tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn achromobacter xylosoxidans bm13 bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion âm
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.08 MB, 90 trang )
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
--- ---
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TINH SẠCH ENDOGLUCANASE TỪ DỊCH NUÔI CẤY
VI KHUẨN ACHROMOBACTER XYLOSOXIDANS BM13
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION ÂM
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:
SINH VIÊN THỰC HIỆN:
ThS. VÕ VĂN SONG TOÀN
VÕ TRUNG NGHĨA
PGS. TS. TRẦN NHÂN DŨNG
MSSV: 3102837
LỚP: CNSH TT K36
Cần Thơ, tháng 5 năm 2015
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
--- ---
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TINH SẠCH ENDOGLUCANASE TỪ DỊCH NUÔI CẤY
VI KHUẨN ACHROMOBACTER XYLOSOXIDANS BM13
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION ÂM
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN:
SINH VIÊN THỰC HIỆN:
ThS. VÕ VĂN SONG TOÀN
VÕ TRUNG NGHĨA
PGS. TS. TRẦN NHÂN DŨNG
MSSV: 3102837
LỚP: CNSH TT K36
Cần Thơ, tháng 5 năm 2015
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
SINH VIÊN THỰC HIỆN
ThS. Võ Văn Song Toàn
Võ Trung Nghĩa
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGS. TS. Trần Nhân Dũng
XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
..............................................................................................
Cần Thơ, ngày
tháng
năm 2015
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
LỜI CẢM TẠ
-------------------Trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp bên cạnh sự cố gắng của
bản thân, tôi còn nhận được sự động viên khích lệ to lớn cả về vật chất lẫn tinh thần từ
gia đình, sự quan tâm hướng dẫn, giúp đỡ từ thầy cô và bạn bè. Đó chính là động lực
giúp tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành đề tài nghiên cứu này.
Xin được gửi lời cảm ơn đến thầy PGS. TS. Trần Nhân Dũng, thầy Ths. Võ Văn
Song Toàn, hai thầy cố vấn đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cũng như tận tụy hướng dẫn
tôi hoàn thành đề tài. Xin được gửi lời tri ân sâu sắc đến quý thầy.
Xin được gửi lời cám ơn chân thành đến thầy TS. Nguyễn Đức Độ, tất cả quý
thầy cô Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã tận tình truyền đạt, giúp
đỡ tôi có những kiến thức hữu ích phục vụ cho việc thực hiện đề tài.
Xin chân thành cám ơn các bạn sinh viên Ngô Thùy Dương lớp CNSHTT K36,
Nguyễn Lê Bảo Trân lớp CNSHTT K36, các em sinh viên lớp CNSH K37, VSV K3
và các bạn sinh viên của phòng thí nghiệm Công Nghệ Enzyme, Sinh Hóa đã nhiệt
tình giúp đỡ và chia sẻ nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập và thực
hiện đề tài.
Xin gửi lời cám ơn chân thành đến cố vấn học tập cô Trần Thị Xuân Mai đã động
viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình và người thân đã động viên,
khích lệ và luôn ủng hộ tôi về mặt vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian qua
để tôi vững tin hoàn thành đề tài này.
Cuối lời, kính chúc mọi người luôn mạnh khỏe, hạnh phúc, vui vẻ và thành đạt.
Xin trân trọng cám ơn!
Cần Thơ, ngày 01 tháng 05 năm 2015
Võ Trung Nghĩa
--------------------
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
TÓM LƯỢC
Đề tài “Tinh sạch endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Achromobacter
xylosoxidans BM13 bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion âm Uno Sphere Q” được
thực hiện nhằm mục tiêu khảo sát phương pháp kết tủa hiệu quả và tinh sạch
endoglucanase từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans BM13. Dịch vi
khuẩn BM13 được nuôi cấy trong môi trường bổ sung cơ chất bã mía sau khi ủ kị khí
ở 38oC trong 5 ngày được ly tâm để thu enzyme ngoại bào. Từ 700 ml dịch enzyme
ngoại bào ban đầu với protein tổng là 28,2 mg và hoạt tính tổng là 985,2 U, dịch
enzyme được tủa phân đoạn với ammonium sulfate (AS), tủa với các dung môi hữu cơ
ethanol và acetone. Kết quả cho thấy phương pháp tủa phân đoạn với AS hiệu quả hơn
cả khi hiệu suất thu hổi đạt khá cao và ít bị biến tính enzyme. Trong đó, phân đoạn 50
– 80% AS là phân đoạn hiệu quả nhất khi protein tổng và hoạt tính tổng của
endoglucanase đạt lần lượt là 7,38 mg; 672,2 U. Phân đoạn tủa bằng AS từ 50 – 80%
được giữ lại và tinh sạch tiếp tục bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion âm trên gel
Uno Sphere Q. Dịch enzyme tách ra phân đoạn FI. Phân đoạn FI có hàm lượng
protein và hoạt tính đặc hiệu lần lượt là 2,8 mg và 84,2 U/mg. Kết quả điện di trên gel
SDS-PAGE kết hợp phương pháp nhuộm bạc với độ nhạy cao xác định enzyme tinh
sạch có hai băng với trọng lượng phân tử là 64,4 kDa và 60,4 kDa. Toàn bộ quá trình
tinh sạch đạt hiệu suất 38,6% và độ tinh sạch tăng lên 7 lần.
Từ
khóa:
Achromobacter
xylosoxidans
BM13,
ammonium
sulfate,
endoglucanase, sắc ký trao đổi ion âm.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
i
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
MỤC LỤC
Trang
TÓM LƯỢC ................................................................................................................... i
MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii
DANH SÁCH HÌNH ......................................................................................................v
DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................... vi
TỪ VIẾT TẮT ........................................................................................................... viii
CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU ...........................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1
1.2. Mục tiêu đề tài ..........................................................................................................2
CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .....................................................................3
2.1. Tổng quan về Achromobacter xylosoxidans ............................................................3
2.1.1. Lịch sử phát hiện .............................................................................................3
2.1.2. Phân loại..........................................................................................................3
2.1.3. Đặc điểm của Achromobacter xylosoxidans ...................................................3
2.2. Tổng quan về endoglucanase....................................................................................5
2.2.1. Enzyme cellulase ............................................................................................5
2.2.2. Cấu trúc endoglucanase ..................................................................................6
2.2.3. Cơ chế thủy phân của endoglucanase .............................................................8
2.2.4. Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến hoạt tính endoglucanase .............8
2.2.4.1. Ảnh hưởng bởi nhiệt độ ...............................................................................8
2.2.4.2. Ảnh hưởng bởi pH .......................................................................................9
2.2.4.3. Ảnh hưởng của ion kim loại ........................................................................9
2.2.4.4. Tính đặc hiệu cơ chất của endoglucanase ....................................................9
2.2.4.5. Một số tính chất khác của endoglucanase ..................................................10
2.3. Các phương pháp nghiên cứu .................................................................................10
2.3.1. Trích ly protein .............................................................................................10
2.3.1.1. Phương pháp ly tâm ...................................................................................10
2.3.1.2. Phương pháp lọc ........................................................................................11
2.3.2. Phương pháp tủa protein ...............................................................................11
2.3.2.1. Phương pháp tủa bằng muối ......................................................................11
2.3.2.2. Phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ ...................................................12
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
ii
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
2.3.2.3. Phương pháp tủa bằng điểm đẳng điện ......................................................13
2.3.3. Phương pháp sắc ký trao đổi ion ...................................................................14
2.3.4. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (SDS – PAGE).....................16
2.3.5. Các phương pháp phân tích protein ..............................................................18
2.3.5.1. Khảo sát hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford ........................18
2.3.5.2. Khảo sát hoạt tính protein ..........................................................................19
a. Định tính protein bằng vòng tròn đường kính thủy phân ...................................19
b. Định lượng hoạt tính bằng phương pháp Nelson - Somogyi ..............................19
2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ............................................................20
2.4.1. Trong nước ....................................................................................................20
2.4.2. Ngoài nước ....................................................................................................21
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................22
3.1. Phương tiện nghiên cứu ..........................................................................................22
3.1.1. Thời gian và địa điểm ...................................................................................22
3.1.2. Nguyên, vật liệu ............................................................................................22
3.1.3. Dụng cụ, thiết bị ............................................................................................22
3.1.4. Hóa chất ........................................................................................................22
3.1.5. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật ................................................23
3.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................24
3.2.1. Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa phân đoạn với ammonium
sulfate .....................................................................................................................24
3.2.2. Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa với ethanol ......................25
3.2.3. Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa với acetone ......................26
3.2.4. Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion .................27
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ..................................................................28
4.1. Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa phân đoạn với ammonium sulfate
.......................................................................................................................................28
4.2. Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa với ethanol ................................32
4.3. Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp tủa với acetone................................35
4.4. Tinh sạch endoglucanase bằng phương pháp sắc ký ion âm với gel Uno Sphere Q
.......................................................................................................................................39
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................43
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
iii
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
5.1. Kết luận...................................................................................................................43
5.2. Kiến nghị ................................................................................................................43
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................44
PHỤ LỤC .........................................................................................................................
PHỤ LỤC 1. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH .....................................................
PHỤ LỤC 2. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM .......................................................................
PHỤ LỤC 3. KẾT QUẢ THỐNG KÊ ...........................................................................
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
iv
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans ..............................................................4
Hình 2. Phân loại enzyme cellulase .................................................................................5
Hình 3. Đặc tính và thứ tự phân cắt của 3 loại enzyme thuộc hệ enzyme cellulase .......6
Hình 4. Cấu trúc các domain của endoglucanase ............................................................7
Hình 5. Cấu trúc tâm hoạt động endoglucanase khi tương tác với cơ chất cellobiose....7
Hình 6. 2 cơ chế thủy phân liên kết β-1,4-glycosidic ......................................................8
Hình 7. Ảnh hưởng của nồng độ muối đối với tính tan của protein ..............................12
Hình 8. Cấu trúc amino acid khi pH thay đổi ................................................................13
Hình 9. Giản đồ thể hiện điểm đẳng điện của protein ...................................................14
Hình 10. Hai loại hạt gel dùng trong sắc ký trao đổi ion ..............................................15
Hình 11. Sắc ký trao đổi ion ..........................................................................................16
Hình 12. Biểu đồ hấp thụ điện tích protein trong sắc ký trao đổi ion ...........................16
Hình 13. Công thức phân tử Coomassie Brilliant Blue G-250 .....................................19
Hình 14. Hoạt tính giữa các phân đoạn tủa với AS bằng phản ứng thủy phân cơ chất
CMC ..............................................................................................................................29
Hình 15. ĐKTP các phân đoạn tủa với ammonium sulfate ...........................................30
Hình 16. Lượng cơ chất CMC bị thủy phân bởi enzyme tủa bằng ethanol...................33
Hình 17. Đường kính thủy phân của enzyme tủa bằng ethanol ....................................34
Hình 18. Lượng cơ chất CMC bị thủy phân bởi enzyme tủa bằng acetone ..................35
Hình 19. Đường kính thủy phân của enzyme tủa bằng acetone ....................................36
Hình 20. Sắc ký đồ phân đoạn 50 – 80% AS ................................................................39
Hình 21. ĐKTP endoglucanase .....................................................................................40
Hình 22. ĐKTP endoglucanase .....................................................................................40
Hình 23. Điện di SDS-PAGE ........................................................................................41
Hình 24. Bảng chuẩn lượng muối ammonium sulfate khi tủa phân đoạn .................. PL1
Hình 25. Đường chuẩn Bradford ................................................................................ PL2
Hình 26. Đường chuẩn Nelson - Somogyi ................................................................. PL2
Hình 27. Đường chuẩn CMC ..................................................................................... PL2
Hình 28. Đường chuẩn trọng lượng phân tử của protein chuẩn ................................. PL2
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
v
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1: Thành phần môi trường đặc nuôi cấy vi khuẩn (M1) ......................................23
Bảng 2: Thành phần môi trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn (M2).....................................23
Bảng 3: Tổng kết quá trình tinh sạch enzyme bằng phương pháp tủa phân đoạn
ammonium sulfate .........................................................................................................28
Bảng 4: Endoglucanase được tủa với ethanol ...............................................................32
Bảng 5: Endoglucanase được tủa với acetone ...............................................................35
Bảng 6: So sánh số liệu giữa 3 phương pháp tủa protein ..............................................38
Bảng 7: Sắc ký trên gel Uno Sphere Q ..........................................................................39
Bảng 8: Tóm tắt quy trình tinh sạch ..............................................................................41
Bảng 9: Dựng đường chuẩn BSA ............................................................................... PL1
Bảng 10: Pha dung dịch đường chuẩn glucose........................................................... PL1
Bảng 11: Dựng đường chuẩn glucose ........................................................................ PL1
Bảng 12: Dung dịch chạy điện di ............................................................................... PL1
Bảng 13: Dung dịch buffer ......................................................................................... PL1
Bảng 14: Thành phần gel phân tích ............................................................................ PL1
Bảng 15: Thành phần gel tập trung ............................................................................ PL1
Bảng 16: Giá trị OD 595nm đường chuẩn BSA ......................................................... PL2
Bảng 17: Giá trị OD 520nm đường chuẩn glucose .................................................... PL2
Bảng 18: Giá trị độ nhớt đường chuẩn CMC ............................................................. PL2
Bảng 19: Số liệu đường tuyến tính trọng lượng phân tử và khoảng cách di chuyển của
protein chuẩn .............................................................................................................. PL2
Bảng 20: Giá trị OD 595nm định lượng protein các phân đoạn tủa với ammonium
sulfate.......................................................................................................................... PL2
Bảng 21: Định lượng protein tủa bằng AS ................................................................. PL2
Bảng 22: Giá trị OD 520nm định lượng hoạt tính các phân đoạn tủa với ammonium
sulfate.......................................................................................................................... PL2
Bảng 23: Định lượng hoạt tính enzyme tủa bằng AS ................................................. PL2
Bảng 24: Giá trị đường kính thủy phân định tính enzyme tủa bằng AS .................... PL2
Bảng 25: Giá trị độ giảm độ nhớt enzyme tủa bằng AS ............................................. PL2
Bảng 26: Giá trị OD 595nm định lượng protein các phân đoạn tủa bằng ethanol ..... PL2
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
vi
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
Bảng 27: Định lượng protein tủa bằng ethanol .......................................................... PL2
Bảng 28: Giá trị OD 520nm định lượng hoạt tính các phân đoạn tủa bằng ethanol .. PL2
Bảng 29: Định lượng hoạt tính enzyme tủa bằng ethanol .......................................... PL2
Bảng 30: Giá trị đường kính thủy phân định tính enzyme tủa bằng ethanol ............. PL2
Bảng 31: Giá trị độ giảm độ nhớt enzyme tủa bằng ethanol ...................................... PL2
Bảng 32: Giá trị OD 595nm định lượng protein các phân đoạn tủa bằng acetone .... PL2
Bảng 33: Định lượng protein tủa bằng acetone .......................................................... PL2
Bảng 34: Giá trị OD 520nm định lượng hoạt tính các phân đoạn tủa bằng acetone .. PL2
Bảng 35: Định lượng hoạt tính enzyme tủa bằng acetone .......................................... PL2
Bảng 36: Giá trị đường kính thủy phân định tính enzyme tủa bằng acetone ............. PL2
Bảng 37: Giá trị độ giảm độ nhớt enzyme tủa bằng acetone...................................... PL2
Bảng 38: Giá trị OD 280nm các phân đoạn sắc ký trên gel Uno Sphere Q ............... PL2
Bảng 39: Giá trị OD 595nm định lượng protein các phân đoạn sau sắc ký ............... PL2
Bảng 40: Định lượng protein các phân đoạn sau sắc ký ............................................ PL2
Bảng 41: Giá trị OD 520nm định lượng hoạt tính các phân đoạn sau sắc ký ............ PL2
Bảng 42: Định lượng hoạt tính enzyme sau sắc ký .................................................... PL2
Bảng 43: Trọng lượng phân tử các băng protein trong mẫu enzyme tinh sạch.......... PL2
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
vii
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
TỪ VIẾT TẮT
AS
Amonium Sulfate
BSA
Bovine Serum Albumin
CBH
1,4-β-D-glucan cellobihydrolase
CBM
Cellulose binding module
CD
Catalytic domain
CMC
Carboxymethyl cellulose
ĐKTP
Đường kính thủy phân
pI
Isoelectric point
SDS
Sodium Dodecyl Sulfate
TEMED
Tetramethylethylenediamine
VSV
Vi sinh vật
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
viii
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Cellulose là nguồn vật chất dồi dào nhất trên trái đất và chiếm ưu thế trong toàn
bộ giới thực vật (Zvidzai và Johnson, 2012). Cellulose còn là nguồn carbon và có khả
năng tái tạo lại nên được xem là nguồn năng lượng rất đáng hứa hẹn. Một số các
nghiên cứu đã được thực hiện với chiến lược là tận dụng cellulose để sản xuất năng
lượng sinh học thay thế cho nguồn năng lượng hóa thạch đang dần cạn kiệt (Beguin và
Aubert, 1994; Demain et al., 2005). Bên cạnh đó, việc bảo toàn hệ sinh thái thông qua
việc tận dụng cellulose được xem như là một giải pháp khắc phục ô nhiễm môi trường
do chất thải rắn trong nông nghiệp. Ngoài ra, một số sản phẩm có giá trị kinh tế như
bột giấy, rượu, acid… có thể được sản xuất từ cellulose (Coral et al., 2002).
Trong suốt nhiều năm, trở ngại đối với các nhà khoa học là tìm giải pháp cũng
như cải tiến các phương pháp, kỹ thuật và phương tiện để có thể chuyển hóa nguồn
cellulose trong thực vật cũng như các nguồn vật chất chứa cellulose (Sakata et al.,
1985; Tewari et al., 1987; Julian et al., 1990). Việc phân hủy cellulose bằng phương
pháp vật lý hay hóa học rất phức tạp, tốn kém và gây ô nhiễm môi trường. Trong khi
đó, việc xử lý các chất thải hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt sử
dụng enzyme cellulase ngoài bào từ vi sinh vật có ưu điểm về kinh tế, kỹ thuật và môi
trường (Pason et al., 2006). Cellulase được phân loại vào nhóm enzyme hydrolase thủy
phân các liên kết glycoside (glycodyl hydrolase). Cellulase là một hệ enzyme bao gồm
endoglucanase, excoglucanase và cellobiase. Mỗi loại enzyme có cơ chế, vị trí cắt và
cho ra sản phẩm khác nhau nhưng nhìn chung đều thủy phân liên kết β-1,4-glycosidic
trong phân tử cellulose.
Trong thập kỷ qua, enzyme được sử dụng trong các ngành công nghiệp ngày
càng nhiều và trở thành nhu cầu thiết yếu cho xã hội. Không ngoài xu thế đó, enzyme
cellulase đã được ứng dụng khá rộng rãi. Enzyme này được ứng dụng vào sản xuất
thức ăn gia súc, điều chế các chất tẩy rửa, tạo mùi hương, công nghiệp giấy và cả trong
sản xuất rượu. Một trong những ứng dụng quan trọng của cellulase là áp dụng để sản
xuất ethanol từ mùn bã hữu cơ. Từ quá trình đường hóa các vật liệu chứa cellulose như
bã mía, bột bắp, vỏ thóc, mùn cưa… sẽ cho ra ethanol sinh học, đây là hướng ứng
dụng chính của cellulase hiện nay (Sukuraman et al., 2005; Kuhad et al., 2010).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
1
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
Enzyme cellulase đóng góp 8% vào nhu cầu sử dụng enzyme trên toàn thế giới và tỉ lệ
này hi vọng sẽ tăng thêm 10% trong năm 2014 (Costa et al., 2008). Đặc biệt trong số 3
loại enzyme, endoglucanase là enzyme có cơ chế cắt phổ biến hơn so với 2 loại
enzyme còn lại.
Nhu cầu xã hội hiện nay là sản xuất enzyme cellulase từ phế thải nhà máy như:
rơm rạ, mạt cưa… đồng thời sẽ giúp bảo vệ được môi trường cũng như đẩy mạnh ứng
dụng enzyme vào công nghiệp nước ta. Bước đầu tiên của việc sản xuất là phải tinh
sạch được enzyme với độ tinh khiết cao đủ đạt tiêu chuẩn để ứng dụng vào thực phẩm
và nguồn vi sinh vật là nguồn nguyên liệu phong phú nhất để ta có thể thu được nhiều
cellulase. Enzyme có thể được trích ly từ nhiều nguồn nhưng vi khuẩn là nguồn có
nhiều tiềm năng nhất. Vi khuẩn có khả năng tăng sinh khối rất nhanh chóng, hệ
enzyme phân giải các chất gốc đường phức tạp hơn và do vi khuẩn có khả năng sinh
trưởng ở những điều kiện khắc nghiệt nhất nên hệ enzyme cellulase của chúng có độ
bền cao hơn so với trích ly từ những nguồn khác (Miranda et al., 2009). Một số chủng
vi sinh vật sản xuất cellulase được nghiên cứu nhiều như Clostridium, Cellulomonas,
Thermomonospora, Trichoderma (Kuhad, 2010). Trong khi đó, vi khuẩn
Achromobacter xylosoxidans đã được nghiên cứu khi phối hợp với một số dòng nấm
men có khả năng phân hủy cơ chất bã mía (Võ Văn Song Toàn et al., 2014). Trên thế
giới đã có những nghiên cứu về tinh sạch endoglucanase từ vi khuẩn nhưng tinh sạch
enzyme từ dòng vi khuẩn này vẫn còn rất hạn chế; đối với nước ta vấn đề này vẫn còn
khá mới mẻ và cũng chưa có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn này. Từ đó, đề tài “Tinh
sạch enzyme endoglucanase từ dịch nuôi cấy Achromobacter xylosoxidans BM13 bằng
phương pháp sắc ký trao đổi ion” được tiến hành nhằm khảo sát phương pháp tủa
endoglucanase từ vi khuẩn này một cách hiệu quả.
1.2. Mục tiêu đề tài
Đề tài được tiến hành nhằm mục tiêu tinh sạch endoglucanase của vi khuẩn
Achromobacter xylosoxidans BM13.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
2
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về Achromobacter xylosoxidans
2.1.1. Lịch sử phát hiện
Achromobacter xylosoxidans lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1971 bởi 2 nhà
khoa học Yabuuchi và Ohyama (Duggan et al., 1996). Ban đầu VSV này có tên là
Alcaligenes denitrificans thuộc phân loài xylosoxidans và Alcaligenes xylosoxidans
thuộc phân loài xylosoxydans. Tuy nhiên, dần dần chúng được biết đến rộng rãi với tên
Achromobacter xylosoxidans.
Hiện này, Achromobacter xylosoxidans được ứng dụng rộng rãi trong y học để
tìm hiểu về qui trình gây ra một số căn bệnh trên cơ thể người. Đồng thời, chúng cũng
được nghiên cứu về mặt hóa sinh trong sản xuất các enzyme phục vụ cho đời sống con
người.
2.1.2. Phân loại
Theo phân loại quốc tế, Achromobacter xylosoxidans thuộc
Giới
Bacteria
Ngành
Proteobacteria
Lớp
Beta Proteobacteria
Bộ
Burkholderiales
Họ
Alcaligenaceae
Giống
Achromobacter
Loài
A. xylosoxidans
2.1.3. Đặc điểm của Achromobacter xylosoxidans
A. xylosoxidans là vi khuẩn hiếu khí, gram âm, có dạng que và di chuyển được
nhờ vào roi (flagella). VSV này sống chủ yếu ở môi trường nước (Duggan et al., 1996).
A. xylosoxidans thuộc về nhóm các VSV có khả năng tổng hợp oxidase và
catalase, không có khả năng lên men và có sự tương đồng với một số các VSV khác
như Ochrobactrum anthropi, Agrobacterium tumefaciens hay Achrmobacter nhóm b.
Tuy nhiên các VSV này hình thái sinh học rất khác biệt nhau (Duggan et al., 1996).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
3
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
Hình 1. Vi khuẩn Achromobacter xylosoxidans
(*Nguồn: ngày 22/5/2014)
A. xylosoxidans còn thường xuyên được tìm thấy trong rễ cây và có nhiều chức
năng hiệu quả đã được nghiên cứu trước đó, một trong số những chức năng đó bao
gồm kiểm soát các sinh vật gây bệnh trên thực vật (Joe et al., 2012), cải thiện môi
trường bị ô nhiểm phenol (Ho et al., 2012) kích thích sự vận chuyển của ion để điều
hòa sự phát triển của cây (Jha và Kumar, 2009) và ức chế sự tạo ra aflatoxin ở
Asperillus sp. (Yan et al., 2004).
Hệ enzyme của A. xylosoxidans cũng khá đa dạng như cellulase, glucanase,
enzyme phân hủy lignin... Đặc biệt hơn, A. xylosoxidans đã được nghiên cứu trong
việc tạo ra các enzyme để phân hủy 2,4,6-trinitrotoluene (TNT). A. xylosoxidans sử
dụng TNT như nguồn nitrogen, một số ít lại sử dụng như nguồn carbon và năng lượng
cho quá trình sinh trưởng (Spain, 1995, Esteve et al., 2001, Nyanhongo et al., 2005).
Trong đó, để phân hủy TNT thì vai trò của enzyme nội và ngoại bào là cực kì quan
trọng. Enzyme ngoại bào phân hủy lignin gồm lignin peroxidase (LiP), manganese
peroxidase (MnP) và laccase có tác dụng phân hủy rồi khoáng hóa hoàn toàn TNT
(Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự, 2009). A. xylosoxidans hiện được nghiên cứu nhiều để
phục vụ cho việc tìm kiếm các phác đồ điều trị hiệu quả các bệnh nhiễm khuẩn do vi
khuẩn gây nên.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
4
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
2.2. Tổng quan về endoglucanase
2.2.1. Enzyme cellulase
Cellulase hay còn được gọi với các tên khác như endo-1,4-beta-Dglucanase, beta-1,4-glucanase, beta-1,4-endoglucan
hydrolase, cellulase
A,1,4-
(1,3, 1,4)-beta-D-glucan 4-glucanohydrolase là enzyme xúc tác cho quá trình thủy
phân cellulose thành glucose. Celulase có thể được tổng hợp bởi các loài nấm, vi
khuẩn và các loài động vật nguyên sinh. Phản ứng chính được xúc tác bởi cellulase là
thủy phân các liên kết 1,4-beta-D-glycosidic trong cellulose, lichenin và ngũ cốc của
các gốc đường β-D. Tuy nhiên, cellulase là 1 hệ enzyme và để phản ứng diễn ra hoàn
toàn cần có sự tham gia của 3 loại enzyme cellulase khác nhau (Nguyễn Đức Lượng,
2004).
Hình 2. Phân loại enzyme cellulase
(*Nguồn: Kluepfel, 1988)
+ Endoglucanase (EC 3.2.1.4) (β-1,4-endoglucan hydrolase, β-1,4-glucanase,
Endo-1,4-β-D-glucanase, Endo-1,4- β-D-glucanohydrolase) là enzyme thủy phân ngẫu
nhiên các liên kết β-1,4 glucoside ở phía trong cấu trúc cellulose và cho ra các một số
sản phẩm như glucose, cellodextrin, cellobiose... Sản phẩm sinh ra từ quá trình thủy
phân của endoglucanase sẽ là cơ chất cho exoglucanse tiếp tục thủy phân. Enzyme này
cũng được ghi nhận là có trong một số vi sinh vật như Clostridium thermocellum,
cellulomonas fimi và một số VSV khác… (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
+ Exoglucanase (EC 3.2.1.91) bao gồm 2 loại enzyme là exo-β-1,4-glucanase và
1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase được gọi tắt lần lượt là CBHI và CBHII
(Schemidhalter và Canevascini, 1993). CBHI bao gồm CBHII có thể phân cắt từ đầu
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
5
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
khử hoặc không khử của chuỗi polymer là sản phẩm từ endoglucanase và cho ra các
sản phẩm là các đường đôi hoặc đường đa (chủ yếu là đường với 4 đơn vị) gọi là các
cellobiose (Zvidzai et al., 2012). Exoglucanase còn các tên gọi khác như avicecellase,
exocellulase, cellobiosidase... (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
+ Cellobiase (EC 3.2.1.21) hay còn được gọi là β-D-glucoside glucohydrolase
thủy phân tiếp tục các sản phẩm từ exocellulase là các cellobiose thành các đường đơn
chủ yếu là glucose. Cellobiase không có khả năng phân cắt cellulose từ ban đầu
(Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Hình 3. Đặc tính và thứ tự phân cắt của 3 loại enzyme thuộc hệ enzyme cellulase
(*Nguồn: Lutzel và Nielson, 1983)
G: glucose
(1). Thủy phân trực tiếp do tác dụng của exocellulase.
(2). Thủy phân do tác dụng phối hợp của endocellulase, exocellulase và β-glucosidase.
(3). Thủy phân trước tiên bởi endocellulase và sau đó bởi exocellulase.
2.2.2. Cấu trúc endoglucanase
Endoglucanase được xếp vào loại enzyme ngoại bào, tức là các loại enzyme được
vi sinh vật tiết ra bên ngoài tế bào để xúc tác các phản ứng thủy phân cơ chất để thu
chất dinh dưỡng nuôi sống tế bào (Poulsen và Petersen, 1987).
Endoglucanase cũng như các enzyme trong phức hệ cellulase có cấu tạo gồm hai
domain là: catalytic domain (CD-domain xúc tác) và module liên kết carbohydrate
(CBM) còn được gọi là cellulose-binding domain (CBD-domain liên kết cellulose), cả
hai được liên kết với nhau bằng liên kết peptide. Liên kết này gồm có rất nhiều các
acid amine như proline, threonine và serine, có vai trò duy trì sự liên kết giữa CD và
CBM, 2 domain này có chức năng độc lập nhau (Zvidzai và Johnson, 2012).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
6
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
Hình 4. Cấu trúc các domain của endoglucanase
(*Nguồn: Zong et al., 2008)
Domain xúc tác (CD) có kích thước to và module gắn kết cellulose (CBM) có
kích thước nhỏ hơn. Trong CD có chứa vùng kích hoạt enzyme chịu trách nhiệm thủy
phân cellulose. CBD là một chuỗi amino acid giúp đánh dấu và giữ CD nằm trên bề
mặt cellulose thông qua các liên kết hydro và lực liên kết van der Waals (Boraston et
al., 2004; Guillen et al., 2010).
Các amino acid tích điện âm cận kề trong tâm hoạt động như asparatic acid,
glutamic acid, tryptophan hay histidine hổ trợ và duy trì tính bền vững của sự hình
thành ion oxocarboniuum (Henrissat et al., 1989; Gilkes et al., 1991; Kawaminami et
al., 1998; Gebler et al., 1992). Trong tâm hoạt động của endoglucanase vi khuẩn, 8
trình tự amino acid với độ bảo tồn cao được hiện diện. Những amino acid đó bao gồm
2 tryptophan, lysine, serine, 2 tyrosine, glutamate và histidine
Hình 5. Cấu trúc tâm hoạt động endoglucanase khi tương tác với cơ chất
cellobiose
(*Nguồn: Davies et al., 1998)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
7
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
2.2.3. Cơ chế thủy phân của endoglucanase
Để phân cắt hoàn toàn cellulose cần có sự hợp tác hoạt động của 3 loại enzyme
cellulase, chúng có sự tương tác và hỗ trợ lẫn nhau trong quá trình thủy phân (Halliwel
và Riaz, 1970). Endoglucanase thủy phân rất mạnh các liên kết β-1,4-glucosides giải
phóng sản phẩm rất đa dạng gồm glucose, cellodextrin... Hai cơ chế thủy phân được
biết đến là thủy phân đảo cấu hình (inverting mechanism) và thủy phân duy trì cấu
hình β (retaining mechanism). Trong cả hai cơ chế, acid-baze cho một proton vào Oglycosidic để tạo sự tách rời liên kết này, đồng thời với sự thành lập của điện tích
dương ở carbon C1 (Nutt, 2006).
Hình 6. 2 cơ chế thủy phân liên kết β-1,4-glycosidic
(A) : Cơ chế duy trì cấu hình ; (B) : Cơ chế đảo cấu hình.
(*Nguồn: Nutt, 2006)
2.2.4. Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến hoạt tính endoglucanase
2.2.4.1. Ảnh hưởng bởi nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cũng như tính chất enzyme
của vi khuẩn. Ở một khoảng nhiệt độ nhất định, vận tốc phản ứng được xúc tác bởi
enzyme sẽ tăng lên và enzyme thể hiện hoạt tính cực đại ở một nhiệt độ thích hợp. Tuy
nhiên, khi nhiệt độ tiếp tục tăng lên, hoạt tính enzyme sẽ giảm xuống và vận tốc phản
ứng chậm lại. Đến khi vượt qua ngưỡng nhiệt độ giới hạn, enzyme sẽ bị biến đổi cấu
trúc và mất hoạt tính. Điều tương tự cũng xảy ra khi nhiệt độ giảm xuống dưới ngưỡng
giới hạn.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
8
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
Nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính endoglucanase khác nhau tùy theo từng chủng vi
khuẩn sản sinh ra. Theo một số nghiên cứu thì nhiệt độ tối ưu cho cellulase trích ly từ
vi khuẩn hoạt động được dao động trong khoảng 30oC - 50oC (Yin et al., 2010). Vi
khuẩn Cellulomonas, Bacillus và Microccocus spp. nhiệt độ tối ưu để để
endoglucanase hoạt động là 400C trong 1,5% nồng độ cơ chất (Immanuel et al., 2006).
Nhìn chung endoglucanaase vi khuẩn có độ bền nhiệt khá cao, hoạt tính vẫn có thể
được giữ khi nhiệt độ tăng lên 50oC - 60oC (Pason et al., 2006). Khoảng chịu nhiệt của
enzyme cũng khác nhau tùy theo loài vi khuẩn.
2.2.4.2. Ảnh hưởng bởi pH
pH là một nhân tố tác động chính đến hoạt tính enzyme. Endoglucanase của A.
xylosoxidans chưa được nghiên cứu nhiều, tuy nhiên theo một số nghiên cứu cho thấy
endoglucanase của vi khuẩn có khoảng pH dao động từ 4 - 9 (Pason et al., 2006).
Immanuel và cộng sự (2006) cho thấy với 1,5% nồng độ cơ chất thì pH tối ưu cho hoạt
tính của endoglucanase từ vi khuẩn Cellulomonas, Bacillus và Microccocus spp. là 7.
Endoglucanase của Bacillus strain M-9 có thể hoạt động trong khoảng pH từ 3 - 10
nhưng ở pH 5 thì endoglucanase có hoạt lực mạnh nhất (Bajaj et al., 2009).
Endoglucanase bền trong khoảng pH từ 4 - 10 tùy vào từng loài cụ thể.
2.2.4.3. Ảnh hưởng của ion kim loại
Sự ảnh hưởng của ion kim loại đối với hoạt tính enzyme có 2 dạng, 1 dạng là
tăng cường hoạt tính enzyme, dạng còn lại là ức chế hoạt tính enzyme. Các ion kim
loại nặng ở nồng độ nhất định có thể làm biến tính, kìm hãm không thuận nghịch
enzyme. Một số các báo cáo khác cho thấy các ion Co2+, Mn2+ tăng cường hoạt tính
enzyme endoglucanase, trong khi các ion kim loại như Cu2+, Hg2+, Fe3+, Cd2+ lại là
các tác nhân gây ức chế và kìm hãm hoạt tính enzyme (Seo et al., 2013). Các ion K+,
Na+, Ca2+ và NH4+ không ảnh hưởng hoạt tính enzyme (Mawadza et al., 2000).
2.2.4.4. Tính đặc hiệu cơ chất của endoglucanase
CMC và β-glucan là 2 cơ chất mà endoglucanase cho hoạt tính rất cao. Ngoài
ra, enzyme này còn cho thấy hoạt tính đối với một số các cơ chất khác như avicel,
xylan, coton nhưng hoạt lực không mạnh (Yin et al., 2010; Mawadza et al., 2000).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
9
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
2.2.4.5. Một số tính chất khác của endoglucanase
Mỗi loài vi khuẩn khác nhau sẽ sản sinh ra cellulase có phân tử lượng cũng
như điểm đẳng điện khác nhau. Thông thường, endoglucanase từ vi khuẩn có trọng
lượng phân tử trong khoảng từ 23 - 146 kDa (Gilkes et al., 1991). Ở trực khuẩn thì
trọng lượng phân tử rơi vào khoảng 35 - 82 kDa (Park et al., 1991; Han et al., 1995;
Kim et al., 1995; Mawadza et al., 2000). Điểm đẳng điện của endoglucanase trích ly từ
các nguồn khác nhau thì cũng khác nhau.
2.3. Các phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Trích ly protein
Để có được nguyên liệu cho việc tinh sạch enzyme thì công đoạn tách chiết
nguồn nguyên liệu enzyme ban đầu là bước không thể thiếu. Dịch trích enzyme thô
cũng là một yếu tố quyết định hiệu suất tinh sạch enzyme. Để có thể lấy được enzyme
trong tế bào VSV, ta cần phá vỡ màng tế bào và trích ly enzyme ra khỏi tế bào dưới
dạng enzyme thô. Có 2 dạng phương pháp được dùng để trích ly enzyme là phương
pháp cơ học và phi cơ học.
Phương pháp cơ học là phương pháp dùng những tác động vật lý (nghiền) để phá
vỡ màng tế bào, phóng thích enzyme khỏi tế bào. Đối với tế bào động vật, màng tế bào
dễ bị phá vỡ, nhưng đối với tế bào VSV do kích thước quá nhỏ nên nếu không dùng
các chất trợ nghiền sẽ không mang lại kết quả. Những phương pháp phi cơ học là
những phương pháp không dùng đến các tác động vật lý chẳng hạn như phương pháp
hóa học, phương pháp sinh học... Tuy nhiên đề tài này áp dụng phương pháp để trích
lý enzyme và 2 phương pháp chủ yếu được dùng là ly tâm và lọc.
2.3.1.1. Phương pháp ly tâm
Ly tâm là quá trình tách vật thể rắn ra khỏi dung dịch. Trong công nghệ
enzyme, ly tâm là phương pháp thường được sử dụng để trích ly enzyme, dung dịch
này chứa các enzyme ngoại bào, muốn thu enzyme nội bào cần phải tiến hành phá vỡ
màng tế bào. Dịch trích enzyme thô bao gồm các thành phần chính sau:
+ Protein
+ Các chất
+ Nước
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
10
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
2.3.1.2. Phương pháp lọc
Sau khi phá vỡ thành tế bào hay sau khi lên men, dịch enzyme nội bào hay
enzyme ngoại bào hòa tan được thu nhận thông qua phương pháp lọc. Trong công
nghiệp sản xuất enzyme thường có các kiểu lọc sau:
+ Lọc ép
+ Lọc chân không
+ Lọc theo dòng chảy cắt ngang
+ Lọc thông thường
(Nguyễn Đức Lượng, 2004)
2.3.2. Phương pháp tủa protein
Phương pháp tủa được sử dụng rất phổ biến để thu nhận enzyme. Có một số
phương pháp tủa thường được sử dụng như: tủa bằng dung môi hữu cơ, tủa bằng muối,
tủa bằng nhiệt hay thay đổi pH.
2.3.2.1. Phương pháp tủa bằng muối
Cơ chế của phương pháp tủa protein bằng muối dựa vào cấu trúc bề mặt, tính
tan của protein và nồng độ muối. Khi protein cuộn xoắn tạo thành cấu trúc bậc 3 thì
luôn có xu hướng cuộn bề mặt kị nước vào trong lõi protein. Tuy nhiên khi protein
trong dung môi thì các gốc kị nước lại để lộ ra, lúc này trên bề mặt protein hình thành
cấu trúc thể khảm gồm các gốc mang điện, không mang điện và các gốc kị nước
(Jakoby, 1971).
Khi ta bổ sung muối vào dung dịch, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in)
do các ion muối tương tác với bề mặt protein. Do các ion muối chen bám vào bề mặt
protein nên lượng nước cần để hòa tan protein giảm xuống, lượng nước tự do tăng lên.
Nhìn chung ở giai đoạn này, tính tan của protein tăng.
Tuy nhiên, khi nồng độ muối càng cao thì độ tan của protein đạt ngưỡng rồi
giảm xuống. Nguyên nhân là do các ion muối lúc này đã bám kín bề mặt protein nên
sẽ quay sang tranh giành các ion dung môi (nước) với protein làm giảm hiện tượng
solvate hóa. Các protein khi không tương tác với nước được nữa sẽ tương tác, liên kết
với nhau thông qua các liên kết kị nước và các liên kết phân cực trên bề mặt. Khi các
điện tích trên bề mặt đã bị trung hòa, các phân tử protein không thể tương tác với nước
nữa nên sẽ tủa xuống (salting out) (Jakoby, 1971).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
11
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
Hình 7. Ảnh hưởng của nồng độ muối đối với tính tan của protein
(*Nguồn: Inyang và Iduh, 1996)
Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau
Log S = B – KI
Trong đó:
S: độ hòa tan của protein
B: hằng số (phụ thuộc vào loại protein, pH và nhiệt độ)
K: hằng số salting out (tùy thuộc vào pH, hỗn hợp và lượng muối trong dung
dịch)
I: cường độ ion của muối
Các muối được dùng để tủa protein thường là các muối sulphate, trong đó phổ
biến hơn cả là (NH4)2SO4 (ammonium sulphate). Lí do là sử dụng (NH4)2SO4 tiết kiệm
về mặt kinh tế và đạt được hiệu quả rất cao, ngoài ra còn giúp ổn định cấu trúc bề mặt
protein (Janson và Ryden, 1998). Nồng độ muối (NH4)2SO4 cần dùng để tủa protein
khác nhau thì khác nhau.
2.3.2.2. Phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ
Nhìn chung phương pháp tủa protein bằng dung môi hữu cơ không khác nhiều
so với tủa bằng muối. Cơ chế của phương pháp này là giảm tính tan của protein và độ
linh động các phân tử nước thông qua các phân tử dung môi hữu cơ. 2 loại dung môi
hữu cơ thường được dùng là acetone và ethanol (Saha, 2004 và Golbeck et al., 2013),
phương pháp này dựa vào hằng số điện môi của các chất trong hệ thống. Các dung môi
hữu cơ có hằng số điện môi thấp sẽ triệt tiêu các phân tử nước liên kết với protein
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
12
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36
Trường ĐHCT
thông qua các liên kết ưu nước trên bề mặt, ngoài ra còn giúp cố định các phân tử nước
làm giảm hằng số điện môi trong môi trường. Do không còn liên kết với nước nữa, các
protein liên kết với nhau thông qua các liên kết cộng hóa trị trên bề mặt và tủa xuống
(Janson và Ryden, 1998). Yếu tố nhiệt độ rất cần được lưu ý trong phương pháp này,
thông thường các phản ứng nên được giữ dưới 4oC để tránh biến tính protein.
2.3.2.3. Phương pháp tủa bằng điểm đẳng điện
Tính tan của protein phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là pH môi
trường. Protein được cấu thành từ những chuỗi polypeptide mà đơn phân là các amino
acid. Mỗi amino acid đều có điểm chung là có nhóm amine (NH2) và carboxyl
(COOH), protein tích điện âm hay dương phụ thuộc vào sự đóng góp của 2 nhóm này.
Điểm đẳng điện (pI) là giá trị pH mà tại đó protein không mang điện, khi pH < pI
protein mang điện tích dương do nhóm amine bị proton hóa, còn khi pH > pI thì
protein mang điên tích âm do nhóm carboxyl mất đi proton (Hình 8). Tựa chung lại,
khi protein mang điện tích dương hay âm thì khả năng tương tác giữa nước và protein
sẽ cao hơn khi protein không mang điện tích, do đó tại điểm đẳng điện protein sẽ thể
hiện tính tan kém nhất (Xia, 2007) (Hình 9).
Hình 8. Cấu trúc amino acid khi pH thay đổi
(*Nguồn: Janson và Ryden, 1998)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến
13
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
