NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM CHẾ TẠO THIẾT BỊ VI LƯU CHO KỸ THUẬT PCR

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

Nguyễn Thị Hồng Thắm

NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM CHẾ TẠO THIẾT BỊ
VI LƯU CHO KỸ THUẬT PCR

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC HỆ CHÍNH QUY
Ngành: Vật lý kỹ thuật

HÀ NỘI - 2011


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ

Nguyễn Thị Hồng Thắm

NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM CHẾ TẠO THIẾT BỊ
VI LƯU CHO KỸ THUẬT PCR

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC HỆ CHÍNH QUY
Ngành: Vật lý kỹ thuật

Cán bộ hướng dẫn: TS. Trần Đăng Khoa
Cán bộ đồng hướng dẫn: TS. Nguyễn Thăng Long

HÀ NỘI - 2011

Lời cảm ơn
Bài báo cáo này được hoàn thành dưới sự giảng dạy và hướng dẫn trực tiếp của
TS. Trần Đăng Khoa và TS. Nguyễn Thăng Long. Với sự kính trọng và lòng biết ơn
sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn các thầy về những sự chỉ dẫn chu đáo, tận tình.
Thời gian em được nghiên cứu cùng các thầy không nhiều nhưng đã giúp em có thêm
được những kiến thức bổ ích, các tư duy và tiến hành công việc một cách có hệ thống,
có hiệu quả và thực tế mà các thầy đã mang lại cho em.
Em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu Trường Đại học Công nghệ - Đại học
Quốc gia Hà Nội, các giảng viên của Khoa Vật lý Kỹ thuật & Công nghệ Nano cũng
như các Khoa khác trong trường đã tạo điều kiện và cung cấp cho em những kiến thức
cơ bản, nền tảng khoa học trong suốt bốn năm học qua.
Em cũng gửi lời cảm ơn đến các cán bộ ở Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa
học và Công Nghệ; phòng thí nghiệm Công nghệ Micro & Nano – Trường ĐH Công
Nghệ (ĐHQGHN), em cảm ơn CN. Nguyễn Thị Hòa và CN. Nguyễn Đức Diệp, cùng
các anh chị làm việc ở công ty Cổ phần Điện tử dân dụng Hanel, những người luôn
giúp đỡ nhiệt tình, góp ý và ủng hộ em hết mình trong quá trình nghiên cứu.
Cuối cùng con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, người luôn là chỗ dựa
tinh thần vững chắc nhất của con, luôn cổ vũ và động viên con. Xin gửi tới những
người thân yêu và bạn bè những tình cảm thân thương nhất!

Xin chân thành cảm ơn mọi người!


Tóm tắt nội dung
Cùng với sự phát triển nhanh chóng của Công nghệ nano việc nghiên cứu và chế
tạo lab-on-chip (phòng thí nghiệm siêu nhỏ tích hợp trên một con chip) ngày càng
được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới bởi tính ứng dụng hiệu quả của
hệ thống nay.
Nội dung nghiên cứu của khóa luận là bước đầu tiếp cận việc chế tạo hệ thống vi
lưu PCR cho việc phân tích DNA. Để thực hiện nghiên cứu này, tôi đã tìm hiểu, thu

thập thông tin về kỹ thuật PCR và công nghệ vi lưu cũng như những ứng dụng của
công nghệ này trong lĩnh vực y sinh để chế tạo hệ vi lưu PCR dùng cho nhân DNA. Sử
dụng phần mềm COMSOL để mô phỏng kênh dẫn vi lưu, mô phỏng quá trình truyền
nhiệt trong vật liệu và tính toán thiết kế hệ thống vi lưu. Dựa trên cơ sở thông tin mô
phỏng có được chế tạo hệ thống vi lưu bằng máy VersaLASER đặt tại phòng thí
nghiệm, Trường ĐH Công Nghệ. Tìm hiểu về quá trình gia nhiệt cho buồng phản ứng
PCR theo cơ chế Peltier.


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan bài khóa luận của tôi không sao chép các tài liệu hay công trình
của người nào khác. Tất cả những lý thuyết và tài liệu đều được trích dẫn rõ ràng ở
trang tài liệu tham khảo của khóa luận này.


Mục lục


Mở đầu
Công nghệ vi lưu ứng dụng trong rất nhiều ngành: Kỹ thuật, Vật lý, Hóa học,
Công nghệ vi chế tạo và Công nghệ sinh học. Công nghệ này đang từng bước trở thành
công nghệ mũi nhọn cho phép chế tạo những vi hệ thống sử dụng những vi thể tích
chất lỏng, (còn được biết đến với cái tên “phòng thí nghiệm siêu nhỏ tích hợp trên một
con chip” lab-on-chip). Hệ thống vi lưu bao gồm hệ phức hợp như bơm, khoang chứa,
khoang trộn, các van đóng mở có khả năng được điều khiển ... Hệ thống này có thể
được sử dụng cho một loạt ứng dụng như dẫn thuốc, in ấn và đặc biệt là ứng dụng
trong lĩnh vực sinh học phân tử như phân tích enzyme, phân tích DNA và proteomic.
Trong công nghệ sinh học đã có rất nhiều các kỹ thuật phân tích DNA như PCR,
RT-PCR là các kỹ thuật nhân gene; ngoài ra còn có các kỹ thuật lai gene như Southern
Blot, lai protein như Wertern Blot… Tất cả các kỹ thuật này nếu thực hiện sẽ cần rất

nhiều hóa chất và thời gian, nhưng với bước tiến của công nghệ chế tạo hệ vi lưu thì
những khó khăn trên có thể được giải quyết.
Trong khuôn khổ khóa luận này tôi tập trung nghiên cứu về hệ thống vi lưu ứng
dụng trong việc phân tích DNA, cụ thể hơn là hệ thống vi lưu dùng cho phản ứng
PCR. Để tiếp cận với việc chế tạo và ứng dụng thiết bị vi lưu trong công nghệ sinh học
phân tử, tôi đã dựa vào hiểu biết kỹ thuật PCR thông thường để thiết kế hê vi lưu PCR;
tiến hành sử dụng phần mềm COMSOL để mô phỏng kênh dẫn vi lưu, mô phỏng quá
trình truyền nhiệt trong vật liệu và tính toán thiết kế hệ thống vi lưu. Dựa trên cơ sở
thông tin mô phỏng có được chế tạo hệ thống vi lưu bằng máy VersaLASER đặt tại
phòng thí nghiệm nhà G2 - Trường ĐH Công Nghệ (ĐHQGHN).

1


Chương 1. Tổng quan tài liệu
1.1. Công nghệ Nano Sinh học
1.1.1. Giới thiệu về công nhệ nano sinh học
Với sự phát triển nhanh chóng và bao gồm nhiều lĩnh vực, công nghệ nano cho
đến nay vẫn chưa có được một định nghĩa thống nhất. Theo cơ quan hàng không vũ trụ
Hoa Kỳ (NASA), công nghệ nano là công nghệ chế tạo ra các cấu trúc, vật liệu, thiết
bị và hệ thống chức năng với kích thước đo bằng nanometer (khoảng từ 1 đến 100 nm)
và khai thác ứng dụng các đặc tính độc đáo của những sản phẩm này [15]. Công nghệ
nano cũng có thể hiểu là ngành công nghệ dựa trên các hiểu biết về các quy luật, hiện
tượng, tính chất của cấu trúc vật lý có kích thước đặc trưng ở thang nano[2].
Như vậy, khái niệm trọng tâm ở đây là cấu trúc, vật liệu nano. Cấu trúc nano
được hiểu là các hệ thống có kích cỡ thuộc thang nano gồm các nguyên tử, phân tử
được sắp đặt sao cho cả hệ thống thực hiện được các chức năng định trước. Trên cơ sở
phân loại hình học, cấu trúc nano có thể là hạt nano, sợi, dây hoặc ống nano, lớp nano
hay màng mỏng nano. Về chức năng, cấu trúc nano có thể được phân thành: (i) Vật
liệu nano như các hạt nano; (ii) Linh kiện nano (nanodevices) như các cảm biến nano

(nanosensor); (iii) Các máy nano như các phân tử protein có khả năng tự lắp ráp[2].
Trên cơ sở công nghệ nano và công nghệ sinh học, các nguyên tử hay phân tử có
thể được thiết kế và ghép lại với nhau để tạo ra một số loại linh kiện, cấu trúc nano
như chip sinh học có phạm vi ứng dụng rộng rãi trong khoa học sự sống, đặc biệt trong
y – dược. Có nhiều cách định nghĩa công nghệ sinh học nano (nanobiotechnology/
nano – biotechnology/ nanobiotech). Thuật ngữ này có thể được sử dụng để mô tả
những vấn đề chung của công nghệ nano và sinh học. Công nghệ nano sinh học cũng
có thể được xem là những ứng dụng công nghệ nano vào lĩnh vực nghiên cứu sinh học,
tìm kiếm dược phẩm và dẫn chuyển thuốc hướng đích, các vật liệu nano mới, các thiết
bị chẩn đoán, trị liệu giúp loại bỏ các thể ngoại lai khỏi cơ thể, sửa chữa tế bào và
mô…[1].
Trong tự nhiên luôn luôn tồn tại các quá trình vật thể cấu trúc ở mức độ nano. Rất
nhiều hệ thống sinh học như các virut, phức hợp protein và màng… có cấu trúc nano
và công nghệ sinh học nano chính là sự sinh trưởng của các tế bào và mô đa chức năng
ở thực vật và động vật từ một tế bào sinh vật.

2


1.1.2. Phạm vi ứng dụng của công nghệ nano sinh học

Hình 1. Phạm vi ứng dụng của công nghệ nano sinh học [14]

Trên thế giới, các bài báo khoa học về công nghệ nano xuất hiện từ giữa thập kỷ
90. Từ đó đến nay, số lượng hồ sơ đăng ký bảo hộ sáng chế trong lĩnh vực công nghệ
nano tăng rất mạnh (từ 500 hồ sơ/ năm 1998 lên 1300 hồ sơ/ năm 2000) chứng tỏ tính
hấp dẫn và giá trị ứng dụng to lớn của ngành khoa học mới mẻ này. Phạm vi ứng dụng
của công nghệ sinh học nano rất rộng, từ lĩnh vực y học, dược phẩm, sinh học, tới các
ngành công nghiệp thực phẩm và nông nghiệp.
Trong lĩnh vực sinh học, công nghệ sinh học nano được ứng dụng để nghiên cứu

bộ gene học (genomics), tin sinh học (bioinformatics), xác định trình tự gene, tìm kiếm
và sàng lọc nhanh dược phẩm…
Đối với y học, một trong những lĩnh vực ứng dụng chủ yếu của công nghệ sinh
học nano, các vấn đề chính bao gồm: Tái sinh mô (tissue regeneration), nuôi cấy và
sửa chữa các cơ quan (growth anh repair of organs), các hệ thống dẫn chuyển và
hướng đích dược phẩm (drug – targeting anh delivery systems). Đặc biệt, các hệ thống
dẫn chuyển và hướng đích dược phẩm trên cơ sở công nghệ nano ngày càng được

3


quan tâm nghiên cứu và đưa vào ứng dụng, bởi vì trên thực tế hầu hết dược phẩm
khong chỉ có các tác dụng dược lý hữu ích mà còn có những tác dụng phụ. Các hệ
thống này bao gồm những hạt nano (nanoparticles) là vector điều khiển dược phẩm tác
động trực tiếp và tế bào đích và không gây ảnh hưởng đến các tế bào xung quanh [1].
Trong lĩnh vực dược phẩm, công nghệ nano sinh học cùng với ngành hóa học đã
tạo ra sự phát triển mạnh mẽ của mảng tìm kiếm dược phẩm. Những triển vọng mới
của công nghệ dược phẩm đã mở ra cùng với sự ra đời và phát triển của công nghệ
DNA chip hay DNA microarray. Chẳng hạn, trong trường hợp ưng thư thể tăng sinh tế
bào lympho B, hầu hết bệnh nhân ban đầu phản ứng rất tốt đối với phương pháp trị
liệu chuẩn. Sau đó, hơn một nửa những trường hợp này nhanh chóng chuyển sang tình
trạng nguy kịch. Một vài năm trước đây, các nhà điều trị không có cách nào để phát
hiện các bệnh nhân thuộc nhóm có nguy cơ rủi ro cao này để điều trị tích cực. Gần
đây, công nghệ sinh học cho phép các nhà nghiên cứu phân biệt giữa các nhóm bệnh
nhân có thể chống lại bệnh tật trong một thời gian dài và ngắn dựa trên sự khác biệt
tổng thể của các hoạt động liên quan đến hàng trăm gene trong các tế bào khối u của
họ vào thời điểm chẩn đoán. Thành tựu này là cơ sở để đưa ra thử nghiệm chẩn đoán
các bệnh nhân có nguy cơ cao.
Trong các ngành công nghiệp thực phẩm và nông nghiệp, công nghệ nano sinh
học được ứng dụng để bảo quản thực phẩm, chế tạo các màng nhựa tổng hợp nano có

thể phân hủy sinh học, trong các kỹ thuật siêu lọc.v.v… (Hình 1).

1.2. Lab on a chip, chip sinh học
1.2.1. Lab-on-chip
Đây là thuật ngữ chỉ nhiều phép phân tích xử lý mẫu DNA, tiến hành song song
và được thực hiện trên cùng một chip. Về cơ bản: chip DNA là các sensor DNA thu
nhỏ, có thể phân tích đồng thời nhiều thông số (massive parallel analysis) tức thời và
song song (Hình 2).

4


Hình 2. Mô hình một biochip [6]

1.2.2. Chip DNA / Microarray
Một thiết bị siêu nhỏ, chứa các đoạn DNA hoặc các vật liệu sinh học khác
(protein, tế bào) cho phép thực hiện song song hàng chục nghìn phản ứng phân tử trên
cùng một miếng vật liệu có diện tích khoảng 1cm.
Cấu trúc
Thiết bị thu nhỏ gồm một bề mặt chất rắn (đế) có cấu trúc & thành phần hóa học
xác định, trên đó được gắn các mẫu dò DNA (probe) là các sợi đơn (single strand)
bằng các liên kết hoá học (cộng hóa trị) hoặc vật lý (hấp phụ, đơn phân tự lắp ráp Self Asembly Monolayer - SAM). Đây là phần thụ thể sinh học của chip DNA (còn
được gọi là DNA probe arrays).

5


Các mẫu dò DNA
Gene hoặc một trình tự xác định ngắn và với số lượng từ hàng trăm đến hàng
nghìn tùy thuộc vào mục đích sử dụng của chip và là thông số quyết định độ phức tạp

(complexity) của chip.
Nguyên lý hoạt động
Dựa trên khả năng nhận dạng (sensing) chọn lọc và tức thời các DNA đích
(target) khi các DNA mẫu dò và đích kết hợp với nhau tạo thành sợi kép nhờ sự ghép
cặp bổ sung giữa các base A, T, G, C trong quá trình lai phân tử:
–

A-T và G-C.

–
Nếu phân tử DNA đích liên kết với mẫu dò có trình tự là ATCGGC thì
có thể suy ra trình tự bổ sung của phân tử DNA đích này.
–
RNA cũng tuân theo nguyên tắc ghép cặp base nghiêm ngặt khi kết hợp
với DNA.
–
Do vậy rất dễ dàng suy luận trình tự của bất kỳ sợi RNA nào bắt cặp với
DNA trên microarray.
Ưu điểm:


Thể tích nhỏ (vài µl) để phân tích



Phân tích đồng thời (arrays) => hiệu suất cao



Giảm thời gian cho 1 mẫu phân tích



Tăng độ chính xác



Dễ dàng lặp lại

Tại sao chip có thể thực hiện đồng thời hàng loạt phản ứng trong một thí nghiệm
dưới những điều kiện gần như nhau?
Câu trả lời là mỗi loại mẫu dò được định vị ở một vị trí cố định trên đế của chip
& các phân tử DNA hay RNA đưa lên bề mặt array đã đánh dấu (ví dụ, bằng
huỳnh quang) có thể được phát hiện trên máy quét. Khi chip được quét thì máy
tính sẽ chuyển số liệu thô sang kết quả có thể đọc được.

6


Nhận dạng DNA đích
•

Phương pháp quang học:
– Huỳnh quang
– Phương pháp SPR (Surface Plasmon Resonance)

•

Phương pháp nhận biết điện hóa
– Sử dụng tính chất hoạt động điện hóa (oxi hóa - khử) nội tại của các

bazơ (A, G, C)
– Sử dụng các hợp chất hoạt động điện hóa (electroactive intercalation)
– Sử dụng các polyme chức năng hoạt động điện

Chất huỳnh quang (HQ) được gắn vào các DNA đích (thường trong quá trình
PCR). Khi lai với các DNA mẫu dò, chất HQ sẽ được phát hiện. Đây là phương pháp
có độ nhạy cao nhưng đòi hỏi quá trình chuẩn bị đánh dấu (labelling) khá công phu.

1.2.3. Chip protein
Lai các protein trên bề mặt chip
• Sử dụng kỹ thuật di truyền để xử lý các protein nhằm đính lên bề mặt.
Đối với các protein tái tổ hợp, cách thích hợp nhất là gắn các đuôi vào đầu N
hoặc C. His-tag có thể được sử dụng để lai các protein có đính Ni 2+ trên bề mặt
chip
• Phương pháp khác liên quan đến đầu N là gắn serine hay threonine
vào trình tự protein tạo cơ sở để gắn đặc hiệu vị trí với poly ethylene glycol.
Các đuôi khác như protein đặc hiệu biotin cũng đã đợc sử dụng để lai và cho
kết quả tốt.
• Đối với các protein không tái tổ hợp, các phương pháp khác để lai có
định hướng dựa trên các nhóm chức năng sẵn có trong protein. Đại đa số
phương pháp được xây dựng cho các kháng thể đơn dòng và được thiết kế
nhằm đảm bảo các vị trí đặc hiệu kháng nguyên của kháng thể hướng ra khỏi bề
mặt chip.

7


Ứng dụng của Biochip
Các lĩnh vực chính sử dụng công nghệ chip DNA là nghiên cứu kiểu gen, phát
hiện đa hình nucleotide đơn, phân tích sự biểu hiện gen, đột biến… Chip DNA được

ứng dụng trực tiếp trong các ngành y - dược để tìm kiếm dược phẩm, xác định độ an
toàn của thực phẩm & môi trường, trong quân sự để phát hiện vũ khí sinh học…
Hướng ứng dụng về kiểu gen: Kỹ thuật MicroArray có thể cho biết, nguyên nhân
lây nhiễm chính xác của bệnh nhân có triệu chứng giống cúm (như đau đầu, sốt cao và
khó thở). Bề mặt của MicroArray có thể được gắn các DNA đại diện cho các gen chỉ
xuất hiện trong những tác nhân gây bệnh chọn lọc và phòng thí nghiệm y học có thể
tách chiết và đánh dấu DNA từ mẫu mô lây nhiễm (ví dụ, từ dịch mũi của bệnh nhân).
Sự kết hợp giữa DNA của bệnh nhân với một số trình tự gen trên chip có thể cho biết
đâu là tác nhân gây bệnh. Tương tự, hiện nay nhiều chip đang được thiết kế nhằm xác
định các loại vi khuẩn than đặc biệt dùng trong khủng bố sinh học hay các mầm bệnh
khác xâm nhập vào cộng đồng.
Nghiên cứu sự biểu hiện gene: trên cơ sở xác định lượng mRNA có trong mẫu
mô. Các chip xác định trực tiếp lượng protein mặc dù rất phức tạp cũng đang được
nghiên cứu thiết kế. Các nhà sinh học tế bào thường sử dụng loại array này để thu thập
các thông tin về những protein chiếm ưu thế sau khi mô chịu tác động bởi những điều
kiện khác nhau.

1.3. Hệ thống vi lưu
Hệ thống vi lưu là một lĩnh vực mới thú vị của khoa học và kỹ thuật cho phép
phân tích kiểm soát trên quy mô rất nhỏ và thiết bị nhỏ gọn, tiết kiệm chi phí, hiệu quả
và mạnh hơn hệ thống thông thường khác.
Vi lưu đã xuất hiện vào đầu những năm 1980 và được sử dụng trong việc phát
triển DNA chip, phòng thí nghiệm trên một công nghệ vi mạch (lab-on-chip), công
nghệ vi nhiệt.v.v…

8


Hình 3. Hình ảnh thiết bị của hệ thống vi lưu

Vi lưu khống chế và điều khiển dòng chất lỏng trong một không gian, một thế
tích siêu nhỏ cỡ dưới milimet (micromet, nanomet…) [4].
Một thiết bị vi lưu có thể có một hoặc nhiều kênh với ít nhất một kích thước nhỏ
hơn 1 mm. Chất lỏng thường được sử dụng trong các thiết bị vi lưu bao gồm toàn bộ
mẫu máu, tế bào vi khuẩn, protein, DNA, hóa chất dùng cho các phản ứng sinh hóa...
Việc điều khiển dòng chảy của chất lỏng ở những kích thước siêu nhỏ phụ thuộc
nhiều yếu tố khác nhau như: Sức căng bề mặt của chất lỏng, sự mất mát năng lượng,
sức cản chất lỏng…
Công nghệ vi lưu đòi hỏi sự kết hợp của các ngành Kỹ thuật, Vật lý, Hóa học,
Công nghệ vi chế tạo và Công nghệ sinh học. Công nghệ này đang từng bước trở thành
một công nghệ mũi nhọn cho phép chế tạo những vi hệ thống sử dụng vi thể tích chất
lỏng.
Những nghiên cứu trong công nghệ sinh học thường đòi hỏi một số lượng khá lớn
những trang thiết bị và phòng thí nghiệm, cụ thể là những phân tích DNA, những
nghiên cứu về các loại thuốc, những trang thiết bị thu thập thông tin về người bệnh
như film chụp X-quang, cắt lớp… Hầu hết những quá trình nêu trên đều đòi hỏi phải
khống chế và điều khiển được dòng chảy của chất lỏng. Nhu cầu sử dụng thường
xuyên và liên tục đòi hỏi những thiết bị này phải nhỏ gọn, tiện dụng và có thế mang ra
khỏi các phòng thí nghiệm. Chính vì lẽ đó mà xu hướng “càng nhỏ càng tốt” đang dần
biến đổi “thế giới lỏng” theo một cuộc cách mạng tương tự như cuộc cách mạng về
công nghiệp điện tử khi transistor ra đời. Trên thực tế có rất nhiều những nghiên cứu,
những ứng dụng trong công nghệ sinh học cần phải thao tác với dòng chảy của chất
lỏng trong những kênh dẫn rất nhỏ, lĩnh vực này được gọi tên là vi lưu. Lĩnh vực này
đòi hỏi sự nghiên cứu tổng hợp ba vấn đề: nghiên cứu phương pháp mới nhằm chế tạo

9


ra những hệ thống điều khiển chất lỏng, nghiên cứu những phương pháp tích hợp
những chức năng phức tạp của chất lỏng vào trong một thiết bị, và nghiên cứu về cách

thức, đặc điểm của chất lỏng khi nó chảy trong những kênh dẫn siêu nhỏ. Sự phát triển
của công nghệ vi lưu đang góp phần tạo ra những phương pháp thí nghiệm mới trong
ngành sinh học cơ bản, ngành khoa học vật liệu và hóa lý.
Các hệ thống vi lưu gồm rất nhiều loại khác nhau tương ứng với nhiều ứng dụng
khác nhau như: những ứng dụng trong ngành công nghiệp in phun, trong pin nhiên liệu
lỏng, nghiên cứu hóa sinh, tổng hợp hóa chất, tách chiết DNA ra khỏi tế bào, phân tích
di truyền, phân tích PCR, bào chế thuốc.v.v…
Mọi hệ thống vi lưu đều được cấu thành từ những thành phần cơ bản như: máy
bơm, van, bộ trộn, bộ lọc, bộ chia… Trong ngành vi điện tử, kích thước của linh kiện
không làm ảnh hưởng đến tính năng của linh kiện, nhưng trong công nghệ vi lưu dòng
chảy trong thể tích nhỏ khác khá nhiều so với dòng chảy trong thể tích lớn hơn, điều
này có thể quan sát thấy trong thực tế đời sống. Cụ thể hơn nữa khi các thiết bị vi lỏng
điều khiển các dòng chảy trong những thể tích chỉ cỡ microlit hoặc nhỏ hơn đến cỡ
picolit thì sự khác biệt trên lại trở nên cực kỳ rõ ràng. Những thiết bị phần cứng của
các thiết bị vi lưu đòi hỏi phương pháp thiết kế và chế tạo rất khác so với những thiết
bị siêu nhỏ khác. Khi kích thước của một thiết bị hay một hệ thống vi lưu được làm
nhỏ hơn thì cách thức hoạt động của chất lỏng đột ngột thay đổi. Những hiệu ứng
không đáng kể trong quy mô lớn cũng trở nên vượt trội hơn, rõ rệt hơn trong quy mô
rất nhỏ. Đó chính là hiện tượng mao dẫn sẽ xuất hiện khi chất lỏng chảy trong những
ống có tiết diệt nhỏ hơn 1mm, nhưng hiện tượng này lại không xuất hiện khi chất lỏng
chảy trong những ống có thiết diện rất lớn [8].
Trong thời kỳ khủng hoảng về nhiên liệu của thế giới thì việc nghiên cứu và phát
triển ngành công nghệ vi lưu đang trở nên có ý nghĩa hơn. Các hệ thống vi lưu thường
có kích thước rất nhỏ, việc chế tạo ra chúng sử dụng ít nhiên liệu hơn, rẻ hơn và rất dễ
dàng chế tạo hàng loạt. Thêm nữa là các kênh dẫn trong thiết bị vi lưu chỉ có thể tích
vài nanolit, các mẫu thử cũng trở nên rất nhỏ, lượng thuốc thử sử dụng cũng rất ít, do
đó mà việc phân tích các kết quả thí nghiệm cũng trở nên dễ dàng hơn, tiết kiệm
nguyên liệu hơn.
Đến đây chúng ta có thể thấy được sự tương đồng giữa ngành công nghệ vi điện
tử và công nghệ vi lưu, đó là cố gắng tích hợp nhiều thiết bị, nhiều chức năng chỉ trên

một con chip. Trong tương lai chúng ta hoàn toàn có thể tin tưởng khả năng các thiết
bị nghiên cứu phân tích có thể được tích hợp trên một thiết bị cầm tay. Cũng không có

10


gì phải ngạc nhiên khi trong tương lai ngành công nghệ vi lưu sẽ tạo ra những bước
tiến nhảy vọt cho các ngành khoa học khác, đặc biệt là lĩnh vực y sinh.

1.4. PCR, Cơ sở của phản ứng PCR
1.4.1. Giới thiệu về kỹ thuật PCR
PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được dịch ở một vài
sách là Phản ứng chuỗi trùng hợp cũng có sách gọi là "phản ứng khuếch đại gen". PCR
là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản
sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm
men. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục
đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh
nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống.
Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh ra, ông đã đoạt giải
Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông
đưa ra ý tưởng. Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên
nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase.
DNA polymerase có tự nhiên trong sinh vật sống, nơi mà nó thực hiện chức năng
nhân DNA khi tế bào phân chia. Nó làm việc bằng cách nối với sợi DNA và tạo sợi bổ
sung. Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA được thực
hiện trong ống nghiệm (in vitro). Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở
96 °C. Tuy nhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase bị phá hủy vì vậy cần bổ sung
enzyme sau mỗi giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ. Quy trình PCR gốc của Mullis
không có hiệu quả cao vì nó mất nhiều thời gian, cần một lượng lớn DNA polymerase,
và phải liên tục lưu ý suốt trong quá trình PCR.

Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA-Polymerase lấy
từ vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên
110 °C. DNA polymerase từ sinh vật này là thermostable (ổn định ở nhiệt độ cao) và
khi dùng trong PCR nó không bị phá vỡ khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợi
DNA. Từ đó, không cần phải thêm DNA-polymerase vào mỗi chu kỳ, quá trình sao
chép DNA có thể đơn giản và tự động hơn.
Một trong những DNA-polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được từ
Thermus aquaticus và được gọi là Taq. Taq polymerase được dùng rộng rãi trong thực
nghiệm PCR (5/2004). Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong quá

11


trình sao chép DNA, dẫn đến đột biến (sai) trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa sai
exonuclease 3’-5’. Các polymerase như Pwo hay Pfu, được phân lập từ Archaea có cơ
chế sửa sai (cơ chế kiểm tra lỗi sai) và có thể làm giảm một cách đáng kể số đột biến
xảy ra trong chuỗi DNA được sao chép. Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu có thể
cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn sự nhân bản chính xác của DNA [13].
1.4.2. Sự ra đời của kỹ thuật PCR
Những phát minh cơ bản mà nếu không có chúng thì sẽ không có phát minh ra
PCR:
1) Năm 1953, Watson, Crick & Wilkens công bố công trình mô tả cấu trúc
xoắn kép và đưa ra ý tưởng sao chép của phân tử DNA (giải thưởng Nobel
1962)
- DNA gồm 4 bases, liên kết với nhau bởi các phân tử đường deoxyribose và các
gốc phosphate.

Hình 4. Thành phần cơ bản để tạo nên phân tử DNA là các mononucletide

- Hai sợi của phân tử DNA chạy ngược chiều nhau

- Mặt phẳng của các bases nằm vuông góc với trục xoắn ốc, mặt phẳng của các
phân tử đường gần như thẳng đứng.
- Hai sợi của phân tử DNA được liên kết với nhau bởi các cầu nối hydrogen giữa
các bases: adenine-thymine; cytosine-guanine

12


2) Năm 1950's, Arthur Kornberg phân lập nghiên cứu enzyme DNA
polymerase từ E. coli (Pol I) và cơ chế sinh tổng hợp DNA (giải thưởng
Nobel 1959)

- Tổng hợp DNA cần dNTPs
- Muốn phát hiện được dNTPs đính vào phân tử DNA cần đánh dấu đồng vị
phóng xạ phân tử phosphate của dNTPs và kết tử DNA bằng tricloroacetic acid - TCA.
- Chọn E. coli làm đối tượng nghiên cứu vì vậy thu được một lượng lớn tế bào và
từ đó thu được một lượng lớn enzyme và nghiên cứu 1 enzyme quan trọng từ E. coli enzyme xúc tác sinh tổng hợp DNA - Ông đặt tên là DNA polymerase. Hiện nay là
DNA polymerase - chìa khóa mở đầu cho rất nhiều nghiên cứu sau này.
3) Năm 1969, Brock & Freeze: mô tả vi khuẩn thermus aquaticus chịu nhiệt.
4) Năm 1970, Klenow & Henningsen tạo ra mảnh Klenow bằng enzyme thủy
phân hoạt tính exonuclease đầu 5' của E. coli pol 1
5) Ý tưởng của Cary Mullis và thí nghiệm của ông về phát minh PCR. (giải
thưởng Nobel năm 1993)
- Năm 1983, ông đã cân nhắc làm thế nào để sử dụng polymerase DNA với mồi
oligonucleotide để xác định một nucleotide được ở một vị trí nhất định trong một phân
tử DNA phức tạp, chẳng hạn như hệ gene của người. Trong ổ đĩa này ông đã phát
minh hay phát hiện ra phương pháp tạo bản sao DNA không giới hạn từ một bản sao
của DNA, và được gọi là phương pháp "phản ứng chuỗi polymerase (PCR)"
Sau công bố của Cary Mullis phải có những phát minh say đây thì chúng ta mới
có được PCR hoàn hảo như ngày nay:

- Năm 1984, ông đã tiến hành thí nghiệm đầu tiên thành công cùng với Klenow
Fragment
- Năm 1988, Saiki sử dụng DNA - polymerase chịu nhiệt trong phản ứng PCR
- Cùng năm 1988, Perkin Elmer- hãng đầu tiên sản xuất máy chu kỳ nhiệt tự động
(Thermocycle)
- Năm 1989, Lawyer và cs Taq tái tổ hợp trong E. coli
- Năm 1990's, thập kỷ đưa PCR vào nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi (chẩn đoán,
lập bản đồ di truyền, xác định trình tự DNA, tạo đột biến DNA in vitro...).

13


1.5. Hệ vi lưu PCR
Việc thu nhỏ kích thước của sinh học và hóa học trong phân tích của các thiết bị
công nghệ vi-điện-cơ-hệ thống (MEMS) đã đặt ra một ảnh hưởng quan trọng trên các
lĩnh vực như chẩn đoán y tế, phát hiện vi sinh vật và sinh học phân tích khác. Trong số
rất nhiều các thiết bị thu nhỏ phân tích, các chuỗi phản ứng polymerase vi mạch (PCR)
/ microdevices được nghiên cứu rộng rãi, và do đó sự tiến bộ lớn đã được thực hiện
trên các khía cạnh của vi gia trên chip (chế tạo, liên kết và đóng dấu), lựa chọn vật liệu
bề mặt, hóa học bề mặt và kiến trúc của buồng phản ứng, xử lý mẫu chất lỏng cần
thiết, kiểm soát của ba hoặc thermocycling nhiệt độ hai bước, phát hiện các sản phẩm
khuếch đại acid nucleic, tích hợp với các đơn vị phân tích chức năng chẳng hạn như
chuẩn bị mẫu, điện mao dẫn (CE), lai tạo DNA microarray, vv…

Hình 5. Sơ đồ minh họa các thiết bị vi lưu trên chip cho hệ thống phân tích DNA [12]

Trong đó bao gồm: (A) – phân loại, sàng lọc, phân tích các tế bài hoạt động
chống lại chất kích thích; (B) – ly giải tế bào; (C) – PCR và thu hồi DNA của kháng
thể đặc hiệu từ một ngăn riêng biệt.
Công nghệ vi lưu sẽ đại diện cho một công nghệ trung tâm trong nhiều hệ thống

thu nhỏ được sử dụng cho hóa học, sinh học và y tế ứng dụng, có tiến bộ hứa hẹn cách
mạng hóa nhiều quá trình phát hiện các mầm bệnh hoặc chất gây ô nhiễm môi trường.
Trong số các microfluidics, các dụng cụ PCR thu nhỏ (hay gọi là PCR microfluidics)
đã trở thành một công cụ rất quan trọng. Quá trình PCR được sử dụng rộng rãi như
một công cụ sinh học phân tử để tái tạo ADN, và có thể tạo ra các bản sao của đoạn cụ

14


thể của DNA qua các chu trình nhiệt. Mỗi một chu kỳ nhiệt độ có thể tăng gấp đôi
DNA, và như vậy 20-35 chu kỳ có thể tạo ra hàng triệu bản DNA. Tuy nhiên, dụng cụ
PCR thông thường, để phân tích PCR hoàn chỉnh cần khoảng 1-2 h. Tất cả các loại
công nghệ PCR vi lỏng đã tạo điều kiện khuếch đại DNA với tỷ lệ nhanh hơn nhiều đó
là kết quả tốc độ truyền nhiệt lớn hơn.
Việc ứng dụng các thiết bị thu nhỏ của PCR đạt được nhiều cải tiến, chủ yếu bao
gồm giảm chi phí chế tạo và sử dụng; tiết kiệm được thời gian khuếch đại DNA; lượng
mẫu tiêu thụ ít; giảm việc sinh ra các sản phẩm PCR không đặc hiệu khác; tăng tính di
động và hội nhập của các thiết bị PCR. Ngoài ra, thực hiện được một số lượng lớn các
phân tích khuếch đại song song trên cùng một chip vi lưu PCR.

1.6. Giới thiệu phần mềm COMSOL
Mô phỏng hiện tượng khoa học đã nhanh chóng trở thành một phần của việc thiết
kế và tối ưu hóa quy trình trong tất cả các lĩnh vực kỹ thuật.
COMSOL là môi trường cho phép bạn thực hiện các nghiên cứu khoa học liên
quan đến tất cả các chủ đề được xây dựng trên một multiphysics-mô hình hóa nền tảng
duy nhất với phương trình dựa trên giao diện trực quan.
COMSOL cho phép bạn mô hình và giải quyết mọi thứ, từ công nghệ nano đến
thiên văn học…
Một vài ứng dụng mô-đun cụ thể có sẵn cho COMSOL Multiphysics
 AC / DC Module

 Âm Module
 CAD Import Module

Module

Chemical Engineering

 Khoa học Trái đất Module
 Heat Transfer Module
 Thư viện vật liệu
 MEMS Module
 RF Module
 Cấu trúc cơ Module Hình 6. Các module có sẵn trong COMSOL Multiphysics

15


Chương 2. Các phương pháp thực nghiệm

2.1. Thực hiện phản ứng PCR
2.1.1. Các thành phần tham gia phản ứng
- Sợi khuôn (DNA hoặc cDNA)
- Các mồi (oligonucleotide primers)
- DNA polymerase chịu nhiệt (Taq)
- dNTP's
- Dung dịch đệm
- Ion Mg++
2.1.2. Các bước của phản ứng PCR
- Biến tính DNA: 94-95oC, 30-60 giây
- Bắt cặp của mồi vào sợi khuôn: 40-72oC, 30-60 giây

- Phản ứng kéo dài chuỗi: 72oC, 60s/1kb
Ba bước trên hình thành 1 chu kỳ. Phản ứng PCR được tiến hành trong khoảng
25-40 chu kỳ.
Trong kỹ thuật PCR thông thường người ta thực hiện bước biến tính DNA trước
khi bước vào chu kỳ. Bước này thường được thực hiện ở 94-95oC, 2-3 phút.
Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR BioRad.

2.2. Mô phỏng kênh dẫn vi lưu, sử dụng chương trình COMSOL
2.2.1. Áp suất và nguyên lý đo áp suất chất lưu
2.2.1.1. Áp suất và đơn vị đo
Áp suất là đại lượng có giá trị bằng tỉ số giữa lực tác dụng vuông góc lên một mặt
với diện tích của nó:

16


(2.1)
Trong đó: p là áp suất; dF là lực tác dụng; ds là diện tích mặt.
Đối với các chất lỏng, khí hoặc hơi (gọi chung là chất lưu), áp suất là một thông
số quan trọng xác định trạng thái nhiệt động học của chúng. Trong công nghiệp, việc
đo áp suất chất lưu có nghĩa rất lớn trong việc đảm bảo an toàn cho thiết bị cũng như
giúp cho việc kiểm tra và điều khiển hoạt động của máy móc thiết bị có sử dụng chất
lưu.
Trong hệ đơn vị quốc tế (SI) đơn vị áp suất là pascal (Pa): 1 Pa là áp suất tạo bởi
một lực có độ lớn bằng 1N phân bố đồng đều trên một diện tích 1m 2 theo hướng pháp
tuyến.
Đơn vị Pa tương đối nhỏ nên trong công nghiệp người ta còn dùng đơn vị áp suất
là bar (1 bar = 105 Pa) và một số đơn vị khác.
2.2.1.2. Nguyên lý đo áp suất
Đối với chất lưu không chuyển động, áp suất chất lưu là áp suất tĩnh (pt):

p = pt

(2.2)

Do vậy đo áp suất chất lưu thực chất là xác định lực tác dụng lên một diện tích
thành bình. Đối với chất lưu không chuyển động chứa trong một ống hở đặt thẳng
đứng, áp suất tĩnh tại một điểm M cách bề mặt tự do một khoảng (h) xác định theo
công thức sau:
(2.3)
Trong đó:
P0 - áp suất khí quyển.
- khối lượng riêng chất lưu.
g - gia tốc trọng trường.
Để đo áp suất tĩnh có thể tiến hành bằng các phương pháp sau:
- Đo áp suất chất lưu lấy qua một lỗ được khoan trên thành bình nhờ
cảm biến thích hợp.
-

Đo trực tiếp biến dạng của thành bình do áp suất gây nên.

17


Trong cách đo thứ nhất, phải sử dụng một cảm biến đặt sát thành bình. Trong
trường hợp này, áp suất cần đo được cân bằng với áp suất thủy tĩnh do cột chất lỏng
mẫu tạo nên hoặc tác động lên một vật trung gian có phần tử nhạy cảm với lực do áp
suất gây ra. Khi sử dụng vật trung gian để đo áp suất, cảm biến thường được trang bị
thêm bộ phận chuyển đổi điện. Để sai số đo nhỏ, thể tích chết của kênh dẫn và cảm
biến phải không đáng kể so với thể tích tổng cộng của chất lưu cần đo áp suất.
Trong cách đo thứ hai, người ta gắn lên thành bình các cảm biến đo ứng suất để

đo biến dạng của thành bình. Biến dạng này là hàm của áp suất.
Đối với chất lưu chuyển động, áp suất chất lưu (p) là tổng áp suất tĩnh (p t) và áp
suất động (pđ):
(2.4)
Áp suất tĩnh tương ứng với áp suất gây nên khi chất lỏng không chuyển động,
được đo bằng một trong các phương pháp trình bày ở trên. Áp suất động do chất lưu
chuyển động gây nên và có giá trị tỉ lệ với bình phương vận tốc chất lưu:

(2.5)
Trong đó

là khối lượng riêng chất lưu.

Khi dòng chảy va đập vuông góc với một mặt phẳng, áp suất động chuyển thành
áp suất tĩnh, áp suất tác dụng lên mặt phẳng là áp suất tổng. Do vậy, áp suất động được
đo thông qua độ chênh lệch giữa áp suất tổng và áp suất tĩnh.

2.2.2. Lưu lượng
Lưu lượng chất lưu là lượng chất lưu chảy qua tiết diện ngang của ống trong một
đơn vị thời gian. Tùy theo đơn vị tính lượng chất lưu (theo thể tích hoặc khối lượng)
người ta phân biệt:
-

Lưu lượng thể tích (Q) tính bằng m3/s, m3/giờ …

-

Lưu lượng khối (G) tính bằng kg/s, kg/giờ …

Lưu lượng trung bình trong khoảng thời gian ∆ t = t2 - t1 xác định bởi biểu thức:

(2.6)
Trong đó ∆ V, ∆ m là thể tích và khối lượng chất lưu chảy qua ống trong khoảng
thời gian khảo sát.

18


Lưu lượng tức thời xác định theo công thức:
(2.7)
Để đo lưu lượng người ta dùng các lưu lượng kế. Tùy thuộc vào tính chất chất
lưu, yêu cầu công nghệ, người ta sử dụng các lưu lượng kế khác nhau. Nguyên lý hoạt
động của các lưu lượng kế dựa trên cơ sở:
- Đếm trực tiếp thể tích chất lưu chảy qua công tơ trong một khoảng
thời gian xác định ∆ t.
-

Đo vận tốc chất lưu chảy qua công tơ khi lưu lượng là hàm của vận

tốc.
- Đo độ giảm áp qua tiết diện thu hẹp trên dòng chảy, lưu lượng là hàm
phụ thuộc độ giảm áp.
Tín hiệu đo biến đổi trực tiếp thành tín hiệu điện hoặc nhờ bộ chuyển đổi điện
thích hợp.

Phương trình Navier Stoke
Phương trình Navier-Stokes, được đặt tên theo Claude-Louis Navier và George
Gabriel Stokes, miêu tả dòng chảy của các chất lỏng và khí (gọi chung là chất lưu).
Những phương trình này thiết lập trên cơ sở biến thiên động lượng trong những thể
tích vô cùng nhỏ của chất lưu đơn thuần chỉ là tổng của các lực nhớt tiêu tán (tương tự
như ma sát), biến đổi áp suất, trọng lực, và các lực khác tác động lên chất lưu - một

ứng dụng của định luật 2 của Newton.
Phương trình Navier-Stokes được xây dựng từ sự bảo toàn của khối lượng, động
lượng, và năng lượng được viết cho một thể tích đang xem xét bất kì. Dạng tổng quát
nhất của hệ phương trình Navier-Stokes là:

(2.8)
Đây chỉ là định luật bảo toàn động lượng trong một chất lưu, chỉ là áp dụng định
luật 2 của Newton cho một môi trường liên tục (continuum). Phương trình này thường
được viết dưới dạng đạo hàm vật chất (substantive derivative hoặc material
derivative), làm rõ đây chỉ là một áp dụng của định luật 2 Newton:

19