.9.4.
2.9.5.
2.9.6.

NỘI DUNG
DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU
Dụng cụ, trang thiết bị
Hóa chất

PHƢƠNG PHÁP DÕNG HÓA

Nối sản phẩm RT-PCR/PCR vào vector tách dòng
Chuyển nạp sản phẩm dòng hóa vào tế bào khả biến
Chọn lọc, nuôi cấy khuẩn lạc và tách chiết ADN tái tổ hợp

Kiểm tra ADN tái tổ hợp
PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE
PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

Xử lý chuỗi trong chƣơng trình Chromas
Chƣơng trình biên tập chuỗi nucleotide SeqEd
Hệ chƣơng trình MacVector
Chƣơng trình so sánh và phân tích chuỗi gen GeneDoc
Chƣơng trình phân tích di truyền tiến hóa phân tử (MEGA)
Xử lý số liệu trong nghiên cứu

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1.

THU NHẬN VÀ LƢU GIỮ GEN H5 CỦA VIRUS CÖM A/H5N1

39
39
39
40
40
40

41

47
48
48
48

49
49
50
50


v

TRONG VECTOR TÁCH DÒNG

3.1.1. Tách ARN tổng số và thực hiện RT-PCR
3.1.2. Dòng hoá sản phẩm và lƣu gen H5 trong vector tách dòng
3.1.3. Giải trình tự và phân tích thành phần amino acid của HA (H5) so
sánh về thành phần nucleotide và amino acid với các chuỗi đăng ký
trong Ngân hàng gen
3.1.4. Phân tích vị trí điểm cắt protease, bám dính thụ thể, epitope và
glycosyl hoá của polypeptide H5 trên cơ sở trình tự amino acid suy
diễn
3.1.5. Phân tích tƣơng đồng về nucleotide và amino acid ở H5
3.1.6. Phân tích mối quan hệ phả hệ và nguồn gốc giữa các chủng của Việt
Nam và thế giới
XÁC ĐỊNH CÁC PHÂN NHÁNH NHÓM KHÁNG NGUYÊN (CLADE)
3.2.

50
52
54

65

67
69
73

XUẤT HIỆN MỚI TẠI VIỆT NAM

3.2.1
3.2.2
3.3.

Kết quả sự hình thành phân nhóm kháng nguyên mới 1.1 của clade 1
Kết quả sự hình thành phân nhóm kháng nguyên mới của clade 2.3.2
và 2.3.4

74
76

THU NHẬN, GIẢI TRÌNH TỰ VÀ LƢU GIỮ GEN N1 CÁC CHỦNG
VIRUS CÚM A/H5N1 TRONG VECTOR TÁCH DÒNG

79

3.3.1. Thực hiện RT-PCR thu nhận gen N1

79

3.3.2. Dòng hoá sản phẩm gen N1 trong vector tách dòng
3.3.3. Phân tích thành phần nucleotide và amino acid của gen N1
3.3.3.1. Phân tích thành phần nucleotide gen N1
3.3.3.2. Phân tích thành phần amino aicd gen N1

3.3.4. Phân tích đột biến trƣợt-xoá gen của N1 qua thời gian tiến hoá
3.3.5. Phân tích mối quan hệ phả hệ gen N1 của các chủng virus cúm
A/H5N1 giai đoạn 1996 - 2011

81
83
83
85
89
92

KẾT LUẬN
ĐỀ XUẤT VÀ KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH SÁCH CÁC BÀI BÁO LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ CÔNG BỐ
PHỤ LỤC

98
99
100
114


vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu
bp
Ck

Tiếng Anh
base pair
Chicken

Tiếng Việt
Cặp bazơ
Gà

dNTP
ddNTP
Dk

Deoxy Nucleotide Triphosphate
dideoxy Nucleotide Triphosphate
Duck

Deoxy Nucleotide Triphosphate
dideoxy Nucleotide Triphosphate
Vịt

DNA
FAO

Acid deoxyribonucleic
Food and Agricultural Organization

Axit deoxyribonucleic
Tổ chức nông lương thế giới

Gs

Goose

Ngỗng

HA
HI
HPAI
kb
kDa

Hemagglutinin
Hemagglutination Inhibition
Highly Pathogenic Avian Influenza
Kilo base
Kilodalton

Kháng nguyên HA
Phản ứng ngưng kết hồng cầu
Cúm gia cầm thể độc lực cao
Kilo base
Đơn vị khối lượng kilodalton

LB
LPAI
M

Luria-Bertani medium
Low Pathogenic Avian Influenza

Matrix protein

Môi trường LB
Cúm gia cầm thể độc lực thấp
Protein đệm M

Md

Muscovy duck

Ngan

MEGA
NA
NEP
NP
NS
OIE
PA

Molecular Evolutionary Genetics Analysis
Neuraminidase
Nuclear Export Protein
Nucleoprotein
Non-structural protein
Office International des Epizooties
Polymerase acidic protein

Phân tích di truyền tiến hoá phân tử
Kháng nguyên NA

Nuclear Export Protein
Nucleoprotein
Protein không cấu trúc
Tổ chức dịch tễ thế giới
Protein PA

PB1
PB2
RNA
RNP
RT-PCR

Polymerase basic protein 1
Polymerase basic protein 2
Ribonucleic acid
Ribonucleoprotein
Revertranscription Polymerase Chain
Reaction
Specific Pathogen Free
World Health Organization

Protein PB1
Protein PB2
Axit ribonucleic
Ribonucleoprotein
Phản ứng trùng hợp chuỗi PCR
ngược
Không tác nhân mầm bệnh
Tổ chức Y thế thế giới

SPF
WHO


vi


ix

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 1.1

Thống kê số lượng người bị nhiễm và chết do cúm gia cầm qua
các năm.

26

Bảng 2.1

Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 phân lập giai đoạn
2004 – 2011.

39

Bảng 2.2

Danh sách các cặp mồi sử dụng trong thu nhận gen kháng

42

nguyên H5 và N1.
Bảng 2.3

Thành phần phản ứng RT-PCR và chu trình nhiệt.

42

Bảng 2.4

Danh sách các cặp mồi sử dụng trong giải trình tự gen kháng
nguyên H5 và N1.

47

Bảng 2.5

Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt giải trình tự.

47

Bảng 3.1

Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế
giới sử dụng chuỗi H5 trong phân tích so sánh thành phần gen và
mối quan hệ nguồn gốc phả hệ.

54

Bảng 3.2

Các vị trí nucleotide sai khác trong chuỗi H5 giữa các chủng so
sánh.

56

Bảng 3.3

Kết quả tổng hợp phát hiện 41 vị trí sai khác amino acid của
chuỗi H5 so sánh ở 32 chủng phân lập tại Việt Nam từ năm 2004
- 2011.

64

Bảng 3.4

Các vị trí amino acid quan trọng trong chuỗi polypeptide H5

65

Bảng 3.5

Tỷ lệ (%) tương đồng về nuleotide (trên đường chéo) và amino
acid (dưới đường chéo) của gen H5.

68

Bảng 3.6

Kết quả thống kê 14 chủng virus cúm AH5N1 được xác định gen
H5 và các nhóm kháng nguyên giai đoạn 2004 – 2011 trong
nghiên cứu.

78

Bảng 3.7

Danh sách các chủng cúm A/H5N1 thu thập qua các năm 2004-

83

2011 đã giải trình tự và cung cấp chuỗi gen N1 sử dụng để so
sánh nucleotide và amino acid.
Bảng 3.8

Kết quả thống kê 14 chủng virus cúm A/H5N1 giai đoạn 20042011 đã được giải trình tự và đăng ký gen N1

97


ix


ix

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1
Hình 1.2

Dịch tễ học các biến chủng virus cúm A ở khu vực Đông Nam Á
(A) Hình thành genotype trong quá trình tiến hóa từ các nguồn gen
khác nhau. (B) Các genotype bắt đầu từ khi mới xuất hiện thể độc

Trang
6
8

lực cao HPAI tạo thành từ các trao đổi chéo tiến hóa tạo genotype
mới tại Việt Nam từ 2001 – 2007.
Hình 1.3

Quá trình tái tổ hợp và sự hình thành các genotype của virus cúm

8

A/H5N1
Hình 1.4

(A)Ảnh các dạng hình thái của virus cúm A được nhuộm âm tính

12

trên kính hiển vi điện từ truyền qua. (B) Mô hình cấu tạo hạt virus
cúm A. (C) Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP của
Hình 1.5
Hình 1.6
Hình 1.7
Hình 1.8
Hình 1.9

Hình 2.1
Hình 2.2
Hình 3.1
Hình 3.2
Hình 3.3

Hình 3.4

Hình 3.5

virus cúm.
Mô hình cấu trúc hemagglutinin.
Minh họa đột biến điểm của hiện tượng “lệch kháng nguyên”
(antigenic drift) ở virus cúm A.
Minh họa đột biến tái tổ hợp của hiện tượng “trộn kháng nguyên”
(antigenic shift) của virus cúm A.
Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng vật chủ của biến chủng virus
cúm A.
Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A trong tế bào.
Sơ đồ nghiên cứu sinh học phân tử virus cúm A/H5N1.

16
23
24
30
31
41

Cấu trúc của vector pCR2.1- TOPO

43

Điện di sản phẩm RT-PCR gen H5 của 14 chủng virus cúm
A/H5N1trên thạch agarose 1%.
Kết quả tách dòng ADN tái tổ hợp gen H5 của 14 chủng virus
cúm A/H5N1 và điện di trên agarose 1% .
Trình bày so sánh trình tự amino acid chuỗi polypeptide H5 của 33
chủng (có 14 chủng phân lập 2004-2011 tại Việt Nam thuộc
nghiên cứu này) với các chủng liên quan có trong Ngân hàng gen
trong danh sách liệt kê ở Bảng 3.1

51

Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa các chủng cúm A/H5N1 xác
lập dựa trên thành phần nucleotide gen H5 sử dụng chương trình
MEGA4.0.
Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa các chủng cúm A/H5N1 dựa
trên thành phần amino acid của polypeptie H5 sử dụng chương

70

53
61

71


ix

trình MEGA4.0.

Hình 3.6

Cây phả hệ sự hình thành phân nhóm kháng nguyên mới clade 1.1

74

của clade 1 dựa trên thành phần nucleotide gen H5
Hình 3..7

Cây phả hệ sự hình thành phân nhóm mới của clade 1 và 1.1 dựa

75

Hình 3.8

trên thành phần amino acid của H5
Cây phả hệ sự hình thành phân nhóm mới của clade 2.3..2.1 và
2.3.4.3 dựa trên thành phần nucleotide của H5.

77

Hình 3.9

Cây phả hệ sự hình thành phân nhóm mới của clade 2.3.2 và 2.3.4
dựa trên thành phần amino acid của H5.

77

Hình 3.10

Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR gen N1 trên thạch agarose 1%

80

Hình 3.11

của 14 chủng:virus cúm A/H5N1
Kết quả tách dòng các DNA tái tổ hợp và điện di trên thạch

81

Hình 3.12
Hình 3.13

Hình 3.14

Hình 3.15

Hình 3.16

agarose 1% gen N1 của 14 chủng virus cúm A/H5N1.
So sánh đối chiếu trình tự amino acid của N1 giữa các chủng virus
cúm A/H5N1 thu thập qua các năm 2004 -2011.
Vị trí của các nucleotide protein N1 có đột biến trượt-xoá ở các
chủng nghiên cứu (2004 - 2011) so với các chủng liên quan trong
Ngân hàng gen.
Vị trí các amino acid của chuỗi polypeptide N1 có đột biến trượtxoá ở 14 chủng nghiên cứu (2004-2011) so sánh với các chủng
liên quan có trong Ngân hàng gen.
Cây phả hệ biểu thị mối quan hệ nguôn gốc phả hệ giữa các chủng
cúm A/H5N1 dựa trên phân tích thành phần nucleotide gen N1 sử

dụng chương trình MEGA4.0.
Cây phả hệ biểu thị mối quan hệ nguôn gốc phả hệ giữa các chủng
cúm A/H5N1 dựa trên phân tích thành phần amino acid
polypeptise N1 sử dụng chương trình MEGA4.0.

89
90

91

94

96


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cúm gia cầm thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI) do
virus cúm A/H5N1 gây ra là bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh với tỷ
lệ gây chết cao trong đàn gia cầm bị bệnh. Virus cúm A/H5N1 là một phân type trong
nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, có protein Hemagglutinin (HA) và
Neuraminidase (NA) trên bề mặt capsid của hạt virus mang tính kháng nguyên tham
gia quá trình đáp ứng miễn dịch. Kháng nguyên HA có 16 phân type (ký hiệu từ H1
đến H16) và kháng nguyên NA có 9 phân type (ký hiệu từ N1 đến N9).
Kháng nguyên HA được mã hóa bởi phân đoạn 4 của hệ gen virus cúm A, có
đặc tính kết hợp với thụ thể đặc hiệu trên bề mặt màng của tế bào nhiễm. HA có khả
năng đột biến trong gen tạo nên sự khác biệt làm thay đổi tính kháng nguyên, đặc biệt
là “vùng kháng nguyên 2” (vị trí 152 – 157) và điểm cắt của enzym protease ở vị trí

chuỗi nối giữa HA1 và HA2) hoặc tái tổ hợp biến chủng làm thay đổi kháng nguyên bề
mặt dẫn đến sự thay đổi tương quan đáp ứng miễn dịch.
Kháng nguyên NA do phân đoạn 6 mã hóa, đây là một protein bề mặt làm
nhiệm vụ enzym phân giải thụ thể tế bào và cắt liên kết glycosid của phân tử acid sialic
(N-acetylneuramic acid) giải phóng virus trong quá trình lây nhiễm.
Từ năm 2003 đến nay, virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao gây dịch cúm gia cầm
đã bùng phát ở nhiều nước trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Dịch cúm gia cầm liên
tục tái phát hàng năm với tốc độ lây lan nhanh và diễn biến phức tạp tại nhiều quốc gia.
Đặc biệt, chủng virus cúm A/H5N1 có thể xâm nhiễm gây bệnh ở người với tỉ lệ tử
vong rất cao và đang trở thành mối đe dọa nguy hiểm cho sức khỏe cộng đồng.
Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm bắt đầu xuất hiện từ những tháng cuối năm
2003 đầu năm 2004 và đã nhanh chóng lan rộng ở hầu hết các địa phương trong cả
nước. Hàng chục triệu gia cầm và thuỷ cầm đã bị chết hoặc bị tiêu hủy gây thiệt hại
kinh tế nặng nề cho ngành chăn nuôi. Năm 2011 và những tháng đầu năm 2012 đến
nay, dịch cúm A/H5N1 bùng nổ với clade clade 2.3.2.1 xuất hiện mới tại Việt Nam,


2

làm cho tình hình dịch tễ mối quan hệ lây nhiễm và phòng chống bằng vaccine càng
phức tạp hơn.
Tìm hiểu sự thay đổi phân tử các vật liệu di truyền của virus cúm A/H5N1, đặc
biệt là đặc điểm phân tử phân đoạn gen kháng nguyên HA (H5) và NA (N1) ở các
chủng phân lập trên gia cầm tại Việt Nam trong giai đoạn 2004 đến nay là cần thiết,
nhằm đánh giá cấu trúc gen, khả năng tiến hoá của virus liên quan đến thay đổi đặc
điểm kháng nguyên để từ đó có thể đưa ra những dự báo về dịch tễ học ở mức độ phân
tử, định hướng sử dụng nguồn gen kháng nguyên để sản xuất và sử dụng vaccine
phòng bệnh cúm gia cầm thích hợp đạt hiệu quả.
Xuất phát từ những yêu cầu trên chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu đặc điểm gen H5 và N1 của virus cúm A/H5N1 phân lập tại

Việt Nam để tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vaccine thế hệ mới”.
2. Mục tiêu của đề tài
1- Giải mã toàn bộ phân đoạn gen kháng nguyên H5 và N1 một số chủng virus cúm
A/H5N1 thu nhận tại một số địa phương của Việt Nam giai đoạn 2004 - 2011.
2- Lưu giữ các gen H5 và N1 trong vector tách dòng để làm nguồn vật liệu cho
nghiên cứu tiếp theo làm nguyên liệu để tạo vaccine thế hệ mới.
3- Phân tích đặc điểm sinh học phân tử các gen kháng nguyên H5 và N1, xác định
mối quan hệ phả hệ với các chủng cúm A/H5N1 của Việt Nam và thế giới.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Đây là công trình giải trình tự toàn bộ gen H5 và N1 theo cặp trong hệ gen của
từng chủng của virus cúm A/H5N1 đại diện của một số địa phương tại Việt Nam được
phân lập theo thời gian từ năm 2004 – 2011.
Các kết quả phân tích mối quan hệ nguồn gốc phả hệ trong nghiên cứu này cho
thấy sự đa nhiễm các clade của virus cúm gia cầm ở từng thời điểm, từ khi xuất hiện tại
Việt Nam đến nay, đó là clade 1, 1.1, clade 2.3.4 (2.3.4.3) và clade 2.3.2 (2.3.2.1) tại
Việt Nam bằng phương pháp sinh học phân tử sử dụng kỹ thuật RT-PCR và giải trình
tự chuỗi nucleotide để phân tích thành phần gen.


3

3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Do hệ gen của virus cúm A/H5N1 là hệ gen phân đoạn, luôn biến đổi và thích
ứng - đặc biệt là hai gen kháng nguyên HA (H5) và NA (N1), việc theo dõi thông tin di
truyền của virus cúm A/H5N1 là hết sức cần thiết, vì đây là những dữ liệu cung cấp
thông tin về sự tiến hóa của virus và khả năng tái tổ hợp tạo nên một biến chủng mới
trong quần thể virus cúm gia cầm.
Xác định trình tự nucleotide và phân tích đặc điểm sinh học phân tử của toàn bộ
phân đoạn gen kháng nguyên H5 và N1 của gia cầm, thuỷ cầm ở một số chủng phân

lập qua các năm từ 2004 đến nay sẽ là cơ sở dữ liệu quan trọng để tìm hiểu về dịch tễ
học và mối quan hệ nguồn gốc tiến hoá của loại virus cúm gia cầm lưu hành ở Việt
Nam và thế giới trong thời gian qua. Việc phân tích trình tự nucleotide và amino acid
của các chủng virus cúm A/H5N1 còn có ý nghĩa lớn trong việc xác định biến đối di
truyền của các chủng tại các địa phương khác nhau, các vùng địa lý và quốc gia khác
nhau, giúp cho việc sưu tập và duy trì các chủng theo đặc tính di truyền và nghiên cứu
tiến hoá, từ đó có thể biết dịch tễ học ở mức độ sinh học phân tử.
Mặt khác, do virus cúm có khả năng biến đổi kháng nguyên cao, có thể chủng
virus phân lập ở đầu và cuối ổ dịch đã khác nhau về bộ mã di truyền và đặc tính kháng
nguyên, vì vậy, cần phải có một số lượng các chủng đa dạng theo thời gian tạo tiền đề
định hướng giám sát nguồn gốc dịch bệnh. So sánh giống và khác nhau của trình tự
nucleotide và amino acid từ các chủng phân lập hàng năm, giúp chúng ta tìm hiểu
những vùng gen thường thay đổi và không thay đổi trong toàn bộ hệ gen, góp phần xác
định được loại vaccine phù hợp cho công tác phòng chống dịch cúm gia cầm.


4

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ VIRUS CÖM
1.1.1. Virus cúm và phân loại virus cúm
Virus cúm chủ yếu gây bệnh đường hô hấp ở người và động vật được phân
thành các nhóm:
1/ Nhóm virus cúm A (Influenza A virus) thường tồn tại trong các loài vật (gia
cầm, ngựa, gà, vịt, ngỗng, ngan và các loài chim di cư hoang dã) sau đó tiếp xúc với
con người và gây bệnh cho loài người. Virus cúm A có thể gây nên những vụ dịch hoặc
những trận đại dịch toàn cầu.
2/ Nhóm virus cúm B (Influenza B virus) thường tồn tại trong cơ thể con người,
chủ yếu gây bệnh ở người, một số ít tồn tại trong loài hải cẩu.

3/ Nhóm virus cúm C (Influenza C virus) tồn tại trên người và lợn.
Ba nhóm virus cúm A, B, C được nhận diện bởi sự khác nhau trong cấu trúc
kháng nguyên bề mặt, phức hợp protein cũng như vai trò gây bệnh khác nhau trên động
vật có xương sống. Virus cúm A và B có kháng nguyên bề mặt là protein
hemagglutinin (HA), còn ở cúm C là HEF (hemagglutinin esterase fusion).
4/ Nhóm Thogotovirus gây bệnh cho động vật, người và động vật không xương
sống (muỗi, rận biển). Kháng nguyên bề mặt của Thogotovirus là GP (glycoprotein).
Virus cúm A được định type phụ dựa vào phản ứng huyết thanh học của các
glycoprotein bề mặt HA và NA. Hiện nay, người ta đã xác định được 16 phân type HA
(H1 - H16) và 9 phân type NA (N1 - N9). Từ năm 1980, việc xác định phân type HA
đã được tiêu chuẩn hóa cho tất cả các virus cúm type A từ gia cầm, chim, ngựa và
người. Huyết thanh từ gia cầm và chồn sương sau khi mắc bệnh và kháng thể đơn dòng
được dùng để xác định sự có mặt kháng nguyên của virus cúm trong từng phân type.
Kháng thể đơn dòng được dùng trong nghiên cứu chi tiết về các epitope trong từng
kháng nguyên như so sánh HA của các virus H1N1 từ gà tây và lợn để thiết lập mối
quan hệ về tính kháng nguyên của các HA của chúng [18].


5

1.1.2. Đặc điểm tiến hóa tạo nên các phân dòng có độc lực cao của virus cúm
A/H5N1
Năm 1959, lần đầu tiên phát hiện chủng virus cúm A/H5N1 gây bệnh ở gia cầm
được coi là chủng cổ điển. Sau thời gian gần 40 năm không xuất hiện, vào năm 1996,
virus cúm A/H5N1 được phân lập từ ngỗng tại một ổ dịch ở Quảng Đông (Trung Quốc)
cho thấy đây là chủng đã tạo nên các dòng virus gây bệnh cúm gia cầm trong những năm
vừa qua [126]. Chủng virus nguyên thuỷ này cung cấp nguồn gen HA (H5) cho quá trình
tái tổ hợp tạo nên các biến chủng gây dịch bệnh trên gia cầm và người ở Hồng Kông
năm 1997, nguồn gen khung khác của virus cúm A/H5N1 Hồng Kông được kiến tạo từ
virus cúm A có ở chim cút [57]. Riêng nguồn gen NA (N1) trong cấu trúc của gen đã có

hiện tượng xóa đi 57 nucleotide mã hóa cho 19 amino acid, tại vùng đầu N của protein
neuraminidase và đột biến “xóa gen” của N1 có liên quan đến tính thích ứng của virus
cúm từ thuỷ cầm lên gia cầm trên cạn và người [86].
Năm 1997, virus cúm A/H5N1 gây bệnh tại Hồng Kông làm chết 6 người trong
tổng số 18 người bị nhiễm. Do toàn bộ đàn gia cầm bị tiêu diệt, virus cúm A/H5N1
nguyên thủy gốc Quảng Đông không còn gia cầm cạn để gây bệnh, tưởng như virus đã
biến mất, nhưng thực tế chủng nguyên thủy này vẫn tiếp tục tồn tại trong ngỗng ở vùng
Nam Trung Quốc, trở thành nguồn gen tái tổ hợp hình thành biến chủng mới [33],
[120]. Trong các năm 1997 đến 2002, các biến chủng virus cúm A/H5N1 mang nhiều
đặc tính kháng nguyên khác nhau của phân type H5 được hình thành tạo nên clade 1 có
độc lực cao với gà nhưng thấp đối với vịt, để rồi sau đó bị đào thải trong những năm
2001 - 2002. Tiếp tục trong năm 2002 - 2003, gen mã hóa kháng nguyên H5 có những
đột biến mới do hậu quả của hiện tượng lệch kháng nguyên (antigenic drift) để tạo nên
biến chủng có tính gây bệnh cao, đặc biệt đối với vịt, và có khả năng lây nhiễm sang
người [56]. Đặc tính thích ứng và gây bệnh trên người càng ngày càng cao dần, cùng
với độc lực tăng cường đối với đa vật chủ để rồi hình thành nhiều biến chủng xâm nhập
xuống các nước phía Nam châu Á trong đó có Việt Nam, Thái Lan [34], [45].
Tại Việt Nam, virus cúm gia cầm H5N1 xuất hiện từ năm 2001, nhưng đến cuối
năm 2004 mới chính thức được công bố [5], [7]. Virus H5N1 thể độc lực cao và H5N2,


6

H9N3 thể độc lực thấp đã được phân lập ở ngỗng và vịt từ năm 2001 và 2003 [122].
Phân tích phả hệ cho thấy nhóm virus này không phải clade 1 thuộc phân dòng Quảng
Đông đã gây bệnh ở người vào cuối năm 2003 [71]. Tiến hóa chủng/phân type và phân
dòng tái tổ hợp mới thường xuất phát từ phía của Nam Trung Quốc [107], [118], [122].
Sau giai đoạn 1997 - 2003, virus cúm A/H5N1 đã đạt đến mức độ hoàn thiện về
đặc tính gây bệnh trở nên mối nguy cơ gây bệnh rất cao đối với gia cầm và người trong
các năm 2004 - 2005 [107]. Tuy nhiên, xét về di truyền học phân tử và tính kháng

nguyên, các chủng virus H5N1 giai đoạn 1997 - 2002 vẫn mang tính đồng nhất kháng
nguyên cùng với chủng nguyên thuỷ A/Gs/Gd/1/96 của Quảng Đông [34] và bắt đầu
phân hóa ở giai đoạn dịch cúm ác liệt xảy ra năm 2003 - 2005 (Hình 1.1).

Hình 1.1 Dịch tễ học các biến chủng virus cúm A ở khu vực Đông Nam Á. Các mũi tên chỉ
vùng xuất phát và thời điểm lan truyền của virus [45]

Từ cuối năm 2005, ngoài phân dòng chính Quảng Đông tiếp tục lưu hành, còn có
nhiều phân dòng khác của virus cúm A/H5N1 cùng lúc được hình thành, đó là sự xuất
hiện của phân dòng Thanh Hải (Qinghai and Qinghai-like sublineage) và phân dòng
Phúc Kiến (Fujian and Fujian-like sublineage), tràn ngập châu Á bao gồm Trung Quốc,


7

Hồng Kông, Việt Nam, Indonesia, Thái Lan [78], [107], tràn sang Trung Á, châu Âu và
châu Phi có tính gây bệnh cao đối với người [47], 106].
Các chủng thuộc phân dòng Phúc Kiến và Thanh Hải có cấu trúc gen N1 không
thay đổi nhiều, nhưng trong gen H5 có motif amino acid ở vùng chuỗi nối của điểm cắt
protease là (-RRRK-) đã giảm mất một lysine (K) so với các chủng thuộc phân dòng
Quảng Đông [107], vì thế kể từ năm 2006 đến nay, có nhiều chủng virus cúm A/H5N1
thuộc nhiều clade khác nhau cùng tồn tại gây bệnh trên thế giới, trong đó có Việt Nam
[94]. Trong các năm 2006 - 2008, dịch cúm gia cầm xảy ra không ác liệt như những
năm 2003 - 2005, nhưng do xuất hiện nhiều chủng cúm A/H5N1 có biến động kháng
nguyên và độc lực, vấn đề dịch tễ học có thể đã trở nên phức tạp hơn [53], [128].
1.1.3. Sự hình thành genotype của virus cúm A/H5N1 trên thế giới và Việt Nam
Kể từ khi cúm gia cầm A/H5N1 xuất hiện ở ngỗng tại Quảng Đông
(A/Gs/CN/Gd1/1996(H5N1) [126], cho đến nay có tất cả 12 genotype được hình thành
(Hình 1.2A).
Từ năm 2002 trở lại đây, những genotype nguyên thủy của dòng Quảng Đông đã

không còn tồn tại (đó là các genotype A, C, D, E) nhưng thêm nhiều genotype kế tiếp,
bao gồm GD, A, B, C, D, E, X(X0-X3), V, Y, W, Z(Z+) và G, tiếp tục tiến hóa xuất hiện
và tồn tại 8 genotype của H5N1 (V, W, X1, X2, X3, Y, Z và Z+) [85].
Sự xuất hiện của genotype Z với tính gây bệnh cao ở các nước Đông Nam Á là
bằng chứng của sự đột biến “lệch kháng nguyên” của virus cúm A/H5N1 [125].
Các chủng virus A/H5N1 phân lập tại Việt Nam năm 2004 - 2006 thuộc dòng
Quảng Đông, tập trung chủ yếu là genotype Z, gần đây xuất hiện thêm genotype G
nhưng được phân biệt thành 2 nhóm: nhóm N (North) phổ biến ở phía Bắc Việt Nam và
nhóm S (South) phân bố ở phía Nam [94], [107]. Từ năm 2001 đến 2007, đã có 9 nhóm
di truyền là VN1 – VN9 (genotype) xuất hiện hoặc xâm nhập vào Việt Nam, được xác
định dựa trên phân tích trao đổi chéo các phân đoạn để tái tổ hợp hình thành genotype
[117] (Hình 1.2B), theo đó dựa trên thành phần H5 chúng thuộc vào các clade khác nhau.


8

Hình 1.2 (A). Hình thành các genotype trong quá trình tiến hóa từ các nguồn gen khác nhau,
(B). Các genotype bắt đầu từ khi mới xuất hiện thể độc lực cao HPAI tạo thành từ các trao đổi
chéo tiến hóa tạo genotype mới tại Việt Nam từ 2001 – 2007 [117].

Hình 1.3 Quá trình tái tổ hợp và sự hình thành các genotype của virus cúm A/H5N1 [45].


9

Các nhóm di truyền và clade, cụ thể đó là: VN1, năm 2001 (clade 3), VN2, năm
2003 (clade 5), VN3, các năm 2003 – 2007 (clade 1), VN4, từ năm 2005 (clade 2.3.2),
VN5, năm 2005 (clade 0), VN6, từ năm 2007 (clade 2.3.4), VN7, từ năm 2007 (clade
2.3.4), VN8, từ năm 2007 (clade 2.3.4), VN9, từ năm 2007 (clade 2.3.4) [117]. Các
chủng thuộc clade 7, dòng Á - Âu đã được xác định ở Lạng Sơn năm 2007 - 2008 và

biến mất sau đó [95] và clade 2.3.2 xuất hiện từ 2009 đến nay [42], [117]. Một số
chủng virus chỉ xuất hiện rồi biến mất trong vòng một năm và chỉ trao đổi nguồn gen
trong quá trình tiến hoá (Hình 1.3), một số khác chỉ tồn tại vài năm rồi sau đó không
phát hiện được, số khác mới xâm nhập gần đây, chẳng hạn như phân dòng 2.3.4 có
nguồn gốc từ Phúc Kiến và phân dòng 2.3.2 phát hiện năm 2009 có nguồn gốc từ vùng
hồ Thanh Hải (Trung Quốc) hiện nay có xu hướng tiến hoá nội bộ tạo nên nhiều chủng
biến đổi khác nhau.
Genotype Z phổ biến hầu hết các nước trong khu vực châu Á. Đặc điểm của
genotype Z là các gen NA và NS đều bị mất đoạn, và vùng chuỗi nối HA1-HA2 (điểm
cắt protease) của protein HA (H5) mang nhiều aminno acid qui định độc lực của virus.
Tuy nhiên, một số virus phân lập tại vùng phía Nam Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng
Tây và Hồ Nam) có sự đa dạng hơn của các type Z, V, W và G. Sự xuất hiện của
genotype G có thể do quá trình tái tổ hợp của genotype W và genotype Z [36].
1.1.4. Biến đổi thành phần hemagglutinin (HA) tạo nên các clade của virus cúm
A/H5N1
Sự tiến hoá của virus cúm gia cầm A/H5N1 có thể làm thay đổi tính kháng
nguyên dẫn đến ảnh hưởng đáp ứng miễn dịch của gia cầm khi được tiêm phòng vaccine.
Virus cúm gia cầm lưu hành tại Việt Nam đa dạng về kiểu hình HA liên quan nhiều đến
đặc tính kháng nguyên, trong đó clade 1 và clade 2 được xác định gây bệnh cho người và
clade 2 cũng đã phát triển thành các clade khác nhau trên cơ sở thay đổi về một số amino
acid [13].
Thông báo của Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO) và Tổ chức Y tế thế giới
(WHO) cho biết, hiện nay đã phát hiện các phân nhánh virus cúm A/H5N1 thể độc lực
cao thuộc clade 1.1 và 2.3.2.1 (9]. Các phân nhánh này không phải là mới xuất hiện mà


10

do trong quá trình tiến hoá tự nhiên được hình thành. Clade 1.1 có nguồn gốc từ clade
1 trước đây. Phân nhánh 2.3.2.1 được tiến hoá từ clade 2.3.2 đã được phát hiện từ chim

hoang dã sau đó là gia cầm Trung quốc (Hunan, Qinghai), Mông Cổ, Nga, Nhật Bản,
Hàn Quốc, Lào và Hồng Kông và mới đây là Việt Nam [124].
Hiện nay, clade 1.1 đã thay thế cho clade 1 ở phía Nam nước ta. Trong năm
2011, clade 2.3.2.1 đã được phát hiện ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam và vùng duyên
hải miền Trung thay thế cho clade 2.3.4 trước đây [50, 123, 124] (Phụ lục 3).
Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của virus cúm gia cầm A/H5N1 thuộc clade 1 tại
Việt Nam và Campuchia cũng cho thấy có sự hình thành clade 1.1. Clade 1.1 đã được
phát hiện ở gia cầm của Việt Nam tại phía Nam, ở gia cầm và người tại Campuchia gây
chết 9/9 người từ cuối 2010 đến nay [123]. Cho đến nay, sau gần 10 năm xuất hiện tại
Việt Nam, virus cúm gia cầm A/H5N1 đã trở thành một tác nhân nguy hiểm cho gia cầm
và cộng đồng và là mối nguy cơ lại càng gia tăng khi vaccine hiện nay không có đáp ứng
miễn dịch đối với các chủng virus thuộc các clade mới xuất hiện năm 2011. Kết quả thí
nghiệm của Cục Thú y liên quan đến clade 2.3.2.1 xuất hiện năm 2011 cho thấy, sau
khi công cường độc 100% gà bị chết trong vòng 3 ngày và 20% vịt chết trong vòng 7
ngày. Như vậy nhóm virus này có độc lực cao với gà hơn đối với vịt (nhánh cũ có thể
gây chết 60 – 70% vịt) ( />Hiện tại chưa phát hiện thấy virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 ở người. Tuy
nhiên vấn đề chưa có vaccine tiêm phòng cho gia cầm đối với clade 2.3.2.1 này, như
vậy, gia cầm hoàn toàn bỏ ngỏ không được bảo hộ miễn dịch tạo điều kiện cho virus
cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 có thể tiếp tục biến đổi trở thành nguy cơ đáng lo ngại gây
bệnh trên người [124]. Do đó, việc quan trọng cần làm là phải tăng cường công tác
giám sát virus cúm ở gia cầm, chủ động áp dụng các biện pháp phòng chống dịch thích
hợp. Mục đích nhằm ngăn chặn sự lây truyền dịch ở gia cầm và ngăn chặn lây truyền
từ gia cầm sang người.


11

1.2. ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA VIRUS CÚM A
1.2.1. Đặc tính cấu trúc chung
Dưới kính hiển vi điện tử, hầu hết các hạt của virus (virion) có dạng hình cầu

đường kính từ 50 - 100 nm (Hình 1.4A). Một số ít có dạng hình sợi đường kính 20 nm
và dài từ 200 - 300 nm. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài
(envelope) và lõi chứa RNA. Vỏ virus có bản chất cấu tạo là màng lipid kép, có nguồn
gốc từ màng tế bào nhiễm đã được thích ứng một cách đặc hiệu gắn các protein màng
của virus vào, bao gồm một số protein được glycosyl hoá (glycoprotein) và một số
protein dạng trần không được glycosyl hoá (non-glycosylated protein).
Protein bề mặt có cấu trúc từ glycoprotein, bao gồm protein gây ngưng kết hồng
cầu HA, protein enzym cắt thụ thể NA và protein đệm M (matrix). Lipid tập trung ở
màng virus, chủ yếu là lipid có gốc photpho, số còn lại là cholesterol, glucolipid và một
ít carbohydrate gồm các loại đường galactose, mannose, ribose, fructose, glucosamin.
Bên trong virus có cấu trúc phức tạp gồm protein capsid và các sợi RNA nối với nhau
thành các nucleocapsid có cấu trúc đối xứng xoắn. Vỏ của virus được cấu tạo bởi 2 lớp
lipid, trên bề mặt có khoảng 500 các gai khác nhau nhô lên từ bề mặt của virus, mỗi gai
có độ dài từ 10 - 14 nm. Các gai này được cấu tạo bởi các glycoprotein. Có hai loại
glycoprotein là hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Các gai HA thường nhiều
hơn và xen kẽ với các gai NA với tỷ lệ là (4-5):1.
Hệ gen virus cúm A là RNA sợi đơn âm, gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt (Hình
1.4B), mã hoá cho 11 protein khác nhau của virus, các phân đoạn được sắp xếp theo
trật tư: PB2, PB1 (PB1 và PB1-F2), PA, HA, NP, NA, M (M1 và M2), NS (NS1 và
NS2) [91], [103]. Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc xoắn bậc 2 α đối
xứng dài 50 - 100 nm, đường kính 9 - 10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein (NP) với
bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) (Hình 1.4C).
Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptide
tạo nên vòm (loop) tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi RNA duy
nhất có độ dài từ 10.000 - 15.000 nucleotide (tuỳ theo từng chủng virus cúm A) và có
cấu trúc xoắn α (α-helix) bên trong vỏ virus.


12

HA có chức năng giúp virus bám dính vào tế bào cảm nhiễm và làm xâm nhập
vật liệu di truyền của virus vào bên trong tế bào. NA có chức năng thúc đẩy sự lắp ráp
để giải phóng virus từ các tế bào cảm nhiễm. Các glycoprotein HA và NA quyết định
tính kháng nguyên đặc hiệu của từng phân type virus khác nhau và cũng là vị trí để các
loại thuốc kháng virus trong điều trị bệnh sẽ gắn kết và phát huy tác dụng diệt virus.
Đồng thời HA và NA còn có vai trò quan trọng trong việc quyết định tính kháng
nguyên trong sản xuất vaccine. Phân tích thành phần hoá học các hạt virus cúm A có
chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA, 70-75% là protein, 20 - 24% lipid và 5 - 8% là
carbohydrate [91].
neuraminidase

(B)
heagglutinin

(A)

(A)

(B)

(C) (C)

Hình 1.4 (A) Ảnh các dạng hình thái của virus cúm A được nhuộm âm tính trên kính hiển vi
điện từ truyền qua. (Nguồn: Dr. Erskine Palmer, Centers for Disease Control and Prevention
Public Health Image Library), (B) Mô hình cấu tạo hạt virus cúm A (hemagglutinin: phân tử
kháng nguyên HA, neuraminidase: phân tử kháng nguyên NA, PB2, PB1, PA: ba dưới đơn vị
phức hợp enzym polymerase của virus), (C) Cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP
của virus cúm (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge).

Về mặt dịch tễ học, virus cúm A có nhiều biến chủng khác nhau, thích ứng hầu

như với mọi loài vật chủ và hệ gen luôn luôn biến đổi, định kỳ gây nên những vụ dịch
cúm trong lịch sử ở động vật và người [70], [121]. Do đặc tính biến đổi nội gen nhanh
chóng và trao đổi gen để tái tổ hợp tạo biến thể mới truyền lây trong quần thể sinh vật,
cho nên virus cúm A thuộc nhóm virus nguy hiểm gây bệnh động vật sang người
(zoonotic infections). Virus cúm A/H5N1 được coi là loại biến chủng có mức độ độc