Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học của vi nấm nội sinh được phân lập từ cây họ rutaceae và zingiberaceae

MỤC LỤC
1.ĐẶT VẤN ĐỀ.........................................................................................................................................3
2. TỔNG QUAN VỀ VI NẤM NỘI SINH......................................................................................................4
2.1. Vi nấm nội sinh:...........................................................................................................................4
2.2.Quan hệ giữa vi nấm nội sinh và thực vật:....................................................................................4
2.3. Nguyên tắc cơ bản để chọn thực vật ly trích vi nấm nội sinh [14,29]:.........................................4
2.3.1. Thực vật sống trong môi trường sinh học bất thường:.........................................................4
2.3.2. Thực vật được sử dụng như dược liệu dân gian:..................................................................5
2.3.3. Thực vật có tính đặc thù về sinh thái:...................................................................................5
2.4. Một số vi nấm nội sinh sản xuất các chất biến dưỡng thứ cấp có hoạt tính sinh học:.................5
2.4.1. Vi nấm nội sinh sản xuất kháng sinh:....................................................................................5
2.4.2. Vi nấm nội sinh sản xuất các chất có tác động sinh học khác................................................6
2.5. Ly trích vi nấm nội sinh:...............................................................................................................6
2.6. Nuôi cấy và chiết tách chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh:..........................................6
3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU....................................................................................................................7
3.1. Các nghiên cứu ở nước ngoài......................................................................................................7
3.2. Các nghiên cứu trong nước..........................................................................................................8
4. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU...................................................................................................................10
5. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................................................................10
5.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................................................10
5.2. Các phương pháp nghiên cứu....................................................................................................10
5.2.1. Ly trích vi nấm nội sinh từ thực vật.....................................................................................10
5.2.2. Khảo sát hoạt tính sinh học của các chủng vi nấm nội sinh.................................................12
5.2.3. Định danh những chủng vi nấm có hoạt tính ở mức Chi [16]..............................................12
5.2.4. Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu để các chủng vi nấm nội sinh sản xuất tối đa hoạt chất
sinh học........................................................................................................................................13
5.2.5. Chiết tách các chất biến dưỡng có tác động sinh học từ các chủng vi nấm nội sinh...........13
5.2.6. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh
......................................................................................................................................................13

1

6. NỘI DUNG VÀ PHẠM VI CỦA VẤN ĐỀ SẼ ĐI SÂU NGHIÊN CỨU........................................................14
7. NƠI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI.....................................................................................................................14
8. TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................................................14
[12]. Deborah KB Runyoro, Mecky IN Matee, Olipa D Ngassapa, Cosam C Joseph, Zakaria H
Mbwambo, (2006), Screening of Tanzanian medicinal plants for anti-Candida activity, BMC
Complement Altern Med......................................................................................................................15
[13]. E. Christine Davis, Joseph B. Franklin, A. Jonathan Shaw and Rytas Vilgalys, (2003), Endophytic
Xylaria (Xylariaceae) among liverworts and angiosperms: phylogenetics, distribution, and symbiosis,
American Journal of Botany 90(11),1661-1667....................................................................................15
[25]. Rios J.L, Recio M.C., Villar A., (1988), Screening methods for natural products with antimicrobial
activity: A review of the literature, Journal of Ethnopharmacology, Volume 23, pp 127–149..............16
[26]. Ranganathan S, Balajee SA., (2000), Anti-Cryptococcus activity of combination of extracts of
Cassia alata and Ocimum sanctum, Mycoses.43(7-8), pp 299-301.......................................................16
[27]. Sai-Cheong Lee, Chang-Phone Fung, Ning Lee, Lai-Chu See, Jen-Seng Huang, Chi-Jen Tsai, Kuo-Su
Chen, Wen-Ben Shieh (2001), Fluconazole Disk Diffusion Test with Methylene Blue- and GlucoseEnriched Mueller-Hinton Agar for Determining Susceptibility of Candida Species, J Clin Microbiol.,
39(4), pp 1615–1617............................................................................................................................16

2


TÓM TẮT LUẬN ÁN
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có khoảng 80% dân số thế giới từ các
nước phát triển dựa chủ yếu vào các loại thuốc truyền thống (chủ yếu có nguồn gốc từ thực
vật) để chăm sóc sức khỏe. Trong 119 loại hợp chất hóa học, ít nhất 90 loại có nguồn gốc từ
thực vật, đây là các loại thuốc đang được sử dụng ngày càng nhiều ở nhiều quốc gia (theo
Balick và cộng sự, 1996). Hiện nay có rất nhiều chất chiết xuất từ cây có tác dụng chữa bệnh,
vấn đề đặt ra là các chất có hoạt tính sinh học trong cây là do chính cây sinh ra hay là kết quả

của mối liên hệ tương sinh với các vi sinh vật nội sinh có ích trong mô thực vật. Vi sinh vật
nội sinh thực vật (endophyte) là những vi sinh vật phát triển bên trong các mô sâu của cây
nhưng thường không gây bệnh cho cây chủ [14]. Trong đó, vi khuẩn và vi nấm là các vi sinh
vật nội sinh thường gặp nhất. Tần số ly trích được vi sinh vật nội sinh là vi nấm chiếm tỷ lệ
cao hơn, vì vậy cơ hội tìm ra chủng vi nấm nội sinh mới từ cây là rất cao. Những nghiên cứu
gần đây của Hawksworth và Rossman đã ước tính có đến 1 triệu loài vi nấm khác nhau,
nhưng chỉ khoảng 100.000 loài đã được mô tả [17,16]. Hiện tại và tương lai vi nấm nội sinh
sẽ là nguồn đa dạng sinh học dồi dào, mới lạ trong đó có nhiều loài chưa được biết đến.
Vi nấm nội sinh có mối quan hệ chặt chẽ với cây chủ, chúng sử dụng các chất dinh dưỡng
trong cây để tồn tại, mang lại nhiều lợi ích cho cây như tạo ra các sản phẩm trao đổi chất có
hoạt tính sinh học như các hormon sinh trưởng, các chất kháng sinh có khả năng bảo vệ cây
khỏi các vi sinh vật gây bệnh. Nhiều tài liệu cho thấy khi sống cộng sinh trong mô thực vật, vi
nấm nội sinh đã sản sinh ra nhiều chất có hoạt tính sinh học như kháng khuẩn và kháng nấm,
ví dụ như Kennedia nigriscans, một loài cây leo ở Úc đã được dân gian sử dụng sáp nhựa để
trị vết thương, sát trùng; từ cây này đã ly trích được chủng Streptomyces sp. NRRL 30562
mới sản xuất kháng sinh munumbicin phổ rộng [29]. Ở quy mô rộng, vi nấm nội sinh có tác
động quan trọng trong nông nghiệp, rừng và đang được quan tâm nghiên cứu và tiềm năng
của chúng có ý nghĩa rất lớn trong các lĩnh vực y học, nông nghiệp và công nghiệp..
Họ Rutaceae ở Việt Nam rất đa dạng, có khoảng 140 loài trong đó cam, chanh, quýt,
bưởi...là những cây trồng phổ biến, có nhiều ứng dụng trong dược phẩm, thực phẩm…Thân,
cành, lá, hoa và vỏ quả các loại cây này chứa nhiều tinh dầu…Nhiều công trình nghiên cứu
trên thực vật cũng như trên người cho thấy tinh dầu của vỏ quả các cây họ Rutaceae có tác
dụng an thần, chữa cảm cúm. Bên cạnh đó, các cây thuộc họ Zingiberaceae cũng có vai trò
quan trọng trong đời sống con người. Từ xa xưa, gừng đã trở thành gia vị, thức ăn, vị thuốc
hết sức quan trọng của người Á đông. Theo nghiên cứu của Nguyễn Nghĩa Thìn và cộng sự
thì số lượng các loài có khả năng chữa bệnh ung thư là 50 loài thuộc 36 chi và 24 họ, trong số
đó, họ Zingiberaceae là đa dạng nhất (16%). Trên thế giới cũng đã có nhiều nghiên cứu về các
hoạt tính sinh học như tính kháng viêm, chống lão hóa, kháng khuẩn mạnh, ức chế khối u…
cùng nhiều tác dụng khác của các cây họ Gừng, đặc biệt là các cây gừng, riềng, nghệ. Từ
những đặc tính trên cho thấy, tiềm năng những họ này chứa hệ endophyte phong phú, tiết

nhiều chất biến dưỡng và có ý nghĩa trong việc điều trị bệnh...Tuy vậy, cho đến nay, ở Việt
Nam nói riêng và trên thế giới nói chung vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về endophyte trên các
loài cây thuộc họ Rutaceae và Zingiberaceae. Do đó, việc nghiên cứu tìm kiếm các chủng vi
nấm nội sinh có khả năng tạo ra các chất biến dưỡng có lợi và có khả năng sản sinh các chất
có hoạt tính sinh học với hy vọng dùng để điều trị bệnh cho người là một công việc hết sức
3


thú vị và được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành thực
hiện đề tài: “Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học của vi nấm nội sinh được
phân lập từ cây họ Rutaceae và Zingiberaceae” với mục tiêu chính là tìm được các chủng
vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học cao trên các họ thực vật này.
2. TỔNG QUAN VỀ VI NẤM NỘI SINH
2.1. Vi nấm nội sinh:
Endophyte là những vi sinh vật sống ở mô sâu thực vật nhưng không gián tiếp hoặc trực
tiếp gây bất lợi cho cây [24]. Vi nấm nội sinh là thành phần chiếm tỉ lệ cao trong hàng ngũ
đông đảo endophyte thực vật hiện nay. Vi nấm nội sinh có mối quan hệ chặt chẽ với cây chủ,
chúng sử dụng các chất dinh dưỡng trong cây để tồn tại, mang lại nhiều lợi ích cho cây như
tạo ra các sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học như các hormon sinh trưởng, các chất
kháng sinh có khả năng bảo vệ cây khỏi các vi sinh vật gây bệnh.
2.2.Quan hệ giữa vi nấm nội sinh và thực vật:
Giữa vi nấm nội sinh và thực vật có mối quan hệ cộng sinh hoặc tương sinh, vi nấm nội
sinh xuất phát từ một số bệnh lý thực vật trong quá trình tiến hóa của cây. Sự tương tác giữa
cây chủ và vi sinh vật gây bệnh trong suốt quá trình phát triển lâu dài dẫn đến việc xuất hiện
những đột biến gen từ những vi sinh vật gây bệnh để cho ra những chủng vi nấm nội sinh hữu
ích. Chúng được xem như là một tác nhân giúp cân bằng hệ vi sinh trên cây chủ nhằm ngăn
chặn những tác nhân vi sinh gây bệnh [16,28].
Vi nấm nội sinh thúc đẩy khả năng thích nghi sinh thái của thực vật chủ. Ở một số loài cây
cỏ có vi nấm nội sinh sống, người ta nhận thấy chúng có khả năng gia tăng sức chịu đựng khô
hạn hoặc chịu được độc tính của nhôm trong nguồn nước, trong môi trường sống… Ngoài

việc bảo vệ cây chống lại một số yếu tố bất lợi cho kí chủ như động vật ăn cỏ hoặc côn trùng,
nhiều sản phẩm tự nhiên được sinh ra từ vi nấm nội sinh cũng đã được quan sát, theo dõi và
được kết luận về khả năng ngăn chặn, kìm hãm hay diệt nhiều mầm bệnh khác nhau xâm nhập
mô thực vật. Trước thực tế này, một câu hỏi được đặt ra rằng: các hoạt chất quí giá này do
chính cây sản xuất hay là kết quả của mối quan hệ tương sinh của các vi nấm nội sinh có ích
trong mô thực vật và cây chủ sinh ra. Theo nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy một số chất
biến dưỡng của vi nấm nội sinh không những tác động trên những mầm bệnh thực vật mà còn
có khả năng trị liệu trên vi khuẩn, nấm, virus và những sinh vật đơn bào gây bệnh cho người
và động vật.
2.3. Nguyên tắc cơ bản để chọn thực vật ly trích vi nấm nội sinh [14,29]:
Trên thế giới có hàng triệu loài thực vật. Đó là một số lượng quá lớn mà ta không thể thử
nghiệm hết cũng như không thể chọn lựa một cách ngẫu hứng khi đưa vào nghiên cứu. Do đó,
việc chọn thực vật để ly trích vi nấm nội sinh cũng cần phải dựa trên những đối tượng cây có
đặc điểm sinh học. Một số nguyên tắc cơ bản sau đây thường được áp dụng:
2.3.1. Thực vật sống trong môi trường sinh học bất thường:
Với những loài thực vật này, môi trường bất thường và các điều kiện tự nhiên khắc nghiệt
bắt buộc cây muốn tồn tại thì cần có yếu tố đặc biệt nào đó giúp cây có khả năng chống chịu
cao. Và người ta mong đợi nhân tố đó chính là các vi nấm nội sinh có ích.
Ví dụ: Rhyncholacis penicillata là một loài cây sống dưới nước ở Tây Nam Venezuela, nơi
mà môi trường nước rất khắc nghiệt, cây luôn bị va đập bởi tác dụng nước cuốn, mảnh vụn,
đá sỏi…làm cho cây bị tổn thương. Từ đó các nấm gây bệnh thực vật có thể xâm nhập, nhưng
4


cây vẫn khỏe mạnh, vì cây được sự bảo vệ bởi các vi nấm nội sinh có trong cây. Dựa vào đặc
điểm sinh học này, chủng Serratia marcescens được ly trích từ cây R. penicillata có khả năng
sản xuất ra oocydin A, một hợp chất kháng nấm mới.
2.3.2. Thực vật được sử dụng như dược liệu dân gian:
Một số loài thực vật đã được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, từ đời này sang đời khác
để chữa lành vết thương, kháng nấm, kháng khuẩn…ví dụ như, Kennedia nigriscans, một loài

cây leo ở Úc đã được dân gian sử dụng sáp nhựa để trị vết thương, sát trùng. Từ cây này đã ly
trích được chủng Streptomyces sp. NRRL 30562 sản xuất kháng sinh phổ rộng munumbicin,
kháng được nấm gây bệnh thực vật, vi khuẩn và Plasmodium.
2.3.3. Thực vật có tính đặc thù về sinh thái:
Các thực vật có tuổi thọ cao bất thường, phát triển trong các vùng có biến đổi sinh học lớn,
hay sống trong khu vực đất đai cổ xưa…cũng là những đối tượng nghiên cứu rất lý tưởng để
cung cấp các vi nấm nội sinh mới lạ.
2.4. Một số vi nấm nội sinh sản xuất các chất biến dưỡng thứ cấp có hoạt tính sinh học:
Nhiều vi nấm sống nội sinh trong cây đã được ly trích, chúng có khả năng sản sinh những
chất biến dưỡng có hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, kiềm hãm khối u, chống
oxy hóa và các hoạt tính sinh học khác.
2.4.1. Vi nấm nội sinh sản xuất kháng sinh:
– Fusarium sp. là vi nấm ly trích từ cây Selaginella pallescens, được thu nhập từ vùng
Bảo vệ thực vật của Guanacaste của Costa Rica, sản xuất được một pentaketide mới là CR
337 cho tác dụng mạnh trên C.albicans.
– Pestralotiopisis microspora thường gặp ở rừng mưa, sản xuất nhiều chất có tác dụng
sinh học, một trong những chất này là acid ambuic có tác dụng kháng nấm. Chất này được ly
trích từ nhiều chủng P.microspora và được cho là chất tượng trưng được sản xuất bởi
endophyte thực vật ở nhiều rừng mưa trên thế giới.
Ngoài ra, nhiều chủng nấm trong chi Pestalotiopsis đã được ly trích từ các nguồn thực
vật khác, các chủng nấm này có thể sản xuất các kháng sinh kháng nấm.
Bảng 1. Petralotiopisis spp. và các chất biến dưỡng sinh học
Chủng nấm
Nguồn ly trích
Kháng sinh
Tác động sinh học
P.microspora
Torreya axifolia
Pestalopyrone
Kháng sinh thực vật

Hydroxy-pestalopyrone
P.jesteri
Các cây mọc ở sông Hydroxyl-jesterone
Kháng nấm gây bệnh
thuộc Papua New jesterone
thực vật
Guinea
– Colletotrichum gloeosporioides là loại vi nấm nội sinh trong cây Artemisia mongolica
sản xuất acid colletotric có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm Helminthosporium sativum.
– Colletotrichum sp. được ly trích từ Artemissia annua sản xuất những chất biến dưỡng
kháng khuẩn, kháng vi nấm gây bệnh cho người và vi nấm gây bệnh cho thực vật.
– Muscodor albus là vi nấm được ly trích từ cành của cây Quế (Cinnamomum
zeylanicum), vi nấm này sản xuất một số chất bay hơi có thể ức chế vi khuẩn và nấm. Thành
phần chính của những hợp chất này đã được xác định cấu trúc hóa học bằng GC-MS (sắc ký
khí ghép với khối phổ), từ đó được tổng hợp hóa học. Các chất tổng hợp được có hiệu quả
kháng khuẩn, kháng nấm, không độc với người.
5


– Nodulisporium sp. được ly trích từ cây Bontia daphnoides sản xuất hợp chất

nodulisporic có hiệu lực trừ sâu, chống lại ấu trùng của ruồi xanh, nhặng…
– Muscodor vitigenus được ly trích từ cây dây leo Paullina paullinioides sản sinh ra
napthalen có tác động trừ rệp.
2.4.2. Vi nấm nội sinh sản xuất các chất có tác động sinh học khác
Từ môi trường nuôi cấy vi nấm nội sinh, một số chất có tác động chống oxy hóa, làm hạ
đường huyết, gây ức chế miễn dịch đã được ly trích.
Bảng 2. Các vi nấm nội sinh sản xuất các chất có tác động sinh học khác
STT Vi nấm
Nguồn ly trích

Tên chất
Tác động sinh học
1
Pestalotiopsis
Termialia
Pestacin
Kháng khuẩn và chống
microspora
morobensis
Isopestacin
oxy hóa
2
Pseudomasssaria Thực vật ở rừng Nonpeptidal
Giảm glucose huyết với
sp.
mưa Châu Phi
(L-783,281)
cơ chế tương tự insulin
nhưng sử dụng qua đường
uống
3
Fusarium
T-wifordii
Subglutinol A Giảm lympho bào B và T
subglutinans
Subglutinol B (ức chế miễn dịch)
2.5. Ly trích vi nấm nội sinh:
Vi nấm nội sinh có mặt ở khắp nơi trong thế giới thực vật, số lượng của chúng tìm thấy
thay đổi tùy thuộc vào bộ phận cây, chủng loại cây và môi trường sống của nó. Đã có nhiều kĩ
thuật ly trích vi nấm nội sinh được đề nghị bởi nhiều tác giả khác nhau. Nhưng tất cả các quy

trình ly trích đều dựa trên cơ sở chung nhất đó là: giải quyết tốt giai đoạn xử lý bề mặt, diệt
các sinh vật ngoại nhiễm bằng chất sát trùng hoặc các phương pháp sát trùng. Sau đó tạo điều
kiện không nhiễm để chỉ thu nhận các endophyte phát triển từ nội mô thực vật. Tiếp theo chọn
nuôi cấy trên môi trường thích hợp và thử hoạt tính sinh học [14,28,29].
2.6. Nuôi cấy và chiết tách chất có hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh:
Rất nhiều chất có hoạt tính sinh học được tạo ra bởi các vi nấm nội sinh trong quá trình
sinh trưởng và phát triển. Tìm kiếm và khám phá những hoạt chất đó chính là đích ngắm mà
các nhà nghiên cứu sinh dược học không ngừng vươn tới. Rất nhiều phương pháp đã được
ứng dụng để phục vụ công việc này. Sau khi chọn lọc được chủng vi nấm nội sinh và môi
trường thích hợp để sản sinh hoạt chất mong muốn, thông thường chủng này được đưa vào
môi trường nuôi cấy lỏng với những thông số điều kiện nuôi cấy phù hợp. Bước tiếp theo là
dùng các dung môi chiết tách hoạt chất. Sản phẩm thu được sẽ được thử hoạt tính sinh học và
tinh khiết hóa bằng các kĩ thuật sắc kí.

6


Nuôi cấy nấm nội
sinh trên PDB
Nhiệt độ phòng, thu
hồi sau 3 tuần
V dịch nuôi cấy
(20lít)
Chiết đồng thể tích EtOAC
x 3 lần ở to phòng
Dịch chiết
Cô dưới áp suất giảm
Cắn (12 g)
SKC silicagel
(n-hexan:EtOAc 99:1 và 1:1)

Phân đoạn 1 trong 8
phân đoạn

SKC silicagel
(n-C6H6:EtOAc 8:2)

Xác định cấu trúc
Hoạt tính sinh học

2 hợp chất:
KS14-1 (12mg) và
KS14-5 (15mg)

Sơ đồ 1. Tiến trình chiết tách và tinh khiết hóa ergosterol peroxid phân lập từ chủng nấm
Trichomonas konilangbra nội sinh trên cây khổ sâm (Croton tonkinensis Gagnep.) [1].
3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU
3.1. Các nghiên cứu ở nước ngoài
Năm 1955, trên thế giới chỉ tìm ra được 500 chất kháng sinh thì 20 năm sau, năm 1975 đã
tìm ra được 5.000 chất kháng sinh. Theo Berdy, năm 1984 trên thế giới đã biết được hơn
13.000 chất kháng sinh được sản xuất từ thiên nhiên. Theo đó, từ những năm 1990,
Taxomyces andreanae lần đầu tiên được ly trích từ cây Taxus brevifolia, vi nấm này sản xuất
paclitaxel - chất ức chế các thoi phân bào trong quá trình phân chia tế bào, có phổ khối tương
tự như paclitaxel chiết xuất từ cây thông đỏ (Taxus). Một số nhà khoa học đã nghiên cứu khu
hệ nấm nội sinh của các cây thuộc chi Thông đỏ và tìm thấy các hoạt chất taxol (một hoạt chất
được sử dụng hiệu quả nhất trong điều trị bệnh ung thư buồng trứng, ung thư vú) do nấm nội
sinh tổng hợp. Chi thông đỏ (Taxus) luôn là 1 nguồn giàu nấm nội sinh.
Năm 1995 – 1996, các nhà nghiên cứu đã phân lập được hàng trăm loài nấm nội sinh từ
các cây thông đỏ ở Châu Âu, Châu Á và Bắc Mỹ. Có thể nói các cây thông đỏ là một kho báu
chứa nhiều vi sinh vật chưa từng được phát hiện và rất đáng chú ý, chúng tương tác với nhau
và với cây chủ. Những nấm đã được biết là có tổng hợp taxol gồm: Taxomyces andreanae,

Pestolotiopsis microspora. Ngoài ra, thông qua những bằng chứng miễn dịch học, người ta
cũng đã phát hiện được sự tổng hợp taxol ở nhiều nấm nội sinh khác phân lập từ cây thông đỏ
7


Taxus brevifolia, bao gồm nhiều chủng của Penicillium sp., Pestalotiopsis sp. và Truncatella
sp.
Bảng 3. Một số vi nấm nội sinh sản xuất paclitaxel
STT Vi nấm nội sinh
Nguồn ly trích
1
Pestalotiopsis microspora
Taxus wallichiana
2
Pestalotiopsis guepini
Wollemia nobilis (cây quý hiếm)
3
Seimatoantlerium
Maguireothamnus sprciosus
Năm 2000, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về vai trò của vi nấm nội sinh Streptomyces
sp. chủng NRRL 30562 được ly trích từ cây Kennedia nigriscans, sản xuất kháng sinh phổ
rộng munumbicin, kháng vi khuẩn Gram (+) như Bacillus anthracis, M.tuberculosis đa kháng
và một số vi khuẩn kháng thuốc khác. Streptomyces sp. chủng NRRL 30562 phát triển trong
lá cây Grevilea pteridifolia phát triển ở Úc, sản xuất kháng sinh kakadumicin và echinomycin
đều cho tác động kháng P.falciparum với LD50=7-10ng/ml [29].
Năm 2001, Tan và Zou chứng minh rằng vi nấm nội sinh cũng được công nhận là nguồn
phong phú của chất chuyển hóa cho hoạt tính sinh học.
Năm 2003, Strobel và cộng sự đã nghiên cứu về chủng vi nấm nội sinh Cryptospriopsis
quercina được ly trích từ cây Tripterigeum wilfordii, vi nấm này có thể sản xuất cryptocandin
và cryptocin. Trong đó, cryptocandin kháng một số vi nấm gây bệnh cho người như Candida

albicans, Trichophyton spp. và chống một số nấm gây bệnh thực vật như Sclerotinia
sclerotiorum và Botrytis cinerea. Cryptocin có tác dụng kháng Pryriaria oryzae và một số vi
nấm gây bệnh thực vật [16]. Cùng năm 2003, T. Taechowisan và S.lumyong đã nghiên cứu về
endophyte có hoạt tính kháng nấm từ rễ cây Zingiber officinale và Alpinia galanga.
Năm 2006, N.S.H.Raviraja và cộng sự nghiên cứu về khả năng kháng nấm của các vi nấm
nội sinh từ các cây dược liệu miền Tây Ấn Độ…
Năm 2007, Li và cộng sự đã tìm ra vi nấm Acremonium (2F09P03B) từ Huperzia serrate
có khả năng sản xuất huperzine A có tác dụng là chất ức chế enzyme acetylcholinesterase, và
được dùng trong điều trị bệnh Alzheimer.
Năm 2009, Kusari và cộng sự đã phân lập được Fusarium solani từ Camptotheca
acuminate có khả năng sản xuất camptothecin và 2 dẫn xuất (9-methoxycamptothecin và 10hydroxycamptothecin) có khả năng chống ung thư.
Năm 2012, Agnes Joseph Aswathy và cộng sự đã nghiên cứu về endophyte trong cây Nghệ
(Curcuma longa). Các chất dinh dưỡng trong thân rễ của cây nghệ là môi trường sống đa
dạng cho các nhóm vi khuẩn khác nhau. Một số vi khuẩn nội sinh liên quan có thể thúc đẩy
tăng trưởng. Trong nghiên cứu này, hai chủng endophyte Paenibacillus sp. được phân lập từ
thân rễ củ nghệ và cả hai chủng đã được tìm thấy có khả năng để sản xuất IAA qua phân tích
HPLC [7].
Năm 2012, Cui và cộng sự đã phát hiện vi nấm nội sinh Fusarium oxysporum phân lập từ
cây Ginkgo biloba có khả năng sản xuất ginkgolid B dùng để điều trị bệnh tim mạch.
3.2. Các nghiên cứu trong nước
Từ năm 1994, các nhà nghiên cứu trong nước đã phân lập được 6 chủng nấm nội sinh từ vỏ
cây thông đỏ; đã định được tên của 6 chủng nấm này. Đây là loài thực vật đặc hữu có ở Việt
Nam, từ lâu đã được nhân dân ta sử dụng như một vị thuốc. Chúng thường được phân bố ở Pà
Cò, Mai Châu, Hòa Bình, Nghệ An, Hà Tĩnh, Phú Yên, Khánh Hòa, và chủ yếu là ở Lâm
8


Đồng. Trong đó đáng chú ý là chủng nấm Pestalotiopsis maculans (corda) NagRai. có mặt ở
tất cả các mẫu vỏ của cây thông đỏ được lấy mẫu. Chúng phù hợp nhất với hình thái chủng
nấm Pestalotiopsis sp. được tìm thấy trong vỏ cây thông đỏ ở Mỹ và được các nhà khoa học

tiến hành lên men, nuôi cấy, chiết rút, chạy sắc kí bản mỏng cùng với chất taxol chuẩn [30].
Năm 2005, Lê Mai Hương và cộng sự đã phân lập, sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng
khuẩn của 45 mẫu cây lấy ở vùng Yên Tử, Hà Nội và vườn thuốc Mê Linh thu được 89 chủng
vi nấm nội sinh trong đó có 32 chủng có hoạt tính kháng sinh (chiếm 36%); 20 chủng có hoạt
tính kháng nấm và kháng khuẩn (chiếm 22,5% tổng số), 26 chủng có hoạt tính kháng khuẩn
(chiếm 29,2 % tổng số), 27 chủng có hoạt tính kháng nấm (chiếm 30,33% tổng số chủng phân
lập). Từ 32 chủng có hoạt tính, bằng phương pháp lên men tách chiết sơ bộ đã chọn được 9
chủng có hoạt tính mạnh, hoạt phổ rộng, đặc biệt chủng có kí hiệu N2 phân lập từ cây họ
Chôm có hoạt tính cao nhất, kháng Bacillus subtilis (ATCC25922) và Fusarium oxyporum
[2].
Năm 2009, Trần Thị Như Hằng và cộng sự nghiên cứu về vi nấm nội sinh trên cây khổ sâm
(Croton tonkinensis Gapnep.) và bùm bụp (Mallotus paella Lour.) thu được chủng nấm
Trichoderma konilangbra KS14 sản sinh chất ergosterol, ergosterol peroxide, sorbicillin cho
hoạt tính kháng vi sinh vật, độc tế bào, chống oxy hóa và hoạt tính enzym ngoại bào;
sorbicillin cho hoạt tính kháng S.aureus với MIC=25mg/ml. Chất ergosterol peroxid biểu hiện
hoạt tính độc tế bào mạnh với cả 3 dòng tế bào thử là ung thư gan, ung thư màng tử cung và
ung thư màng tim [1].
Năm 2010, Nguyễn Đinh Nga và cộng sự sàng lọc các chủng vi nấm nội sinh thực vật trên
cây ngũ sắc (Lanata camara L.) thu được chủng Pseudeurotium NS-T1 kháng C.albicans,
trên cây mã đề (Plantago major L.) thu được chủng Fusarium MĐ-TR1 và MĐ-TR3 cho hoạt
tính kháng C.albicans và MRSA; tía tô (Perilla ocymoides L.) thu được chủng Trichoderma
TT-L1 kháng C.albicans và MRSA; trầu (Piper betle L.) thu được chủng Fusarium TR-T1
kháng C.albicans…[3]
Năm 2010, các nhà nghiên cứu thuộc phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học các
Hợp chất Thiên nhiên đã đưa ra biểu đồ về quy luật phân bố của các chủng nấm nội sinh trên
các bộ phận của cây thông đỏ (Taxus wallichiana). Theo đó, vi nấm nội sinh được phân bố
trên tất cả các bộ phận khác nhau, nhiều nhất ở lá (50 chủng), thân (43 chủng), cành (39
chủng), rễ (24 chủng) và ít nhất là ở quả (1 chủng). Thử hoạt tính sinh học của dịch chiết 68
chủng nấm nội sinh, kết quả có 17 mẫu (25%) có hoạt tính gây độc với cả 3 dòng tế bào ung
thư như mẫu chiết của các chủng SHT4, SHT6, SHT9…Bằng phương pháp phân loại hình

thái và sinh học phân tử đã định tên được 4 chủng nấm là Trichoderma aureoviride SHT06;
Daldinia fissa SHT46; Eupenicillium ehrlichii SHT101và Gongroniella butleri SHT106. Hợp
chất SHT46.1 thể hiện hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư cơ vân với giá trị IC50 là 4,19
μg/ml. Hợp chất SHT 101.1 biểu hiện khả năng kháng mạnh vi khuẩn S. aureus với MIC là
25 μg/ml. Hợp chất SHT 101.2 có hoạt tính gây độc 2 dòng tế bào ung thư phổi và ung thư cơ
vân với giá trị IC50 tương ứng là 4,0 và 3,06 μg/ml. Kết quả thực nghiệm cho thấy các chủng
nấm lựa chọn đều có khả năng ức chế sâu bệnh với tỉ lệ tương đối cao, từ 11,4-31,4% so với
đối chứng. Với các kết quả đạt được, dự án đã góp phần tích cực vào công tác bảo tồn và phục
hồi hữu hiệu các loài thông quý hiếm đang bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam, đồng thời giúp
9


các nhà quản lý hiểu biết tốt hơn về vai trò của vi nấm nội sinh và sản phẩm của chúng trong
việc hỗ trợ điều trị bệnh ung thư [30].
Năm 2014, Đàm Sao Mai và cộng sự đã phát hiện ra môi trường nuôi cấy thích hợp cho vi
nấm nội cộng sinh Fusarium oxyporum được phân lập trên Thông đỏ (Taxus wallichiana) tại
vùng Lạc Dương, Lâm Đồng và lượng taxol sinh ra ở môi trường nuôi cấy là 250,98 mg/kg
khối lượng khô.
4. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
- Phân lập và sàng lọc được các chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học trên một số
cây thuộc họ Rutaceace và Zingiberaceae.
- Định danh chủng mạnh và khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu bằng phần mềm BC
pharsofl.
- Chiết tách các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh.
- Nghiên cứu về cấu trúc hóa học và tác dụng hoạt tính các hợp chất có hoạt tính sinh học
mạnh.
5. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
5.1. Đối tượng nghiên cứu
Các chủng vi nấm nội sinh được phân lập từ một số cây thuộc họ thực vật Rutaceae và
Zingiberaceae.

5.2. Các phương pháp nghiên cứu
5.2.1. Ly trích vi nấm nội sinh từ thực vật
5.2.1.1. Lấy mẫu dược liệu [29]:
a. Đối tượng thu mẫu: Thực vật nghiên cứu có một trong các đặc điểm sau hoặc kết hợp
nhiều đặc điểm:
• Những cây đã được tài liệu nghiên cứu có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm.
• Những cây thuốc theo kinh nghiệm dân gian sử dụng để rửa, chữa trị vết thương lỡ loét
hoặc bệnh nấm ngoài da.
b. Xác định tên khoa học của thực vật: dựa theo những tên gọi dân gian, những mô tả về
hình thái của thực vật, các đặc điểm hoa, quả, hạt (nếu có) và các bộ phận khác, để từ đó có
cơ sở đem so sánh với khóa phân loại hoặc các tài liệu tham khảo chuyên biệt để xác định tên
khoa học thực vật.
c. Nguyên tắc chọn mẫu:
• Chọn những cây khỏe mạnh, không còi cọc, không bị sâu hại hay các biểu hiện bệnh
như đốm lá, úng lá…
• Thu tất cả các bộ phận của cây như rễ, thân, cành, lá, hoa của các cây trong họ thực vật
nghiên cứu.
Mẫu sau khi thu hái được rửa sạch dưới vòi nước, để ráo nơi khô mát sau đó được xử
lý ngay hoặc phải được giữ ở nhiệt độ thấp (khoảng 4 oC) trong vòng 24 giờ nếu kịp xử lý.
5.2.1.2. Phương pháp xử lý mẫu [14,24,29]:
Mẫu được xử lý tại PTN, trong điều kiện vô trùng của tủ cấy lần lượt các bước theo
sơ đồ 2.

10


Sơ đồ 2. Quy trình xử lý mẫu
Chú ý: Kích thước và vị trí cắt để đưa mẫu vào ly trích vi nấm nội sinh:
• Rễ: cắt thành từng đoạn dài 1cm.
• Lá: cắt thành những mảnh vuông diện tích 1x1 cm, ở các vị trí dọc gân lá, 2 bên thịt lá ở

các vị trí đầu, giữa, cuối và cuống lá.
• Thân hoặc cành: cắt bỏ vỏ ngoài bằng dao vô trùng, chẻ nhỏ dọc theo thân, cắt thành
từng đoạn dài 1 cm.
5.2.1.3. Ly trích vi nấm nội sinh:
Giai đoạn 1:
Mẫu cây sau khi được xử lý sẽ được đặt trên môi trường thạch, không chứa các chất dinh
dưỡng khác. Các vi nấm nội sinh sẽ phát triển bằng chính các chất dinh dưỡng lấy từ mẫu cây.
Đĩa thạch đã đặt mẫu cây được ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển của vi nấm nội
sinh trong khoảng từ 1-2 tuần.
Vi nấm nội sinh được phân biệt với các vi nấm ngoại nhiễm dựa vào nơi xuất phát của
khóm nấm và khóm vi khuẩn.
Sau đó cấy chuyền vi nấm nội sinh sang môi trường dinh dưỡng thích hợp mới. Từ đó phân
biệt các chủng giống khác nhau, ký hiệu chủng.
Giai đoạn 2:
Cấy chuyền vi nấm nội sinh sang môi trường dinh dưỡng thích hợp. Dựa vào đặc điểm về
hình thái hoặc mô tả vi học để gộp chung những chủng giống nhau, phân biệt các chủng khác
nhau và ký hiệu chủng.
Các môi trường thường sử dụng như thạch khoai tây đường (PDA), thạch Czapeck-Dox
(CDA), thạch Sabouraud (SDA). Ủ ở nhiệt độ phòng và theo dõi sự phát triển của vi nấm nội
sinh từ 1-2 tuần hoặc lâu hơn tùy theo tốc độ phát triển của vi nấm nội sinh [14,24].

11


5.2.2. Khảo sát hoạt tính sinh học của các chủng vi nấm nội sinh
Vi nấm nội sinh sẽ phóng thích chất biến dưỡng có hoạt tính sinh học vào môi trường nuôi
cấy trong quá trình phát triển. Các tác động này được phát hiện và đánh giá bằng phương
pháp khuếch tán trên đĩa thạch.
Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch:
- Cấy chủng vi nấm nội sinh trên môi trường thích hợp, ủ ở to phòng từ 5 – 14 ngày cho vi

nấm phát triển.
- Cắt khóm nấm thành khoang thạch tròn đường kính 8 mm (gọi là khoanh thạch thử).
- Đặt các khoanh thạch thử lên mặt thạch đã được trải vi nấm C.albicans (SDA) và vi
khuẩn MRSA, E.coli, Staphylococcus sp., Streptomyces sp. (TSA), mỗi mẫu đặt ít nhất 3
khoanh. Làm 1 mẫu chứng.
- Ủ ở 37oC trong 24h đối với vi khuẩn và 48h đối với vi nấm.
- Đọc kết quả: nếu vi nấm cho chất biến dưỡng có tác động kháng khuẩn, kháng nấm thì
hoạt chất sẽ khuếch tán từ khoanh thạch thử ra môi trường cho vòng vô khuẩn xung quanh
khoanh thạch thử (KTT).
Bảng 4. Mức độ kháng khuẩn, kháng nấm dựa theo đk vòng kháng sinh của KTT
Mức độ hoạt lực
Đường kính vòng kháng sinh (mm)
Kháng hoàn toàn
Kháng không hoàn toàn
+++
≥ 20
≥ 30
++
13 – 19
20 – 29
+
2 – 12
10 – 19
+/≤1
< 10
0
0
5.2.3. Định danh những chủng vi nấm có hoạt tính ở mức Chi [16]
Tên khoa học của các chủng vi nấm nội sinh cho chất biến dưỡng ra môi trường có tác
động kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxi hóa… sẽ được xác định đến mức chi dựa trên các

đặc điểm của vi nấm.
 Các qui tắc chính trong định danh
- Chủng nấm tuyệt đối thuần khiết (không lẫn nấm mốc và VSV khác).
- Sử dụng môi trường nuôi cấy có thành phần phù hợp.
- Quan sát và ghi lại các đặc điểm phân loại của chủng vi nấm cần định danh (đặc điểm
khuẩn lạc, mặt phải, mặt trái, tốc độ phát triển, đặc điểm vi học…).
- Dùng chuyên luận các nhóm phân loại để định loại nấm đến mức chi.
- Kiểm tra chủng vi nấm đã định danh với chủng nấm có trong bộ sưu tầm mẫu.
- Viết tên các nhóm phân loại đúng với danh pháp quốc tế.
 Định danh
- Định danh sơ bộ dưới kính hiển vi sau khi nhuộm với Lacto phenol cotton blue để sơ bộ
phân loại nấm.
- Cấy nấm vào các môi trường chuyên biệt.
- Dựa vào hình thái khuẩn lạc (đường kính, màu sắc, hình dạng…) và các sắc tố vi nấm
tiết ra môi trường để định danh.
- Các vi nấm nội sinh sẽ được định danh theo khóa phân loại của Guy St. Germain, năm
1995.
12


5.2.4. Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu để các chủng vi nấm nội sinh sản xuất tối đa
hoạt chất sinh học
- Môi trường nuôi cấy (nguồn nitơ và carbon, nguồn dầu trong môi trường nuôi cấy).
- Nhiệt độ
- pH môi trường
- Độ thoáng khí
- Thời gian nuôi cấy
5.2.5. Chiết tách các chất biến dưỡng có tác động sinh học từ các chủng vi nấm nội
sinh
Chiết tách: Thăm dò dung môi chiết tối ưu: n-hexan, dichloromethan (CH 2Cl2), ethyl acetat

(EtOAc), chloroform.
Phương pháp khuếch tán qua đĩa giấy [20,27]: nhằm định tính nhanh hoạt lực các chất thu
được trong giai đoạn chiết tách.
- Dịch chiết để bay hơi dung môi đến cắn, hòa cắn trong methanol hoặc các dung môi
hữu cơ. Lấy 10µl dịch thu được tẩm vào đĩa giấy kháng sinh.
- Trải các vi nấm thử nghiệm lên mặt thạch với nồng độ thích hợp.
- Đặt đĩa giấy kháng sinh đã được tẩm lên mặt thạch.
- Ủ ở 37 oC trong 24 giờ đối với vi khuẩn và 48 giờ đối với vi nấm.
5.2.6. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất có hoạt tính sinh
học mạnh
 Nghiên cứu về hoá học
• Sắc ký cột
Nạp dung môi khai triển và tiến hành thu phân đoạn, theo dõi khả năng phân tách (quan sát
màu, chấm trên bản silicagel F254 soi UV). Gộp từng phân đoạn theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng.
• Sắc ký lớp mỏng
Thăm dò hệ dung môi khai triển. Phát hiện vết bằng UV 254 và 365 nm, kiểm tra tác động
kháng khuẩn của các vết trên sắc ký đồ bằng kỹ thuật hiện hình sinh học.
• Kỹ thuật hiện hình sinh học
Dịch chiết cô cắn được chấm trên bản mỏng và khai triển trong hệ dung môi thích hợp.
Phát hiện sự phân tách các hợp chất bằng cách soi UV ở các bước sóng 254 nm, 365 nm, hoặc
bằng các thuốc thử vanillin sulfuric… xác định số vết và Rf.
Trải các vi nấm thử nghiệm lên mặt thạch với nồng độ thích hợp.
Bản mỏng đã khai triển, đuổi hết dung môi và cắt thành những mảnh nhỏ tương ứng với
từng vết trên sắc ký đồ, đặt trên đĩa petri đã trải vi nấm thử nghiệm.
Để 12 giờ ở nhiệt độ thấp (<10 oC) để hợp chất khuếch tán ra đĩa thạch. Sau đó lấy các
mảnh bản mỏng ra rồi đem ủ ở 37 oC trong 24 giờ đối với vi khuẩn và 48 giờ đối với Candida
albicans.
• Xác định các đặc tính lý hóa của các chất tách được
Các chất thu được qua sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng chế hóa được đem xác định các chỉ
tiêu: Phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại khả kiến (UV-vis), khối phổ (MS), phổ cộng hưởng từ

hạt nhân (NMR).
Phương pháp phổ hồng ngoại (IR): Phương pháp phổ dao động là một trong những
phương pháp hữu hiệu nhất để xác định các chất về định tính cũng như định lượng.
13


Sau khi ghi phổ hồng ngại, nếu chất nghiên cứu là hợp chất hữu cơ thì trước tiên nghiên
cứu vùng dao động co giãn của H để xác định xem mẫu thuộc loại hợp chất vòng thơm hay
mạch thẳng hoặc cả hai. Sau đó nghiên cứu các vùng tần số nhóm để xác định có hay không
có các nhóm chức. Phương pháp xác định độ tinh khiết và phân tích định lượng.
Phương pháp phân tích sắc kí khí-khối phổ (GC-MS): Bản chất GC-MS là sự kết hợp của
sắc ký khí (Gas Chromatography) và khối phổ (Mass Spectometry). Ngưỡng phát hiện của
phương pháp này là 1 picogram. Xác định thành phần hóa học và định danh các cấu tử trong
các hợp chất. Sắc ký khí (GC): phân tách hỗn hợp hóa chất thành một mạch theo từng chất
tinh khiết. Khối phổ (MS): xác định định tính và định lượng.
 Nghiên cứu về hoạt tính sinh học
Các chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm mạnh được thử nghiệm
hoạt tính kháng sinh, chống oxi hoá.
• Phương pháp đánh bắt gốc tự do: Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxi hoá theo
cơ chế dập tắt gốc tự do sẽ làm giảm màu của 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl (DPPH). Xác
định khả năng này bằng cách đo quang ở bước sóng có hấp thu cực đại.
Hoạt tính chống oxi hoá được tính theo công thức:
HTCO% = [(ODC – ODT)/ODC x 100
ODC: Mật độ quang của chứng dung môi
ODT: Mật độ quang của mẫu thử
• Thử hoạt tính kháng sinh của sản phẩm
Phương pháp pha loãng: Chất thử được hòa tan trong DMSO để đạt nồng độ gấp 100 lần
nồng độ thử nghiệm cao nhất. Pha loãng trong môi trường lỏng sao cho nồng độ của DMSO
nhỏ hơn 1% (đây là nồng độ không ức chế sự phát triển của vi nấm). Sau đó, ủ ở 37 oC trong
48 giờ đối với C. albicans, ở nhiệt độ phòng trong 7 ngày đối với nấm da. Đọc kết quả bằng

mắt thường. MIC là nồng độ thấp nhất của chất thử ức chế sự phát triển của vi khuẩn.
6. NỘI DUNG VÀ PHẠM VI CỦA VẤN ĐỀ SẼ ĐI SÂU NGHIÊN CỨU
- Phân lập và sàng lọc các vi nấm nội sinh từ một số chi thực vật họ Rutaceace và
Zingiberaceace.
- Định danh đến mức chi các chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính sinh học
- Nghiên cứu chuyên biệt từ một đến hai chủng vi nấm nội sinh sản sinh các hợp chất
kháng khuẩn, kháng nấm mạnh hoặc phổ kháng khuẩn rộng và tiến hành định danh ở mức
loài.
- Thu nhận sinh khối các chủng vi nấm nội sinh có hoạt tính cao đã phân lập được, chiết
các hoạt chất và đánh giá sơ bộ khả năng kháng khuẩn, kháng nấm của các chất chiết được.
- Từ kết quả sàng lọc hoạt tính sinh học của các chủng vi nấm nội sinh; tiến hành chiết
tách, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh.
- Thử nghiệm hoạt tính sinh học các chất kháng khuẩn, kháng nấm thu được.
7. NƠI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
Luận văn được thực hiện tại:
- Bộ môn Vi Sinh – Kí sinh, Khoa Dược, Trường Đại Học Y- Dược Tp. HCM.
- Khoa Dược, Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành.
8. TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Tài liệu tiếng Việt
14


[1]. Trần Thị Như Hằng và cộng sự (2009), Xác định cấu trúc và thử hoạt tính sinh học
của ergosterol perxod phân lập từ chủng nấm Trichoderma konilangbra nội sinh trên cây
Khổ sâm (Croton tonkinensis Gapnep), Tạp chí dược học (400), trang 60-65.
[2]. Lê Mai Hương và cộng sự (2005), Phân lập và sàng lọc hoạt tính kháng nấm, kháng
khuẩn các chủng nấm nội sinh thực vật phân lập từ một số vườn thuốc phía Bắc Việt Nam,
Tạp chí dược học (352), trang 20-23.
[3]. Nguyễn Đinh Nga và cs (2010), Sàng lọc vi nấm nội sinh thực vật kháng Candida
albicans, Tạp chí Y – Dược học quân sự. 4, 17-24.

[4]. Nguyễn Hoàng Nghĩa, Phạm Quang Thu, (2006), Vai trò của vi khuẩn nội sinh trong
cơ chế kháng bệnh loét thân, cành do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. gây
bệnh hại đối với keo lai.
[5]. Phạm Quang Thu (2002), Bước đầu nghiên cứu bệnh khô héo Thông ba lá do tuyến
trùng ở Lâm đồng, Thông tin KHKT Lâm nghiệp số 2/2002.
[6]. Pham Quang Thu, Trần Thanh Trăng (2002), Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối
kháng với nấm gây bệnh vùng rễ trồng cây Thông con, Thông tin KHKT Lâm nghiệp số
3/2002.
• Tài liệu tiếng Anh
[7]. Agnes Joseph Aswathy, B. Jasim, Mathew Jyothis, E. K. Radhakrishnan , (2012),
Identification of two strains of Paenibacillus sp. as indole 3 acetic acid-producing rhizomeassociated endophytic bacteria from Curcuma longa, School of Biosciences, Mahatma
Gandhi University, Priyadarshini Hills, Kottayam, pp 686 – 560, Kerala, India.
[8]. Balick, M.J., Elisabetsky, E. and Laird, S.A. (1996), Medicinal Resources of the
Tropical Forest: Biodiversity and its Importance to Human Health, Columbia University
Press, New York.
[9]. David L. Hawksworth, Amy Y. Rossman,(1997), Where Are All the Undescribed
Fungi?, Phytopathology, Volume 87, Number 9, pp 888-891.
[10]. D.J.Counsins BSc, MTBiol, (1995), Plants with Antimicrobial Properties-volum 2.
Antifungal Properties, CAB INTERNATIONAL.
[11]. David Ezra, Uvidelio F. Castillo, Gary A. Strobel, Wilford M. Hess, Heidi Porter,
James B. Jensen, Margaret A. M. Condron, David B. Teplow, Joseph Sears, Michelle
Maranta, Michelle Hunter, Barbara Weber và Debbie Yaver, Coronamycins, peptide
antibiotics produced by a verticillate Streptomyces sp. (MSU-2110) endophytic on Monstera
sp., Microbiology, 150, pp. 785 – 793.
[12]. Deborah KB Runyoro, Mecky IN Matee, Olipa D Ngassapa, Cosam C Joseph,
Zakaria H Mbwambo, (2006), Screening of Tanzanian medicinal plants for anti-Candida
activity, BMC Complement Altern Med.
[13]. E. Christine Davis, Joseph B. Franklin, A. Jonathan Shaw and Rytas Vilgalys, (2003),
Endophytic Xylaria (Xylariaceae) among liverworts and angiosperms: phylogenetics,
distribution, and symbiosis, American Journal of Botany 90(11),1661-1667.

[14]. Gary Strobel* và Bryn Daisy (2003), Bioprospecting for Microbial Endophytes and
Their Natural Products, Department of Plant Sciences, Microbiology and molecular biology
reviews.
15


[15]. Gary A Strobel (2003), Cyclic lipopeptide from Cryptosporiopsis quercina
possessing antifungal activity., HMV Sep, US 6613738.
[16]. Guy St. Germain (1995), Identifying Filamentous Fungi, Star Publish Company.
[17]. J. Mohanta, K. Tayung & U. B. Mohapatra (2008), Antimicrobial potentials of
endophytic fungi inhabiting three Ethno-medicinal plants of Similipal Biosphere Reserve,
India, The Internet Journal of Microbiology. Volume 5 Number 2.
[18]. Jinwi Kim (2000), Isolation and purification of antifulgal compound and lactamase
inhibitor from endophytic bacteria, MS thesis, SNU.
[19]. Lee (1993). Acacia mangium growing and utilization, Kuala Lumpur, Malaysia.
[20]. Mario Lozano-Chiu,* Page W. Nelson, Victor L. Paetznick, John H. Rex, (1999),
Disk Diffusion Method for Determining Susceptibilities of Candida spp. to MK-0991, Journal
of Clinical Microbiology. 37(5), pp 1625–1627.
[21]. Merk & Co. (2005), Fungal diseases pathophysiology Fungal infections in patients
with cancer, Merk Medicus Modules Fungal Diseases-Pathophysiology.hmt.
[22]. Miss Yuparet Puangmali (1999). Isolation and selection of some Herbal endophytic
Bacteria Capable of Producing L-Asparaginase.
[23]. N S Raviraja, G L Maria, K R Sridhar (2006), Antimicrobial evaluation of endophytic
fungi inhabiting medicinal plants of the Western Ghats of India, Engineering In Life Sciences.
[24]. R. X. Tan, W. X. Zou (2001), Endophytes: A Rich Source of Functional Metabolites,
Nat. Prod. Rep., 18, pp 448 – 459.
[25]. Rios J.L, Recio M.C., Villar A., (1988), Screening methods for natural products with
antimicrobial activity: A review of the literature, Journal of Ethnopharmacology, Volume 23,
pp 127–149.
[26]. Ranganathan S, Balajee SA., (2000), Anti-Cryptococcus activity of combination of

extracts of Cassia alata and Ocimum sanctum, Mycoses.43(7-8), pp 299-301.
[27]. Sai-Cheong Lee, Chang-Phone Fung, Ning Lee, Lai-Chu See, Jen-Seng Huang, ChiJen Tsai, Kuo-Su Chen, Wen-Ben Shieh (2001), Fluconazole Disk Diffusion Test with
Methylene Blue- and Glucose-Enriched Mueller-Hinton Agar for Determining Susceptibility
of Candida Species, J Clin Microbiol., 39(4), pp 1615–1617.
[28]. T.Taechowisan, S.lumyong (2003), Activity of endophyte actinomycetes from roots of
Zingiber oficinale and Alpinia galang against phytopathogenic fungi, Annals of
Microbiology, 53 (3), pp 291 – 298.
[29]. U.F. Castillo, G.A. Strobel, E.J. Ford, W.M. Hess, H. Porter, J.B Jensen, H.Albert,
R.Robison, M.A. Condron, D.B. Teplow, D. Stevens và D.Yaver (2000), Munumbicins,
Wide-spectrums antibiotics produced by Streptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia
nigriscans, Microbiology 148, pp 2675 – 2685.
• Nguồn Internet
[30]. nuoc/1457
[31]. />
16