Theo dõi hàmlƣợng hoạt chất diterpenoit trong cây Khổ sâm cho lá (Crotontonkinensis Gagnep.,) họ Euphorbiaceae

1

MỞ ĐẦU
Theo thống kê số lượng các dược phẩm mới được phép lưu hành trong
20 năm vừa qua đã cho thấy, các hợp chất thiên nhiên đã và vẫn được coi là
nguồn cấu trúc mới để tạo ra các dược phẩm mới. Đặc biệt rõ ràng nhất
là trong lĩnh vực thuốc chống ung thư có tới 60%, trong bệnh truyền
nhiễm là
70% có nguồn gốc tự nhiên.
Ý nghĩa to lớn của những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học
là ở chỗ chúng không chỉ được sử dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh, mà
quan trọng hơn là chúng có thể là những chất mẫu, chất dẫn đường để
phát triển các thuốc mới hoặc là các chất dò sinh hoá để làm sáng tỏ các
nguyên lý của dược lý học con người.
Các nhà khoa học ở Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia Hoa Kỳ coi
kho tàng cây thuốc của Trung Quốc là nguồn khai thác các chất mẫu, chất
dẫn đường mới nhằm khám phá và phát triển các thuốc chống ung thư và
chống HIV trong tương lai. Những năm gần đây có nhiều cây thuốc cổ
truyền của y học Trung Quốc là đối tượng nghiên cứu thực nghiệm và lâm
sàng điều trị ung thư, qua đó đã và đang phát hiện ra hàng loạt chất mới,
nhiều chất rất có triển vọng trở thành những chất dẫn đường. Nhiều ent
-kauran d itecpenoit thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, gây độc hại tế bào,
chống khối u và anti -HIV. Đã có nhận xét rằng, hoạt chất ở một số cây
thuốc có tính kháng khuẩn, chống viêm, chống ung thư, hạ huyết áp, lợi
tiểu và thường có mặt các ent -kauran ditecpenoit.
Cây Khổ sâm cho lá thuộc loại cây thuốc dân gian Việt Nam. Cây
mọc hoang dại ở nhiều nơi trên miền Bắc Việt Nam, nhưng cũng được trồng
nhiều ở các trạm xá đông y, y tế xã và trong nhà dân, nhất là ở vùng đồng
bằng sông Hồng, vì được coi như nguồn thuốc tại chỗ để chữa các bệnh
viêm nhiễm,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái

Nguyên

-tnu.e du.v n


2

bệnh đường ruột cho người và gia súc. Nhân dân dùng lá tươi nhai sống, vò
hoặc giã nát vắt lấy nước uống chữa bệnh đau bụng đi ngoài, chữa các vết
thương nhiễm trùng, chữa viêm loét hành tá tràng, đau dạ dày, trị sốt rét.
Những kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học và thử hoạt tính sinh
học của lá cây Khổ sâm đã khẳng định tính kháng khuẩn mạnh được
quyết định bởi các ent -kauran d itecpen, đồng thời đã phát hiện tính gây
độc hại rất mạnh đối với một số dòng tế bào ung thư người và chế phẩm từ
cây Khổ sâm còn có hoạt tính chống suy giảm miễn dịch ở gà b ị nhiễm
virus (gây suy giảm miễn d ịch) Gumboro cường độc.
Chúng tô i cho rằng các ent -kauran từ cây Khổ sâm rất có triển vọng
là chất dẫn đường nhiều hứa hẹn để tạo ra các thuốc chống viêm, chống ung
thư và chống suy giảm miễn dịch có hiệu lực.
Để góp phần tìm hiểu và đánh giá chất lượng nguồn nguyên liệu phong
phú đang được sử dụng rộng rãi trong dân gian, đề tài: “Theo dõi hàm
lƣợng hoạt chất diterpenoit trong cây Khổ sâm cho lá (Croton
tonkinensis Gagnep.,) họ Euphorbiaceae” là nội dung chính của luận văn
này.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái
Nguyên

-tnu.e du.v n

3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Những loài cây thuộc chi Croton L., và công dụng trong y học
Các thực vật chi Croton L., thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) có
khoảng 700 loài [26], gặp phổ biến ở các vùng nhiệt đới, ít gặp ở vùng ôn
đới và rất hiếm ở vùng hàn đới. ở châu Á có khoảng 50 loài, r iêng ở Đông
dương có hơn 40 loài [35].
ở Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ chi Croton L. có 18 loài [1], còn
Nguyễn Nghĩa Thìn [13] đã thống kê được 41 loài, trong đó có tới 21 loài
đặc hữu trong hệ thực vật nước ta.
Có nhiều loài cây thuộc chi Croton L. được sử dụng trong y học
dân gian nhiều dân tộc, nhất là ở khu vực Trung và Nam Mỹ cũng như ở
Đông Nam Á.
Y học cổ truyền ở Brasil và các dân tộc sinh sống trong vùng Amazon
dùng lá, vỏ và rễ cây C. cajucara [36] để chữa trị nhiều loại bệnh như là
sốt cao, chống viêm nhiễm, ỉa chảy, viêm loét dạ dày, giảm cholestero l máu,
chữa ung thư, hạ huyết áp, diệt trừ ốc sên, xua đuổi côn trùng [37]. Nước sắc
rễ cây C. campestris ở Bras il được dùng để chữa bệnh giang mai, viêm
ống mật, thuốc sổ, trị ung thư [26].
ở Equađo người ta dùng vỏ cây C. eluteria chữa bệnh cao huyết áp,
kiết lỵ, sốt rét, đau dạ dày và còn có tác dụng bồi bổ sức khoẻ [45]. Nhân
dân các nước vùng Trung và Nam Mỹ như Peru, Equađo dùng nhựa và
vỏ cây C.lechlerii có tính kháng sinh để chữa các vết thương, trị ung thư
[27]. Nước sắc lá cây C. schiedeanus được y học dân gian Columb ia chữa
bệnh cao huyết áp, có tác dụng giãn mạch [29].
Rễ cây C. macrostachys ở Tanzania được dùng để chữa bệnh tiểu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái

Nguyên

-tnu.e du.v n


4

đường [27]. Một số nước ở vùng Đông Phi (Camơrun, Nigeria, S iraleon
v.v..) dùng rễ và vỏ thân cây C. zambicus làm thuốc nhuận tràng, trị kiết
lỵ và chống co giật [39].
ở Thái Lan người ta dùng vỏ, rễ cây cũng như quả của cây
C. oblongifolius để chữa bệnh rối loạn tiêu hoá, kiết lỵ, loét dạ dày, trị ung
thư [44] hoặc dùng cây C. sublyratus [33] để trị loét hành tá tràng.
ở nước ta cũng có một vài loài thuộc chi Croton L., được dùng trong
y học dân gian. Cây Lơpơté (C. crassifolium) ở Tây Nguyên được dùng để
trị bệnh đường ruột [13], cây Khổ sâm cho lá (C. tonkinensis) trị sốt rét,
bệnh đường ruột [2], [12].
Bên cạnh những cây được dùng làm thuốc trong y học dân gian,
người ta cũng biết một số cây thuộc chi Croton L., có chứa độc tố. ở châu
Phi có nhiều Croton spp thuộc loại cây độc, được thổ dân sử dụng trong
đánh bắt cá, tẩm tên độc trong săn bắn như vỏ cây C. hovarum ở Madagasca
là một thí dụ [34]. ở Việt Nam có nói đến cây Ba đậu (C. tiglium) [3] là cây
độc, dùng làm thuốc trừ sâu thảo mộc.
1.2. Những nghiên cứu hoá thực vật về chi Croton
L.,
Cho đến nay có khoảng trên 50 loài thực vật chi Croton L., được
nghiên cứu hoá thực vật [28], đã phân lập và nhận dạng được 271 chất, chủ
yếu gồm các ditecpenoit và ancaloit.
1.2.1. Các ancaloit
Các ancaloit tìm thấy trong thực vật chi Croton L., đều có chứa dị

vòng cơ bản là isoquinolin [41], tạo ra các bộ khung proaporphin (1),
aporphin

(2),

morphinandienon

(3)

và

rất

gần

đây

là

berbin

(tetrahydroprotoberberin) (4).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái
Nguyên

-tnu.e du.v n


5

1.2.1.1. Ancaloit khung proaporphin (1)
3

4

2

5

1

NH

6

8
13
9
10

11

6a

H

7
12

O

(1)
Các ancaloit kiểu khung proaporphin (1) khác nhau bởi các nhóm thế
ở các vị trí 1, 2, 6 và cấu hình của hydro ở vị trí 6a.
1.2.1.2. Ancaloit khung aporphin (2)
Các ancaloit khung aporphin (2) thường khác biệt nhau bởi nhóm thế
ở các vị trí 1, 2, 6, 9, 10, 11 và cấu hình hydro ở vị trí 6a.
4

3

5

2
1

N6

6a

H
7

11
10

8
9

(2)
1.2.1.3. Ancaloit khung morphinandienon
2
3

1
12
13

5
6

C
7

10

B
14
15

9

D N

8

17

16

O

(3)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái
Nguyên

-tnu.e du.v n


6

Các ancaloit khung morphinand ienon (3) khác biệt nhau bởi các
nhóm thế ở vị trí 2, 3, 4, 6, 8, 17 và cấu hình của vòng D.
1.2.1.4. Ancaloit khung berbin (tetrahydroprotoberberin) (4)
R2
R1

4

5
6

N
1

14

H

8

R3
9

13

R4

10

12

R5
R6

(4)
Các berbin (4) hay tetrahydroprotoberberin ancalo it là những
ancalo it mới phát hiện rất gần đây trong hai loài thực vật chi Croton L.,
các ancaloit này khác nhau bởi các nhóm thế gắn vào các vị trí 2, 3, 8, 10,
11 và cấu hình của proton ở vị trí C14.
1.2.2. Các hợp chất ditecpenoit
Các ditecpenoit chiếm tới 114/271 kiểu hợp chất đã phân lập và nhận
dạng được từ các loài thuộc chi Croton [28]. Cách gọi tên và cấu trúc hoá
học của chúng rất đa dạng, từ loại khung không vòng cho đến khung đa vòng
giáp nhau.
Kiểu không vòng như phytan (5) (2,6,10,14-tetrametylhexadecan), loại
một vòng lớn như cembran (6) (18,19,20-trimetyl-1-isopropylcyclotridecan).
Kiểu hai vòng giáp nhau như labdan (7), clerodan (8). Ba vòng giáp nhau

như pimaran (9), kauran (10), beyeran (11). Kiểu 4 vòng giáp nhau như
atisan (12), sarcopetelan (13), phorbol (14). Năm vòng như trachyloban (15).
1.2.2.1. Ditecpen không vòng
Phytan thuộc loại d itecpen không vòng, có cấu trúc hoá học
2,6,10,14- tetrametylhexadecan (5).


(5)
Các ditecpen loại này khác nhau bởi số lượng, vị trí và cấu hình các
nhóm hydroxy, xeton và olefin.
1.2.2.2. Ditecpen vòng lớn Cembran (6)
Cembran thuộc loại d itecpenoit một vòng lớn chung có cấu trúc hoá
học
4,8,12-trimetyl-1-isopropyl-cyclotridecan khác nhau bở i số lượng, vị trí
và cấu hình của liên kết olefin.
18
5
6

7
19

4
3

17

2
15

8

1
9

10

13

11

16

14

12
20

(6)
1.2.2.3. Ditecpen 2 vòng
1.2.2.3.1. Khung labdan (7)
12
20

13

11

15
16

1

17

9

2

8

10

3

4

7

5
6

19

14

18

(7)

1.2.2.3.2. Clerodan ditecpen (furanoditecpen)
Các hợp chất ditecpen khung clerodan gặp rất phổ biến trong
thiên nhiên, chỉ riêng chi Croton L. đến nay đã phân lập được 42 trong số
114 ditecpenoit từ những thực vật này. ở vị trí 15, 16 của hầu hết các
clerodan ditecpen đóng vòng epoxy để hình thành vòng furan, nên các
ditecpenoit loại
này còn được gọi là furanoditecpen.
12
11
1

10

2
3

20
9

5

4

13

14

15

16
17

8
7

19 6

18

(8)
1.2.2.4. Ditecpen có 3 vòng dính kết (pimaran)
Các loài thuộc chi Croton L. được nghiên cứu, mới chỉ thấy kiểu
khung
pimaran (9).
12 17 15
20

1
2
3
18

4

10
5
19

11

13

9

16
14

8
7

6

(9)
1.2.2.5. Ditecpen 4 vòng dính kết
Thường gặp các kiểu khung kauran (10), beyeran (11), atisan
(12), sarcopetelan (13) và phorbol (14) ditecpen.
1.2.2.5.1. Kauran ditecpen


12
13
11

20

17

1
8

10

3

4

HOOC

16

14

9

2

7

5

O

15

O

6
18

19

(10)

(10.13)
8,15-seco-kauran

1.2.2.5.2. Các ditecpen kiểu khung beyeran (11), atisan (12)
và
sarcopetelan (13)
Các kiểu cấu trúc (11) và (12) thường gặp trong nhiều họ thực
vật, nhưng chỉ rất gần đây mới phát hiện thấy trong cây Croton
sarcopetalus và cũng đồng thời khám phá ra kiểu khung sarcopetelan
ditecpen (13). Điều đáng chú ý là trong rễ cây này còn tìm thấy các dẫn
xuất của clerodan (8) và
pimaran (9) ditecpen.
12
12
11
1
9

3

10
4

1

16

10

8

3

15

15
9

2

4

8

6
18

19

19

(11)

(12)
O
1

2
3
18

4

20
10
5
19

11
9

12

16
8
7

6

O
13

14

15
17

(13)

13
7

5

6
18

17

20
14

7

5

16

11

13

20
2

17

14


1.2.2.5.3. Phorbol ditecpen
R1O
18

19

3
O

4

16

8

10

2

17

15

14

9

1

OR2

12
13

11

OH

7

5

20
CH2OR3

6

HO

(14)
Các phorbol ditecpen có cấu trúc hoá học 4,9 ,12 ,13 ,20pentahydroxy-1,6-tigliadien-3-one, chúng chỉ khác nhau về cấu hình
của nhóm hydroxyl ở vị trí 4 và các nhóm chức khác, cho đến nay mới chỉ
gặp duy nhất một cấu hình 4 của phorbol, còn hầu hết là cấu hình 4 .
1.2.2.6. Ditecpen 5 vòng dính kết (trachyloban)
Các dẫn xuất của trachyloban thuộc loại 5 vòng dính kết.
12
11

1
2
3
18

4

20
10
5
19

9

13
14
8

17
16
15

7
6

(15)
1.2.3. Các hợp chất khác
Thường gặp một số hợp chất tritecpenoit như là 3 -acetoxy-14taraxeren-28-oic acid (16.a) [32, 34, 36, 41], 3 -O-axetoaxetyl-20(29)-lupeol
(16.b) [28]. Các hợp chất steroit (17) glucosid như là 3 , 14 ,15 ,16
- tetrahydroxypregnan-20-one glucosid (17.1) và (17.2) trong cây C.

ruizianus [43].


COOH

AcO

CH3CO-CH2CO

(16.a)

(16.b)
O
OH

OH
RO

OH

H

(17)

MeO
N

O

O

(Me)2

N
O

O

O
NH

O

O
OMe

(18)

(19)

Ngoài những nhóm chất điển hình nêu trên, trong các thực vật chi
Croton rất thường gặp taspin (18), nhưng chỉ xuất hiện ở nhựa cây tiết ra
tại nơi b ị thương tổn do yếu tố ngoại lai [38], Julocrotine (19) là những
ancalo it khá đặc biệt và gây độc tế bào [40].


1.3. Những nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng của cây Khổ
sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.,)
1.3.1. Giới thiệu cây khổ sâm
Cây Khổ sâm cho lá có tên khoa học là Croton tonkinensis Gagnep.,

họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) [1, 2], thuộc loại cây nhỏ, cao khoảng 0,72,0m, mọc thành bụi, lá mọc so le, nhìn gần như đối nhau, có khi mọc
thành vòng giả có từ 3 đến 6 lá. Lá có hình mũi mác, cả 2 mặt đều có lông
óng ánh như lá cây nhót. ở mặt dưới lá có 3 gân toả ra từ cuống, lá có tuyền
hoa nhỏ, trắng, mọc thành chùm ở kẽ lá hay đầu cành. Hoa đơn tính cùng
gốc, quả có 3 mảnh vỏ hạt hình trứng, màu đỏ. Mùa ra hoa kết quả khoảng từ
tháng 5 đến tháng 8.
1.3.2. Tác dụng của cây khổ sâm
Cây Khổ sâm cho lá mọc hoang dại ở nhiều nơi trên miền Bắc
Việt Nam, nên có nhiều tên gọ i khác nhau như là Cổ sâm, Sâm nam, ở
vùng Tây Thiên, Tam Đảo, Vĩnh Phúc nhân dân gọi là cây kẻ chỉ. Thường
gặp nhiều ở các vùng Ninh Bình, Hoà Bình, Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Bắc
Giang, Thanh Hoá [6]. Hiện nay, cây khổ sâm được trồng nhiều ở các trạm
xá đông y, y tế xã và nhà dân. Cây này thuộc loại cây thuốc dân gian,
chữa được một số bệnh, nhất là bệnh đường ruột cho người và gia súc.
Nhân dân dùng lá tươi nhai sống, vò hoặc giã nát để lấy nước uống chữa
bệnh đau bụng, đ i ngoài, phụ nữ b ị bệnh hậu sản, lở loét người ngoài da,
chữa các vết thương nhiễm trùng, chữa viêm loét hành tá tràng, đau dạ dày,
trị sốt rét. ở Hưng Yên, nhân dân dùng cành, lá khô đem sao vàng, sắc lấy
nước uống để chữa bệnh tê thấp.
Gần đây những kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học và thử hoạt
tính sinh học của cây Khổ sâm đã khẳng định tính kháng khuẩn mạnh được
quyết định bởi các ent -kauran d itecpen, đồng thời đã phát hiện tính gây
độc hại rất mạnh đối với một số dòng tế bào ung thư người [4] và chế phẩm


từ cây


13

Khổ sâm còn có hoạt tính chống suy giảm miễn dịch ở gà b ị nhiễm virus
(gây suy giảm miễn dịch) Gumboro cường độc [10].
1.3.3. Những nghiên cứu về thành phần hoá học cây Khổ sâm
Những nghiên cứu hoá học về cây khổ sâm đã cho biết thành
phần trong đó rất phong phú và đa dạng bao gồm nhiều nhóm chất khác
nhau như: steroit, tritecpenoit, flavonoit, ancaloit, và d itecpenoit [4].
1.3.3.1. Các ditecpenoit
Cho đến nay đã biết 13 ent -kauran ditecpen phân lập được từ cây
Khổ sâm (Croton tonkinensis) hầu hết chúng là chất mới thuộc dẫn xuất
hydroxy của bộ khung ent -kauran-16-ent-15-on.
Theo qui tắc IUPAC, chúng tô i đề nghị gọi tên các ent -kauran này
là crotonkin kèm theo thứ tự phân lập (bảng 1.1), cấu trúc hoá học và một
vài đặc tính vật lý của chúng (bảng 1.2).
B ả ng 1. 1 : Các ent -kauran phân lập đƣợc từ Croton tonkinensis
Gagnep.,
Thứ
Tên chất
tự
1 Crotonkin-1

2

Crotonkin-2

3

Crotonkin-3

4

Crotonkin-4

CTPT

Tên khoa học

C22H32O4 ent-18-axetoxy-7 hydroxykaur-16-en15-on
C22H32O5 ent-1a-axetoxy7 ,14adihydroxykaur-16en-15-on
C22H34O4 ent-16(S)-18axetoxy-7 hydroxykaur-15-on
C20H30O3 ent-7 ,14adihydroxykaur-16en-15-on

Thời gian
công bố
25/10/1999
13/2/2003

Tài
liệu
14,16

10/11/2002
28/3/2003

15,18

13/02/2003
01/3/2004

16,20

9/7/1998
28/3/2003

17,18


14

C22H32O5 ent-18a-axetoxy7a,14 dihydroxykaur-16en-15-on
C20H30O3 ent-7 ,18dihydroxykaur-16en-15-on
C24H34O6 ent-1a,14adiacetoxy-7 hydroxykaur-16-en15-on
C24H34O6 ent-1a,7 -diacetoxy14a -hydroxykaur16-en-15-on
C22H32O4 ent-18-axetoxy-14ahydroxykaur-16-en15-on
C22H32O5 ent-11a -axetoxy7 ,14adihydroxykaur-16en-15-on

5

Crotonkin-5

6

Crotonkin-6

7

Crotonkin-7

8

Crotonkin-8

9

Crotonkin-9

10

Crotonkin-10

11

Crotonkin-11

C20H28O3

12

Crotonkin-12

C20H32O

13

Crotonkin-13

C26H36O7

28/03/2003

18

09/9/2003

19

01/03/2004

20

01/03/2004

20

01/03/2004

20

Chem.
21,24
Pharm.Bull.
2002,50, 808813.
29/12/2004.
ent-kaur-16-en-15Phytochem.
22,24
on-18-oic acid
1973, 12,
2712-2723.
29/12/2004.
ent-18- hydroxykaur- Phytochem.
23,24

16-en
1988, 27,
3209-3212.
29/12/2004
ent-1a,7 ,14a2007
triacetoxykaur-16en-15-on


15
R1
R5

R4
R3 O

R2-H2C

B ả ng 1. 2 : Cấu trúc hoá học và đặc tính vật lý của các Crotonkin
từ cây Croton tonkinensis Gagnep.,
Th

R1

ứ tự

R2

R3

R4

o

R5

M

m p( C)

Rt
(phút)

1

H

OAc

OH

H

=CH2

360

142-143

23.9

2

OAc

H

OH

OH

=CH2

376

97-98

21.6

3

H

OAc

H

OH

CH3

362

177-179

22.43

4

H

H

OH

OH

=CH2

318

210-212

22.63

5

H

OAc

OH

OH

=CH2

376

6

H

OH

OH

H

=CH2

318

7

OAc

H

OH

OAc

=CH2

418

22.64

8

OAc

H

OAc

OH

=CH2

418

23.01

9

H

OAc

H

OH

=CH2

360

10

11-OAc

H

OH

OH

=CH2

376

11

H

COOH

H

H

=CH2

316

12

H

OH

H

H

=CH2

288

13

OAc

H

OAc

OAc

=CH2

460

21.39
155-156

1.3.3.2. Các ancaloit
Những nghiên cứu về thành phần ancalo it từ cây Khổ sâm cho biết
đã phân lập và nhận dạng được 6 ancaloit với bộ khung rất phong phú đó là
các berbin
protoberberin

ancalo it

(corytenchin,

corytenchirin

[4],

[6],


(dehydrocorytenchin) [7], benzyltetrahydroisoquinolin (laudanid in) [7]
và aporphin ancalo it (corunnin, oxoglaucin) [9].
B ả ng 1. 3 : Ancaloit khung berbin
Berbin

TT

R

Tên chất

1

H

Corytenchin

[M+H]

+

H3CO
H3CO

H

N

342

R

2

OCH3

CH3 Corytenchirin

356

OH

B ả ng 1. 4 : Ancaloit khung protoberberin
Protobe rberin

TT

R

Tên chất

[M+H]

H3CO
N+

H3CO

3

OH Dehydrocorytenchin

338

OCH3
R

B ả ng 1. 5 : Ancaloit khung Benzyltetrahydroisoquinolin
Benzylte trahydroisoquinolin

TT

Tên chất

[M+H]

H3CO
H3CO

N

CH3

4
OH
OCH3

(+)-laudanid in

344

+

+

B ả ng 1. 6 : Ancaloit khung Aporphin
Aporphi n

TT

R1

5

O-

R2

R3

Tên chất

[M+H]

+

H3CO
N

R1

R3

6

CH3O

OCH3 CH3 Corunnin

OCH3 OCH3

352

Oxoglauc in 352

R2

1.3.3.3. Các flavonoit
Một vài flavonoit đã phân lập được từ cây Khổ sâm (C. tonkinensis)
,

đó là kaempfero l hay 3,4 ,5,7-tetrahydroxyflavon, vitexin hay apigenin-8C-D- glucopyranosid, và isovitexin hay ap igenin -6C- -D-glucopyranosid
[4], [8]. Kaemperol là một trong những flavono l gặp rất phổ biến trong
giới thực vật, có hoạt tính chống viêm nhiễm, lợi tiểu, chống oxy hoá [28].
Trong y học cổ truyền Việt nam, người ta đã phát hiện chất giải độc chính
là vitexin [4], và vitexin thể hiện hoạt tính yếu với nấm mốc Aspergillius
niger ngoài ra không
có hoạt tính nào khác, còn isovitexin thì không có hoạt tính.
2'

8

HO

9

O

2
1'

6
5

OH

10

4

4'
6'

OH

O

Kaempferol

OH


HO
OH
3''

6''
5''

OH

HO
1''

O

OH

O

HO

OH

O

HO
OH

HO
HO

O

OH

OH O

OH O

Vitexin hay

Isovitexin hay

apigenin-8C- -Dglucopyranosid

apigenin-6C- -Dglucopyranosid

1.3.3.4. Các tritecpenoit
Hai hợp chất tritecpenoit được phát hiện từ cây Khổ sâm đó là Amyrin axetat (urs-12-en-3 -yl axetat) và Axetyl aleurito lic
axit (3 hydroxytaraxer-14-en-28-oic axit)
[5].

COOH

AcO

AcO

-Amyrin axetat

Axetyl aleurito lic axit

1.3.3.5. Các steroit
Nhóm chất steroit tìm thấy trong các dịch chiết từ các bộ phận

khác nhau của cây Khổ sâm cho lá, chủ yếu thuộc loại stero l C29 với bộ
khung 3 - ol,

5

-pregnan, có mạch nhánh với cấu hình và cấu dạng khác


nhau. Đó là các


-sitosterol, poriferasterol, -sitosterol-3-O- -D-glucopyranosyl, -sitosterol
với stigmasterol [4].
21
12

18

R2
20
17

19
10
3
R1O

8

14

15

5

B ả ng 1. 7 : Các steroit khung sterol
R1

R2
29

-sitosterol

H

22
24

poriferastero l

-sitosterol-3-O- -D-glucopyranosyl

H

C6H12O5

1.4. Áp dụng phƣơng pháp LC /MS trong phân tích các chất
Việc sử dụng cây cỏ làm thuốc đóng vai trò quan trọng và có hiệu
quả trong sức khỏe cộng đồng. Đó là những nguồn gốc thiên nhiên với thành
phần hoạt chất rất nhỏ trong cây cỏ thực vật được sử dụng có hiệu quả

trong các bệnh viện y học cổ truyền. Theo đó để đảm bảo tính ổn định
cũng như hiệu quả sử dụng cây cỏ trong việc khám chữa bệnh, cần có hệ
thống đánh giá chất lượng các dược phẩm. Có nhiều phương pháp áp dụng
để kiểm tra chất lượng


đó là xác định hoạt chất toàn phần hoặc từng thành phần. Đơn giản hơn cả
là phương pháp định lượng để xác định .
Việc phân tích các ditecpenoit thành phần trong hỗn hợp là nhiệm
vụ
khó khăn và phức tạp, vì chúng thường là những chất đồng phân có nhiều
tính chất hoá lý rất gần nhau. Nghiên cứu xác định đ ịnh tính và định
lượng các hỗn hợp phức tạp như vậy thường phải dùng các phương pháp
sắc ký như là sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng phân giải cao và đặc biệt gần
đây phổ biến là các kỹ thuật của sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS).
Phương pháp HPLC - DAD-ESI/MS là một công cụ phân tích nhanh để
xác định thành phần hóa học trong cây cỏ thực vật . Nó được kết hợp giữa
kỹ thuật HPLC, đặc trưng phổ UV, và bộ phận cung cấp thông tin về khố
i lượng phân tử (ESI/-MS) được sử dụng để phân tích hỗn hợp các chất
phức tạp trong cây cỏ so sánh với với chất chuẩn hoặc là thời gian lưu. Và
cuối cùng những công bố về việc sử dụng kỹ thuật HPLC -DAD-ESI/MS
đã đánh dấu một bước phát triển trong việc phân tích thành phần phức tạp ở
các phân đoạn dịch chiết thô từ cây cỏ thiên nhiên [30], [31]. Người ta
thường sử dụng kỹ thuật này để phân tích những thành phần phức tạp
trong các dịch chiết thu được từ thực vật.
1.4.1. Nguyên tắc chung của phương pháp sắc ký lỏng cao áp
(HPLC).
Sắc

ký

lỏng

cao

áp

(HPLC

-

High

Performance

Liquid

Chromatography) là một kỹ thuật phân tách vật lý hai hay nhiều cấu tử
trong một hỗn hợp, có thể dùng để phân tích các phân tử hoặc ion hữu cơ.
Như vậy, độ tinh khiết của nhiều hợp chất hữu cơ có thể được đánh giá bằng
phương pháp HPLC. Kỹ thuật bao gồm một pha rắn cố định (pha tĩnh) được
nhồi vào một cột thép không rỉ và một pha lỏng di động (p ha động) chạy
qua. Việc phân tách các cấu tử trong dung dịch được thực hiện là nhờ sự
khác nhau về tỷ số phân bố của các chất tan giữa hai pha. Phương pháp
HPLC, dựa trên các cơ chế của hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc


kích cỡ (exclusion gel

21

permeation) tuỳ thuộc vào kiểu pha tĩnh đem sử dụng.
Cấu hình thiết bị của HPLC bao gồm: hệ thống bơm, van bơm mẫu,
cột sắc ký, đầu dò (detector) và hệ thống sử lý, ghi sắc ký đồ (máy tính).
Sơ đồ 1.1: Hệ thống sắc ký lỏng phân giải cao.

HPLC

Pump

Stationary and

Mobile
phase

Mobile phase

Liquid

<400 bar

Injector
<400 l

1 ml/min

Data
evaluation

Detector
light detector

Column
Oven
<1000 C

Cấu tạo của hệ thống bơm đảm bảo việc duy trì tốc độ dòng của
pha động không thay đổi. Thiết kế của hệ thống van bơm mẫu đảm bảo việc
đưa mẫu phân tích vào cột có thể thao tác ở áp suất cao không phải ngắt
dòng.
Cột sắc ký dùng trong HPLC có thể thuộc một trong các kiểu phân
tách dưới đây:
- Cột pha thƣờng: sự phân tách dựa trên sự khác nhau về tính hấp
phụ của pha tĩnh, vật liệu được sử dụng thường là hạt silica có bề mặt
phân cực gây ra bởi các nhóm silanol (-Si-OH).
- Cột pha đảo: sự phân tách dựa trên nguyên lý phân bố các phân tử
chất tan giữa pha động và pha tĩnh, trong đó pha tĩnh có bề mặt không
phân


22

cực. Vật liệu thường dùng là các hạt silica được biến tính hóa học thông
qua phản ứng của nhóm silano l với các nhóm chức khách nhau và thường
là:
Octa

-Si-(CH2)7CH3

C8

Octadecyl

-Si-(CH2)17CH3

C18

Phenyl

-Si-(C6H5)2

C6H5

Cyanopropyl

-Si-(CH2)3CN

CN

Aminopropyl

-Si-(CH2)3 NH2

NH2

- Cột trao đổi ion: sự phân tách dựa trên tương tác tĩnh điện giữa các
phân tử chất tan mang đ iện tích với pha tĩnh. Vật liệu để nhồ i cột là nhựa
trao
đổi ion (cationit hoặc anionit) dùng làm pha tĩnh.

- Cột sắc ký gel (size exc lusion) : pha tĩnh là các hạt polime có các
lỗ hổng khác nhau. Sự phân tách được thực hiện là nhờ sự khuyếch tán của
phân tử chất tan vào pha tĩnh, các phân tử có kích thước nhỏ dễ dàng vượt
qua pha tĩnh và bị rửa giải chậm hơn các phân tử có kích thước lớn.
Vì yêu cầu phân tách, vật liệu nhồ i cột dùng làm pha tĩnh trong
HPLC thường dùng là các hạt có kích thước nằm trong khoảng 5 đến 10 m
có dạng hình cầu hoặc bất kỳ và cột thường dùng là thép không gỉ, có
đường kính trung bình vào khoảng 2 đến 5mm, chiều cao dài 50 - 300mm.
Một cách lý tưởng, nhiệt độ của pha động và cột phải giữ ổn định trong
suốt quá trình phân tách. Cũng như vậy, nhiệt độ của pha động thoát ra
khỏ i cột cũng phải tương đương với nhiệt độ của đầu dò.
Khi cột đã được lựa chọn thì thành công của việc phân tách tuỳ
thuộc vào thành phần pha động, đặc biệt là trong trường hợp sắc ký đẳng
dòng.
Trong cột tách luôn luôn xảy ra sự cạnh tranh giữa độ tan của chất