Nghiên cứu xác định hàm lượng hợp chất hypophyllanthin trong một số chế phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

LÊ VĂN THUYÊN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
HỢP CHẤT HYPOPHYLLANTHIN TRONG
MỘT SỐ CHẾ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Vinh, 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

LÊ VĂN THUYÊN

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
HỢP CHẤT HYPOPHYLLANTHIN TRONG
MỘT SỐ CHẾ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ
Mã số: 60.44.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. ĐINH THỊ TRƯỜNG GIANG

Vinh, 2015


LỜI CẢM ƠN
Luận văn được thực hiện tại phòng thí nghiệm - Trung tâm thực
hành thí nghiệm - Trường Đại học Vinh.
Tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Giảng viên TS. Đinh Thị
Trường Giang, người đã giao đề tài, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, tạo mọi
điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Trần Đình Thắng – Khoa Hóa
Học – Trường Đại học Vinh đã giúp đỡ và chỉ bảo tận tình cho tôi hoàn
thành luận văn.
Tác giả xin chân thành cảm ơn Hội đồng Khoa học – khoa Hóa học
trường Đại học Vinh, các thầy giáo, cô giáo trực tiếp giảng dạy lớp cao
học 21 đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi làm nền tảng để thực
hiện luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu – Các phòng ban – Trung
tâm thực hành thí nghiệm trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện cho tôi
được học tập và nghiên cứu trong một môi trường học tập khoa học.
Và cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, người thân và
bạn bè đã động viên, cổ vũ, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình
học tập nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Xin chân thành cảm ơn!
Vinh, ngày 10 tháng 10 năm 2015
Tác giả

Lê Văn Thuyên


MỤC LỤC

Trang
MỞ ĐẦU........................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN.............................................................................4
1.1. Tổng quan về chi phyllanthus..................................................................4
1.1.1. Đặc điểm thực vật..................................................................................4
1.1.2. Thành phần hóa học..............................................................................4
1.1.3. Hoạt tính sinh học của chi Phyllanthus.................................................5
1.1.3.1. Tác dụng dược lí.................................................................................5
1.1.3.2. Một số công trình nghiên cứu về dược lý của cây diệp hạ châu........7
1.2. Giới thiệu về hợp chất lignan...................................................................9
1.2.1.Phyllanthin ...........................................................................................9
1.2.2.Hypophyllanthin

...............................................................................10

1.3. Những nghiên cứu về hypophyllanthin và loài phyllanthus...................11
1.3.1. Ở nước ngoài.......................................................................................11
1.3.2. Ở Việt Nam.........................................................................................12
1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.....................................14
1.4.1. Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.......................14
1.4.1.1. Cơ sở lí thuyết của phương pháp......................................................14
1.4.1.2. Phân loại sắc ký và ứng dụng...........................................................15
1.4.1.3. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ.............................................17
1.4.2. Hệ thống HPLC...................................................................................20
1.4.3. Chọn điều kiện sắc ký.........................................................................21
1.4.3.1. Lựa chọn pha động...........................................................................21
1.4.3.2. Lựa chọn pha tĩnh.............................................................................22
1.4.3.3. Detector............................................................................................24
1.4.4. Tiến hành đo sắc ký.............................................................................26

1.4.4.1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc.........................................................26
1.4.4.2. Chuẩn bị dung môi pha động...........................................................26
1.4.5. Định lượng bằng phương pháp HPLC................................................26
1.4.5.1. Nguyên tắc định lượng trong phân tích HPLC.................................26
1.4.5.2. Các bước định lượng bằng phương pháp HPLC..............................27
1.4.5.3. Các phương pháp định lượng...........................................................27
Chương 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM................................30
2.1. Trang thiết bị và dụng cụ........................................................................30
2.2. Hóa chất và chất chuẩn...........................................................................30
2.3. Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc...........................................30
2.3.1. Phương pháp phân lập.........................................................................31
2.3.2. Phương pháp xác định cấu trúc...........................................................31
2.4. Phương pháp định lượng........................................................................31
2.4.1.Các loại mẫu dùng nghiên cứu định lượng hypophyllanthin .............31
2.4.2. Phương pháp chuẩn bị mẫu ................................................................35
2.4.2.1. Phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc chất chuẩn .....................35
2.4.2.2. Chuẩn bị dung dịch chuẩn hypophyllanthin cho phép
đo HPLC..........................................................................................35
2.4.2.3. Chuẩn bị mẫu chế phẩm và cách tiến hành ...................................36
2.4.2.4. Điều kiện sắc ký...............................................................................39
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................38
3.1. Xác định cấu trúc chất hypophyllanthin ............................................ 40
3.2. Xác định và định lượng hypophyllanthin

..........................................43

3.2.1. Xác định khoảng tuyến tính và đường chuẩn
của hypophyllanthin

.......................................................................43

3.2.2. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương
pháp phân tích....................................................................................48


3.2.2.1. Giới hạn phát hiện LOD...................................................................48
3.2.2.2. Giới hạn định lượng LOQ................................................................49
3.2.3. Kết quả phân tích hypophyllanthin trong các mẫu chế phẩm.............50
3.2.4. Đánh giá phương pháp xác định hypophyllanthin ............................51
3.2.4.1. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp...............................................51
3.2.4.2. Xác định độ thu hồi..........................................................................55
3.2.5. Các sắc đồ của hypophyllanthin trong phép đo HPLC.......................60
KẾT LUẬN..................................................................................................64
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................66


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
AOAC

Tên đầy đủ
Tên tiếng anh
Hiệp hội hóa học phân Association

ACN
MeOH
FLD
LOD
LOQ

MW
HPLC

tích
Axetonitrin
Metanol
Detector huỳnh quang
Giới hạn phát hiện
Giới hạn định lượng
Khối lượng phân tử
Sắc ký lỏng hiệu năng

NP-HPLC

cao
Chromatography
Sắc ký hấp phụ pha Normal
phase

RP-HPLC

of

Official

Analytical Chemists
Acetonitril
Methanol
Fluorescence detector
Limit of detection

Limit of quantitation
Molecular weight
High
Performance

thường

performance

Sắc ký hấp phụ pha đảo

chromatography
Reversed
phase
performance
chromatography

Liquid
–

High
liquid

–

High
liquid


DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 2.1: Cách pha các dung dịch chuẩn......................................................36
Bảng 3.1: Số liệu NMR của hợp chất 1..........................................................42
Bảng 3.2: Diện tích píc của hypophyllanthin tương ứng với từng
nồng độ chuẩn .............................................................................. 47
Bảng 3.3: Kết quả tính độ lệch chuẩn 10 phép đo lặp lại xác định
diện tích píc của hypophyllanthin ................................................49
Bảng 3.4: Kết quả phân tích hàm lượng trung bình của
hypophyllanthin trong các mẫu chế phẩm ...................................51
Bảng 3.5.: Kết quả trung bình, độ lệch chuẩn, hệ số biến thiên của các
mẫu chế phẩm ...............................................................................52
Bảng 3.6: Kết quả tính toán độ thu hồi đối với mẫu M1...............................56
Bảng 3.7: Kết quả tính toán độ thu hồi đối với mẫu M2...............................56
Bảng 3.8: Kết quả tính toán độ thu hồi đối với mẫu M3...............................57
Bảng 3.9: Kết quả tính toán độ thu hồi đối với mẫu M4...............................57
Bảng 3.10: Kết quả tính toán độ thu hồi đối với mẫu M5.............................58
Bảng 3.11: Kết quả tính toán độ thu hồi đối với mẫu M6.............................58
Bảng 3.12: Kết quả tính toán độ thu hồi đối với mẫu M7.............................59


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Trang
Hình 1.1: Cấu trúc của phyllanthin...............................................................10
Hình 1.2: Cấu trúc của hypophyllanthin .....................................................10
Hình 1.3: Píc sắc ký và thời gian lưu............................................................17
Hình 1.4: Hệ thống máy sắc ký HPLC Agilent 1100....................................20
Hình 2.1: Mẫu M1........................................................................................34
Hình 2.2: Mẫu M2.........................................................................................34
Hình 2.3: Mẫu M3.........................................................................................34
Hình 2.4: Mẫu M4.........................................................................................34

Hình 2.5: Mẫu M5.........................................................................................34
Hình 2.6: Mẫu M6.........................................................................................35
Hình 2.7: Mẫu M7.........................................................................................35
Hình 3.1: Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất 1.......................................40
Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của hợp chất 1..........................................................41
Hình 3.3: Phổ 13C-NMR của hợp chất 1.........................................................41
Hình 3.4: Sắc đồ chuẩn hypophyllanthin có nồng độ 0,5ppm.....................44
Hình 3.5: Sắc đồ chuẩn hypophyllanthin có nồng độ 1 ppm.......................44
Hình 3.6: Sắc đồ chuẩn hypophyllanthin có nồng độ 2 ppm.......................45
Hình 3.7: Sắc đồ chuẩn hypophyllanthin có nồng độ 5 ppm.......................45
Hình 3.8: Sắc đồ chuẩn hypophyllanthin có nồng độ 10 ppm.....................46
Hình 3.9: Sắc đồ chuẩn hypophyllanthin có nồng độ 50 ppm.....................46
Hình 3.10: Đường chuẩn hypophyllanthin ..................................................47
Hình 3.11: Sắc đồ mẫu M1- VRXOGA-PV..................................................60
Hình 3.12: Sắc đồ mẫu M2- Diệp hạ châu BPV...........................................60
Hình 3.13: Sắc đồ mẫu M3- Diệp hạ châu- DANAPHA..............................61
Hình 3.14: Sắc đồ mẫu M4- Chancapiedra Diệp hạ châu.............................61


Hình 3.15: Sắc đồ mẫu M5- Diệp hạ châu V................................................62
Hình 3.16: Sắc đồ mẫu M6- Diệp hạ châu phylanthus unirania....................62
Hình 3.17: Sắc đồ mẫu M7- L’ANGFARM Diệp hạ châu sấy khô..............63


1

MỞ ĐẦU
1.

Lí do chọn đề tài:

Ngày nay, trong nền y học thế giới nói chung, xu hướng sử dụng các sản

phẩm thuốc và thực phẩm chức năng có nguồn gốc thực vật để phòng và trị
bệnh đang trở nên phổ biến. Hướng nghiên cứu tân dược, hóa thuốc đông dược
và nam dược đã và đang phát triển mạnh mẽ ở nhiều nước có nền công nghiệp
dược phẩm tiên tiến như: Mỹ, Pháp, Nhật Bản, Ấn Độ, Trung Quốc...
Việt Nam nằm trong vùng trung tâm Đông Nam Á, hàng năm có lượng
mưa và nhiệt độ trung bình tương đối cao. Với khí hậu nhiệt độ gió mùa
nóng, ẩm đã cho rừng Việt nam một hệ thực vật đa dạng và phong phú. Có hệ
thực vật, động vật đa dạng chứa đựng nguồn lợi rất lớn về đa dạng sinh học.
Hiện nay, xu hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc dược liệu tự
nhiên đang được ưa chuộng vì tính an toàn, có thể sử dụng lâu dài, hạn chế
tác dụng phụ khi sử dụng thuốc tổng hợp hóa học: hạn chế hiện tượng nhờn
thuốc, kháng kháng sinh... dùng để điều trị nhiều loại bệnh mãn tính, thời gian
sử dụng thuốc kéo dài như bệnh tim mạch, tiểu đường, và đặc biệt là bệnh
viêm gan ngày càng trở nên phổ biến.
Trên thế gới hiện có khoảng trên 2 tỉ người mắc bệnh về viêm gan B,
trong đó có khoảng trên 350 triệu người chuyển sang giai đoạn mãn tính và
gây ra khoảng trên 500.000 ca tử vong mỗi năm. Việt Nam là nước có tỉ lệ
nhiễm virus viêm gan B cao (từ 10-20%). Bên cạnh việc sử dụng các thuốc
có nguồn gốc tổng hợp hóa dược và công nghệ sinh học thì thuốc có nguồn
gốc từ thảo dược rất được quan tâm. Nhiều loại cây đã được nghiên cứu và áp
dụng trong điều trị viêm gan B, trong đó có các cây thuộc chi phyllanthus
như: Phyllanthus niruri L. ( Diệp hạ châu đắng ngọt hay chó đẻ răng cưa) và
Phyllanthus amarus Schum. Et Thonn( Diệp hạ châu đắng hay chó đẻ đắng).


2

Các cây mang tên “ Diệp hạ châu” thuộc chi phyllanthus rất phổ biến ở

Việt Nam với số lượng phong phú. Dựa trên các nghiên cứu khoa học và kinh
nghiệm dân gian, cây “ Diệp hạ châu” ngày càng được dùng nhiều trong công
nghiệp dược. Các nghiên cứu cho thấy chất phyllanthin và hypophyllanthin
có mặt như nhứng thành phần chính của cây. Các chất này có tác dụng làm
gia tăng lượng glutathion là chất bảo vệ và phục hồi tế bào gan. Làm giảm
men gan do ức chế men ADN polymerase của virus viêm gan B. Vì vậy Diệp
hạ châu có tác dụng rất tốt để hỗ trợ điều trị viêm gan, viêm gan B, gan nhiễm
mỡ, xơ gan, giải độc men gan do uống rượi bia, ... trên thị trường trong nước
hiện nay xuất hiện rất nhiều dòng sản phẩm có nguồn gốc từ Diệp hạ châu.
Các sản phẩm hết sức đa dạng về cả hình thức và chất lượng, chúng được bào
chế dưới dạng: trà tan, viên nang cứng, viên nén bao phim, viên bao đường, ...
như Diệp hạ châu, Bình can ACP, Bibina, Hamega, ... Thực tế cho thấy việc
kiểm tra , kiểm soát chất lượng các chế phẩm này phải được thực hiện chặt
chẽ hơn, đặc biệt là việc kiểm tra chất lượng vì đó là yếu tố chính quyết định
hiệu quả điều trị của thuốc. Tuy nhiên hầu hết các sản phẩm này mới chỉ được
đánh giá trên các tiêu chí về hình thức, đồng đều về khối lượng, độ rã, định
tính dược liệu, ... mà hầu như chưa có tiêu chuẩn về định tính, định lượng các
hoạt chất chính trong các chế phẩm này. Trong đó cũng có một số công trình
nghiên cứu và định lượng về chất phyllanthin trong cây Diệp hạ châu và một
số dược phẩm khác.
Để góp phần vào công tác kiểm tra, đánh giá chất lượng của các chế
phẩm có nguồn gốc dược liệu tự nhiên, chúng tôi chọn đề tài “ Nghiên cứu
xác định hàm lượng hợp chất hypophyllanthin trong một số chế phẩm
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)”.
2. Đối tượng nghiên cứu:


3

- Hợp chất hypophylanthin trong một số loại thuốc thảo dược và chế

phẩm gồm:
+ VRXOGA-PV của công ty cổ phần dược phẩm Phúc Vinh.
+ Diệp hạ châu BPV- Công ty cổ phần BV PHARMA.
+ Diệp hạ châu : công ty cổ phần dược DANAPHA.
+ Chancapiedra Diệp Hạ Châu: Công ty cổ phần hóa dược Việt Nam.
+ Diệp hạ châu V: Công ty TNHH Vạn Xuân.
+ Diệp hạ châu phylanthus unirania: công ty cổ phần dược phẩm 2/9NADYPHAR.
+ L’ANGFARM Diệp hạ châu sấy khô- đặc sản Đà Lạt, 225gr- Công ty
TNHH Quảng Thái.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu:
3.1. Nghiên cứu các tính chất hoá học, vật lý và phương pháp định lượng
hypophyllanthin :
- Phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc chất hypophyllanthin trong cây Chó
đẻ làm chất chuẩn trong phân tích HPLC.
- Tổng quan và phương pháp xác định chất hypophyllathin.
- Ngưỡng đối tượng dược liệu chứa nhiều chất và hoạt tính sinh học của
chúng.
3.2. Xây dựng quy trình định lượng và nghiên cứu định lượng hợp chất
hypophyllanthin trong các chế phẩm bằng phương pháp HPLC:
- Nghiên cứu điều kiện đo HPLC với hypophyllanthin.
- Xây dựng đường chuẩn của hợp chất hypophyllathin.
- Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của
phương pháp.


4

- Xác định hiệu suất thu hồi và xác định hàm lượng hypophyllanthin
trong chế phẩm đã nêu.

5

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về chi Phyllanthus:
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Các loài thực vật thuộc chi Phyllanthus L. họ Thầu dầu phân bố hầu hết
ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam có 44 loài, các loài được
chú ý nhiều hơn cả là P. niruri L (chó đẻ thân xanh), P. amarus Schum (chó
đẻ đắng = diệp hạ châu đắng), P. urinaria L. (chó đẻ răng cưa). Trên thế giới
các loài này đã được Y học cổ truyền sử dụng từ lâu để chữa bệnh gan, bệnh
thận, bệnh tiểu đường vv... Cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.)
trong y học dân tộc được nhân dân dùng để chữa viêm họng, đinh râu, mụn
nhọt, viêm da, lở ngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, chàm má, tưa lưỡi, rắn rết
cắn, liều lượng không hạn chế .
Về mặt hoá học thực vật, từ cây chó đẻ răng cưa đã phân lập được một số chất
có tác dụngsinh học cao như các flavonoit, các steroit, các tanin, các glycozit,
gần đây người ta đã phân lập được 4 lignan mới có tác dụng chữa bệnh từ cây
chó đẻ răng cưa Đài Loan. Ở Việt Nam, cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus
urinaria L.) đã được sử dụng làm thuốc chữa bệnh từ lâu, nhưng các nghiên
cứu hoá học thực vật thì mới chỉ bắt đầu từ vài năm gần đây.
1.1.2. Thành phần hóa học: [14],[16], [19],[22],[26]
Thành phần hóa học của Chi Phyllanthus rất đa dạng và phong phú,
bao gồm :
+ Nhiều hợp chất triterpenoid như: phyllanthol, β-amyrin… (từ P.
acidus), lupeol, lupenon (từ P. emblica), friedelan-3-β-ol, friedelin, βsitosterol, betulinic acid, glochidonol, 21-α-hydroxy-friedelan-4(23)-en-3-one
(từ P. reticulatus), β-amyrin, β-sitosterol, tricontanol… (từ P. urinaria).
+ Các hợp chất flavonoid như: quercetin-3-glucosid, rutin (từ P.
amarus), quercetin, kaemferol, astragalin (từ P. emblica)…

6

+ Các hợp chất ancaloid thuộc nhóm quinolizidin như: Phyllanthin ,
securinin, norsecurinin, isobulebialin, epibubbitin (từ P. amarus), allosecurin,
phyllantidin, phyllantin, hypophyllantin (từ P. amarus, P. urinaria).
+ Nhiều hợp chất tanin như geraniin, amariin, gallocatechin (từ P.
amarus), phyllembin, gallotannin, ellagitannin terchebin, corilagin, chebulagic
acid… (từ P. emblica)… Còn gặp các phenolic acid ở nhiều loài khác (P.
acidus, P. emblica, P. reticulatus, P. simplex…).
+ Các acid hữu cơ như:

Axid succinic, acid ferulic, acid

dotriancontanic, acid hecxacosanoic, acid amarinic,...
+ Các flavonoid: Kaempferol, quercetin, rutin.
+ Một số đại diện của lignan: Hypophyllanthin C24H30O7 (r-l-(3,4dimethoxyphenyl)-6-methoxy-t-2,c-3-bimethaxymethyl-7,8-methylene dioxy1,2,3,4- tetra hydro naphthalene); niranthin C24H32O7, nirtralin C24H30O7,
Phyllanthin

C24H34O6,

lintertralin, isolintetralin, demethoxyniranthin

C23H30O6), urinatetralin C22H24O6, dextrobursehernin C21H22O6, urinaligran
C22H24O7 và phylteralin C24H34O6...
1.1.3. Hoạt tính sinh học của chi Phyllanthus:
Các hợp chất chiết từ các loài Diệp hạ châu đắng (P. amarus), cây Chó
đẻ răng cưa (P. urinaria) có hoạt tính kháng virus, kháng khuẩn, đặc biệt là ức
chế hoạt động của virus viêm gan B. Các hợp chất từ quả Me rừng (P.
emblica) có tác dụng phòng chống một số dạng ung thư, kìm hãm sự phát

triển của virus HIV và chống suy giảm miễn dịch.
1.1.3.1. Tác dụng dược lý: [38], [39],[40]
 Điều trị viêm gan:
Tại Việt Nam, khá nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng điều trị
viêm gan của Diệp hạ châu đã được tiến hành, chẳng hạn: nhóm nghiên cứu


7

của Lê Võ Định Tường (Học Viện Quân Y - 1990 - 1996) đã thành công với
chế phẩm Hepamarin từ Phyllanthus amarus.
 Tác dụng trên hệ thống miễn dịch:
- Vào năm 1992, các nhà khoa học Nhật Bản cũng đã khám phá tác
dụng ức chế sự phát triển HIV-1 của cao lỏng Phyllanthus niruri thông qua sự
kìm hãm quá trình nhân lên của virus HIV.
- Năm 1996, Viện nghiên cứu Dược học Bristol Myezs Squibb cũng đã
chiết xuất từ Diệp hạ châu được một hoạt chất có tác dụng này và đặt tên là
“Nuruside”.
 Tác dụng giải độc:
- Người Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc dùng Diệp hạ châu để trị các
chứng mụn nhọt, lở loét, đinh râu, rắn cắn, giun. Nhân dân Java, Ấn Độ dùng
để chữa bệnh lậu. Theo kinh nghiệm dân gian Malaysia, Diệp hạ châu có thể
dùng để trị các chứng viêm da, viêm đường tiết niệu, giang mai, viêm âm
đạo,...
- Công trình nghiên cứu tại Viện Dược liệu - Việt Nam (1987 - 2000)
cho thấy khi dùng liều 10 - 50g/kg, Diệp hạ châu có tác dụng chống viêm cấp
trên chuột thí nghiệm.
 Điều trị các bệnh đường tiêu hóa:
Cây thuốc có khả năng kích thích ăn ngon, kích thích trung tiện. Người
Ấn Độ dùng để chữa các bệnh viêm gan, vàng da, kiết lỵ, táo bón, thương

hàn, viêm đại tràng. Nhân dân vùng Haiti, Java dùng cây thuốc này trị chứng
đau dạ dày, rối loạn tiêu hóa,..
 Bệnh đường hô hấp:


8

Người Ấn Độ sử dụng Diệp hạ châu để trị ho, viêm phế quản, hen phế
quản, lao,. ..
 Tác dụng giảm đau:
Kenneth Jones và các nhà nghiên cứu Brazil đã khám phá tác dụng
giảm đau mạnh và bền vững của một vài loại Phyllanthus, trong đó có cây
Diệp hạ châu. Tác dụng giảm đau của Diệp hạ châu mạnh hơn indomethacin
gấp 4 lần và mạnh hơn 3 lần so với morphin. Tác dụng này được chứng minh
là do sự hiện diện của acid gallic, ester ethyl và hỗn hợp steroid (beta
sitosterol và stigmasterol) có trong Diệp hạ châu.
 Tác dụng lợi tiểu:
Y học cổ truyền một số nước đã sử dụng Diệp hạ châu làm thuốc lợi
tiểu, trị phù thũng. Một nghiên cứu của trường Đại học Dược Santa Catarina
(Brazil-1984) đã phát hiện một alkaloid của Diệp hạ châu (phyllan thoside) có
tác dụng chống co thắt cơ vân và cơ trơn, các nhà khoa học đã nhờ vào điều
này để giải thích hiệu quả điều trị sỏi thận, sỏi mật của cây thuốc.
 Điều trị tiểu đường:
Tác dụng giảm đường huyết của Diệp hạ châu (Phyllanthus niruri) đã
được kết luận vào năm 1995, đường huyết đã giảm một cách đáng kể trên
những bệnh nhân tiểu đường khi cho uống thuốc này trong 10 ngày.
1.1.3.2. Một số công trình nghiên cứu về tác dụng dược lý của cây Diệp
hạ châu:
 Các nhà khoa học đã chứng minh dịch chiết của Phyllantus có tác dụng ức
chế mạnh HBV, thông qua cơ chế ức chế enzym ADNp (DNA polymerase)

của HBV, làm giảm hoạt độ HbsAg và Anti- HBs. Theo các nghiên cứu, cây
diệp hạ châu chứa một số enzyme và hoạt chất có tác dụng chữa viêm gan


9

như: Phyllanthine, hypophyllanthine, alkaloids và flavonoids... Người ta cho
rằng chó đẻ răng cưa có tác dụng ức chế mạnh HBV- DNA (virut viêm gan B
trên hệ mã di truyền) và làm cho virut bị đào thải, không bám vào được ADN
của người. Những bệnh nhân viêm gan do HBV sau khi sử dụng thuốc có chó
đẻ răng cưa, được phục hồi enzym transaminase từ 50-97%, bilirubin toàn
phần trở về bình thường.
 Một nghiên cứu cho thấy, 50% yếu tố lây truyền của virus viêm gan B
trong máu đã mất đi sau 30 ngày sử dụng loại cây này (với liều 900 mg/ngày).
Trong thời gian nghiên cứu, không có bất kỳ sự tương tác nào giữa Diệp hạ
châu với các thuốc khác.
 Theo một nghiên cứu tiến hành năm 1995, cây thuốc này có tác dụng lợi
tiểu, giảm huyết áp tâm thu ở người không bị tiểu đường và giảm đáng kể
đường huyết ở bệnh nhân tiểu đường.
 Thí nghiêm trên chuột cống trắng cho thấy: Phyllanthin và
hypophyllanthin

chống lại tính độc hại tế bào gây ra bởi carbontetraclorid

và galactosami; chất triterpen triacontanol có tác dụng bảo vệ gan chống lại
tính độc hại tế bào gây ra bởi galactosamin.
 Trên in vitro: cây chó đẻ có tác dụng kháng virus viêm gan B.
Một loạt những acid phenolic phân lập từ các lào Phyllanthus có tác dụng ức
chế DNA polymerase của virus viêm gan B.
 Cây chó đẻ có tác dụng kháng khuẩn đối với tụ cầu vàng, trực khuẩn mủ

xanh, trực khuẩn coli, Shigella dysenteriae, S.flexneri, S.shigae, Moraxella,
và kháng chế phẩm đối với Aspergillus fumigatus. Acid galic chứa trong cây
có tác dụng kháng khuẩn yếu. Một dẫn chất phenolic và một flavonoid phân
lập từ cây chó đẻ có tác dụng kháng khuẩn mạnh hơn và kháng chế phẩm rõ
rệt.


10

 Cao chiết với cồn-nước từ cây chó đẻ có tác dụng giảm đau ở chuột nhắt
trắng và cao cồn methylic có tác dụng hạ đường huyết trên chuột cống trắng
đái tháo đường.
 Năm 1998, trên thế giới đã có nước công bố nghiên cứu thành công điều
trị viêm gan do virus B bằng Diệp hạ châu đắng.
 Trên thị trường Việt Nam cũng có nhiều chế phẩm trị viêm gan do HBV,
trong thành phần có chó đẻ răng cưa. Ngoài ra, còn dùng chữa lở loét, mụn
nhọt không liền miệng: Lá chó đẻ răng cưa, lá thồm lồm ăn tai, lượng bằng
nhau, đinh hương 1 nụ, giã nát, đắp vào chỗ đau.
 Bệnh viện Quân khu IV đã thử nghiệm lâm sàng điều trị viêm gan B mãn
tính với hepaphyl có chứa bột Diệp hạ châu đắng của xí nghiệp dược phẩm
Trung Ương 25 trên 54 bệnh nhân. Sau 4 tháng theo dõi, kết quả cho thấy các
bệnh nhân đã giảm hoặc mất các triệu chứng lâm sàng của viêm gan B, phục
hồi nhanh chức năng gan; Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc
thuộc Viện Dược liệu (Bộ Y tế) cũng nghiên cứu thành công và đưa vào sản
xuất đại trà "Trà diệp hạ châu”. Loại trà này có tác dụng giải nhiệt, trợ giúp
tiêu hóa, giải độc do rượu và bia.
1.2. Giới thiệu về hợp chất lignan:
1.2.1. Phyllanthin
Công thức hóa học: C24H34O6
Khối lượng phân tử: 418,52316 g/mol

11

Hình 1.1 Cấu trúc của phyllanthin
Phyllanthin cho tinh thể hình kim khi kết tinh trong dầu hỏa, tan nhiều
trong hexan, etylacetat, methanol, sắc ký lớp mỏng trên bản silicagel 60 F 254
Merck, dung môi động hexan – etylacetat (2:1) hiện màu bằng H 2SO4 10 %
trong methanol khi hơ nóng hiện rõ một vết tròn có màu xanh dương nhạt,
Rf = 0,35.
1.2.2. Hypophyllanthin
Công thức hóa học: C24H30O7
Khối lượng phân tử: 430,4908 g/mol

Hình 1.2 Cấu trúc của hypophyllanthin


12

Hypophyllanthin kết tinh trong dầu hỏa hoặc hexan được tinh thể hình kim
dài, tan nhiều trong hexan, etylacetat. Sắc ký lớp mỏng trên bản silicagel 60
F254 Merck, dung môi động hexan – etylacetat (2:1), hiện màu bằng H 2SO4
10% trong methanol, khi hơ nóng hiện rõ một vết tròn, có màu xanh dương
đậm. Rf = 0,4.
1.3. Những nghiên cứu về hypophyllanthin và loài phyllanthus
1.3.1. Ở nước ngoài:[38], [39]
Đã có nhiều nghiên cứu của nước ngoài về mặt hóa học cũng như tác dụng
chữa bệnh gan của các loài Phyllanthus:
- Tác dụng chống virus:

trên các bệnh nhân mang viruts viêm gan B,

Phyllanthus amarus đã làm giảm các kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B.
Dịch chiết nước của cây có khả năng ức chế men tổng hợp DNA nội sinh của
virus viêm gan B và gắn vào bề mặt kháng nguyên của virus trong ống
nghiệm. Ở mức độ tế bào , dịch chiết nước của Phyllanthus amarus có tác
dụng ức chế HbsAg trong 48 giờ trên các tế bào ung thư gan ở nồng độ 1
mg/ml.
- Tác dụng chống độc gan: bột Phyllanthus amarus có khả năng khôi phục lại
bình thường các mức cholesterol, triglyceride và phospholipids ở các con
chuột bị gây ngộ độc gan bằng rượu. Các thông số men gan như AST, ALT
cũng trở lại bình thường. Nghiên cứu trên chuột bị gây ngộ độc bằng CCl 4
cũng cho kết quả tương tự. Trên tế bào gan chuột nuôi cấy bị ngộ độc bằng
CCl4 hay galactosamine, dịch chiết n- hexan của cây Phyllanthus niruri và các
chất phân lập từ dịch chiết này là: Phyllanthin , hypophyllanthin

và

triacontanal có tác dụng bảo vệ tế bào rất tốt.
- Năm 1988( Lancet Oct.1.1988) Blumberg và Thiogarajan công bố đã điều
trị 37 bệnh nhân viêm gan siêu vi B bằng Diệp hạ châu đắng( phyllathus
amarus) với liều dùng hằng ngày 200 mg cao toàn cây Diệp hạ châu


13

đắng( loại bỏ rễ) trong 30 ngày. Kết quả 22/37 bệnh nhân điều trị đã mất
kháng nguyên bề mặt của viêm gan B khi làm xét nghiệm ở 15-20 ngày sau
khi kết thúc điều trị. Một số đối tượng được theo dõi 9 tháng, không có trường
hợp nào kháng nguyên bề mặt trở lại. Tuy vậy, hiệu quả của diệp hạ châu

đắng trong điều trị những người mang virus viêm gan B không thật rõ ràng,
có cả những trường hợp thành công và thất bại được báo cáo. Các tác giả còn
chứng minh phyllathus amarus có chứa chất làm ức chế lên men polymerase
DNA của virus viêm gan siêu vi B.
- Các loại cây phyllathus amarus có chứa vài lignan, flavonoid và tanin thủy
phân có tác dụng bảo vệ gan, có khả năng làm sạch phần lớn các kháng
nguyên HbsAg, ức chế mạnh HIV trancriptase ngược.
1.3.2. Ở Việt Nam
- Công trình nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Đậu và Trần Thị thu Hà,
khoa Hóa- trường ĐH khoa học tự nhiên- ĐH Quốc gia Hà nội, đăng trên tạp
chí Dược năm 2007 đã trình bày nghiên cứu của các tác giả về hóa học thực
vật của cây chó đẻ ( phyllanthus niruri L. ) mọc ở Bắc Ninh theo hướng phân
lập các hoạt chất có hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan. Từ phần dịch
chiết n- hexan đã phân lập được phyllanthin , hypophyllanthin , ...[7]
- Công trình tốt nghiệp Dược sỹ đại học khóa 59 của sinh viên Lê Quân do
PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh và TS. Trần Văn Ơn hướng dẫn với đề tài: “
Nghiên cứu tính đa dạng sinh học của các loài mang tên “chó đẻ” thuộc chi
phyllanthus L. Tại Việt Nam” bảo vệ năm 2009. Đề tài đã thực hiện nghiên
cứu trên 10 mẫu mang tên “ chó đẻ” thuộc 2 loài phyllathus amarus Schum et
Thorn và phyllathus urinaria L. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng loại
phyllathus amarus không có sự biến đổi hình thái theo mùa, còn loại
phyllathus urinaria có sự biến đổi về màu sắc thân,cành , quả. Về kết quả
định lượng sơ bộ, 06 mẫu thuộc loài phyllathus amarus có hàm lượng


14

Phyllanthin trong khoảng 0.52-0.89% và hypophyllanthin

khoảng 0.12-

18%; 04 mẫu thuộc loài phyllathus urinaria không có Phyllanthin . Điều này
khác với một số công bố trước đâycho rằng loài phyllathus urinaria có cả hai
hợp chất phyllanthin và hypophyllanthin [14] .
- Đề tài : “ sự tăng trưởng và tích lũy hợp chất thứ cấp của cây diệp hạ châu
đắng nuôi cấy quang tự dưỡng trong điều kiện môi trường giàu” của các tác
giả: Phạm Minh Duy, Nguyễn Như Hiến, Hoàng Ngọc Nhung, Nguyễn Du
Sanh, Nguyễn Thị Quỳnh được đăng trên Tạp chí sinh học, số 34, 2012. Đề
tài nghiên cứu vai trò của CO 2 lên sự tăng trưởng và tích lũy hợp chất thứ cấp
của cây diệp hạ châu đắng invitro không chỉ có lợi cho việc sản xuất cây
invitro, mà còn cho việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ cây invitro. Kết quả
nghiên cứu cho thấy: Cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy invitro trong môi
trường giàu CO2 tăng trưởng tốt hơn và tạo ra được nhiều hợp chất
phyllanthin , hypophyllanthin

và niranthin hơn so với cây nuôi cấy ở điều

kiện CO2 không khí thấp. Khi đưa ra vườn ươm, cây được nuôi cấy invitro ở
nồng độ CO2 cao tiếp tục duy trì sự tăng trưởng tốt hơn so với cây này ở nồng
độ CO2 thấp.
- Công trình nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thanh Hồng, Nguyễn Ngọc
Hạnh, Nguyễn Quang Trung, Phạm Ngọc Thành, Trần Thị Huệ, Viện công
nghệ hóa học TP Hồ Chí Minh và Đại Học Cần Thơ, đăng trên tạp chí Hóa
học,T40, Số 4, năm 2012, đã trình bày nghiên cứu của các tác giả “ Khảo sát
thành phần lignan của các loại phyllanthus thuộc họ thầu dầu
(EUPHORBIACEA). Kết quả nghiên cứu thu được: Từ cây chó đẻ
(PHYLLANTHIN .niruri) đã tách được 3 hợp chất lignan và xác định được
3 hợp chất đó là: Phyllanthin , hypophyllanthin
hypophyllanthin

và niranthin. Lignan tổng,

và phyllanthin đều có tác động đến virus gây bệnh và làm


15

giảm tỉ lệ phôi chết do virus trong dãy: Hypophyllanthin

> lignan tổng >

phyllanthin[9].
1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
1.4.1. Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.4.1.1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp
HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng Tiếng Anh của phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography),
trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid
Chromatography).
Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải
tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay, phương pháp HPLC ngày
càng phát triển và hiện đại hóa cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành
chế tạo máy phân tích. Hiện nay đây là phương pháp áp dụng rất lớn trong
nhiều ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm
thuốc, là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép
định tính và định lượng.
Ưu điểm của HPLC:
- Điều kiện phân tích khá dễ dàng.
- Dễ dàng thu hồi chất phân tích với độ tinh khiết cao.
- Độ lặp lại cao.

- Thường không phân hủy mẫu trong quá trình phân tích.
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh và pha
động. Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến
hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha tĩnh và
pha động. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất
hóa học của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha