BÁO cáo CHUYỂN đề CÔNG NGHỆ SINH học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ - CNSH
MÃ HỌC PHẦN: CS326

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

PGS.TS NGUYỄN VĂN THÀNH

Nguyễn Anh Kiệt

B1303675

Đỗ Thị Huỳnh Mai

B1303679

Nguyễn Thị Trúc Mai

B1303680

Nguyễn Thị Kiều Nga

B1303685

Ngô Nhật Thành

B1303847

Cần Thơ, 09/2015
CHUYÊN ĐỀ:


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

MỤC LỤC
A. ĐẶT VẤN ĐỀ: ................................................................................................................... 1
B. PHƯƠNG PHÁP TIẾP CẬN VÀ PHẠM VI ĐỀ TÀI: ................................................. 2
C. GIỚI THIỆU: ....................................................................................................................... 2
D. NỘI DUNG: ........................................................................................................................ 2
I. CÔNG NGHỆ SINH HỌC TẾ BÀO ĐỘNG VẬT. ........................................................ 2
1. Khái niệm .............................................................................................................2
2. Lịch sử phát triển .................................................................................................2
3. Các kỹ thuật..........................................................................................................3
3.1. Nuôi cấy mô tế bào động vật............................................................................... 3
3.1.1. Khái niệm ................................................................................................ 3
a. Môi trường nuôi cấy .................................................................................3
Môi trường hóa chất ..................................................................................3
Nhân tố sinh trưởng ...................................................................................4
Các chất kháng sinh ...................................................................................4
3.1.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào động vật ....................................................6
a. Nuôi cấy sơ cấp ......................................................................................... 6
THU NHẬN MẪU VÀ XỬ LÝ SƠ BỘ ...................................................8
TÁCH RỜI CÁC TẾ BÀO........................................................................8
a. Tách bằng cơ học ..................................................................................... 8

b. Tách bằng Enzyme .................................................................................. 8
c. Tách tế bào bằng các phương pháp khác ............................................ 10
b. Nuôi cấy thu nhận mô tế bào ..................................................................11
Nuôi tế bào sơ cấp ................................................................................... 11
Nuôi cấy phát triển mảnh mô sơ cấp ....................................................... 11
Cấy chuyền .............................................................................................. 12
c. Sự sinh trưởng của tế bào trong nuôi cấy ................................................13
d. Phương thức nuôi cấy .............................................................................13
3.1.3. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật ........................................14
a. Nuôi cấy và tạo tế bào lai soma động vật................................................14
b.Nhân bản vô tính ...................................................................................... 18
c. Kỹ thuật chuyển nhân ..............................................................................18

i


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

3.1.4. Thành tựu .............................................................................................. 23
Ứng dụng trong lĩnh vực y tế. ....................................................................23
Cấy ghép mô, cơ quan .............................................................................23
Nuôi cấy tế bào trong mô hình thực nghiệm để khảo sát tác động của hóa
chất ..........................................................................................................28
Nuôi cấy tế bào để sản xuất chế phẩm sinh học ......................................28
Nuôi cấy tế bào trong độc chất học ......................................................... 28
3.1.5. Các ưu điểm của nuôi cấy tế bào động vật ...........................................29
3.1.6. Một số hạn chế của nuôi cấy tế bào động vật .......................................30
3.2 Chuyển gen _ Công nghệ gen. ........................................................................... 30

3.2.1. Khái niệm .............................................................................................. 30
3.2.2. Mục đích ............................................................................................... 31
3.2.3 Đối tượng chuyển gen ............................................................................31
3.2.4. Các kỹ thuật chuyển gen .......................................................................31
a. Kỹ thuật điện xung. .................................................................................31
b. Kỹ thuật vi tiêm....................................................................................... 36
c. Kỹ thuật chuyển gen nhờ liposome. ........................................................ 40
d. Chuyển gen bằng cách sử dụng tế bào gốc phôi .....................................42
e. Chuyển gen trực tiếp vào tinh trùng kết hợp với thụ tinh in vitro .........44
f. Chuyển gen gián tiếp (Chuyển gen nhờ vector virus và phage) ..............48
Vector transposon .................................................................................... 49
Vector retrovirus......................................................................................52
Vector adenovirus....................................................................................59
Vector episome ........................................................................................62
3.2.4. Thành tựu .............................................................................................. 71
Chuột chuyển gen .................................................................................... 71
Thỏ chuyển gen ....................................................................................... 73
Lợn chuyển gen ....................................................................................... 75
Cừu chuyển gen ....................................................................................... 76
Dê chuyển gen ......................................................................................... 76
Bò chuyển gen: ........................................................................................ 77
Gà chuyển gen ......................................................................................... 77

ii


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

Khỉ chuyển gen ........................................................................................ 82
Muỗi chuyển gen ..................................................................................... 84
Cá chuyển gen ......................................................................................... 89
3.2.5. Lợi ích và hạn chế của việc tạo động vật chuyển gen. ......................... 98
Lợi ích .........................................................................................................98
Hạn chế .......................................................................................................98
3.2.6 Ý nghĩa, thuận lợi và khó khăn trong chuyển gen tế bào động vật .......98
Ý nghĩa ........................................................................................................98
Thuận lợi .....................................................................................................99
Khó khăn .....................................................................................................99
Triển vọng của công nghệ chuyển gen ....................................................... 99
3.3. Công nghệ tế bào gốc (sẽ nói rõ ở phần II) ..................................................... 99
II. CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GỐC ......................................................................................... 99
1. Khái niệm tế bào gốc........................................................................................100
2. Đặc tính, chức năng của tế bào gốc..................................................................100
2.1. Đặc tính. ............................................................................................................. 100
2.1.1. Tế bào gốc là tế bào không chuyên dụng. ..........................................100
2.1.2. Tế bào gốc có thể phân chia và tái tạo trong thời gian dài. ................101
2.1.3. Tế bào gốc có thể biến đổi thành tế bào chuyên dụng. .......................101
2.2. Chức năng. ......................................................................................................... 101
2.3. Phân loại ............................................................................................................ 102
2.3.1. Phân loại theo nguồn gốc ....................................................................102
a. Tế bào gốc phôi (Embryonic stem cells)...............................................102
b. Tế bào gốc mầm phôi (Embryonic germ cells) .....................................103
c. Tế bào gốc thai (Foetal stem cells) .......................................................103
d. Tế bào gốc trưởng thành (Adult stem cells/Somatic stem cells) ..........104
e. Tế bào gốc khối u (Embryonic carcinomas cells) .................................104
2.3.2. Phân loại theo tiềm năng biệt hóa .......................................................105
a Tế bào gốc toàn năng (totipontent stem cells). ......................................105
b. Tế bào gốc vạn năng (pluripotent stem cells) .......................................105

c. Tế bào gốc đa năng (multipotent stem cells) ........................................106
d. Tế bào gốc đơn năng (mono/unipotential progenitor cells) ..................107

iii


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

2.5. Nuôi cấy và biệt hóa tế bào gốc ...................................................................... 107
2.5.1. Nuôi cấy tế bào gốc ............................................................................107
a. Điều kiện, môi trường nuôi cấy.............................................................107
Điều kiện nuôi cấy tế bào gốc ...............................................................107
Môi trường nuôi cấy ..............................................................................108
b. Nuôi cấy sơ cấp. ....................................................................................108
c. Nuôi cấy thứ cấp. ..................................................................................109
2.5.2. Biệt hóa ...............................................................................................110
a. Biệt hóa bằng hóa chất. .........................................................................110
b. Biệt hóa bằng chất nền. .........................................................................110
c. Kích thích vật lí. ....................................................................................111
d. Chuyển gen. ..........................................................................................111
e. Các gốc tự do và dạng oxygen họat động. ............................................111
f. Đồng nuôi cấy với các tế bào đã biệt hóa. .............................................111
2.6. Ứng dụng ........................................................................................................... 111
2.6.1. Ghép tế bào gốc trị liệu (stem cell theraphy)......................................111
Ứng dụng tế bào gốc trưởng thành trong điều trị. ....................................112
Ứng dụng tế bào gốc phôi trong điều trị. ..................................................112
2.6.2. Công nghệ mô (Tissue engineering) ...................................................113
2.6.3. Các ứng dụng tế bào gốc phôi không liên quan đến ghép ..................114

3. Liệu pháp tế bào gốc. .......................................................................................115
3.1. Tế bào gốc trong điều trị bện thần kinh ......................................................... 115
3.1.1. Cấy ghép tế bào gốc hay tế bào thần kinh ..........................................116
3.1.2. Kích hoạt các tế bào gốc nội sinh .......................................................116
3.2. Liệu pháp tế bào gốc trong bệnh tim mạch ...........................................116
3.2.1. Huy động tế bào gốc ...........................................................................116
3.2.2. Cấy ghép tế bào gốc vào tim...............................................................117
3.3. Liệu pháp tế bào gốc trong điều trị bệnh tiểu đường .............................117
3.3.1. Cấy ghép tế bào gốc ............................................................................117
3.3.2. Ghép tế bào tiết insulin được biệt hóa từ tế bào gốc trước đó ............118
3.4. Tái tạo biểu mô và da.............................................................................118
4. Một số nghiên cứu về tế bào gốc .....................................................................118

iv


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

4.1. Tế bào gốc phôi biệt hóa thành 3 loại tế bào gốc tim .................................. 118
4.2. Chuyển đổi thành công tế bào gốc thành tế bào phổi .................................. 119
4.3. Liệu pháp tế bào gốc trong điều trị bệnh đái tháo đường type 2 ................ 121
4.4. Biến tế bào gốc thành tế bào gan, tụy tạng .................................................... 122
4.5. Tạo ra thủy tinh thể từ tế bào gốc ................................................................... 123
4.6. Tạo tế bào gốc từ màng dây rốn ..................................................................... 124
4.7. Tạo tinh trùng từ các tế bào gốc tủy xương................................................... 125
4.8. Thử nghiệm phương pháp điều trị ung thư phổi nhờ tế bào gốc ................ 126
5. Các thành tựu ứng dụng tế bào gốc tiêu biểu ...................................................126
5.1. Tế bào gốc chữa khỏi bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm ......................... 127

5.2. Ghép tế bào gốc điều trị bệnh tiểu đường...................................................... 128
5.3. Tạo tế bào gan từ mỡ dưới da ......................................................................... 129
5.4. Tế bào gốc phôi trong điều trị bệnh Parkinson ............................................. 130
5.5. Điều trị thoái hóa khớp gối .............................................................................. 131
5.6. Tế bào gốc và ứng dụng trong thẩm mỹ ........................................................ 132
III. LIỆU PHÁP GEN............................................................................................................. 133

1. Khái niệm. ........................................................................................................133
1.1. Liệu pháp gen. ................................................................................................... 133
1.2. Gen liệu pháp ( therapeutic gene) ................................................................... 134
2. Nguyên tắc cơ bản của điều trị bằng liệu pháp gen. ........................................135
3. Phân loại liệu pháp gen. ...................................................................................135
3.1. Liệu pháp gen soma. ........................................................................................ 135
3.2. Liệu pháp gen tế bào mầm. ............................................................................. 135
4. Các kỹ thuật cơ bản của liệu pháp gen. ............................................................136
4.1. Cơ sở của liệu pháp gen. .................................................................................. 136
4.2. Các bước cơ bản trong liệu pháp gen. ............................................................ 137
4.3. Phương pháp và Kỹ thuật chuyển gen liệu pháp. ......................................... 138
5. Nguyên lý của liệu pháp gen. ...........................................................................140
5.1. Tách dòng gen liệu pháp. ................................................................................. 140
5.2. Các loại vecto thường sử dụng trong liệu pháp gen. .................................... 140
5.2.1. Các vecto liệu pháp có bản chất virus. ...............................................141
a. Vector Adenovirus: ...............................................................................142

v


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

b. Vectơ retrovirus. ...................................................................................144
c. Vector Adeno-Associated Virus (AAV). ..............................................146
d. Vector Herpes Simplex Virus (HSV). ..................................................148
5.2.2. Các vector không có bản chất virus ....................................................149
a. Liposomes .............................................................................................149
b. Các polymer cation ...............................................................................150
c. Cấy trực tiếp ..........................................................................................151
d. Liệu pháp tế bào gốc .............................................................................151
e. Biến đổi biểu hiện gen ...........................................................................151
Oligonucleotide .....................................................................................152
Ribozyme...............................................................................................153
Promoter ................................................................................................154
6. Ứng dụng của liệu pháp gen trong chữa một số bệnh. .....................................154
6.1. Các lĩnh vực ứng dụng chủ yếu của liệu pháp gen ...................................... 154
6.1.1. Trong điều trị các bệnh do rối loạn di truyền .....................................154
a. Điều trị và chữa các bệnh do rối loạn di truyền các locus đơn gen ......154
b. Điều trị và chữa các bệnh do rối loạn di truyền các locus đa gen.........154
6.1.2. Trong chữa các bệnh do nhiễm trùng. ................................................154
6.2. Một số xu hướng chữa bệnh bằng liệu pháp gen. ......................................... 155
6.2.1. Thay thế gen liệu pháp vào vị trí gen hỏng ........................................155
6.2.2. Tăng cường hoặc hỗ trợ hoạt động của gen. .......................................155
6.2.3. Sửa chữa gen. ......................................................................................155
6.2.4. Ức chế tế bào đích. .............................................................................156
6.2.5. Tiêu diệt tế bào đích. ..........................................................................156
6.3. Những thành tựu đáng quan tâm. ................................................................... 156
6.3.1. Ứng dụng liệu pháp gen trong chữa trị HIV/AIDS.........................156
6.3.2. Liệu pháp gen trong điều trị ung thư. .................................................159
a. Ung thư. .................................................................................................159
b. Liệu pháp gen điều trị ung thư. .............................................................159

6.3.3. Ứng dụng liệu pháp gen trong điều trị bệnh Parkinson. .....................161
6.4. Triển vọng của liệu pháp gen trong tương lai. .............................................. 162
E. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 163

vi


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

1. KẾT LUẬN ................................................................................................................ 163
2. KIẾN NGHỊ................................................................................................................ 163
F. TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 164

vii


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

CÔNG NGHỆ SINH HỌC TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
TẾ BÀO GỐC, LIỆU PHÁP GEN
A. ĐẶT VẤN ĐỀ:
Thế kỷ 21 là thế kỷ của CNSH, nó sẽ xâm nhập vào mọi lĩnh vực của đời sống.
Với sự tiến bộ vượt bật của khoa học ngày nay, ngày càng có nhiều sản phẩm cải tiến
phục vụ cho cuộc sống được ứng dụng từ công nghệ sinh học. Điều này có thể thấy
qua những kết quả nghiên cứu đã được công bố của các nước trên thế giới. Trong vòng
30 năm qua, chúng ta chứng kiến những thành tựu đáng kinh ngạc của sinh học và

công nghệ sinh học cả trong nghiên cứu cơ bản lẫn nghiên cứu ứng dụng. Sự thành
công của sinh học và công nghệ sinh học còn nằm ở chỗ nó tạo ra những sản phẩm
chuyên về sinh – y – nông nghiệp – công nghệ sinh học với đủ mọi cấp độ quy mô.
Vấn đề nuôi cấy tế bào nói chung và nuôi cấy tế bào động vật nói riêng cùng
với các phương pháp chuyển gen đang ngày càng được dư luận thế giới quan tâm hết
mức trên nhiều phương diện khác nhau, cả về lợi ích lẫn những tác hại có thể vô cùng
to lớn mà hiện nay người ta chưa lường hết được. Bên cạnh đó, tế bào gốc là một lĩnh
vực nghiên cứu còn khá mới mẻ ở Việt Nam nhưng trên thế giới công nghệ tế bào gốc
đã xuất hiện cách đây cả nửa thập kỷ. Những nghiên cứu về tế bào gốc chủ yếu phục
vụ cho y tế nhằm tái tạo và thay đổi các mô của cơ thể người bệnh nhờ vào công nghệ
tế bào gốc. Công nghệ tế bào gốc có thể áp dụng cho mọi cơ thể sống nhưng do chi phí
nghiên cứu, phân lập và nuôi cấy rất đắt nên hiện nó chỉ được sử dụng hạn chế trên
một số mô của một số bệnh nhân có khả năng tài chính hoặc với mục đích thực
nghiệm là chính. Từ những tiến bộ và các nghiên cứu trên người ta thấy được rằng
nhiệm vụ hàng đầu của công nghệ sinh học là gỉai quyết các vấn đề bệnh hiểm nghèo
và di truyền. Và liệu pháp gen là kỹ thuật cao trong CNSH và có nghĩa quan trọng
trong nhiệm vụ này. Nhằm tìm hiều và bổ sung kiến thức về những vấn đề trên nhóm
đã tiền hành làm đề tài “ CNSH tế bào động vật, liệu pháp gen, tế bào gốc” dưới sự
hướng dẫn của PGS. TS Nguyễn Văn Thành.

1


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

B. PHƯƠNG PHÁP TIẾP CẬN VÀ PHẠM VI ĐỀ TÀI:
Đây là một đề tài tương đối rộng và các kỹ thuật ngày càng hiện đại, phạm vi
đối tương nghiên cứu lại lớn. Nhưng trình độ và khả năng nhóm có hạn nên phạm vi

nghiên cứu chỉ trên tế bào động vật với một số các kỹ thuật và thành tựu cơ bản.
Để thực hiện đề tài này chúng tôi đã sưu tằm thông tin trên internet, sách, giáo
trình, báo…và đã so sánh qua lại giữa các đề tài để đảm bảo tính chính xác vad tổng
quát nhất.
C. GIỚI THIỆU:
CNSH tế bào động vật là tổ hợp tất cả các thao tác kỹ thuật nhằm tạo ra các cơ
quan, bộ phận hòan chỉnh, hay động vật mới từ một hay một số tế bào ban đầu. Kỹ
thuật này có sự khác nhau với các đối tượng khác nhau.
Tế bào gốc là tế bào có khả năng phân chia vô hạn định và có khả năng sinh sản
và tạo ra các tế bào khác có những chức năng chuyên biệt mỗi khi cấy vào các tế bào
khác nhau. CNSH tế bào gốc là sử dụng tế bào gốc để tạo ra các sản phẩm phục phụ
trong đời sống, đặc biệt là trong y học hiện đại.
Liệu pháp gen là phương pháp đưa gen lành vào cơ thể thay thế cho gen bệnh
hay đưa gen cần thiết nào đó thay thế cho gen hư hỏng để đạt được mục tiêu cuả liệu
pháp. Phương pháp này được sử dụng nhiều trong y học và có ứng dụng rất cao.
D. NỘI DUNG:
I. CÔNG NGHỆ SINH HỌC TẾ BÀO ĐỘNG VẬT.
1. Khái niệm
Công nghệ sinh học tế bào động vật là ngành khoa học nghiên cứu về qui trình
ứng dụng phương pháp nuối cấy tế bào động vật để tạo ra cơ quan hay cơ thể hoàn
chỉnh.
2. Lịch sử phát triển
Năm 1907, Harrison là người đầu tiên đã nuôi cấy thành công một mảnh mô
phôi ếch trong dịch dịch bạch huyết với kỹ thuật “giọt treo” (Hanging drop).Năm
1923, Carel đã hoàn thiện kỹ thuật nuôi cấy tế bào trong các bình thủy tinh (in vitro),
để tuyệt trùng và tạo điều kiện cho tế bào phát triển tốt. Nhưng phải chờ đến những
năm 1960, khi hoàn thiện môi trường nuôi cấy nhân tạo thì kỹ thuật nuôi cấy tế bào
động vật mới được phát triển mạnh và được ứng dụng vào nhiều ngành công nghệ sinh
học.

2


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

Sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô ngày càng tinh vi, hiện đại do nhu cầu
bức thiết của hai hướng nghiên cứu chính: tạo vaccine kháng virus và nghiên cứu về
ung thư.
Hiện nay, các nhà nghiên cứu đang tiến tới sử dụng dạng tế bào lai
(hybridoma) giữa tế bào động vật và tế bào ung thư, như là một hệ thống sản xuất các
protein tái tổ hợp, ví dụ kháng thể đơn dòng, vaccine, interferon… Gần đây, nuôi cấy
tế bào gốc (stem cell) trở thành mũi nhọn mới trong công nghệ tế bào, với nhiều hy
vọng ứng dụng y sinh.
3. Các kỹ thuật
3.1. Nuôi cấy mô tế bào động vật:
3.1.1. Khái niệm:
Kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào động vật là kỹ thuật nuôi cấy in vitro các tế bào,
mô và cơ quan của động vật nhằm duy trì và/hay tăng sinh các tế bào, mô, cơ quan đó
một cách độc lập, tách khỏi những biến đổi của hệ thống in vivo ở điều kiện bình
thường hoặc stress. Kỹ thuật này đầu tiên được thực hiện với các mẫu mô, và tốc độ
tăng sinh của chúng rất chậm
a. Môi trường nuôi cấy:
Nhu cầu dinh dưỡng của các tế bào động vật lớn hơn vi sinh vật, không giống
vi sinh vật động vật không trao đổi chất nitrogen vô cơ. Vì thế, nhiều amino acid và
vitamin cần dược bổ sung vào môi trường. Môi trường đặc trưng dùng trong nuôi cấy
tế bào động vật bao gồm các amino acid, các vitamin, các hormone, các nhân tố sinh
trưởng, muối kháng và glucose. Ngoài ra môi trường cần được cung cấp từ 2-20 %
(Theo thể tích) huyết tương của động vật. Mặc dù huyết tương có thànhp hần chưa

được xác định đầy đủ, nhưng nhiều nghiên cứu cho thấy nó rất cần thiết cho sự phát
triển và tồn tại của tế bào trong nuôi cấy
Môi trường hóa chất:
Huyết thanh dung trong môi trường nuôi cấy không chỉ đắt tiền mà còn là
nguồn nhiểm bẩn virus và mycoplasma. Do bản chất hóa học của huyết thanh chưa
được xác định đầy đủ nên trong một số trường hợp có thể ảnh hưởng xấu đến kết quản
nuôi cấy.sự hiện diện của nhìu protein khác nhau trong huyết thanh củng có thể làm
phức tạp các quá trinh phân tách và tinh sạch đầu ra.vì lí do đó, nhiều nghiên cứu đã
được thực hiện để xây dựng môi trường không có huyết thanh. Những công thức này

3


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

chứa các hormone và các nhân tố sinh trưởng được tinh sach để thay thế cho huyết
thanh.
Môi trường hóa chất được sáng chế từ những năm 1960 đã thay thế hoàn toàn
cho các dịch sinh học như dịch chiết từ phôi gà,huyết tương,…môi trường hóa chất
được điều chế hàng loạt, cất giữ được lâu, dễ thay thế , thêm, bớt các chất cần thuyết,
ít bị ô nhiễm…môi trường nuôi cấy có chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng (cacbonhyrat,
acid amin, vitamin, nguyên tố vi lượng, hormon, nhân tố sinh trưởng).hiện nay, người
ta dung một số môi trường như môi trường eagle, môi trường dulbecco,…
Môi trường nuôi cấy phải đẳng trương để duy trì cân bằng áp suất thẩm
thấu.người ta thường dung bicacbonat để tạo hệ đệm kết hợp với hệ làm giàu kết hợp
với hệ làm giàu CO2 môi trường (5-10% CO2/95%

không khí) trong đó tế bào

được nuôi.độ ph thích hợp là 7.4.người ta thường sử dụng đỏ phenol để kiểm tra đọ pH
của môi trường, nếu môi trường chuyển dần từ đỏ sang vàng cam thì tế bào phát triển
tốt, nếu chuyển snag vàng nhạt là môi trường nhiểm khuẩn.
Nhân tố sinh trưởng:
Nếu không có nhân tố sinh trưởng thì tế bào động vật sẽ không phát
triển.người ta thường phải bổ sung huyết thanh bê vào môi trường nuôi cấy (10-15%)
vì trong huyết thanh có chứa nhân tố sinh trưởng.nhưng vừa đắt tiền lại vừa lại nhiểm
khuẩn cho nên ngày nay người ta thường dùng các chất bỏ trợ để thay thế cho huyết
thanh như: insulin, transferrin, ethanolmin,… hoặc sử dụng lớp tế bào nuôi.
Các chất kháng sinh:
Các chất kháng sinh như penecilin, steptomicin hoặc amphotericin B thường
được dùng để chống nhiểm khuẩn cho mẻ cấy.tuy nhiên, các chất kháng sinh thường
độc vì phải dùng với liều lượng thích hợp và kết hợp với qui trình tiệt trùng chu đáo.

4


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

Thành phần môi trường eagle (1959)

(Môi trường nuôi cấy)

5


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

3.1.2. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào động vật:
a. Nuôi cấy sơ cấp :
Nuôi cấy sơ cấp là quá trình nuôi cấy tế bào trực tiếp từ mô trước lần cấy truyền
đầu tiên (subculture). Trong nuôi cấy sơ cấp, các tế bào ban đầu thường là hổn hợp
các dòng tế bào khác nhau, hoặc chứa một kiểu tế bào trội nhất, trong đó có những tế
bào quan tâm và những tế bào khác (được gọi là tế bào miển nhiễm). có thể loại bỏ các
tế bào nhiễm bằng cơ học hay enzyme khi tách mô hay bằng cách duy trì các điều kiện
chon lọc dương tính cho sự sống sót của một kiểu tế bào quan tâm cần thu nhận.

6


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

Thu nhận mẫu
mô
Cắt nhỏ
(Chọn lọc mẩu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết)

Cắt nhỏ
(Mảnh nhỏ để nuôi)

Tách tế bào bằng cơ học
(Nghiền, ép)

Nuôi mẫu mô sơ
cấp

Tách tế bào bằng enzyme
(Ủ, v.v…)

Tryspin lạnh

Tryspin ấm

Collagenase

Li tâm

Nuôi sơ cấp
Thu nhận tế bào mới

Cấy truyền

Nuôi mảnh mô thứ cấp

Dòng tế bào

Tái huyền phù

Sơ đồ nuôi cấy sơ cấp (nguồn: CNSH trên người và động vật)
Qui trình nuôi cấy sơ cấp gồm:
-Bước 1: Thu nhân mô (tươi hoặc đông lạnh) có chứa tế bào sống.
-Bước 2: Phẩu tích và (hoặc) tách rời tế bào, xác định nồng độ.
-Bước 3: Nuôi cấy tế bào.

7


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

THU NHẬN MẪU VÀ XỬ LÝ SƠ BỘ:
Mẫu thu nhận có thể bao gồm bất kỳ ở mô nào của cơ thể. Tại nơi thu nhận,
mẫu cần được làm sạch (rửa và sát trùng bằng cồn) rồi đưa vào bảo quản trong dung
dịch DPBS rồi chuyển nhanh về phòng thí nghiệm. Tùy loại mẫu mô cũng như thời
gian cần thiết đưa về phòng thí nghiệm, để có kế hoạch vận chuyển chúng trong điều
kiện nhiệt độ ấm (370C), nhiệt độ lạnh hay đông lạnh tạm thời.
Xử lý sơ bộ mẫu mô: rửa nhiều lần bằng dung dịch DPBS có bổ sung kháng sinh,
kháng nấm cắt bỏ các phần mô chết, phần thừa cắt mảnh nhỏ ra thành từng mảnh 2-3
mm2 nuôi mẫu mô sơ cấp hoặc tách rời các tế bào.
TÁCH RỜI CÁC TẾ BÀO:
Mô là tập hợp các tế bào được tổ chức tinh vi và đặc trưng, chúng liên kết
thành một khối thống nhất, thông qua các cầu nối gian bào. Tách các tế bào ra khỏi
mô cần phá bỏ những cầu nối liên bào này, nhưng không gây tổn thương đáng kể cho
tế bào. Có hai biện pháp chính để tách rời các tế bào:
a. Tách bằng cơ học
- Cắt nhuyễn mô: Dùng kéo cắt nhuyễn mảnh mô, huyền phù trong dung dịch
PBS (-), để lắng và thu dịch trong (huyền phù thu nhận các tế bào đơn). Phương pháp
này cho khả năng sống của tế bào cao nhưng số lượng tế bào đơn thu nhận ít nên
thường được áp dụng cho những mẫu mô có kích thước lớn và không khan hiếm.
Trên thực tế, việc cắt nhuyễn mô thường dùng để làm tăng khả năng tiếp xúc của mô
với enzyme trong kỹ thuật tách bằng enzyme được tiến hành sau đó.
- Ép nhuyễn mô sử dụng hai phiến lame: thường được sử dụng để tách tế bào ở

những mô có liên kết yếu (như mô lách). Ngoài ra còn có thể sử dụng các pittong của
syringe để ép mô trong đĩa petri nhằm tách rời các tế bào.
- Ép bằng màng lọc tế bào (Cell strainer): đặt mẫu mô lên trên màng lọc (có
đường kính lỗ 70 – 100µm), sử dụng pittong của syringe để chà sát mạnh mảnh mô,
khi đó, những tế bào sẽ va chạm vào lưới lọc và tách rời. Những tế bào đơn (có đường
kính nhỏ hơn lỗ lọc) sẽ lọt qua lỗ lọc.
b. Tách bằng Enzyme
Cầu nối gian bào có bản chất là protein (các tế bào liên kết với nhau và với
ECM), do vậy các protease sử dụng để tách tế bào là những enzyme thuỷ phân protein

8


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

như: trypsin, collagenase, elastase, pronase, dispase hay những tổ hợp khác. Việc sử
dụng enzyme có thể riêng lẻ, hay kết hợp tùy thuộc vào mục đích.
Trypsin cắt liên kết giữa nhóm carboxyl (-COOH) của lysin hoặc arginin và
gốc amin (NH2) của axid amin bất kì đứng liền kề với nó trong polypeptid, ngoại trừ
liên kết giữa lysin và arginin. Xử lý trypsin dẫn đến sự cuộn tròn tế bào. Khi các tế
bào co lại, các liên kết trở nên lỏng lẻo và tế bào dễ dàng được tách ra bởi tác động cơ
học.
Trypsin hoạt động trong môi trường pH 6 – 9, tối ưu ở pH 8 – 9, rất bền vững
trong môi trường acid yếu.
Canxi được xem như chất bảo vệ cho trypsin, hoạt tính xúc tác của trypsin bị
giảm 50% khi vắng mặt Ca2+ vì trypsin trở nên trơ. Một số kim loại như coban,
mangan… có khả năng hoạt hóa trypsin. Hoạt tính của trypsin sẽ bị kìm hãm bởi
huyết thanh bò có thai hoặc DFP (di-isopropyl fluoro phosphate).

Nồng độ trypsin thường dùng để tách tế bào là 0,01–0,5% (thường là 0,25%),
đôi khi là 1%. Có thể sử dụng quy trình trypsin ấm (370C) hay trypsin lạnh (40C).
Trypsin không tác động đặc hiệu cho loại protein, vì vậy có thể phân cắt các
protein ở màng và gây vỡ tế bào khi dùng nồng độ cao, hoặc cho tác động trong thời
gian dài. Cần trung hòa trypsin bằng huyết thanh ngay sau khi thu đuợc tế bào đơn.
Collagenase là enzyme thủy phân các liên kết peptid dạng poly-L prolin đặc
trưng cho vùng xoắn của collagen. Collagenase thu nhận từ động vật hữu nhũ thì cắt
chuỗi collagen tại những điểm riêng biệt, còn thu nhận từ vi khuẩn thì cắt tại nhiều vị
trí dọc trên chuỗi collagen.
Đa số các collagenase hoạt động ở pH trung tính hoặc hơi kiềm (pH 7- 8), nhiệt độ
thích hợp dưới 400C, và giảm hoạt tính ở nhiệt độ trên 450C. Có 4 loại collagenase:
- Collagenase loại I: chứa một lượng trung bình những hoạt chất (collagenase,
caseinase, clostripain, trypsin hoạt động). Chúng thường được dùng cho việc
tách tế bào da, gan, phổi, mỡ và những tế bào mô thượng thận.
- Collagenase loại II: chứa hợp chất clostripain nhiều hơn, được sử dụng để tách
tế bào từ tim, xương, cơ và sụn.
- Collagenase loại III: có hoạt tính phân giải protein thấp.
- Collagenase loại IV: có hoạt tính trypsin thấp, thường dùng phân tách tế bào
tụy.

9


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

Collagenase và dispase phân cắt không hoàn toàn các cầu nối nên ít làm hư hại
tế bào. Người ta còn sử dụng hyaluronidase kết hợp với collagenase để phân hủy các
chất dịch nội bào, DNase được sử dụng để phân hủy các DNA thoát ra từ các tế bào bị

ly giải.
Chymotrypsin có tính đặc hiệu kém hơn trypsin, nó phân giải các liên kết
peptide tạo thành bởi nhóm carboxyl của acid amin thơm (như tyrosin, phenylalanin,
tryptophan, methionin và leucin) với một nhóm amin của một acid amin khác.
Chymotrypsin có pH thích hợp từ 8 – 9, và bị ức chế bởi DFB (di-isopropyl fluoro
phosphate)
Papain thủy phân protein thành các polypeptid và các acid amin. Papain chịu
được nhiệt độ tương đối cao (dạng khô không bị biến tính ở 1000C trong 3 giờ), hoạt
động ở pH từ 4,5 – 8,5 (tùy vào cơ chất để lựa chọn độ pH thích hợp nhất cho mỗi
phản ứng). Papain bị kìm hãm bởi các chất oxy hóa như oxy, ozone, hydroperoxyte,
iod acetamid, thủy ngân chlobenzoate, cystin và các hợp chất disulfur khác.
Elastase thủy phân một số lượng lớn protein nền. Elastase là enzyme duy nhất
có khả năng thủy phân elastin, một chất nền không bị tác động bởi trypsin,
chymotrypsin hay pepsin.
Elastase thường được sử dụng có kết hợp với các enzyme khác như collagenase,
trypsin và chymotrypsin. Elastase là enzyme được chọn để tách tế bào từ phôi.
c. Tách tế bào bằng các phương pháp khác
+ Phương pháp ly tâm theo gradient tỷ trọng: được sử dụng để phân tách tinh
trùng hay các tế bào đơn nhân trong máu. Môi trường ly tâm thường sử dụng là
Percoll, Ficoll…
VD: Quy trình Ficoll dùng để phân tách tế bào máu đơn nhân:
-Pha loãng máu (có chất chống đông) 2 lần với dung dịch đệm PBS
-Đặt 35 ml máu pha loãng lên 15ml Ficoll, ly tâm ở tốc độ 400g trong 20

phút ở 240C
-Thu dịch nổi, huyền phù trong cùng một lượng dung dịch đệm
-Ly tâm lần nữa ở tốc độ 500g trong 20 phút ở 240C
-Thu cặn, huyền phù trong cùng một lượng dung dịch đệm
-Bảo quản dịch huyền phù tế bào ở 2 – 80C

10


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

+ Phương pháp tách tế bào dựa vào marker bề mặt (là những receptor bề mặt
của tế bào): được sử dụng để đánh dấu và phân lập tế bào gốc. Những tế bào gốc hiếm
hoi được chọn từ hàng triệu tế bào khác. Dịch tế bào được đính một phân tử huỳnh
quang vào receptor, dưới tác dụng của lực đẩy, dịch (có tế bào) sẽ đi qua một đầu kim
rất nhỏ, sao cho mỗi lần chỉ có một tế bào. Ở đầu ra của kim là một nguồn ánh sáng,
thường là tia laser và sau đó là một điện trường. Những tế bào phát huỳnh quang sẽ
mang điện tích âm, còn những tế bào không phát huỳnh quang mang điện tích dương.
Sự tích điện khác nhau như vậy cho phép thu nhận tế bào cần.
Mặc dù mỗi loại mô có những yêu cầu về điều kiện tách khác nhau, nhưng cho
dù là mô nào, khi tách tế bào để nuôi cấy đều cần lưu ý một số điểm sau:
- Các mô mỡ, mô chết, mô tạp phải được loại bỏ ra trong quá trình tách.
- Mô nên được cắt nhuyễn bằng dụng cụ nhọn, bén để tránh hư hại tế bào.
- Enzyme sử dụng trong quá trình tách tế bào, trước đó phải được tách ra khỏi
dung dịch (bằng ly tâm), hay phải bị bất hoạt (bằng huyết thanh).
- Nồng độ tế bào thu nhận cho nuôi cấy sơ cấp phải đảm bảo, đồng thời luôn cao
hơn nồng độ tế bào nuôi cấy sau đó.
- Hồi phục tế bào bằng cách nuôi trong môi trường dinh dưỡng cao hay bổ sung
huyết thanh với nồng độ cao.
- Phân tách tế bào từ mô non hay phôi nhanh hơn, hiệu quả cao hơn, tế bào thu
được nhiều hơn, sống và tăng sinh mạnh hơn so với các mô đã trưởng thành.
b. Nuôi cấy thu nhận mô tế bào
Nuôi tế bào sơ cấp
Ly tâm dịch tách tế bào loại bỏ dịch nổi, thu cặn huyền phù tế bào đưa dịch

huyền phù tế bào vào bình nuôi cấy (bình Roux), bổ sung môi trường ủ ở 37,50C trong
tủ nuôi, sau 24 giờ thay môi trường mới và tiếp tục ủ.
Sau lần nuôi cấy sơ sẽ cấp thu được các tế bào sơ cấp. Thành phần tế bào sơ
cấp rất phức tạp, bao gồm nhiều loại tế bào khác nhau cùng hiện diện trong bình nuôi.
Để có dòng tế bào thuần nhất, cần thực hiện bước tiếp là chọn dòng.
Nuôi cấy phát triển mảnh mô sơ cấp
Đối với trường hợp lượng mẫu mô quá ít, cần nuôi cấy nguyên mảnh mô để
thu nhận tế bào, tránh mất mẫu khi tách mô: đặt các mảnh mô trong đĩa nuôi, sử dụng
cùng môi trường với môi trường nuôi tế bào từ mô đó.

11


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

Các mảnh mô thường nổi, hay lơ lửng trong môi trường nuôi cấy, thường bị
chết nhanh nếu không bám vào bề mặt nuôi. Có thể bổ sung ít môi trường để tăng sự
bám dính của mảnh mô vào bề mặt dụng cụ nuôi hoặc cố định mẫu mô bằng huyết
tương/ huyết thanh.
Khi các tế bào đã phát triển và lan rộng ra từ các rìa của mảnh mô, tiến hành
tách bỏ mẫu mô và thu được tế bào.
Cấy chuyền
Cấy chuyền rất cần để cung cấp chất dinh dưỡng và không gian cho các dòng
tế bào phát triển liên tục. Tần số và tỷ lệ pha loãng, hay nồng độ tế bào trong cấy
chuyền phụ thuộc vào các đặc tính của mỗi dòng. Nếu dòng được cấy chuyền quá
thường xuyên hay nồng độ tế bào quá thấp, chúng có thể bị mất.
Cấy chuyền bao gồm các thao tác sau:
- Tách bỏ môi trường nuôi cấy cũ.

- Rửa bề mặt giá thể nuôi (có tế bào bám).
- Tách các tế bào bám khỏi bề mặt dụng cụ nuôi.
- Pha loãng các tế bào bằng môi trường mới.
Cấy chuyền các tế bào bám dính:
- Tách bỏ môi trường khỏi hộp nuôi. Nếu các tế bào bám chặt, có thể đổ bỏ
môi trường. Nếu nhiều tế bào nổi hay bám yếu, nên lắc nhẹ và rửa, sau đó làm lỏng sự
bám dính các tế bào bằng dung dịch trypsin.
- Rửa dụng cụ nuôi với PBS.
- Bổ sung dung dịch trypsin.
- Ủ trong tủ ấm 370C chừng 2 – 3 phút (tùy kiểu tế bào và kiểu nuôi) xem
dưới kính hiển vi: nếu các tế bào có hình tròn có nghĩa là chúng đã tách ra khỏi bề mặt
giá thể nuôi.
- Huyền phù với môi trường có bổ sung huyết thanh, và rửa tế bào bằng cách
ly tâm ở 800 vòng/phút trong 5 – 10 phút tái huyền phù bằng môi trường nuôi (bước
này có thể bỏ nếu tỷ lệ pha loãng cao trong môi trường có chứa huyết thanh)
Cấy chuyền các tế bào huyền phù:
- Nuôi cấy các tế bào trong các flask hay các spinner có thể được duy trì bằng
việc pha loãng một lượng tương đương của huyền phù tế bào bằng môi trường tươi:

12


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

- Giữ flask đứng thẳng, dùng pipette huyền phù vài lần tách rời các cụm tế
bào.
- Tách lấy một lượng huyền phù để đếm hoặc pha loãng vào bình nuôi mới ly
tâm thu cặn, loại bỏ dịch nổi tái huyền phù cặn vón vào môi trường tươi lấy một thể

tích tương đương lượng tế bào mong muốn vào các bình nuôi và tiến hành nuôi.
c. Sự sinh trưởng của tế bào trong nuôi cấy :
- Pha chậm (lag phase) là giai đoạn khi tế bào được đưa vào môi trường nuôi
cấy cho đến khi tế bào bắt đầu phát triển.thời gian này dài hay ngắn tùy thuộc vào
trạng thái biệt hóa của mô được trích tế bào.
- Pha tiến triển (exponential) là giai đoạn tế bào phân chia liên tục, tăng nhanh
số lượng tế bào trong khoảng thời gian từ 15-25 giờ với số lượng tế bào đạt 1-2x106
/cm3, là nồng độ chuẩn cho nuôi cấy theo mẻ.
- Pha dừng (stationary phase) là giai đoạn pha tiến triển, trong đó số lượng tế
bào không thay đổi, tức là khi môi trường dinh dưỡng nghèo dần và bắt đầu tích lũy
các sản phẩm trao đổi chất độc hại, Bắt đầu xuất hiện tự hoại tế bào thể hiện ở chổ
nhân bị đứt chẻ và trên bề mặt tế bào tạo thành các mảnh khối có thể quan sát được với
kính hiển vi. Muốn cho tế bào tiếp tục sinh trưởng caabf thực hiện các mẻ cấy truyền
với môi trường mới.
d. Phương thức nuôi cấy :
Phương thức nuôi cấy đơn giản nhất là nuôi cáy theo mẻ (batch culture), trong đó
tế bào được nuôi vài ngày cho tớ khi sinh trưởng dừng lại đây là hệ thống nuôi cấy kín
vì hkông cho thêm gì vào cả củng không lấy ra môi trường một chất nào. Điều kiện
chuẩn : mật độ tế bào trong môi trường là 105 /cm3 và nuôi trong 3 ngày cho tớ khi mật
độ tế bào đạt 106 /cm3 .trong khi nuôi cấy phải khuấy lắc để huyền phù tế bào và chất
dinh dưỡng phân bố đều trong môi trường. Tuy nhiên, môi trường sẽ nghèo dần chất
dinh dưỡng và tích lũy nhìu chất độc (sản phẩm chuyển hóa của tế bào) do đó tế bào sẽ
đi vào thoái hóa.
Người ta có thể kéo dài thời gian nuôi cấy bằng cách bổ sung thêm chất dinh
dưỡng vào môi trường nuôi cấy theo thời gian để tế bào tiếp tục sinh, nhưng đến một
thời gian nhất định sinh trưởng sẽ dừng lại do môi trường tích lũy quá nhiều chất độc
như amoniac hay lactat,…

13

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

Để giải quyết vấn đề trên người ta tiến hành phương thức nuôi cấy liên tục
(continuous fulture), trong đó môi trường luôn được đổi mới, và chất độc luôn được
loại bỏ tương tự như trong cơ thể. Có 2 cách nuôi cấy liên tục : cách thứ nhất dùng hệ
thống tiếp liệu chất dinh dưỡng nhưng vẩn duy trì tế bào trong mẻ cấy cho đến khi số
lượng tế bào đạt 106 /cm3. Cách thứ 2 là đồng thời có thêm hệ thống rút bớt môi trường
cùng với tế bào ra khỏi mẻ cấy, như vậy hệ số tăng trưởng tế báo sẽ tỉ lệ với hệ số đổi
mới dòng chảy vào và ra. Một hệ cân bằng như vậy được gọi là hệ ổn hóa (chemostat),
là một dạng nồi lên men dùng để nuôi cấy liên tục.
3.1.3. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật:
a. Nuôi cấy và tạo tế bào lai soma động vật :
Tế bào soma :
Như đã biết in vivo, sự tạo thành tế bào lai soma là vô cùng hiếm. Tuy nhiên, in
vitro người ta có thể nuôi cấy các loại tế bào của cùng một mô, của các mô khác nhau
trong cùng một cơ thể, của các cơ thể khác nhau trong cùng một loài, thậm trí người ta
có thể nuôi cấy các tế bào giữa các loài khác nhau để tạo nên tế bào lai soma
(hybridoma).
Năm 1950, lần đầu tiên, cac tác giả Barski, Sorieul, Cornefet thông báo là đã tạo
được tế bào lai soma in vitro khi nuôi cấy trộn lẫn các tế bào sarcoma của chuột thuộc
hai dòng khác nhau. Các dòng tế bào nuôi cấy khác biệt nhau ở nhiều đặc điểm : khả
năng tạo thành u khi tiêm chúng và chuột mang tính tương hợp mô và số lượng, hình
thái nhiễm sắc thể của chúng cũng khác nhau.
Khi tế bào lai được hình thành từ các tế bào cùng một khởi nguồn, thì tế bào lai
được gọi là tế bào đồng nhân (Homocaryon-lai giả), còn khi các tế bào lai được nuôi
cấy thuộc các cơ thể khác nhau về bậc phân loại khác nhau ta thu được tế bào lai dị
nhân (Heterocaryon-lai thật). Như vậy, theo nghĩa đúng đắn thì heterocaryon mới thực

sự là tế bào lai (hybridoma). Khi nuôi cấy trộn lẫn các tế bào thuộc hai loài khác nhau
người ta vẩn có thể thu được tế bào lai một cách ngẫu nhiên nhưng xảy ra với tần số
rất thấp. Vì vậy, để thu được tế bào lai dễ dàng với tầng số cao hơn người ta thường
phải sử dụng các nhân tố kích thích, thông thường người ta dùng hóa chất hoặc virut
làm nhân tố kích thích. Một só virut được sử dụng làm nhân tố kích thích đã trở nên
phổ biến là các virut chứa ADN (nhóm virut Herpes, virut đậu mùa,…), các virut chứa

14


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

ARN (virut lợn, virut Niucatson, virut Sendai,..) hoặc các virut gây ung thư (virut
Sarcoma Rous),…
Đặc tính của tế bào lai soma :
+Sự hoạt hóa của nhân :
 Khi lai các tế bào bào mang nhân hoạt hóa như limpho bào của chuột, tế bào
ung thư Hela của người với tế bào mang nhân bất hoạt ví dụ tế bào hồng cầu của gà,
người ta thu được tế bào lai có chứa nhân lai ở trạng thái biệt hóa, trong đó các gen
của hồng cầu gà trước đây bất hoạt nay đã trở nên hoạt hóa, tổng hợp ARN và
protein đặc trưng cho gà.
 Khi sử dụng tế bào nhân bất hoạt nhưng ở mức độ vừa phải so với nhân hồng
cầu của gà, ví dụ đại thực bào chẳng hạn (bình thường các đại thực bào không tổng hợp
ADN và các tế bào ở giai đoạn biệt hóa G1, chúng chứa hoạch nhân nhỏ, và tổng hợp ít
ARN). Khi nuôi cấy các đại thực bào (của chuột hoặc thỏ) với các tế bào hoạt hóa như
tế bào Hela hoặc tế bào melanom của người, sẽ tạo nên các tế bào lai heterocaryon,
trong đó nhân đại thực bào tăng cao thể tích và chúng tổng hợp ARN tăng 4-10 lần so
với bình thường chỉ 1 giờ sau dung hợp và 3 giờ sau xảy ra tổng hợp ADN. Điều này

chứng tỏ so với nhân hồng cầu gà, nhân đại thực bào bất hoạt ở mức thấp hơn.
 Khi nghiên cứu tiến trình tổng hợp các ARN và ADN trong tế bào lai giữa đại
thực bào và tế bào melanom, người ta đã chứng minh sự tổng hợp ADN trong nhân
đại thực bào không phụ thuộc vào sự tổng hợp ARN và protein trong nhân đại thực
bào mà phụ thuộc vào các nhân tố đến từ tế bào chất của tế bào melanom.
 Khi lai tế bào soma với tinh trùng thì nhân của tinh trùng tồn tại trong tế bào lai
rất lâu (vài tháng) và vẫn ở trạng thái bất hoạt, nhưng khi đem lai tinh tử với tế bào
soma (ví dụ đem tinh tử của chuột cống lai với tế bào soma của chuột nhắt) thì tạo
nên các tế bào lai có khả năng phân chia.
 Khi đem trứng chưa thụ tinh của chuột nhắt lai với các tế bào soma khác nhau
như tế bào chuột cống, khỉ hoặc người thì sẽ tạo nên tế bào lai và tế bào này có thể
phát triển tới giai đoạn phôi dâu.
+ Sự thụ tinh là sự dung hợp giữa tinh trùng và trứng để tạo nên hợp tử chứa cả
hai nhân – có thể được xem như một tế bào lai giữa hai tế bào đơn bội cùng nguồn
hoặc đôi khi khác loài xảy ra in vivo, trong ống dẫn rứng của con cái hoặc ở phần nào
đó trong xoang bụng ngoài ống dẫn trứng là đã được chương trình hóa trong bộ gen
15


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

của sinh vật. Trong nuôi cấy in vitro, để thực hiện được sự thụ tinh giữa tinh trùng và
trứng thì tinh trùng phải được xử lý để làm thay đổi tính chất sinh lý, được gọi là khả
năng hóa (capacitation), nhưng khi sử dụng virut Sendai để kích thích thì không cần
khả năng hóa vẫn thực hiện được sự thụ tinh.
+ Sự điều hòa tổng hợp ADN và ARN trong tế bào lai: Khi sử dụng các dạng tế
bào soma có đặc tính hoạt hóa hay bất hoạt khác nhau về tổng hợp ADN và ARN
trong nhân để tạo tế bào lai, thấy rằng:

 Tế bào có hoạt tính càng cao tham gia vào tế bào lai sẽ kích thích nhân tế bào
không có hoạt tính, hoặc có hoạt tính thấp tổng hợp ADN và ARN càng tích cực hơn
(trừ trường hợp tế bào ít hoạt tính có kích thước lớn hơn nhiều so với tế bào hoạt tính
cao, hoặc khi tế bào heterocaryon được tạo thành từ các tế bào quá già).
 Nhân không có hoạt tính hoặc hoạt tính thấp sẽ đạt mức tổng hợp ADN và
ARN như ở nhân có hoạt tính.
Tín hiệu phát động sự tổng hợp ADN và ARN đến từ tế bào chất của tế bào có
hoạt tính cao và không mang tính đặc trưng mô hoặc loài.
 Cơ chế và nguyên tắc điều hòa sự tổng hợp ADN và ARN diễn ra trong tế bào
lai tương tự như ở tế bào bình thường. Nhiều gen là bất hoạt trong các tế bào không
có hoạt tính vẫn giữ trạng thái bất hoạt trong tế bào lai chứng tỏ chúng không mang
tính ngược chiều, nhưng nhiều gen bất hoạt đã trở lại hoạt động trong tế bào lai
chứng tỏ chúng có tính ngược chiều. Những công trình cấy ghép nhân hoặc nhân bản
vô tính từ tế bào soma chứng tỏ tùy loại tế bào, tùy mức độ và giai đoạn biệt hóa mà
tính ngược chiều của hoạt động gen thể hiện khác nhau từ các gen riêng lẻ, các họ
gen hay toàn bộ genom.
+ Biến đổi của bộ nhiễm sắc thể trong tế bào lai: Phân tích bộ nhiễm sắc thể
của tế bào lai có tầm quan trọng trong việc xác định các tế bào dung hợp có thực sự là
tế bào lai hay không và cho phép ta nghiên cứu nhiều vấn đề về cấu trúc, tập tính của
nhiễm sắc thể như là cấu trúc hiển vi chứa thông tin di truyền của tế bào. Bằng phương
pháp đánh dấu nhiễm sắc thể và phương pháp tế bào học khác như xây dựng kiểu
nhân, nhuộm cắt băng cũng như phương pháp lai ADN… người ta đã làm sáng tỏ
nhiều vấn đề di truyền và biến dị của tế bào lai soma.
 Trong tế bào lai khác loài, khi 2 bộ nhiễm sắc thể của 2 tế bào bố mẹ kết hợp
lại với nhau sẽ xảy ra sự biến mất một số nhiễm sắc thể của một trong hai bộ hoặc

16


Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Báo cáo chuyên đề

của cả hai bộ nhiễm sắc thể. Ví dụ: Khi lai giữa tế bào người và chuột nhắt thì bộ
nhiễm sắc thể của người sẽ bị mất, lai giữa chuột nhắt và chuột cống thì cả hai bộ
nhiễm sắc thể cùng đều bị mất một số nhiễm sắc thể. Sự giữ lại hoặc loại thải nhiễm
sắc thể nào trong bộ nhiễm sắc thể bố mẹ trong tế bào lai xảy ra không phải ngẫu
nhiên mà chắc chắn tuân theo các cơ chế tương tác giữa hai bộ gen trong trạng thái
tế bào chất chung của tế bào lai và với môi trường nuôi cấy in vitro.
 Trong tế bào lai xảy ra sự biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể. Các tế bào bố mẹ
được sử dụng để tạo tế bào lai có thể ở các giai đoạn khác nhau của chu kỳ tế bào,
khi các tế bào bố mẹ dung hợp tạo thành tế bào lai chứa một nhân dung hợp thống
nhất với hai hoặc vài bộ nhiễm sắc thể, thường quan sát thấy sự biến đổi cấu trúc
trong các nhiễm sắc thể như sự đông đặc hóa, đứt đoạn,… Các nhiễm sắc thể bị đông
đặc hoặc đứt mảnh sẽ bị loại thải qua các kỳ phân bào của tế bào lai.
+Sự biểu hiện của gen thành các tính trạng kiểu hình ở tế bào lai:
 Khi ta cho lai hai loại tế bào soma khác loài in vitro ta thu được tế bào lai
heterocaryon chứa hai nhân hoặc vài nhân riêng biệt, về sau các nhân trong
heterocaryon dung hợp tạo nên một nhân độc nhất chứa tổ hợp các bộ nhiễm sắc thể
trong một tế bào lai được gọi là syncaryon. Các heterocaryon có thể tồn tại rất lâu
hoặc chết đi hoặc biến thành syncaryon. Người ta theo dõi số phận và đời sống của
các tế bào lai qua các đặc tính như biểu hiện của hệ gen thành các tính trạng kiểu
hình để đánh dấu, chủ yếu là tổng hợp protein, các enzyme, sự tạo thành các siêu cấu
trúc, sự biệt hóa tế bào về hình thái và một số đặc tính sinh lý, sinh hóa khác như
phản ứng với các tác nhân kích thích, sự sinh sản và phát triển,…
 Sử dụng các kiểu đánh dấu ta có thể theo dõi sự biểu hiện của các gen trong
nhiễm sắc thể thường, hoặc các gen trên nhiễm sắc thể giới tính, đặc biệt là nhiễm
sắc thể X.
 Để nghiên cứu quá trình biệt hóa tế bào lai, người ta thường sử dụng tế bào bố
mẹ, đặc biệt là các tế bào ung thư hoặc các tế bà của các chủng quần biệt hóa cao, ổn

định như limpho, tế bào sợi, tế bào gốc hồng cầu,…
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật không chỉ được phục vụ cho nghiên cứu về di truyền
học, tế bào học, sinh lý học, phân loại học,… mà còn phục vụ cho công nghệ tế bào.

17