Ứng dụng mới trong nhân giống lan hồ điệp

Ứng Dụng Mới Trong Nhân Giống Lan Hồ Điệp
GVHD: Lê Thị Thủy Tiên

ỨNG DỤNG MỚI TRONG NHÂN GIỐNG
LAN HỒ ĐIỆP
MỤC LỤC

GVHD: Ts. Lê Thị Thủy Tiên

1


PHẦN I: TỔNG QUAN
Điệp

Chương 1: Sơ Lược Về Lan Hồ

PHẦN I
TỔNG QUAN

CHƯƠNG I

Sơ Lược Về Lan Hồ Điệp
1.1 Giới thiệu về lan Hồ Điệp.
1.1.1. Vị trí loài.

Lan hồ điệp thuộc:
Ngành: Magnoliophyta (thực vật hạt kín)
Lớp:
Monocotyledoneae (lớp một lá mầm liliopsida)
Bộ:

Orchidaceae
Họ:
Orchidaceae
Giống:
Phalaenopsis
Loài:
Phalaenopsis spp
Tên khoa học: Phalaenopsis wedding promenade
1.1.2. Đặc điểm hình thái

Hình 1: đặc điểm hình thái lan Hồ Điệp
Thân: Cây đơn không có giả hành, được tạo ra bởi một đỉnh sinh
trưởng hoạt động liên tục. Các đốt thân ngắn và thường được bao bọc bởi
hai hàng bẹ lá, xếp lá dọc theo chiều dài thân.
Lá: Lá đơn nguyên, dày, mọng nước, không có cuống và có bẹ ôm lấy
thân, hình dạng lá đơn (elip thuôn hoặc hình lưỡi mác) với mà sắc đơn hoặc
có thể tạp sắc. Lá mang đặc tính của thực vật Cam.
Rễ: Rễ lan là rễ bất định, khí sinh, mọc từ gốc than xuyên qua bẹ lá. Rễ
phát triển mạnh màu lục, xung quanh rễ có màng xốp bao bọc, lớp mô xốp
này tạo sự dễ dàng cho lan hút nước, muối khóang và các chất dinh dưỡng
cho cây, đồng thời đóng vai trò đặc biệt trong việc giữ nước cũng như ngăn
chặn ánh sáng mặt trời gay gắt.
Hoa: Phát hoa mọc ở nách lá, hoa mọc thành cụm, đối xứng hai bên,
bao hoa dạng cánh rời nhau và xếp thành hai vòng, cánh hoa có hình giống
như cánh bươm bướm và có nhiều màu sắc sặc sỡ khác nhau, có thể nói lan
hồ điệp là hoàng hậu của loài lan.
Keiki: Chỉ là một cây mọc từ một mắt trên cuống hoa. Một số loài có
hoa nhỏ như P. lueddemanniana thường tạo keiki trên cuống hoa.
GVHD:TS. Lê Thị Thủy Tiên

2


PHẦN I: TỔNG QUAN
Điệp

1.1.3.

Chương 1: Sơ Lược Về Lan Hồ

Nguồn gốc phân bố.

Lan Hồ Điệp có tên khoa học là Phalaenopsis sp, là loại lan có hoa lớn,
đẹp, bền. Lan Hồ Điệp có màu sắc phong phú, không thua kém giống lan
nào khác
từ trắng, hồng, đỏ, vàng, tím đến các loại lan Hồ Điệp có sọc nằm ngang
hoặc
thẳng đứng hoặc có đốm to hay nhỏ. Giống Phalaenopsis có khoảng 70 loài
trong
đó có 44 chủng loại, mọc từ d.y Hymalaya đến châu Á có hơn 20 loài lan ưa
nóng
có ở các nước Đông Nam Á như bán đảo M. Lai, Indonesia, Philippine, đông
Ấn
Độ, (Nguyễn Công Nghiệp, 2004).
Lan Hồ Điệp được khám phá vào năm 1750, đầu tiên được ông Rumphius
xác định dưới tên là Angraecum album. Đến năm 1753, Linne đổi lại là
Epidenndrum amabilis vào năm 1825, Blume một nhà thực vật Hà Lan định
danh
một lần nữa là Phalaenopsis amabilis Bl ..và tên đó được dùng cho đến ngày
nay.

Lan Hồ Điệp sống ở độ cao 200- 400 m (William và kramer, 1983) nên vừa
chịu khí hậu nóng ẩm vừa chịu khí hậu mát, nhiệt độ trung b.nh từ 200300C,
trong đó khí hậu l. tưởng cho việc nuôi trồng loại lan này là 220C – 270C
Việt Nam có khoảng 5- 6 giống nguyên chủng, gồm Phalaenopsisi gibbosa
Sweet, phalaenopsis mannii Rchob.f, Phalaenopsis braceana (Hook.f)
christenson, phalaenopsis fuscata Rchob.f, Phalaenopsis lobbii (Rchob.f.).
Hầu hết chúng đều có hương thơm độc đáo.
1.1.1. Điều kiện sinh trưởng và phát triển.

1.1.4.1. Nhiệt độ.
Hồ điệp là một loài lan ở vùng nhiệt đới mà sự tăng trưởng của chúng
chịu ảnh hưởng của hai mùa.Tuy nhiên hồ điệp chỉ xuất hiện ở vùng rừng
núi ẩm hoặc ven suối, không có sự biến đổi nhiêu về nhiệt độ và độ ẩm giữa
mùa mưa và mùa khô. Nhiệt độ tối thích cho lan hồ điệp phát triển là 25 –
30 0C.

GVHD:TS. Lê Thị Thủy Tiên

3


PHẦN I: TỔNG QUAN
Điệp

Chương 1: Sơ Lược Về Lan Hồ

1.1.4.2. Ánh sáng.
Đây là loài lan chịu được biên độ ánh sáng khá rộng, ánh sáng hữu
hiệu cho loài là 30%. Nếu ta nuôi lan trong nhà kính ta phải dùng lưới che
bớt ánh sáng. Có thể dùng bốn đèn loại ống 40w và hai bóng đèn thường

được đạt cách ngọn lan khoảng 15 – 20cm và chiếu sáng 12 – 16h/ngày.
1.1.4.3. Độ ẩm
Độ ẩm tối thích của lan là 50% - 80%, nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn
thì lan sẽ phát triển không bình thường và có thể gây hư hỏng hoặc giết
chết lan.
1.1.4.4. Thay chậu.
Nếu để lan phát triển quá lâu mà không thay chậu thì lan sẽ kém phát
triển, khi nhận thấy chậu lan có các dấu hiệu như: lan cao quá chậu, rễ lan
mọc vượt ra khỏi chậu thì nên tiến hành thay chậu cho lan. Thay chậu lần 2
sau trồng từ 16-20 tháng, khoảng cách giữa 2 lá đạt khoảng 18cm bằng chậu
có đường kính 12cm.
1.1.4.5. Chế độ chăm sóc:
Ngoài các điều kiện trên, trong giai đoạn sinh trưởng cần giữ nhiệt độ
khoảng 23oC, không thấp hơn 20oC, hệ thống thông gió hoạt động tốt. Mùa
hè che bớt 80-90% ánh sáng, mùa đông từ 60-70%. Sau trồng 1 tháng bón
thêm phân NPK 30-10-10 pha 30-40mg/lít nước phun 7 ngày/lần. Phun
NPK 30-10-10 (pha 40mg/lít); có thể bổ sung thêm các loại phân bón lá
khác như Komix.
1.2. Giá trị kinh tế.
1.2.1. Trong nước.

Sau khi đất nước giành được độc lập, nhân dân ta bắt tay vào công
cuộc sản xuất, xây dựng nên kinh tế. Đặc biệt là sau khi gia nhập WTO,
nền kinh tế lại có thêm nhiều cơ hội phát triển. Đời sống của người dân
được nâng cao cả cả về vật chất và tinh thần, con người ngày càng có nhu
cầu thưởng thức cảm nhận những cái đẹp và lan là một loài hoa có sắc đẹp
kiêu sa, lộng lẫy được nhiều người trong giới chơi hoa tìm đến.
GVHD:TS. Lê Thị Thủy Tiên

4

PHẦN I: TỔNG QUAN
Điệp

Chương 1: Sơ Lược Về Lan Hồ

Hình 2: Lan Hồ Điệp
Một giò lan hồ điệp có giá từ 150.000 đến vài triệu đồng, có nhiều hộ
dân đã làm giàu bằng nghề trồng lan.”
Lan hồ điệp có vẻ đẹp sang trọng nên chiếm được cảm tình của người
chơi hoa, giá cả phù hợp với túi tiền. Vì vậy nhiều năm gần đây nghề trồng lan
Hồ Điệp rất phát triển, để đáp ứng nhu cầu chơi lan của người dân, nhiều
phương pháp lai tạo và nhân giống được áp dụng cho ngành trồng lan.
Sản xuất lan Hồ Điệp không chỉ đáp ứng nhu cầu trong nước, mà ngày
càng vươn sang thị trường xuất khẩu. Tuy nhiên do xuất khẩu hoa tươi ngặp
nhiều khó khăn, nên xuất khẩu lan chưa được chú trọng. Thị trường chủ yếu là
Hà Lan, Hà Lan chiếm trên 55% tổng lượng hoa xuất khẩu của VN, chủ yếu là
lan hồ điệp (Đà Lạt), với lượng xuất đạt trên 400 nghìn cành, trị giá gần 100
nghìn USD.Từ đầu năm 2010, lượng và kim ngạch xuất khẩu hoa sang Hà Lan
khá đều đặn, dao động từ 45-65 nghìn cành. Xuất khẩu hoa sang Hà Lan chủ
yếu bằng đường hàng không. Theo thống kê năm 2010, Hà Lan gần như là thị
trường nhập khẩu hoa duy nhất của Việt Nam trong khối EU. [Trích trên tờ:
/>
1.2.2. Thế giới.

Thị trường xuất nhập khẩu lan trên thế giới diễn ra hết sức tấp nập, đáp ứng
được nhu cầu chơi lan ở khắp mọi nơi. Theo thống kê năm 2004 ở một số nước
có thế mạnh về xuất khẩu lan như sau.
GVHD:TS. Lê Thị Thủy Tiên

5


PHẦN I: TỔNG QUAN
Điệp

Chương 1: Sơ Lược Về Lan Hồ

Xuất nhập khẩu lan ở Saudi Arabia.
Trong năm 2004 Saudi Arabia
Xuất khẩu: $ 189,70 tỷ USD
Nhập khẩu: 82290000000 $ USD
Bảng 1:
Mỹ
Xuất
khẩu
Nhập
khẩu

1.3.

Năm
1665
1838
1902
1904
1922
1924
1925

1929
1934
1936
1939
1941
1942

Nhật

17,1 %

Hàn
Quốc
15,2 % 10,1 %

Trung
Quốc
9,3 %

Ấn
Độ
7%

12,2 %

7,7 %

10,5 %

4,2 %

5,1 %

Singapoge

Italia

Anh

4,8 %

4,1 %

4,4 %

Lịch sử phát triển của phương pháp nuôi cấy mô thực vật.
Bảng 2: Lịch sử nuôi cấy mô
Những phát minh và sự kiện quan trọng.
Robert Hooke quan sát được tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa ra khái niệm
tế bào.
Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào.
Haberlandt lần dầu tiên thí nghiệm nuôi cấy phôi cây một lá mầm nhưng không
thành công.
Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi đầu tiên ở cây họ cải Crucifers.
Cho hạt lan nảy mầm in vitro.
Hình thành mô sẹo từ củ cà rốt trong môi trường có acid lactic.
Làm hạt phong lan nảy mầm in vitro.
Laibach sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất hòa hợp khi lai ở
Linum spp.
White đã thành công khi nuôi cấy mô cấy mô rễ cà chua trong thời gian dài.

Nuôi cấy phôi các loài cây hạt trần khác nhau.
Gauthere, Noecourt và whte lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời
gian dài từ mô tượng tầng ở cà rốt và thuốc lá.
Overbeek và cộng sự sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi non cà rốt.
Gauthere lần đầu tiên theo dõi sự hình thành chất trao đổi thứ cấp trong nuôi
cấy mô sẹo.

GVHD:TS. Lê Thị Thủy Tiên

6


PHẦN I: TỔNG QUAN
Điệp

1944
1946
1948
1950
1951
1951
1952
1952
1953
1954
1955
1957
1957
1958
1958

1959
1959
1960
1960
1960
1962
1964
1967
1969
1970
1971
1972
1973
1974

Chương 1: Sơ Lược Về Lan Hồ

Skoog lần đầu tiên nghiên cứu sự hình thành chồi phụ từ nuôi cấy mô thuốc lá
in vitro.
Sự tạo cây đầu tiên từ đỉnh chồi ở Lupinus và Tropaeolum
Hình thành trồi phụ ở rễ thuốc lá
Lần đầu tiên nuôi cấy thành công cây một lá mầm bằng nước dừa
Nitsch lần đầu tiên nuôi cấy noãn tách rời in vitro
Skoog nghiên cứu sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng và phát triển cơ quan
Morel và Martin lần đầu tiên tạo được cây thược dược sạch virus bằng nuôi cấy
đỉnh sinh trưởng.
Morel và Martin lần đầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành công.
Tulecke lần đầu tiên thành công trong nuôi cấy bao phấn và tạo mô sẹo đơn bội
từ hạt phấn Ginkgo biloba.
Muir và cộng sự lần đầu tiên tạo được mô sẹo từ mô nuôi dưỡng (nurse culture).

Miller và cộng sự đã phát minh cấu trúc và con đường sinh tổng hợp kinetin
Skoog và Miller đã khám phá vai trò tỉ lệ nồng độ các chất auxin/ cytokinin trong
môi trường đối với sự phát sinh cơ quan.
Vasil nghiên cứu nuôi cấy bao phấn tách rời ở Allium cepa.
Maheshwari thực hiện nuôi cấy noãn tách rời in vitro ở cây anh túc Papaver
somniferum.
Maheshwari đã tái sinh thành công phôi soma từ phôi tâm (nucella) trong nuôi
cấy noãn Citrus
Tulecke và Nickell thử nghiệm sản xuất sinh khối thực vật quy mô lớn (134L)
bằng nuôi cấy chìm.
Reinert và Steward tạo được phôi vô tính từ nuôi cấy mô cà rốt
Kanta lần đầu thực hiện thụ tinh trong ống nghiệm ở Papaver rhoeas.
Cocking lần đầu tiên sử dụng enzyme phân giải tế bào để tạo ta số lượng lớn tế
bào trần.
Morel lần đầu tiên thành công trong nuôi cấy mô đỉnh sinh trưởng để nhân nhanh
phong lan.
Murashige và Skoog đề nghị môi trường nuôi cấy tế bào thực vật- môi trường
MS.
Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công tạo cây đơn bội từ nuôi cấy bao
phấn cà rốt.
Bourgin và Nitsch tạo cây đơn bội từ hạt phấn thuốc lá.
Phân lập tế bào trần từ nuôi cấy huyền phù tế bào Hapopapus gracilis.
Chọn lọc đột biến sinh hóa ở thuốc lá.
Takebe và cộng sự tạo được cây từ tế bào trần mô thịt lá ở thuốc lá.
Carlson và cộng sự tạo được cây từ lai xa tế bào trần đầu tiên nhờ dung hợp tế
bào trần của 2 loài Nicotiana glauca và N. langsdorfii .
Phát hiện cytokinin có khả năng phá ngủ ở Gerberas.
Zaenen và cộng sự phát hiện plasmid Ti đóng vai trò là yếu tố gây u (crown gall)

GVHD:TS. Lê Thị Thủy Tiên

7


PHẦN I: TỔNG QUAN
Điệp

1974
1975
1977
1977
1978
1978
1979
1980
1981
1982
1982
1983
1983
1984
1985
1985
1985
1985
1985
1986
1987
1987
1988

Chương 1: Sơ Lược Về Lan Hồ

ở cây trồng.
Melchers và Lalib tạo cây đơn bội từ tế bào trần đơn bội.
Gengenbach và Green chọn lọc dòng tế bào không bệnh nấm Helminthosporium
maydis trong nuôi cấy mô sẹo ở ngô.
Chilton và cộng sự chuyển thành công T-DNA vào thực vật.
Noguchi và cộng sự nuôi cấy tế bào thuốc lá trong bioreactor 200001
Melchers và cộng sự tạo được cây lai soma cà chua- thuốc lá bằng dung hợp tế
bào trần.
Tabata và cộng sự nuôi cấy tế bào thực vật ở quy mô công nghiệp phục vụ sản
xuất shikonin.
Marton và cộng sự xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần bằng đồng nuô
cấy tế bào và Agrobacterium.
Alfermann và cộng sự sử dụng các tế bào nuôi cấy trong chuyển hóa sinh học
digitoxin thàh digoxin.
Larkin và Scowcroft đưa ra thuật ngữ “ biến dị soma” để chỉ các thay đổi di
truyền tính trạng xảy ra do nuôi cấy mô và tế bào in vitro.
Krens đã chuyển DNA và tế bào trần.
Zimmerman sử dụng kỹ thuật xung điện trong dung hợp tế bào trần.
Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên sản xuất chất trao đổi thứ cấp trên
quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy huyền phù tế bào Lithospermum spp.
Zambryski và cộng sự thiết kế các vector chuyển gen thông qua Agrobacterium.
Chuyển gen vào tế bào trần thuốc lá Nicotiana bằng DNA plamid và tái sinh cây
chuyển gen.
Fraley và cộng sự thiết kế vector Ti plasmid đã loại bỏ các gen độc gây hại cho
việc chuyển gen vào thực vật.
Horsch và cộng sự chuyển gen vào mảnh lá bằng Agrobacterium tumefaciens và
tái sinh cây chuyển gen.

An và cộng sự phát triển hệ thống hai vector cho chuyển gen thực vật.
Chuyển gen vào tế bào trần cây một lá mầm và hai lá mầm bằng phương pháp
điện thẩm.
Flores và Filner lần đầu tiên sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ nhân nuôi rễ tơ ở
Hyoscyamus muicus. Những rễ này sản xuất nhiều hoạt chất hyoscyamine hơn
cây tự nhiên.
Crossway và cộng sự chuyển gen vào tế bào trần thuốc lá bằng vi tiêm DNA trực
tiếp.
Klein và cộng sự đó sử dụng sung bắn gen (particle gun) mang vi đạn trong
chuyển gen và tái sinh cây biểu hiện gen chuyển.
Bytebier và cộng sự lần đầu tiên đã chuyển gen vào cây một lá mầm (Asparagus)
bằng Agrobacterium tumefaciens.
Klein và cộng sự tái sinh cây chuyển gen ổn định thông qua phương pháp bắn
gen.

GVHD:TS. Lê Thị Thủy Tiên

8


PHẦN I: TỔNG QUAN
Điệp

Chương 1: Sơ Lược Về Lan Hồ

1991 Sản xuất cây mang gen đầu tiên ở thông Larix deciduas bằng chuyển gen qua
Agrobacterium zhizodenes.
1992 Lúa kháng chất diệt cỏ nhờ chuyển gen vào tế bào trần thông qua PEG.
1993 Kranz và Lorz thực hiện thụ tinh in vitro tạp ra và nuôi cấy phôi hợp tử ở ngô.
Các quá trình phát triển và phân hóa của phôi sâu đó được quan sát dưới kính

hiển vi bà phân tích biểu hiện của gen nhằm xác định cà gen tham gia trong từng
giai đoạn phát triển của phôi.
1994 Thương mại hóa giống cà chua chuyển gen “Flavr- Savr”
1998 Hamilton và cộng sự đã phát triển vector mang NST nhân tạo của hai vi khuẩn
( BBIC) cho chuyển gen thông qua Agrobacterium (khả năng chuyển 150kb).

GVHD:TS. Lê Thị Thủy Tiên

9


PHẦN I: TỔNG QUAN
Nhân Giống

Chương 2: Các Phương Pháp

CHƯƠNG 2
CÁC PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG
2.1. giống bằng phương pháp truyền thống.
2.1.1. Nhân Phương pháp giâm cành.
 Vật liệu: là những cành bánh tẻ (không quá non, không quá già) , không bị

bệnh, không bị tật.
 Phương pháp:
- Bước 1 : dùng dao sắc cắt thành các đoạn hom, mỗi đoạn hom cắt khoảng 2 đốt

(có 3 mắc lá), sau đó cắt sạch lá ở mắt lá phía gốc rồi cho ngay vào sô nước
sạch để cho hom khỏi bị héo. Chú ý nên cắt gần sát mắt gốc để hom dễ ra rễ.
- Bước 2 : Lấy hom giống đã được cắt xong nhúng ngập mắt hom gốc vào thuốc

kích thích ra rễ đã được pha sẵn, sau đó dùng dớn mút đã được xé nhỏ quấn
quanh mắt gốc rồi giâm vào vỉ xốp (loại vỉ 102 lỗ, giâm hom cách hom 01
hàng lỗ trên vỉ). Khi giâm hom giống vào vỉ xốp xong nên tưới sương nhẹ cho
hom ngay để hom giống khỏi bị héo, hom giống giâm phải được để trong nhà
lưới có mái che lưới đen 70% (cần che chắn xung quanh để tránh gió lùa vào
làm cây héo), sau đó cần tưới từ 2 – 4 lần/ngày để đảm bảo cây không bị mất
nước, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình ra rễ của hom giống. Giai đoạn này
kéo dài trong khoảng 30 ngày thì

hom giống đã ra rễ, lúc này ta tiến
hành chuyển hom giống đã có rễ sang bầu đất.


PHẦN I: TỔNG QUAN
Nhân Giống

Chương 2: Các Phương Pháp

Hình 3: Giâm cành

- Bước 3 : Hom giống sau khi đã có rễ đạt yêu cầu (cây con) thì tiến hành trồng

vào bầu đất.
+ Bầu đất: Dùng loại bịch nilon đường kính 15cm (đã đục lỗ) để làm
bầu đất. Giá thể bầu đất gồm có: 70% đất đỏ + 20% đất sạch DASA + 10%
phân chuồng đã ủ hoai.
+ Cách trồng: Chuẩn bị sẵn bầu đất sau đó nhổ cây con từ vỉ xốp (chú
ý không được làm đứt rễ ) và trồng ngay vào bầu đất, dùng ngón tay nén chặt
xung quanh gốc để giữ cây được đứng vững tránh cây bị đổ ngã khi tưới
nước. Cây sau khi trồng vào bầu được chuyển vào nhà lưới có che lưới đen

60% và tưới bằng vòi nhỏ (phải kê bầu đất lên trên gạch để tránh bầu đất bị
đọng nước), sau đó tưới 2 lần/ngày đảm bảo bầu đất luôn đủ ẩm để cây nhanh
hồi phục và phát triển.
+ Giai đoạn này kéo dài trong khoảng 30 – 40 ngày cây có thể xuất
vườn đi trồng được.
 Nhận xét:
Phương pháp này đơn giản, dễ làm, vốn đầu tư thấp, giữ được ưu điểu
của cây mẹ thích hợp cho các hộ gia đình sản xuất nhỏ lẻ. Tuy nhiên hiệu quả
của phương pháp không cao, hệ số nhân giống thấp, không tạo được giống
sạch bệnh, cây con rễ mang bệnh của cây mẹ. phương pháp này không được
áp dụng quy mô công nghiệp.
2.1.2. Nhân giống bằng phương pháp ghép cành.
 Các yếu tố ảnh hưởng.

+ Chọn mắt ghép: Là bước đầu tiên để có cây giống tốt. Chọn cành đã ra hoa,
dùng mắt ở đoạn giữ làm mắt ghép. Những mắt ghép gần gốc cành hình thành
ở gia đoạn phát dục sớm của cành, khi đó cành còn non, quang hợp yếu, chất
dinh dưỡng ít, mầm phát triển kém, sau khi ghép cây ghép sẽ yếu. Các mắt gần
ngọn cành ra đời sau khi cành đã phân hóa hoa thường không to mập, tương
tầng chưa ổn định, tỷ lệ sống thấp.


PHẦN I: TỔNG QUAN
Nhân Giống

Chương 2: Các Phương Pháp

Sau khi cắt cành ghép, cát bỏ gai, cắt bỏ lá và giữ lại cuống lá, ngâm ngay
vào nước sạch không được để cạn nước. Tôt nhất là cắt xuống ghép ngay
không để lâu. Ở nhiệt độ 50C đảm bảo đủ ẩm có thể để được 1-2 tuần.

+ Chuẩn bị gốc ghép: Gốc ghép có thể là cây thực sinh hoặc cắm cành, khi
đạt độ lớn nhất định từ 30 – 40 cm và đường kính thân khoảng 1cm ghép là tốt
nhất.

Hình 3: Phương pháp ghép cành

Vật liệu.

Là một đoạn cành của cây cần nhân giống, trong thời gian phát triển
mạnh, đã ra hoa một lần. Đoạn cảnh được ghép không quá dài, có đường kính
phù hợp với gốc ghép.
Phương pháp và kỹ thuật ghép:
- Ghép đoạn cành:
Cành ghép là 1 đoạn cành nhỏ, ghép lên gốc ghép chủ yếu bằng phương
pháp: ghép nối tiếp, ghép bên, ghép lưỡi… Nhưng sử dụng phương pháp
ghép bên tiện lợi hơn cả, cụ thể như sau:
+ Sử dụng cành ghép.
Dùng cành ngủ sau khi rụng lá làm cành ghép, mỗi cành ghép có hai mắt
là vừa, sau khi cắt cành ngủ, bảo quản lạnh có thể sử dụng được trong thời
gian dài.
+ Thao tác ghép.
Gốc ghép phải to hơn cành ghép, cắt bỏ gốc ghép ở vị trí định ghép từ mặt
ngang. Dùng dao chẻ thành 1 đường làm miệng cắt, mang theo 1 phần gỗ.
Cành ghép là một đoạn cành nhỏ gồm 2-3 mắt, dùng dao cắt ở gốc cành ghép
tạo thành một mặt nghiêng 450 từ phía đối diện mặt nghiêng có độ dài cách


PHẦN I: TỔNG QUAN
Nhân Giống

Chương 2: Các Phương Pháp

2-2,5cm, độ sâu vết cắt vừa bằng một lớp gỗ mỏng và phần vỏ bị cắt. Khi cắt
trước tiên là cắt vào phần vỏ, sau đó cắt xuống phía dưới. Mặt cắt của cành
ghép và mắt ghép phải phẳng, nhẵn sau khi ghép tượng tầng 2 bên tiếp hợp
rồi dùng dây nilông buộc lại. Cách ghép này có thể tiến hành trong vụ đông
xuân nhưng đòi hỏi kỹ thuật cao, sau khi ghép xong đặt vào trong thùng tưới
nước, giữ ẩm, dùng nilông buộc kín đặt trong thùng ấm từ 15-170 C, lúc đầu
phải che nắng . Sau mắt nảy mầm có thể cho tiếp xúc ánh sáng dần dần. Sau
40 ngày có thể đem ra ruộng trồng. Nếu muốn có cây con to hơn thì phải
trồng trong vườn ươm, đợi khi mắt ghép cao khoảng 20cm ngắt ngọn 1 lần có
thể đem trồng.
Ngoài ra trong vụ xuân sớm có thể ghép trong nhà che phủ nilông tránh mưa
phùn, sương muối, nâng cao nhiệt độ không khí.
2.1.3. phương pháp chiết cành.
 Vật liêu.

Cành chiết được lấy trên các cây giống đã được chọn lọc ở thời kỳ sinh
trưởng khoẻ, cây có năng suất cao, ổn định và không có sâu bệnh nguy hiểm
gây hại. Chọn những cành có đường kính từ 1 - 2 cm ở tầng tán giữa và phơi
ra ngoài ánh sáng, không chọn cành nà, cành dưới tán và các cành vượt.

Hình 4: Phương pháp chiết cành
 Phương pháp.


PHẦN I: TỔNG QUAN
Nhân Giống

Chương 2: Các Phương Pháp

Dùng dao cắt khoanh vỏ với chiều dài khoanh vỏ bằng 1,5 - 2 lần đường
kính gốc cành. Sau khi bóc lớp vỏ ngoài, dùng dao cạo sạch phần tượng tầng
đến lớp gỗ.
Sau khi khoanh vỏ 1 - 2 ngày thì tiến hành bó bầu. Đất bó bầu gồm 2/3 là
đất vườn hoặc đất bùn ao phơi khô, đập nhỏ + 1/3 là mùn cưa, rơm rác mục, xơ
dừa... tưới ẩm, bọc bầu bằng giấy polyetylen và buộc kín hai đầu bằng lạt mềm.
Sau 60 - 90 ngày, tuỳ thuộc vào thời vụ chiết, cành chiết rễ. Khi cành
chiết có rễ ngắn chuyển từ màu trắng sang màu vàng ngà là có thể cắt cành
chiết đưa vào vườn ươm.
2.1.4. nhân giống bằng phương pháp tách cây.
Phương pháp này đơn giản, giữ được tính ưu việt của cây mẹ, bộ rễ phát triển, dễ sống và
mọc nhanh. Phương pháp này thích hợp với các loài cây bụi và cây có rễ chùm. Nghề nuôi
trồng hoa gia đình thường dùng cách này thời gian tách cây theo loài hoa: Hoa nở mùa xuân
tách vào mùa thu (tháng 10 - 11) hoa nở vào mùa thu tách cây vào mùa xuân (tháng 3 - 4).

Hình 5: Tách cây để trồng
Có hai phương pháp tách cây: (l) Đào cây lên, bỏ đất để lộ rễ, cắt rời các bộ phận rễ
cây con từ cây mẹ, làm như vậy không ảnh hưởng đến cây mẹ, bảo vệ được sự hoàn chỉnh
của bộ rễ. (2) Không đào hết cây mẹ lên mà chỉ đào bên cạnh rồi cắt lấy cây con đem
trồng.

2.1.4. Phương pháp gieo hạt.

- Gieo ươm hạt trong bầu
Phương pháp gieo ươm hạt trong túi bầu được sử dụng cho cả
phương pháp nhân giống bằng hạt và gieo ươm cây gốc ghép cho nhân giống
bằng phương pháp ghép. Hạt giống được gieo trực tiếp vào túi bầu tiêu chuẩn
hoặc gieo vào túi bầu nhỏ rồi tiến hành ra ngôi sau. Hạt giống thường được xử
lý và ủ cho nứt nanh mới tiến hành gieo. Hỗn hợp bầu đang được sử dụng là

đất + phân chuồng hoai mục với tỷ lệ là 1 m3 đất mặt + 200 - 300 kg phân
chuồng hoai mục + 10 - 15 kg supe lân.
+ Hạt được gieo vào bầu. Độ sâu lấp hạt từ 1 - 3 cm tuỳ thuộc vào thời
vụ gieo và tuỳ thuộc vào hạt giống cây ăn quả đem gieo.
+ Các khâu chăm sóc phải được làm thường xuyên như: tưới nước giữ
ẩm, nhổ cỏ, xới xáo phá váng, bón phân đặc biệt là theo dõi, phát hiện và


PHẦN I: TỔNG QUAN
Nhân Giống

Chương 2: Các Phương Pháp

phòng trừ bệnh kịp thời. Bón thúc bằng nước phân chuồng pha loãng 1/10 1/15 hoặc các loại phân vô cơ pha loãng 1%.
2.1.5. Nhận xét.

Nhìn chung các phương pháp nhân giống truyền thống khá đơn giản, rễ
làm, không đòi hỏi trang thiết bị, kỹ thuật cao. Tuy nhiên hiệu quả của phương
pháp không cao: hệ số nhân giống thấp, cây giống tạo thành không đồng nhất
về kiểu hình và di truyền, không đảm bảo sạch bệnh và dễ bị lây bệnh từ cây
mẹ, giá thành sản xuất cao. Không thể áp dụng hoặc áp dụng không có hiệu
quả trong nhân giống lan.
Các phương pháp này thích hợp cho quy mô sản xuất nhỏ lẻ, hộ gia đình,
khó áp dụng cho quy mô lớn(quy mô công nghiệp). Để tạo giống với số lượng
lớn, đồng nhất về chất lượng , hiệu quả kinh tế cao cần áp dụng các phương
pháp nhân giống hiện đại.
2.2.

Nhân giống bằng phương pháp hiện đại.
2.2.1. Các giai đoạn của quá trình vi nhân giống.

Hiện nay người ta sử dụng nhiều phương pháp vi nhân giống khác nhau:
nhân giống bằng đỉnh sinh trưởng, nuôi cấy nốt đơn thân…. Nhưng các phương
pháp đều phải qua các giai đoạn cơ bản sau.
Giai đoạn 1: Chuẩn bị cây mẹ.
Khi chọn cây mẹ cần phải xác định rõ mục tiêu nhân giống. Cây mẹ phải
sạch bệnh và tốt nhất nên chon cây trong nhà kính hoặc trong phòng tăng
trưởng. Cây mẹ phải được bón phân, phun thuốc trừ sâu bệnh chu đáo.
Thời gian tăng trưởng của cây trong năm có ảnh hưởng đến kết quả nuôi
cấy. Các thay đổi về nhiệt độ, chiều dài ngày, cường độ ánh sáng và lượng nước
tưới trong năm sẽ ảnh hưởng đến lượng carbohydrate, protein và các cơ chất
khác của cây mẹ.
Không nên chọn cây mẹ ở giai đoạn chồi ngọn còn quá non, nếu chọn
đỉnh sinh trưởng thì đỉnh sinh trưởng đang hoạt động. Rễ, thân, lá chọn mẫu
còn non.
Giai đoạn 2: khử trùng mẫu cấy.
Hầu hết các mô hay cơ quan thực vật đều có thể được sử dụng để nuôi
cấy nhưng mức độ thành công phụ thuộc vào hệ số môi trường sử dụng, loài


PHẦN I: TỔNG QUAN
Nhân Giống

Chương 2: Các Phương Pháp

thực vật được nuôi cấy và sự khử trùng thành công. Mục tiêu của giai đoạn
này là thu được lượng lớn các mẫu cấy vô trùng mà vẫn có khả năng tăng
trưởng tốt. Khử trùng bề mặt bao gồm rửa mẫu, tiếp theo là khử trùng mẫu.
Rửa mẫu: Mẫu được rửa dưới vòi nước chảy từ 30 phút ÷ 2 giờ, sau
đó rửa mẫu bằng xà bông sẽ làm giảm đáng kể nguồn gây nhiễm trên những
mẫu cấy ngoài đồng, các mẫu có lông măng, rễ hoặc các cơ quan dự chữ, giúp

cho việc khử trùng dễ dàng hơn.
Khử trùng: Mẫu sau khi rửa sạch được ngâm chìm trong dung dịch
khử các nguồn nhiễm trên bề mặt mẫu cấy. Dung dịch thường được sử dụng
để khử trùng mẫu là hypochlorite sodium 0,5 ÷ 5,25 %. Các dung dịch được
sử dụng như: cồn, hylochlorite calcium, oxy già, natrie bạc …. Khi thêm
tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) sẽ làm tăng hiệu quả khử
trùng. Các loại thuốc thử khác nhau có thể được sử dụng một mình hoặc liên
tiếp nhau sẽ đem lại hiệu khử trùng cao.
Sau khi khử trùng mẫu cấy phải được rửa lại vài lần bằng nước cất vô
trùng trong tủ cấy để rửa sách các chất khử trùng còn bán vào mẫu, những phần
bị tổn thương phải được cắt bỏ, đồng thời mẫu cấy phải được cắt theo kích
thước thích hợp. Sau đó mẫu cấy được đưa vào môi trường dinh dưỡng có bổ
xung vitamin, đường, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật thích hợp cho mẫu
cấy.
Nếu mẫu cấy bị nhiễm bên trong thì có thể được khử trùng bằng cách bổ
xung benomyl hoặc benlate 10mg/l trong môi trường nuôi cấy hoặc xử lý bằng
các chất này trước khi khử trùng mẫu. Thông thường sự khử trùng không thể
loại bỏ được tình trạng nhiễm từ bên trong mẫu, vì vậy người ta thường bổ
xung các chất kháng sinh vào môi trường nuôi cấy để kiểm soát sự tăng trưởng
của vi khuẩn.
Giai đoạn 3: Giai đoạn tăng sinh.
Mục đích của giai đoạn này là tăng sinh nhanh mô.


Tạo phôi soma.
Viêc tạo ra tế bào có khả năng sinh phôi giúp cho việc nhân dòng thực vật
một cách nhanh chóng. Trong quá trình này, một tế bào đơn có thể cảm ứng trở
thành một phôi và từ đó phát triển thành cây nguyên vẹn. Phôi soma là tổ chức
đơn giản được taọ ra từ tế bào soma nhưng sự phát sinh hình thái lại tương tụ
như phôi hữu tính. Việc sinh phôi từ tế bào soma hiên nay đã được thực hiện

PHẦN I: TỔNG QUAN
Nhân Giống

Chương 2: Các Phương Pháp

thành công ở một số loài trong đó có ca rốt, Antirrhinum, petunia và một số
loài khác. Phôi soma thường được sinh ra từ mô sẹo hơn là từ huyền phù tế
bào.
Các bước tạo phôi soma từ huyền phù tế bào.
Bước 1: Tạo mô sẹo có khả năng tăng trưởng mạnh trên môi trường
có lượng khoáng và auxin giảm so với môi trường ban đầu.
Bước 2: Sự phát triển của những tế bào đang tăng trưởng trong môi
trường lỏng tương tự như môi trường tạo mô sẹo.
Bước 3: Loại bỏ auxin hoặc giảm lượng auxin trong môi trường nuôi
cấy.
Bước 4: Sự tạo thành phôi soma và phát triển thành cây con.
 Tăng trưởng và sự phát triển của chồi bên.

Chồi bên hoặc chồi ngọn có thể được cảm ứng phát triển in vitro bằng
cách làm tăng sự phát triển những chồi đang hiện hữu. Một mẫu cấy có mang
một chồi đơn sẽ phát triển thành một cây hay thành một cụm chồi tùy thuộc
vào loài thực vật và môi trường nuôi cấy. Chồi bên sẽ được hình trên chồi ban
đầu, qua những lần cấy chuyền quá trình này sẽ được lặp lại nhiều một cách
chính xác. Sự hình thành sẹo có thể xảy ra cùng với sự phát triển của chồi, và
những chồi bất định có nguồn gốc từ vùng phân sinh ở trong mô sẹo sẽ phát
triển thành cây con. Cytikinin nồng độ 1 ÷ 30 % mg/l có thể sử dụng để kích
thích sự tăng sinh của chồi bên. Sau vài lần cấy chuyền cây con sẽ được tao ra
và chuyển qua giai đoạn 4 để cảm ứng ra rễ.



Sự phát triển của chồi bất định.
Chồi bất định và những mô có liên quan là những cấu trúc có nguồn gốc
từ những vùng không phải trục lá hoặc chồi ngọn. Chồi bất định, rễ, vi củ và
các cấu trúc đặc biệt khác có thể có nguồn gốc từ thân, lá, rễ, củ. Chồi hoặc rễ
bất định có thể có nguồn gốc từ mô sẹo, mô sẹo có thể coi như là thể trung gian
giữa mẫu cấy và cây con. Số lượng cụm chồi/ mô sẹo được tăng lên qua những
lần cấy chuyền. cây con có thể được chuyển sang giai đoạn 4 để tạo rễ.
Giai đoạn 4: Sự tạo rễ in vitro và điều kiện ra rễ.
Ít có loài thực vật nào có thể ra rễ ngay trong môi trường nhân giống.
Nguyên nhân là do cytokinin hiện diện trong môi trường nuôi cấy đã ức chế sự
hình thành rễ vì vậy cần có môi trường chuyên biệt để cảm ứng tạo rễ. Các yếu


PHẦN I: TỔNG QUAN
Nhân Giống

Chương 2: Các Phương Pháp

tố ảnh hưởng đến sự tạo rễ là chất điều hòa sinh trưởng thực vật, khoáng đa
lượng, vi lượng, các hợp chất hữu cơ, cơ chất (chất làm đặc môi trường), ánh
sánh, nhiệt độ.
Ở một số loài thực vật, để cảm ứng sự tạo rễ nhất thiết phải chuyển sang
môi trường hoàn toàn không có cytokinin. Có một số loài có thể tạo rễ trực tiếp
mà không cần môi trường cảm ứng là Aechmea, anh đào lai, đỗ quyên. Tuy
nhiên có một số loài ra rễ nhất thiết phải có sự hiện diện của auxin. Những loại
auxin thường được bổ sung vào môi trường để cảm ứng tạo rễ là IAA (0,1 ÷1,0
mg/l), NAA (0,05÷ 1,0 mg/l) và IBA (0,5 ÷ 3 mg/l). Sự đáp ứng của chồi với
auxin và sự hình thành rễ hoàn toàn phụ thuộc vào loài thực vật. Rễ được tạo

thành trong môi trường có auxin nhưng đôi khi nó lại không thể tiếp tực phát
triển, tăng trưởng trong môi trường trong chính môi trường đó. Vì vậy, có
những trường hợp cần phải ngâm chồi vào môi trường lỏng có auxin trong một
thời gian ngắn trước khi cấy vào môi trường ra rễ.
Nồng độ của khoáng đa lương, vi lượng trong môi trường ra rễ thường
giảm xuống còn một nửa so với bình thường (tuy theo loài thực vật). Nguyên
nhân là do nhu cầu sử dụng đạm của chồi ở giai đoạn này giảm. Kamada và
Harada đã chú ý rằng amino acid và vitamin có thể kích thích hoặc ngăn cản sự
tạo thành rễ tuy theo loài. Đường cần thiết cho sự tạo rễ ở nhiều loài thực vật.
Gautheret chứng minh rằng glucose là nguồn gốc carbonhydrate giúp cho sự ra
rễ của chồi in vitro thích hợp là hơn là fructose và sucrose.
Ánh sáng cũng cần thiết cho sự ra rễ ở một số loài thực vất xác định. Nhu
cầu ánh sáng ở một số loài thực vật để củng cố hàm lượng carbonhydrate nội
sinh khi tạo rễ. Carbonhydrate có thể được cung cấp trực tiếp vào môi trường
nuôi cấy hoặc được cung cấp qua quá trình quang hợp của chồi. Nhưng nếu
carbonhydrate giảm xuống dưới mức tối thiểu thì sự tạo rễ không xảy ra. Ánh
sáng cũng không nhất thiết cần cho sự tạo rễ ở một số loài thực vật thậm chí nó
có thể ngăn cẳn sự tạo rễ ở một số loài.
Giai đoạn 5: Giai đoạn ra rễ in vitro.
Khi được chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, chồi được nuôi cấy vào trong một
hỗn hợp cơ chất ẩm để giúp cho sự ra rễ. hỗn hợp cơ chất có thể là than bùn, vở
cây, khoáng chất, đá nhỏ, đá bọt, cát, đất, và có thể trộn thêm một lượng nhỏ
phân bón. Than bùn có thể quá acid đối với một số loài xác định, trong khi đó
khoáng chất thì có thể quá kiêm . Môi trường lý tưởng cho sự ra rễ là PH trung
tính hoặc hơi acid, có khả năng giữ nước nhưng phải thông thoáng.


PHẦN I: TỔNG QUAN
Nhân Giống

Chương 2: Các Phương Pháp

2.2.4. Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
2.2.4.1.
Đỉnh sinh trưởng.

Mô phân sinh ngọn chứa những tế bào đỉnh sinh trưởng, được bao bọc bởi
một lớp vỏ cutin để hạn chế tối đa sự mất nước. Lớp cutin này bao bọc luôn cả
chồi ngọn.
Quá trình sinh trưởng được chia thành ba giai đoạn:
(1) Giai đoạn thứ nhất, thường được là giai đoạn khởi sinh, trong các điểm sinh
trưởng xẩy ra sự hình thành mầm cơ quan và sự phân chia đầu tiên của nó
thành mô riêng biệt.
(2) Giai đoạn thứ hai là giai đoạn kéo dài do sự tăng trưởng nhanh chóng, mầm cơ
quan đạt đến kích thước tối đa và trở nên có hình dạng nhất định.
(3) Giai đọa thứ ba, kết thúc sự phân hóa tế bào, bắt đầu dẫn đến sự hóa gỗ các
thành tế bào, và kết quả là mô không có khả năng sinh trưởng. Trước hết là các
u lồi dần được hình thành và được gọi là u lá. Thể tích của u lá phát triển rất
nhanh và kéo dài theo nó là một phần lớn của đỉnh sinh trưởng. Dần dần u lồi
chuyển thành phác thể lá (thể nguyên thủy của lá). Pháp thể phát triển nhanh
theo chiều dài. Sau khi lá được tách ra sẽ lặp lại sự phân chia tế bào, kết quả là
thể tích đỉnh sinh trưởng được khôi phục laị nhanh chóng và sự hình thành lá
mới lại bắt đầu. Ở mỗi nách lá đều có chồi nách (chồi bên). Chồi bên thực chất
có cấu tạo không khác đỉnh sinh trưởng thân. Do sự ưu tính ngọn, chồi bên gần
như không phát triển, nhưng khi thoát ra khỏi sự áp chế của chồi ngọn thì
chúng bắt đầu tăng trưởng và có lá đầy đủ như thân chính.
Quá trình tổng hợp DNA của virus thực vật không xảy ra trong tế bào
đỉnh sinh trưởng. Vì vậy, đỉnh sinh trưởng là mô duy nhất sạch virus. Do đó kỹ
thuất nuôi cấy mô thực vật, đỉnh sinh trưởng được sử dụng làm vật liệu nuôi
cấy tạo cây sạch virus. Do vùng ô phân sinh nhỏ, kỹ thuật tách đỉnh sinh trưởng

được thực hiến dưới kính lúp hay mô phân sinh được lấy bao gồm luôn cả chồi
ngọn.
Các phương pháp tạo cây sạch bệnh.
Xử lý nhiệt.
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Xử lý nhiệt, sau đó tiến hành nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
Tạo chồi bất định, sau đó nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
Ghép đỉnh sinh trưởng vào cây con sạch virus.
Nếu nghi ngờ cây bị nhiễm bệnh virus thì tiến hành các phương pháp sau
đây (Quak, 1977).
(1) Trước tiên phải xác định được virus.
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)


PHẦN I: TỔNG QUAN
Nhân Giống

Chương 2: Các Phương Pháp

(2) Tiếp theo cố gắng loại trừ virus.
(3) Tiến hành trắc nghiệm các cây thu được để xem chúng có sạch bệnh virus hay

không.
(4) Cuối cùng tìm cách ngăn cẳn các bệnh virus khác có thể nhiễm vào cây.

Các mẫu cấy sạch bệnh virus cũng có thể bị nhiễm virus trở lại. Các

phương pháp sau đây tiến hành nhằm ngăn cẳn sự nhiễm virus trở lại (Quak,
1966; Theiler, 1981).
(1) Cây được trồng trong nhà kính hoặc ở nhưng nơi không có vi sinh vật trung
gian gây bệnh truyền nhiễm virus.
(2) Liên tục xử lý các vi sinh vật gây bệnh trung gian (nguồn lây nhiễm) như côn
trùng, tuyến trùng.
(3) Phải tuyệt đối giữ vệ sinh: khử trùng tay, quần áo, giày dép, cũng như dao để
ghép, ngăn cản sự truyền bệnh do tác động cơ học trong suốt thời gian chăm
sóc cây ghép.
(4) Chậu cây và chất trồng cây phải không được mang mầm bệnh.
(5) Để hoàn toàn chắc chắn thì mẫu thực vật nên được giữ trong điều kiện in vitro.
(6) Tiến hành chọn lọc liên tục bằng cách quan sát bên ngoài và thực hiện chắc
nghiệm.
Cây mẹ
Tách đỉnh sinh trưởng
Môi trường nuôi cấy
Hình thành chồi
Cảm ứng ra rễ
Đưa ra vườn ươm
Huấn luyện giống
Cây giống
2.2.4.2.

Nhân giống đỉnh sinh trưởng.
Quy trình nhân giống


PHẦN I: TỔNG QUAN
Nhân Giống

Chương 2: Các Phương Pháp

• Kỹ thuật tách đỉnh sinh trưởng:

Chồi ngọn phải được rửa sạch và bỏ
bớt những lá không cần thiết và không
trong cồn 70% . Sau đó, khử trùng bằng
dịch hypoclorite calcium và cuối cùng
rửa lại bằng nước cất vô trùng. Bỏ bớt lá
lúp rồi ngâm lại

ngập
dung
dưới kính

Hình 6: Vùng tách lấy đỉnh
sinh trưởng
trong dung dịch khử trùng pha loãng hoặc cồn 70% trong khoảng thời
gian ngẳn rồi tách bằng dao mổ có đầu nhọn dưới kính lúp. Chồi ngọn được giữ
bằng một kẹp nhỏ trong lúc tiến hành tách lá. Đầu dao mổ phải được khử trùng
thường xuyên trong quá trình thao tác. Khi đỉnh sinh trưởng chỉ còn 1÷2 phác
thểlá thì dùng dao mổ tách rời ra và đặt ngay vào môi trường nuôi cấy để tránh
cho mẫu bị khô. Không nên dùng kính lúp có đèn có ánh sáng mạnh để tách lấy
đỉnh sinh trưởng.
• Huấn luyện giống.


PHẦN I: TỔNG QUAN
Nhân Giống

Chương 2: Các Phương Pháp

Cây con sau khi được tạo thành không thể đưa vào sản xuất ngay, vì lúc này
cây yếu, rễ non. Cây con rễ bị mất nước và chết. Vì vậy, để đảm bảo chất lượng
giống khi đưa vào sản xuất ta nên đưa cây con vào vườn ươm (huấn luyện
giống), tạo điều kiện thích hợp cho cây con phát triển như: cung cấp nước đầy
đủ, bổ xung khoáng và các chất dinh dưỡng cần thiết vào đất, cường độ ánh
sáng không nên cao quá. Cây con sau khi
được huấn luyện thì có thể đưa vào sản xuất
một cách ổn định.
2.2.4. Nhân giống bằng tạo hột nhân
tạo.
Khái niệm.
Hột nhân tạo được tao thành từ phôi vô
tính và lớp vỏ bọc. Hột nhân tạo có khả năng
nẩy mầm và tạo thành cây hoàn chỉnh khi gặp
điều kiện thích hợp. Lớp vỏ bọc được làm
bằng các loại polymer chúng có chứa chất
dinh dưỡng, có khả năng giữ ẩm, có độ cứng
thích hợp để bảo vệ phôi.
Các đặc điểm của hột nhân tạo.
+ Không có phôi nhũ
+ Có khả năng nẩy mầm giống hạt tự nhiên.

•
•
•
•
•
•

Hình 7: Hạt nhân tạo

+ Phôi của hạt nhân tạo là phôi vô tính.
+ Vỏ được cấu tạo bởi lớp cacbonhydrate tạo gel như alginade agar… và
các thành phần dinh dưỡng.
Mục đích của việc tạo hạt nhân tạo.
Có giá trị cạnh tranh do sản xuất tự động hóa.
Có thể sử dụng gieo trực tiếp trên đồng ruộng mà không cần giai đoạn thích
ứng.
Có thể bổ sung vào phần vỏ hạt các chất bảo vệ thực vật, các chất kích thích
sinh trưởng tạo điều kiện tốt khi hạt nảy mầm.
Dễ dàng bảo quản và vận chuyển.
Cây con giống nhau về mặt di truyền.
Phục phụ nhân giống cho cây có hạt không thể nẩy mầm, cây không có hạt
hoặc thực vật chuyển gen.
Quy trình nhân giống.

Phôi soma


PHẦN I: TỔNG QUAN
Nhân Giống

Chương 2: Các Phương Pháp
Phôi trưởng thành
Nhân sinh phôi
Tiêu chuẩn hóa phôi nhũ
Tạo vỏ bọc cho hạt
Làm khô hạt

Hạt nhân tạo

Tạo huyền phù phôi vô tính trong môi trường dinh dưỡng với mật độ phôi
vô tính thích hợp và bổ sung Na- alginate được làm tan trong nước với nồng độ
2-4 %
Dùng pipet (hoặc máy nhỏ giọt nhỏ 100-150 µl chứa một phôi soma vào
ding dịch CaCl2 (2-2,5%). Khi đó sẽ sinh ra phản ứng trao đổi ion Ca –Na và hạt
nhân được hình thành, có độ cứng thích hợp sau đó được đưa qua ngâm trong
nước để làm cứng hạt.
Dùng Ca- alginate thường hạt luôn luôn ẩm ướt bề mặt, hiện nay người ta
dùng một loại polymer Elvax 4260 để bao lớp alginate
Giai đoạn kế tiếp là làm khô hạt để hạt nhân tạo dễ dàng bảo quản và nẩy
mầm khi cần thiết. Kitto & Janick, đặt hạt nhân tạo của cây cà rốt trên khay có
chứa 25% polyoxyethylene để làm mất nước, và khi làm ướt hạt lại thì hạt được
tái sinh (hạt nẩy mầm) và phát triển thành cây hoàn chỉnh.
2.3.

Nhận xét.
Các phương pháp nhân giống in vitro đã thể hiễn rõ ưu điểm như: hệ số
nhân giống cao, cây con đồng nhất về mặt di truyền, kích thướng đồng đều,


PHẦN I: TỔNG QUAN
Nhân Giống

Chương 2: Các Phương Pháp

cây con sạch bệnh và ít bị nhiễm bệnh từ cây mẹ, phương pháp này được áp
dụng ở quy mô công nghiệp, giá thành giảm do chi phí lao động thấp. Tuy
nhiên, phương pháp này vẫn chưa đáp ứng một

PHẦN II
ỨNG DỤNG MỚI VÀO NHÂN GIỐNG


PHẦN I: TỔNG QUAN
Nhân Giống

Chương 2: Các Phương Pháp

LAN HỒ ĐIỆP
CHƯƠNG 3
BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY
NGẬP CHÌM TẠM THỜI TRONG NHÂN GIỒNG
LAN HỒ ĐIỆP LAI – PHALAENOPSIS HYBRID

3.1. Hệ thống ngập chìm.
3.1.1. Sơ lược.

Trước những yếu điểm của phương pháp nhân giống thực vật trên môi
trường thạch, lỏng và lỏng lắc, vào năm 1983 Harris và Mason đã thiết kế hai
hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời là hệ thống nuôi cấy nghiêng và hệ thống
Rocker. Ít lâu sau, vào năm 1985 Vandercook và Tisserat đã thiết kế một hệ
thống tự động APCS đây là hệ thống có thể thay thế được môi trường và có thể
sử dụng trong thời gian dài mà không cần cấy chuyền. Hiện nay đánh chú ý là
hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời RITA® của hãng Cirad Pháp, BIT® Twin
Flask của Cuba đã được khảo sát và nghiên cứu trên nhiều đối tượng khác
nhau.
Nguyên tắc vận hành hệ thống.
Tất cả các hệ thống này đều tuân theo những điều kiện được đề ra bởi

Teisson và cộng sự vào năm 1999.
+ Tránh sự ngập liên tục là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự hình thành
của mẫu cấy.
+ Cung cấp oxy đầy đủ.
+ Có thể thay đổi môi trường và điều kiển tự động
+ Hạn chế sự nhiễm.
+ Góp phần hạ giá thành sản phẩm.
Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đều phải tuân theo một
số nguyên tắc sau: Phải có khả năng tạo sự ngập chìm không liên tục mà theo
chu kỳ xác định. Các hệ thống phải có ngăn chứa môi trường riêng, có thể
chung một bình chứa nhưng có hai ngăn khác nhau, hay gồm một hệ thống
bình chứa môi trường nối với hệ thống mẫu bằng hệ thống dây dẫn và bơm
điều khiển.
Tóm lại hệ thống ngập chìm tạm thời thông thường có những bộ phận sau:
-Bơm hay máy nén khí tạo áp lực cao để hút từ ngăn chứa môi trường lên
ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại.
- Hệ thống cài đặt thời gian dùng điều khiển chu kỳ ngập chìm.
- Hệ thống ống dẫn và van điều khiển.