Theo dõi hàm lượng hoạt chất diterpenoit trong cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis, Gagnep., ) họ Euphorbiaceae

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1
MỞ ĐẦU

Theo thống kê số lượng các dược phẩm mới được phép lưu hành trong
20 năm vừa qua đã cho thấy, các hợp chất thiên nhiên đã và vẫn được coi là
nguồn cấu trúc mới để tạo ra các dược phẩm mới. Đặc biệt rõ ràng nhất là
trong lĩnh vực thuốc chống ung thư có tới 60%, trong bệnh truyền nhiễm là
70% có nguồn gốc tự nhiên.
Ý nghĩa to lớn của những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học là
ở chỗ chúng không chỉ được sử dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh, mà quan
trọng hơn là chúng có thể là những chất mẫu, chất dẫn đường để phát triển
các thuốc mới hoặc là các chất dò sinh hoá để làm sáng tỏ các nguyên lý của
dược lý học con người.
Các nhà khoa học ở Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia Hoa Kỳ coi kho
tàng cây thuốc của Trung Quốc là nguồn khai thác các chất mẫu, chất dẫn
đường mới nhằm khám phá và phát triển các thuốc chống ung thư và chống
HIV trong tương lai. Những năm gần đây có nhiều cây thuốc cổ truyền của y
học Trung Quốc là đối tượng nghiên cứu thực nghiệm và lâm sàng điều trị
ung thư, qua đó đã và đang phát hiện ra hàng loạt chất mới, nhiều chất rất có
triển vọng trở thành những chất dẫn đường. Nhiều ent -kauran ditecpenoit thể
hiện hoạt tính kháng khuẩn, gây độc hại tế bào, chống khối u và anti -HIV. Đã
có nhận xét rằng, hoạt chất ở một số cây thuốc có tính kháng khuẩn, chống
viêm, chống ung thư, hạ huyết áp, lợi tiểu và thường có mặt các ent -kauran
ditecpenoit.
Cây Khổ sâm cho lá thuộc loại cây thuốc dân gian Việt Nam. Cây mọc
hoang dại ở nhiều nơi trên miền Bắc Việt Nam, nhưng cũng được trồng nhiều
ở các trạm xá đông y, y tế xã và trong nhà dân, nhất là ở vùng đồng bằng sông
Hồng, vì được coi như nguồn thuốc tại chỗ để chữa các bệnh viêm nhiễm,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2
bệnh đường ruột cho người và gia súc. Nhân dân dùng lá tươi nhai sống, vò
hoặc giã nát vắt lấy nước uống chữa bệnh đau bụng đi ngoài, chữa các vết
thương nhiễm trùng, chữa viêm loét hành tá tràng, đau dạ dày, trị sốt rét.
Những kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học và thử hoạt tính sinh
học của lá cây Khổ sâm đã khẳng định tính kháng khuẩn mạnh được quyết
định bởi các ent -kauran ditecpen, đồng thời đã phát hiện tính gây độc hại rất
mạnh đối với một số dòng tế bào ung thư người và chế phẩm từ cây Khổ sâm
còn có hoạt tính chống suy giảm miễn dịch ở gà bị nhiễm virus (gây suy giảm
miễn dịch) Gumboro cường độc.
Chúng tôi cho rằng các ent -kauran từ cây Khổ sâm rất có triển vọng là
chất dẫn đường nhiều hứa hẹn để tạo ra các thuốc chống viêm, chống ung thư
và chống suy giảm miễn dịch có hiệu lực.
Để góp phần tìm hiểu và đánh giá chất lượng nguồn nguyên liệu phong
phú đang được sử dụng rộng rãi trong dân gian, đề tài: “Theo dõi hàm lƣợng
hoạt chất diterpenoit trong cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis
Gagnep.,) họ Euphorbiaceae” là nội dung chính của luận văn này.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Những loài cây thuộc chi Croton L., và công dụng trong y học
Các thực vật chi Croton L., thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) có
khoảng 700 loài [26], gặp phổ biến ở các vùng nhiệt đới, ít gặp ở vùng ôn đới
và rất hiếm ở vùng hàn đới. ở châu Á có khoảng 50 loài, riêng ở Đông dương
có hơn 40 loài [35].
ở Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ chi Croton L. có 18 loài [1], còn
Nguyễn Nghĩa Thìn [13] đã thống kê được 41 loài, trong đó có tới 21 loài đặc
hữu trong hệ thực vật nước ta.
Có nhiều loài cây thuộc chi Croton L. được sử dụng trong y học dân
gian nhiều dân tộc, nhất là ở khu vực Trung và Nam Mỹ cũng như ở Đông
Nam Á.
Y học cổ truyền ở Brasil và các dân tộc sinh sống trong vùng Amazon
dùng lá, vỏ và rễ cây C. cajucara [36] để chữa trị nhiều loại bệnh như là sốt
cao, chống viêm nhiễm, ỉa chảy, viêm loét dạ dày, giảm cholesterol máu, chữa
ung thư, hạ huyết áp, diệt trừ ốc sên, xua đuổi côn trùng [37]. Nước sắc rễ cây
C. campestris ở Brasil được dùng để chữa bệnh giang mai, viêm ống mật,
thuốc sổ, trị ung thư [26].
ở Equađo người ta dùng vỏ cây C. eluteria chữa bệnh cao huyết áp, kiết
lỵ, sốt rét, đau dạ dày và còn có tác dụng bồi bổ sức khoẻ [45]. Nhân dân các
nước vùng Trung và Nam Mỹ như Peru, Equađo dùng nhựa và vỏ cây
C.lechlerii có tính kháng sinh để chữa các vết thương, trị ung thư [27]. Nước

sắc lá cây C. schiedeanus được y học dân gian Columbia chữa bệnh cao huyết
áp, có tác dụng giãn mạch [29].
Rễ cây C. macrostachys ở Tanzania được dùng để chữa bệnh tiểu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
4
đường [27]. Một số nước ở vùng Đông Phi (Camơrun, Nigeria, Siraleon v.v..)
dùng rễ và vỏ thân cây C. zambicus làm thuốc nhuận tràng, trị kiết lỵ và
chống co giật [39].
ở Thái Lan người ta dùng vỏ, rễ cây cũng như quả của cây C.
oblongifolius để chữa bệnh rối loạn tiêu hoá, kiết lỵ, loét dạ dày, trị ung thư
[44] hoặc dùng cây C. sublyratus [33] để trị loét hành tá tràng.
ở nước ta cũng có một vài loài thuộc chi Croton L., được dùng trong y
học dân gian. Cây Lơpơté (C. crassifolium) ở Tây Nguyên được dùng để trị
bệnh đường ruột [13], cây Khổ sâm cho lá (C. tonkinensis) trị sốt rét, bệnh
đường ruột [2], [12].
Bên cạnh những cây được dùng làm thuốc trong y học dân gian, người
ta cũng biết một số cây thuộc chi Croton L., có chứa độc tố. ở châu Phi có
nhiều Croton spp thuộc loại cây độc, được thổ dân sử dụng trong đánh bắt cá,
tẩm tên độc trong săn bắn như vỏ cây C. hovarum ở Madagasca là một thí dụ
[34]. ở Việt Nam có nói đến cây Ba đậu (C. tiglium) [3] là cây độc, dùng làm
thuốc trừ sâu thảo mộc.
1.2. Những nghiên cứu hoá thực vật về chi Croton L.,
Cho đến nay có khoảng trên 50 loài thực vật chi Croton L., được nghiên
cứu hoá thực vật [28], đã phân lập và nhận dạng được 271 chất, chủ yếu gồm
các ditecpenoit và ancaloit.
1.2.1. Các ancaloit
Các ancaloit tìm thấy trong thực vật chi Croton L., đều có chứa dị vòng
cơ bản là isoquinolin [41], tạo ra các bộ khung proaporphin (1), aporphin (2),
morphinandienon (3) và rất gần đây là berbin (tetrahydroprotoberberin) (4).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
5
1.2.1.1. Ancaloit khung proaporphin (1)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
13
11
12
NH
O
H
6a

(1)
Các ancaloit kiểu khung proaporphin (1) khác nhau bởi các nhóm thế ở
các vị trí 1, 2, 6 và cấu hình của hydro ở vị trí 6a.
1.2.1.2. Ancaloit khung aporphin (2)
Các ancaloit khung aporphin (2) thường khác biệt nhau bởi nhóm thế ở
các vị trí 1, 2, 6, 9, 10, 11 và cấu hình hydro ở vị trí 6a.
N

H
1
2
3
4
5
6
7
8
6a
9
10
11

(2)
1.2.1.3. Ancaloit khung morphinandienon
O
N
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

13
14
15
16
17
A
B
C
D

(3)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
6
Các ancaloit khung morphinandienon (3) khác biệt nhau bởi các nhóm
thế ở vị trí 2, 3, 4, 6, 8, 17 và cấu hình của vòng D.
1.2.1.4. Ancaloit khung berbin (tetrahydroprotoberberin) (4)
N
R
6
R
5
R
4
R
3
R
1
R
2

H
1
4 5
6
14
13
8
9
10
12

(4)
Các berbin (4) hay tetrahydroprotoberberin ancaloit là những ancaloit
mới phát hiện rất gần đây trong hai loài thực vật chi Croton L., các ancaloit
này khác nhau bởi các nhóm thế gắn vào các vị trí 2, 3, 8, 10, 11 và cấu hình
của proton ở vị trí C14.
1.2.2. Các hợp chất ditecpenoit
Các ditecpenoit chiếm tới 114/271 kiểu hợp chất đã phân lập và nhận
dạng được từ các loài thuộc chi Croton [28]. Cách gọi tên và cấu trúc hoá học
của chúng rất đa dạng, từ loại khung không vòng cho đến khung đa vòng giáp
nhau.
Kiểu không vòng như phytan (5) (2,6,10,14-tetrametylhexadecan), loại
một vòng lớn như cembran (6) (18,19,20-trimetyl-1-isopropylcyclotridecan).
Kiểu hai vòng giáp nhau như labdan (7), clerodan (8). Ba vòng giáp nhau như
pimaran (9), kauran (10), beyeran (11). Kiểu 4 vòng giáp nhau như atisan
(12), sarcopetelan (13), phorbol (14). Năm vòng như trachyloban (15).
1.2.2.1. Ditecpen không vòng
Phytan thuộc loại ditecpen không vòng, có cấu trúc hoá học 2,6,10,14-
tetrametylhexadecan (5).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7

(5)
Các ditecpen loại này khác nhau bởi số lượng, vị trí và cấu hình các
nhóm hydroxy, xeton và olefin.
1.2.2.2. Ditecpen vòng lớn Cembran (6)
Cembran thuộc loại ditecpenoit một vòng lớn chung có cấu trúc hoá học
4,8,12-trimetyl-1-isopropyl-cyclotridecan khác nhau bởi số lượng, vị trí và
cấu hình của liên kết olefin.





(6)
1.2.2.3. Ditecpen 2 vòng
1.2.2.3.1. Khung labdan (7)
1
2
3
4 5
6
7
8
9
10
11
12
13

14
15
16
17
1819
20

(7)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
8
1.2.2.3.2. Clerodan ditecpen (furanoditecpen)
Các hợp chất ditecpen khung clerodan gặp rất phổ biến trong thiên
nhiên, chỉ riêng chi Croton L. đến nay đã phân lập được 42 trong số 114
ditecpenoit từ những thực vật này. ở vị trí 15, 16 của hầu hết các clerodan
ditecpen đóng vòng epoxy để hình thành vòng furan, nên các ditecpenoit loại
này còn được gọi là furanoditecpen.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

(8)

1.2.2.4. Ditecpen có 3 vòng dính kết (pimaran)
Các loài thuộc chi Croton L. được nghiên cứu, mới chỉ thấy kiểu khung
pimaran (9).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

(9)
1.2.2.5. Ditecpen 4 vòng dính kết
Thường gặp các kiểu khung kauran (10), beyeran (11), atisan (12),
sarcopetelan (13) và phorbol (14) ditecpen.
1.2.2.5.1. Kauran ditecpen

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9

1
2
3
4 5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

O
O
HOOC

(10) (10.13)
8,15-seco-kauran
1.2.2.5.2. Các ditecpen kiểu khung beyeran (11), atisan (12) và

sarcopetelan (13)
Các kiểu cấu trúc (11) và (12) thường gặp trong nhiều họ thực vật,
nhưng chỉ rất gần đây mới phát hiện thấy trong cây Croton sarcopetalus và
cũng đồng thời khám phá ra kiểu khung sarcopetelan ditecpen (13). Điều đáng
chú ý là trong rễ cây này còn tìm thấy các dẫn xuất của clerodan (8) và
pimaran (9) ditecpen.

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

1
2

3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

(11) (12)

O
O
20
19
18
17
16
15
14

13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
(13)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
10
1.2.2.5.3. Phorbol ditecpen
R
1
O
OR
2
OH
CH
2
OR
3
HO
1

2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
O

(14)
Các phorbol ditecpen có cấu trúc hoá học 4,9 ,12 ,13 ,20-
pentahydroxy-1,6-tigliadien-3-one, chúng chỉ khác nhau về cấu hình của
nhóm hydroxyl ở vị trí 4 và các nhóm chức khác, cho đến nay mới chỉ gặp
duy nhất một cấu hình 4 của phorbol, còn hầu hết là cấu hình 4 .
1.2.2.6. Ditecpen 5 vòng dính kết (trachyloban)
Các dẫn xuất của trachyloban thuộc loại 5 vòng dính kết.
20
19

18
17
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1

(15)
1.2.3. Các hợp chất khác
Thường gặp một số hợp chất tritecpenoit như là 3 -acetoxy-14-
taraxeren-28-oic acid (16.a) [32, 34, 36, 41], 3 -O-axetoaxetyl-20(29)-lupeol
(16.b) [28]. Các hợp chất steroit (17) glucosid như là 3 , 14 ,15 ,16 -
tetrahydroxypregnan-20-one glucosid (17.1) và (17.2) trong cây C. ruizianus
[43].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
11

AcO
COOH

(16.a) (16.b)
OH
RO
OH
O
OH
H

(17)

O
O
N
(Me)
2
OMe
O
O
MeO
(18)

O
N
O
NH
O
(19)

Ngoài những nhóm chất điển hình nêu trên, trong các thực vật chi
Croton rất thường gặp taspin (18), nhưng chỉ xuất hiện ở nhựa cây tiết ra tại
nơi bị thương tổn do yếu tố ngoại lai [38], Julocrotine (19) là những ancaloit
khá đặc biệt và gây độc tế bào [40].
CH
3
CO-CH
2
CO

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
12
1.3. Những nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng của cây Khổ
sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.,)
1.3.1. Giới thiệu cây khổ sâm
Cây Khổ sâm cho lá có tên khoa học là Croton tonkinensis Gagnep., họ
Thầu dầu (Euphorbiaceae) [1, 2], thuộc loại cây nhỏ, cao khoảng 0,7-2,0m,
mọc thành bụi, lá mọc so le, nhìn gần như đối nhau, có khi mọc thành vòng
giả có từ 3 đến 6 lá. Lá có hình mũi mác, cả 2 mặt đều có lông óng ánh như lá
cây nhót. ở mặt dưới lá có 3 gân toả ra từ cuống, lá có tuyền hoa nhỏ, trắng,
mọc thành chùm ở kẽ lá hay đầu cành. Hoa đơn tính cùng gốc, quả có 3 mảnh
vỏ hạt hình trứng, màu đỏ. Mùa ra hoa kết quả khoảng từ tháng 5 đến tháng 8.
1.3.2. Tác dụng của cây khổ sâm
Cây Khổ sâm cho lá mọc hoang dại ở nhiều nơi trên miền Bắc Việt
Nam, nên có nhiều tên gọi khác nhau như là Cổ sâm, Sâm nam, ở vùng Tây
Thiên, Tam Đảo, Vĩnh Phúc nhân dân gọi là cây kẻ chỉ. Thường gặp nhiều ở
các vùng Ninh Bình, Hoà Bình, Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Bắc Giang, Thanh
Hoá [6]. Hiện nay, cây khổ sâm được trồng nhiều ở các trạm xá đông y, y tế
xã và nhà dân. Cây này thuộc loại cây thuốc dân gian, chữa được một số

bệnh, nhất là bệnh đường ruột cho người và gia súc. Nhân dân dùng lá tươi
nhai sống, vò hoặc giã nát để lấy nước uống chữa bệnh đau bụng, đi ngoài,
phụ nữ bị bệnh hậu sản, lở loét người ngoài da, chữa các vết thương nhiễm
trùng, chữa viêm loét hành tá tràng, đau dạ dày, trị sốt rét. ở Hưng Yên, nhân
dân dùng cành, lá khô đem sao vàng, sắc lấy nước uống để chữa bệnh tê thấp.
Gần đây những kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học và thử hoạt
tính sinh học của cây Khổ sâm đã khẳng định tính kháng khuẩn mạnh được
quyết định bởi các ent -kauran ditecpen, đồng thời đã phát hiện tính gây độc
hại rất mạnh đối với một số dòng tế bào ung thư người [4] và chế phẩm từ cây

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13
Khổ sâm còn có hoạt tính chống suy giảm miễn dịch ở gà bị nhiễm virus (gây
suy giảm miễn dịch) Gumboro cường độc [10].
1.3.3. Những nghiên cứu về thành phần hoá học cây Khổ sâm
Những nghiên cứu hoá học về cây khổ sâm đã cho biết thành phần
trong đó rất phong phú và đa dạng bao gồm nhiều nhóm chất khác nhau như:
steroit, tritecpenoit, flavonoit, ancaloit, và ditecpenoit [4].
1.3.3.1. Các ditecpenoit
Cho đến nay đã biết 13 ent -kauran ditecpen phân lập được từ cây Khổ
sâm (Croton tonkinensis) hầu hết chúng là chất mới thuộc dẫn xuất hydroxy
của bộ khung ent -kauran-16-ent-15-on.
Theo qui tắc IUPAC, chúng tôi đề nghị gọi tên các ent -kauran này là
crotonkin kèm theo thứ tự phân lập (bảng 1.1), cấu trúc hoá học và một vài
đặc tính vật lý của chúng (bảng 1.2).
Bảng 1.1: Các ent -kauran phân lập đƣợc từ Croton tonkinensis Gagnep.,
Thứ
tự
Tên chất CTPT Tên khoa học
Thời gian

công bố
Tài
liệu
1 Crotonkin-1
C
22
H
32
O
4
ent-18-axetoxy-7 -
hydroxykaur-16-en-
15-on
25/10/1999
13/2/2003
14,16
2 Crotonkin-2
C
22
H
32
O
5

ent-1a-axetoxy-
7 ,14a-
dihydroxykaur-16-
en-15-on
10/11/2002
28/3/2003

15,18
3 Crotonkin-3
C
22
H
34
O
4

ent-16(S)-18-
axetoxy-7 -
hydroxykaur-15-on
13/02/2003
01/3/2004
16,20
4 Crotonkin-4
C
20
H
30
O
3

ent-7 ,14a-
dihydroxykaur-16-
en-15-on
9/7/1998
28/3/2003
17,18

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
14
5 Crotonkin-5
C
22
H
32
O
5

ent-18a-axetoxy-
7a,14 -
dihydroxykaur-16-
en-15-on
28/03/2003 18
6 Crotonkin-6
C
20
H
30
O
3

ent-7 ,18-
dihydroxykaur-16-
en-15-on
09/9/2003 19
7 Crotonkin-7
C
24

H
34
O
6

ent-1a,14a-
diacetoxy-7 -
hydroxykaur-16-en-
15-on
01/03/2004 20
8 Crotonkin-8
C
24
H
34
O
6

ent-1a,7 -diacetoxy-
14a -hydroxykaur-
16-en-15-on
01/03/2004 20
9 Crotonkin-9
C
22
H
32
O
4

ent-18-axetoxy-14a-
hydroxykaur-16-en-
15-on
01/03/2004 20
10 Crotonkin-10
C
22
H
32
O
5

ent-11a -axetoxy-
7 ,14a-
dihydroxykaur-16-
en-15-on
Chem.
Pharm.Bull.
2002,50, 808-
813.
29/12/2004.
21,24
11 Crotonkin-11
C
20
H
28
O
3

ent-kaur-16-en-15-
on-18-oic acid
Phytochem.
1973, 12,
2712-2723.
29/12/2004.
22,24
12 Crotonkin-12
C
20
H
32
O
ent-18- hydroxykaur-
16-en
Phytochem.
1988, 27,
3209-3212.
29/12/2004
23,24
13 Crotonkin-13
C
26
H
36
O
7
ent-1a,7 ,14a-
triacetoxykaur-16-
en-15-on

2007




Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
15
R
5
O
R
4
R
1
R
2
-H
2
C
R
3






Bảng 1.2: Cấu trúc hoá học và đặc tính vật lý của các Crotonkin
từ cây Croton tonkinensis Gagnep.,
Th

ứ tự
R
1
R
2
R
3
R
4
R
5
M m
p
(
o
C)
R
t

(phút)
1 H OAc OH H =CH
2
360 142-143 23.9
2 OAc H OH OH =CH
2
376 97-98 21.6
3 H OAc H OH
CH
3

362 177-179 22.43
4 H H OH OH =CH
2
318 210-212 22.63
5 H OAc OH OH =CH
2
376 21.39
6 H OH OH H =CH
2
318 155-156
7 OAc H OH OAc =CH
2
418 22.64
8 OAc H OAc OH =CH
2
418 23.01
9 H OAc H OH =CH
2
360
10 11-OAc H OH OH =CH
2
376
11 H COOH H H =CH
2
316
12 H OH H H =CH
2
288
13 OAc H OAc OAc =CH
2

460
1.3.3.2. Các ancaloit
Những nghiên cứu về thành phần ancaloit từ cây Khổ sâm cho biết đã
phân lập và nhận dạng được 6 ancaloit với bộ khung rất phong phú đó là các
berbin ancaloit (corytenchin, corytenchirin [4], [6], protoberberin

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
16
N
+
H
3
CO
H
3
CO
OCH
3
R
N
H
3
CO
H
3
CO
R
OCH
3
OH

H
N
H
3
CO
H
3
CO
OCH
3
CH
3
OH
(dehydrocorytenchin) [7], benzyltetrahydroisoquinolin (laudanidin) [7] và
aporphin ancaloit (corunnin, oxoglaucin) [9].
Bảng 1.3: Ancaloit khung berbin
Berbin TT R Tên chất [M+H]
+







1

H

Corytenchin

342


2 CH
3
Corytenchirin 356
Bảng 1.4: Ancaloit khung protoberberin
Protoberberin TT R Tên chất [M+H]
+







3


OH


Dehydrocorytenchin


338

Bảng 1.5: Ancaloit khung Benzyltetrahydroisoquinolin
Benzyltetrahydroisoquinolin TT Tên chất [M+H]

+







4


(+)-laudanidin


344


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
17
N
H
3
CO
R
1
R
3
CH
3
O

R
2
O
OOH
HO
OH
OH
1'
2'
4'
2
4
5
6
9
10
8
6'

Bảng 1.6: Ancaloit khung Aporphin
Aporphin TT R
1
R
2
R
3
Tên chất [M+H]
+

5

O
-

OCH
3

CH
3

Corunnin

352

6

OCH
3


OCH
3

Oxoglaucin

352

1.3.3.3. Các flavonoit
Một vài flavonoit đã phân lập được từ cây Khổ sâm (C. tonkinensis) đó
là kaempferol hay 3,4
,
,5,7-tetrahydroxyflavon, vitexin hay apigenin-8C- -D-
glucopyranosid, và isovitexin hay apigenin -6C- -D-glucopyranosid [4], [8].
Kaemperol là một trong những flavonol gặp rất phổ biến trong giới thực vật,
có hoạt tính chống viêm nhiễm, lợi tiểu, chống oxy hoá [28]. Trong y học cổ
truyền Việt nam, người ta đã phát hiện chất giải độc chính là vitexin [4], và
vitexin thể hiện hoạt tính yếu với nấm mốc Aspergillius niger ngoài ra không
có hoạt tính nào khác, còn isovitexin thì không có hoạt tính.





Kaempferol

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
18
O
O
OH
OH
HO
O

HO
OH
HO
OH
1''
3''
5''
6''
O
O
OH
OH
HO
O
HO
HO
OH
OH
AcO
AcO
COOH






Vitexin hay
apigenin-8C- -D-glucopyranosid

Isovitexin hay
apigenin-6C- -D-glucopyranosid
1.3.3.4. Các tritecpenoit
Hai hợp chất tritecpenoit được phát hiện từ cây Khổ sâm đó là -
Amyrin axetat (urs-12-en-3 -yl axetat) và Axetyl aleuritolic axit (3 -
hydroxytaraxer-14-en-28-oic axit) [5].





-Amyrin axetat Axetyl aleuritolic axit
1.3.3.5. Các steroit
Nhóm chất steroit tìm thấy trong các dịch chiết từ các bộ phận khác
nhau của cây Khổ sâm cho lá, chủ yếu thuộc loại sterol C29 với bộ khung 3 -
ol,
5
-pregnan, có mạch nhánh với cấu hình và cấu dạng khác nhau. Đó là các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
19
R
2
R
1

O
3
5
8
10
12
14 15
17
18
19
20
21
-sitosterol, poriferasterol, -sitosterol-3-O- -D-glucopyranosyl, -sitosterol
với stigmasterol [4].





Bảng 1.7: Các steroit khung sterol

R
1
R
2

-sitosterol

H
24

22
29


poriferasterol

H


-sitosterol-3-O- -D-glucopyranosyl

C
6
H
12
O
5



1.4. Áp dụng phƣơng pháp LC /MS trong phân tích các chất
Việc sử dụng cây cỏ làm thuốc đóng vai trò quan trọng và có hiệu quả
trong sức khỏe cộng đồng. Đó là những nguồn gốc thiên nhiên với thành phần
hoạt chất rất nhỏ trong cây cỏ thực vật được sử dụng có hiệu quả trong các
bệnh viện y học cổ truyền. Theo đó để đảm bảo tính ổn định cũng như hiệu
quả sử dụng cây cỏ trong việc khám chữa bệnh, cần có hệ thống đánh giá chất
lượng các dược phẩm. Có nhiều phương pháp áp dụng để kiểm tra chất lượng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
20

đó là xác định hoạt chất toàn phần hoặc từng thành phần. Đơn giản hơn cả là
phương pháp định lượng để xác định .
Việc phân tích các ditecpenoit thành phần trong hỗn hợp là nhiệm vụ
khó khăn và phức tạp, vì chúng thường là những chất đồng phân có nhiều tính
chất hoá lý rất gần nhau. Nghiên cứu xác định định tính và định lượng các
hỗn hợp phức tạp như vậy thường phải dùng các phương pháp sắc ký như là
sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng phân giải cao và đặc biệt gần đây phổ biến là
các kỹ thuật của sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS). Phương pháp HPLC -
DAD-ESI/MS là một công cụ phân tích nhanh để xác định thành phần hóa
học trong cây cỏ thực vật . Nó được kết hợp giữa kỹ thuật HPLC, đặc trưng
phổ UV, và bộ phận cung cấp thông tin về khối lượng phân tử (ESI/-MS)
được sử dụng để phân tích hỗn hợp các chất phức tạp trong cây cỏ so sánh với
với chất chuẩn hoặc là thời gian lưu. Và cuối cùng những công bố về việc sử
dụng kỹ thuật HPLC -DAD-ESI/MS đã đánh dấu một bước phát triển trong
việc phân tích thành phần phức tạp ở các phân đoạn dịch chiết thô từ cây cỏ
thiên nhiên [30], [31]. Người ta thường sử dụng kỹ thuật này để phân tích
những thành phần phức tạp trong các dịch chiết thu được từ thực vật.
1.4.1. Nguyên tắc chung của phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC).
Sắc ký lỏng cao áp (HPLC - High Performance Liquid
Chromatography) là một kỹ thuật phân tách vật lý hai hay nhiều cấu tử trong
một hỗn hợp, có thể dùng để phân tích các phân tử hoặc ion hữu cơ. Như vậy,
độ tinh khiết của nhiều hợp chất hữu cơ có thể được đánh giá bằng phương
pháp HPLC. Kỹ thuật bao gồm một pha rắn cố định (pha tĩnh) được nhồi vào
một cột thép không rỉ và một pha lỏng di động (pha động) chạy qua. Việc
phân tách các cấu tử trong dung dịch được thực hiện là nhờ sự khác nhau về
tỷ số phân bố của các chất tan giữa hai pha. Phương pháp HPLC, dựa trên các
cơ chế của hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc kích cỡ (exclusion gel

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
21

permeation) tuỳ thuộc vào kiểu pha tĩnh đem sử dụng.
Cấu hình thiết bị của HPLC bao gồm: hệ thống bơm, van bơm mẫu, cột
sắc ký, đầu dò (detector) và hệ thống sử lý, ghi sắc ký đồ (máy tính).
Sơ đồ 1.1: Hệ thống sắc ký lỏng phân giải cao.
Cấu tạo của hệ thống bơm đảm bảo việc duy trì tốc độ dòng của pha
động không thay đổi. Thiết kế của hệ thống van bơm mẫu đảm bảo việc đưa
mẫu phân tích vào cột có thể thao tác ở áp suất cao không phải ngắt dòng.
Cột sắc ký dùng trong HPLC có thể thuộc một trong các kiểu phân tách
dưới đây:
- Cột pha thƣờng: sự phân tách dựa trên sự khác nhau về tính hấp phụ
của pha tĩnh, vật liệu được sử dụng thường là hạt silica có bề mặt phân cực
gây ra bởi các nhóm silanol (-Si-OH).
- Cột pha đảo: sự phân tách dựa trên nguyên lý phân bố các phân tử
chất tan giữa pha động và pha tĩnh, trong đó pha tĩnh có bề mặt không phân
HPLC
Stationary and
Mobile phase Liquid <400 bar <400 l
1 ml/min





light detector <100
0
C

Mobile
phase
Pump Injector

Data
evaluation
Detector
Column
Oven

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
22
cực. Vật liệu thường dùng là các hạt silica được biến tính hóa học thông qua
phản ứng của nhóm silanol với các nhóm chức khách nhau và thường là:
Octa -Si-(CH
2
)
7
CH
3
C
8

Octadecyl -Si-(CH
2
)
17
CH
3
C
18

Phenyl -Si-(C
6

H
5
)
2
C
6
H
5

Cyanopropyl -Si-(CH
2
)
3
CN CN
Aminopropyl -Si-(CH
2
)
3
NH
2
NH
2

- Cột trao đổi ion: sự phân tách dựa trên tương tác tĩnh điện giữa các
phân tử chất tan mang điện tích với pha tĩnh. Vật liệu để nhồi cột là nhựa trao
đổi ion (cationit hoặc anionit) dùng làm pha tĩnh.
- Cột sắc ký gel (size exclusion) : pha tĩnh là các hạt polime có các lỗ
hổng khác nhau. Sự phân tách được thực hiện là nhờ sự khuyếch tán của phân
tử chất tan vào pha tĩnh, các phân tử có kích thước nhỏ dễ dàng vượt qua pha
tĩnh và bị rửa giải chậm hơn các phân tử có kích thước lớn.

Vì yêu cầu phân tách, vật liệu nhồi cột dùng làm pha tĩnh trong HPLC
thường dùng là các hạt có kích thước nằm trong khoảng 5 đến 10 m có dạng
hình cầu hoặc bất kỳ và cột thường dùng là thép không gỉ, có đường kính
trung bình vào khoảng 2 đến 5mm, chiều cao dài 50 - 300mm. Một cách lý
tưởng, nhiệt độ của pha động và cột phải giữ ổn định trong suốt quá trình
phân tách. Cũng như vậy, nhiệt độ của pha động thoát ra khỏi cột cũng phải
tương đương với nhiệt độ của đầu dò.
Khi cột đã được lựa chọn thì thành công của việc phân tách tuỳ thuộc
vào thành phần pha động, đặc biệt là trong trường hợp sắc ký đẳng dòng.
Trong cột tách luôn luôn xảy ra sự cạnh tranh giữa độ tan của chất tan
trong pha động và tương tác vật lý của nó với bề mặt của pha tĩnh. Nếu như

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
23
mẫu tan tốt trong pha động thì nó sẽ rửa giải sớm và trong trường hợp không
có tương tác với pha tĩnh thì nó sẽ ra khỏi cột với tốc độ bằng tốc độ của pha
động. “Độ mạnh” của pha động có thể được điều chỉnh bằng cách thay thế tỷ
lệ dung môi đã sử dụng. Pha động càng “mạnh” thì mẫu sẽ được rửa giải càng
sớm.
Với cột pha thường, do bề mặt phân cực nên độ mạnh của pha động
đồng nghĩa với độ phân cực của dung môi. Độ mạnh của dung môi theo thứ tự
tăng dần của độ phân cực trình bày như sau:
Hexane = heptane = pentane < cyclo hexane < chloroform < toluen <
dichloro methane < ethylacetate = THF < diethylete < acetone = acetonitrile <
ethanol < H
2
O <acetic acid.
Trong sắc ký lỏng pha ngược bề mặt của vật liệu nhồi cột không phân
cực và nước hoặc dung dịch nước có thể dùng làm pha động. Độ mạnh của
pha động tăng dần khi độ phân cực của dung môi giảm dần (nghĩa là trật tự

ngược với trường hợp pha thường). Pha động yếu nhất là nước sạch,
acetonitryle hoặc THF là các pha động rất mạnh.
Detector UV-VIS là loại detector hay được dùng vì nó có khả năng ứng
dụng rộng rãi và giá thành rẻ hơn các loại detector khác, nó có độ nhạy trung
bình, tín hiệu không ảnh hưởng bởi nhiệt độ và áp suất. Tuy nhiên, detector
UV-VIS chỉ sử dụng được khi mẫu có hấp thụ ánh sáng trong vùng 200 -
700nm.
Detector chỉ số khúc xạ (RID) là một loại detector phổ thông, dựa trên
khả năng phân biệt sự thay đổi chỉ số khúc xạ, có độ nhạy cảm với nhiệt độ và
áp suất cũng như khí bị hoà tan trong pha động, nên độ nhạy phân tích không
cao.
Ngoài hai loại detector trên người ta còn sử dụng detector huỳnh quang,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
24
detector điện hoá, detector độ dẫn ... trong sắc ký lỏng cao áp.
1.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS).
Mẫu được bơm tự động qua cột LC (pha lệch) dưới áp cao và dung môi
rửa giải thích hợp. Sau đó các thành phần tách qua cột được phát hiện bằng
đầu dò detector UV. Từng thành phần được đưa thứ tự vào buồng ion hóa
(ESI – Electron Spray Ionization). Các ion tạo thành qua bộ phận phân tích
đến Detector, các tín hiệu được chuyển qua dạng tín hiệu điện từ, qua bộ phận
lọc và khuyếch đại cho các phổ khối lượng của từng phần.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
25
CHƢƠNG 2. PHẦN THỰC NGHIỆM
Cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis) thuộc loại thực vật đặc hữu
của Việt Nam là cây thuốc dân gian, chữa được một số bệnh phổ biến, những
hiểu biết về thành phần hóa học và dược lý của cây cho biết có tác dụng
chống viêm, chống ung thư và chống suy giảm miễn dịch có hiệu lực [10].
Nhiệm vụ của bản luận văn này là chiết xuất phân lập một số ent -

kauran ditecpen của cây Khổ sâm cho lá và theo dõi sự biến đổi hàm lượng
ent -kauran ditecpenoit chính ở một số thời gian sinh trưởng của cây trong
năm.
2.1. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu
Nguyên liệu để nghiên cứu là mẫu cành và lá khô. Mẫu cành, lá tươi
được thu theo các tháng 1,3,4,5/2008 tại Tân Yên, Bắc Giang và các mẫu thu
ở các vùng Sóc Sơn, Ninh Bình, Phú Thọ, Hưng Yên. Các mẫu nói trên đã
được TS. Ninh Khắc Bản (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh học, Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam) giám định là đồng nhất về mặt thực vật và định
danh là Croton tonkinensis Gagnep., họ Euphorbiaceae.






Ảnh 2.1: Hoa và quả cây Khổ sâm Ảnh 2.2: Lá và quả cây Khổ sâm