khảo sát khả năng kháng oxy hóa của cao phân đoạn thân ô rô (acanthus ilicifolius l ) in vitro

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN SINH HỌC
----------

DƢƠNG THỊ NGỌC MAI

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CỦA
CAO PHÂN ĐOẠN THÂN Ô RÔ (Acanthus ilicifolius L.)
IN VITRO

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH: SINH HỌC

2015


TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN SINH HỌC
----------

DƢƠNG THỊ NGỌC MAI

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CỦA
CAO PHÂN ĐOẠN THÂN Ô RÔ (Acanthus ilicifolius L.)
IN VITRO

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH: SINH HỌC

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
TS. ĐÁI THỊ XUÂN TRANG

2015


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đƣợc luận văn thì ngoài sự nổ lực và phấn đấu của bản
thân trong việc học tập, tìm tòi và nghiên cứu thì cũng còn không ít khó khăn.
Nhờ có sự giúp đỡ, động viên của quý thầy cô, cha mẹ, gia đình, bạn bè chính
là nguồn động viên to lớn, tạo nên động lực để tôi có thể hoàn thành tốt luận
văn. Với tấm lòng trân trọng và sự biết ơn sâu sắc, em xin gởi lời cám ơn sâu
sắc đến:
Cô TS. Đái Thị Xuân Trang đã tận tình hƣớng dẫn, truyền đạt những
kiến thức vô cùng quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi và luôn động viên giúp
đỡ em trong suốt quá trình làm luận văn.
Cô Ngô Thị Kim Thoa, cô Lý Thị Thanh Thủy, thầy TS. Nguyễn Trọng
Tuân đã tạo mọi điều kiện cho em đƣợc sử dụng các thiết bị và dụng cụ trong
phòng thí nghiệm để thực hiện luận văn.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Bộ môn Sinh Học, Bộ
môn Hóa Học - Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Bộ môn Khoa Học Đất – Khoa
Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng.
Bên cạnh đó, em xin gửi lời cám ơn đến anh Quách Hải Đăng Khôi, lớp
Sinh học K36 đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kinh nghiệm và giúp đỡ trong quá
trình làm luận văn.

Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến cha mẹ, gia đình và tập thể lớp
Sinh học K37 đã luôn bên cạnh, động viên tinh thần và tạo điều liện cho tôi
trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Xin trân trọng cám ơn
Cần Thơ, tháng 04 năm 2014

DƢƠNG THỊ NGỌC MAI

i


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

LỜI CAM KẾT
Em xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và cô hƣớng
dẫn. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai
công bố trong bất kì một luận văn nào trƣớc đây.
Cán bộ hƣớng dẫn

Tác giả luận văn

Ký tên

Ký tên

Đái Thị Xuân Trang

Dƣơng Thị Ngọc Mai

ii


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

PHẦN KÝ DUYỆT
Cán bộ hƣớng dẫn

Tác giả luận văn

Ký tên

Ký tên

Đái Thị Xuân Trang

Dƣơng Thị Ngọc Mai

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................

.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................
.......................................................................................................................

iii


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37
MỤC LỤC

TÓM TẮT ................................................................................................ ix
CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU ........................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề ....................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu .......................................................................................... 2
1.3 Nội dung nghiên cứu ....................................................................... 2
CHƢƠNG 2 .............................................................................................. 3
2.1 Đại cƣơng về cây Ô Rô (Acanthus ilicifolius L.)............................ 3
2.1.1 Khóa phân loại ......................................................................... 3
2.1.2 Nguồn gốc ................................................................................ 3
2.1.3 Đặc điểm phân loại .................................................................. 3
2.1.4 Đặc điểm cây Ô Rô nƣớc ngọt ................................................. 4
2.1.5 Thành phần hóa học và công dụng .......................................... 4
2.2 Một số nghiên cứu về cây Ô Rô (Acanthus ilicifolius L.) .............. 5

2.2.1 Nghiên cứu trong nƣớc ............................................................ 5
2.2.2 Nghiên cứu ngoài nƣớc ............................................................ 5
2.3 Sơ lƣợc về chất kháng oxy hóa ....................................................... 6
2.3.1 Stress oxy hóa .......................................................................... 6
2.3.2 Chất kháng oxy hóa ................................................................. 7
2.3.3 Hoạt động của chất kháng oxy hóa .......................................... 7
2.4 Đại cƣơng những bệnh liên quan đến stress oxy hóa ..................... 8
2.4.1 Bệnh cao huyết áp .................................................................... 8
2.4.2 Bệnh đái tháo đƣờng ................................................................ 9
2.4.3 Bệnh ung thƣ ............................................................................ 9
CHƢƠNG 3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 11
3.1 Thời gian, địa điểm, và phƣơng tiện ............................................. 11
3.1.1 Thời gian ................................................................................ 11
3.1.2 Địa điểm ................................................................................. 11
3.1.3 Phƣơng tiện ............................................................................ 11
iv


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

3.1.3.1 Đối tƣợng ........................................................................ 11
3.1.3.2 Hóa chất .......................................................................... 11
3.1.4 Dụng cụ và thiết bị ................................................................. 11
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................. 12
3.2.1 Phƣơng pháp tách phân đoạn cao từ cao tổng ....................... 12
3.2.2 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa tổng số (Total Antioxidant
Status (TAS) assay) in vitro cao tách phân đoạn ..................................... 14
3.2.3 IC50 (Inhibition concentration of 50%, khả năng loại bỏ 50%

gốc tự do) ................................................................................................. 14
3.2.3.1 Định nghĩa ....................................................................... 14
3.2.4 Thống kê và phân tích số liệu ................................................ 14
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 15
4.1 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa tổng số (Total Antioxidant
Status (TAS) assay) in vitro......................................................................... 15
4.2 Khả năng kháng oxy hóa tổng số của cao hexan thân Ô Rô nƣớc
ngọt .............................................................................................................. 16
4.3 Khả năng kháng oxy hóa tổng số của cao chloroform thân Ô Rô
nƣớc ngọt ..................................................................................................... 18
4.4 Khả năng kháng oxy hóa tổng số của cao ethyl acetate thân Ô Rô
nƣớc ngọt ..................................................................................................... 18
4.5 So sánh hiệu quả kháng oxy hóa của các lại cao phân đoạn dựa vào
giá trị IC50 .................................................................................................... 22
CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................... 23
5.1 Kết luận ......................................................................................... 23
5.2 Kiến nghị ....................................................................................... 23
PHỤ LỤC 2............................................................................................. 29
PHỤ LỤC 3............................................................................................. 33

v


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 4.1 Khả năng kháng oxy hóa tổng số cao phân đoạn hexan thân Ô
Rô .................................................................................................................. 16

Bảng 4.2 Khả năng kháng oxy hóa tổng số cao phân đoạn chloroform
thân Ô Rô .......................................................................................................18
Bảng 4.2 Khả năng kháng oxy hóa tổng số cao phân đoạn ethyl acetate
thân Ô Rô ........................................................................................................20
Bảng 4.4 Phƣơng trình hồi quy và giá trị IC50 cao phân đoạn thân Ô Rô22

vi


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

DANH SÁCH HÌNH
Hình 3.1 Quá trình tách phân đoạn cao thứ từ cao tổng ........................13
Hình 4.1 Đƣờng chuẩn khả năng kháng oxy hóa tổng số in vitro của
vitamin C ........................................................................................................15
Hình 4.2 Hiệu suất loại bỏ gốc tự do của cao phân đoạn hexan thân Ô
Rô ....................................................................................................................17
Hình 4.3 Hiệu suất loại bỏ gốc tự do của cao phân đoạn chloroform thân
Ô Rô ................................................................................................................19
Hình 4.4 Hiệu suất loại bỏ gốc tự do của cao phân đoạn ethyl acetate
thân Ô Rô nƣớc ngọt .......................................................................................21

vii


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
OD

Mật độ quang phổ

ROS

Reactive oxygen dismutase

TAS

Total Antioxidant Status

TBA

Acid thiobarbituric

TBA-RS

Thiobarbituric acid reactive substances

IC50

Inhibition concentration of 50%

viii


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

TÓM TẮT
Cây Ô Rô thuộc là loại thực vật tiểu mộc thuộc họ Acanthus, mọc hoang
ở những nùng nƣớc lợ, vùng ven biển hay bên bờ sông. Khả năng kháng oxy
hóa của cao phân đoạn thân Ô Rô (Acanthus ilicifolius L.) đƣợc xác định bằng
phƣơng pháp khảo sát khả năng kháng oxy hóa tổng số (Total Antioxidant
Status (TAS) assay) in vitro. Kết quả đƣợc so sánh với chất chuẩn là vitamin C
(IC50 = 110,2), cho thấy khả năng kháng oxy hóa tổng số (TAS) của cao phân
đoạn ethyl acetate(IC50 = 0,32) cao hơn chất chuẩn 344,4 lần , cao phân đoạn
chloroform (IC50 = 0,41) cao hơn chất chuẩn 268,8 lần. Khả năng kháng oxy
hóa tổng số (TAS) của cao phân đoạn hexan (IC50 = 1073,3) thấp hơn chất
chuẩn 9,7 lần.
Từ khóa: cây Ô Rô, chất kháng oxy hóa, gốc tự do, TAS,…

ix


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

CHƢƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Theo các nghiên cứu gần đây của các nhà khoa học đã cho kết quả về sự
phát triển của một số bệnh nhƣ ung thƣ, Parkinson, Alzeheimer, xơ vữa động
mạch, đái tháo đƣờng, suy tim đều có nguyên nhân là strees oxy hóa. Ngăn
chặn sự tiến triển của các bệnh lý trên bằng cách bổ sung các chất kháng oxy

hóa đã đƣợc đề xuất và ứng dụng từ rất lâu (Lại Thị Ngọc Hà, Vũ Thị Thƣ,
2009; Singh et al., 1995). Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng cho thấy các chất
kháng oxy hóa tổng hợp tuy có hoạt tính cao nhƣng lại tiềm ẩn nhiều nguy cơ
gây tổn hại đến cơ thể. Điều này đòi hỏi phải nghiên cứu các hoạt chất kháng
oxy hóa có nguồn tự nhiên hiện diện trong các loài thực vật (Pal et al., 2011).
Các chất vừa có khả năng làm sạch các gốc tự do có hại cho cơ thể sinh ra từ
sự stress oxy hóa lại ít có tác động đối với cơ thể.
Chất kháng oxy hóa là một phân tử ức chế quá trình oxy hóa của các
phân tử khác. Quá trình oxy hóa là một phản ứng hóa học chuyển electron
hoặc hydro từ một chất oxy hóa và tạo ra gốc tự do. Chất kháng oxy hóa chấm
dứt các phản ứng dây chuyền bằng cách loại bỏ trung gian gốc tự do và ức chế
các phản ứng oxy hóa khác (Sies và Helmut, 1997). Các hợp chất kháng oxy
hóa nhƣ axit phenolic, poliphenol, triterpenoids, alkaloid, terpenoid, lignin,
steroid và flavonoid có khả năng loại bỏ các gốc tự do peroxide,
hydroperoxide hoặc lipid peroxyl và do đó ức chế cơ chế oxy hóa (Prakash et
al., 2000; Wostmann et al., 2008), có tác dụng ngăn chặn sự phát triển khối u
và sự phát triển ung thƣ (Graham et al., 2000; Babu et al., 2002). Theo các
nghiên cứu, tăng cƣờng khả năng kháng oxy hóa tự nhiên trong cơ thể hay bổ
sung chất kháng oxy hóa qua chế độ ăn uống có thể làm giảm nguy cơ mắc các
bệnh mãn tính và ngăn chặn sự phát triển của bệnh. Các hợp chất phenol và
polyphenol có nguồn gốc thực vật, chẳng hạn nhƣ flavonoid đã đƣợc chứng
minh làm sạch các gốc tự do (Pal et al., 2011).
Ở nƣớc ta, cây Ô Rô (Acanthus ilicifolius L.) chủ yếu đƣợc sử dụng theo
kinh nghiệm dân gian để điều trị một số bệnh nhƣ viêm gan, ung thƣ gan,
nhức mỏi, tê thấp,… (Võ Văn Chi, 1997; Phạm Hoàng Hộ, 2003). Tuy nhiên
còn rất ít nghiên cứu khoa học chứng minh tác dụng chữa bệnh trên của cây Ô
Rô (Acanthus ilicifoliua L.). Đề tài “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG
OXY HÓA CỦA CAO PHÂN ĐOẠN THÂN Ô RÔ (Acanthus ilicifolius
L.) IN VITRO” đƣợc thực hiện. Nhằm mục tiêu chứng minh hoạt tính sinh
học của cây Ô Rô.

1


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

1.2 Mục tiêu
Mục tiêu đề tài khảo sát khả năng kháng oxy hóa tổng số (Total
Antioxidant Status (TAS) assay) của cao chiết phân đoạn hexan, chloroform,
ethyl acetate của thân cây Ô Rô (Acanthus ilicifolius L.) trong điều kiện in
vitro.
1.3 Nội dung nghiên cứu
Chiết phân đoạn từ cao methanol thân cây Ô Rô nƣớc ngọt bằng dung
môi hexan, chloroform, ethyl acetate.
Sử dụng phƣơng pháp TAS để xác định khả năng kháng oxy hóa tổng số
cao chiết phân đoạn thân Ô Rô nƣớc ngọt in vitro.

2


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

CHƢƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Đại cƣơng về cây Ô Rô (Acanthus ilicifolius L.)
2.1.1 Khóa phân loại
Ngành: Ngọc Lan (Magnoliophyta).

Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida).
Bộ: Lamiales.
Họ: Acanthaceae.
Chi: Acanthus.
Loài: A. ilicifolius L.
(Phạm Hoàng Hộ, 2003).
2.1.2 Nguồn gốc
Họ Ô Rô (Acanthaceae) là một trong những họ lớn của vùng nhiệt đới
gồm 250 chi khoảng 2600 loài, tập trung chủ yếu ở Đông Nam Á, châu Phi,
Brazzil và Trung Mỹ. Ở Việt Nam, cây Ô Rô (Acanthus ilicifolius L.) mọc
hoang ở những bãi nƣớc lợ vùng ven biển hay bên bờ sông, bờ ao nƣớc ngọt
và vùng nƣớc mặn ở hầu hết các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL)
(Võ Văn Chi, 1997).
2.1.3 Đặc điểm phân loại
Cây Ô Rô là loại thực vật tiểu mộc thuộc họ Acanthaceae. Thân Ô Rô
cao từ 0,5-3 m, có khi trƣờn, thân tròn, không ngấm chất lignine (chất gỗ
cứng) màu xanh lục, không lông, láng, ít phân nhánh với một cặp gai nhọn
mọc ở nách lá, phần cuối cuống lá (Võ Văn Chi, 1997; Phạm Hoàng Hộ,
2003). Đôi khi thân Ô Rô có những rễ trên không để thích nghi với vùng ngập
nƣớc.
Cây Ô Rô có lá mọc đối, thuộc họ lá đơn, đỉnh nhọn, cứng, dai, màu
xanh sáng bóng, hình bầu dục hay hình mũi mác. Lá có chiều dài 9-14 cm,
chiều rộng 2-6 cm, gợn sóng răng quanh co, bìa lá có gai nhọn. Cuống lá dài
khoảng 0,8-1,5 cm hay ngắn hơn (Võ văn Chi, 1997; Phạm Hoàng Hộ, 2003).
Gié hoa Ô Rô mọc ở chót nhánh, màu tím, xanh nhạt hay màu trắng.
Những hoa Ô Rô đối xứng hai bên, đài hoa có 4 thùy và 4 tiểu nhụy dài
khoảng 3,5-4 cm. Hoa dài khoảng 4 cm, hợp thành 4 hàng, lá hoa hình xoan,
3

Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

tiền diệp dài khoảng 6-8 mm, lá đài giống tiền diệp, mỗi hoa đối diện nhau,
màu xanh lục, lá bắc hẹp dính thành mảng dài 7-8 mm và có 2 lá bắc tƣơng tự
nhƣng nhỏ hơn đƣợc mang ở đầu nhánh (Võ văn Chi, 1997; Phạm Hoàng Hộ,
2003). Đài hoa màu xanh 10-12 mm, hoa có 5 cánh, màu xanh đều nhau, 2
môi, môi dƣới màu xanh nhạt, lan rộng ra hay cong, kích thƣớc khoảng 3 cm,
tràng hoa hợp thành ống ngắn có lông bên trong, 4 tiểu nhụy ngắn so với vành
hoa, bao phấn 1 thùy, chỉ mập. Bầu noãn 2 buồng, 2 noãn mỗi buồng, vòi
nhụy ngắn, nứt đôi.
Trái Ô Rô dạng viên nang, dài khoảng 2-3 cm, mịn, màu xanh lá cây,
hình trứng hay hình chữ nhật bên trong chứa 2-4 hạt dài khoảng 6-10 mm,
dẹp, vỏ hạt màu trắng (Võ Văn Chi, 1997; Phạm Hoàng Hộ, 2003).
2.1.4 Đặc điểm cây Ô Rô nƣớc ngọt
Cây Ô Rô nƣớc ngọt có một số đặc điểm hình thái khác biệt so với cây Ô
Rô nƣớc mặn. Rễ dài, thân cao khoảng 0,5-3 m, thân mềm, có màu nâu đỏ. Lá
có màu lục, chiều dài khoảng 8-20 cm, rộng 2-6 cm, bề mặt lá không có muối
tiết ra. Đặc điểm giải phẫu, thân Ô rô nƣớc ngọt có mật số và kích thƣớc tuyến
tiết muối ít. Lá Ô rô nƣớc ngọt có số lƣợng tuyến tiết muối ít hơn lá Ô Rô
nƣớc mặn. Những sai khác ở rễ, thân, lá Ô Rô sống trong môi trƣờng nƣớc
ngọt và nƣớc mặn thể hiện sự thích nghi cao với môi trƣờng sống đặc trƣng
của loài. Điều kiện môi trƣờng sống đã dẫn đấn sự biến đổi về hình thái và cấu
tạo giải phẫu của cây Ô Rô (Nguyễn Thị Yến Chi, 2014).
2.1.5 Thành phần hóa học và công dụng
Một số hợp chất đƣợc xác định có ở cây Ô Rô (Acanthus ilicifolius L.)
nhƣ (+)-lyoniresinol 3a-OBD-galactopyranosyl-(16)-b-D-glucopyranoside;
(+)-lyoniresinol 2a-OBD-galactopyranosyl-3a-Ob-D- glucopyranoside (Zhang
et al., 2004); acancifoliuside, acteoside, isoacteoside, acanthaminoside, (+)lyoniresinol 3a-O-- glucopyranoside, (+)-lyoniresinol, -amyrine (Huo et al.,

2008); 2-benzoxalinone, blepharin (Nagao et al., 2005); (+)-lyoniresinol 3a[2-(3,5-dimethoxy-4-hydroxy)-benzoyl]-O--glucopyranoside, Glucoside 11
epoymegastigmane, Megastigmane glucosides (Wu et al., 2003); glycoside
d’alcools aliphatiques (Kanchanapoom et al., 2002); dihydroxymethyl-bis(3,5dimethoxy-4-hydroxyphenyl), Glycoside phenylethanoid, tetrahydrofurane-9O--glucopyranoside (Kanchanapoom et al., 2001).
Dịch chiết từ các bộ phận khác nhau của cây Ô Rô đƣợc xác định có
chứa các hợp chất hóa học khác nhau nhƣ: alkaloid, glycosides, lignans,
4


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

saponin triterpenoid, sterol, các axit béo và các dẫn xuất axit coumaric (Singh
et al., 2011).
Dịch chiết methanol từ hoa Ô Rô đƣợc xác định có chứa terpenoid, các
hợp chất phenolic và ancaloit, có khả năng kháng lại các gốc DPPH (Muhanad
et al., 2012).
Dịch chiết từ lá Ô Rô đƣợc xác định có chứa các dẫn xuất axit coumaric,
isoacoside, (+)-lyniresinol 3-O--glucopyranoside, (-)-lyoniresinol và amyrin, acancifoliuside, cùng với acteoside, acanthaminoside, (Chakraborty et
al., 2007; Kiem et al., 2008).
2.2 Một số nghiên cứu về cây Ô Rô (Acanthus ilicifolius L.)
2.2.1 Nghiên cứu trong nƣớc
Ở nƣớc ta, nghiên cứu ứng dụng về cây Ô Rô còn rất ít. Các nghiên cứu
ứng dụng cây Ô Rô đƣợc tiến hành chủ yếu để điều trị bệnh trong y học cổ
truyền theo kinh nghiệm dân gian.
Hoạt tính phòng ngừa ung thƣ in vitro của cây Ô Rô (Acanthus ilicifolius
L.) đƣợc xác định vào năm 2005 (Đỗ Thị Thảo và CSV, 2005).
Nghiên cứu về “Thành phần hóa học của Acanthus ilicifolius L. và khả
năng tác động đến các tế bào osteoblastic MC3T3E1” là một thành công khác
của nghiên cứu trong nƣớc đối với cây Ô Rô vào năm 2008 (Kiem et al.,

2008).
Đề tài “Đặc điểm về hình thái giải phẫu và khảo sát khảo sát khả năng
kháng oxy hóa của cây Ô Rô (Acanthus ilicifolius L.)” chứng minh khả năng
kháng oxy hóa cao methanol cây Ô Rô (Nguyễn Thị Yến Chi, 2014).
2.2.2 Nghiên cứu ngoài nƣớc
Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới liên quan đến cây Ô Rô
(A.ilicifolius L.) đƣợc thực hiện để chứng minh “cây thuốc ít đƣợc biết về hoạt
động dƣợc lý quan trọng” đƣợc nghiên cứu thành công năm 2009 (Singh et al.,
2009).
Công trình nghiên cứu về “Hợp chất Lignan glucosides từ cây Ô Rô”
đƣợc công bố trên tạp chí Hóa thực vật (Phytochemistry) năm 2001
(Kanchanapoom et al., 2001).
Hoạt tính kháng vi khuẩn gây nhiễm trùng da của cây Ô Rô cũng đƣợc
chứng minh tính hiệu quả rất tốt vào năm 2008 (Chinnavenkataraman
5


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

Govindasamy, Mani Arulpriya, 2008) và năm 2011 (Thirunavukkarasu et al.,
2011).
Hoạt động kháng ung thƣ, làm giảm ung bƣớu, làm sạch gốc tự do,
kháng oxy hóa và gây độc tế bào cùng với tiềm năng dƣợc lý, hóa học thực vật
của cây Ô Rô (Acanthus ilicifolius L.) đồng loạt đƣợc chứng minh từ năm
2001 đến năm 2012 (Babu et al., 2001; Babu et al., 2002; Thirunavukkarasu et
al., 2008; Singh et al., 2011; Muhamad et al., 2012).
Nghiên cứu thành công về “Vai trò bảo vệ dạ dày của cây Ô Rô-Một
nghiên cứu làm sáng tỏ các cơ chế cơ bản của hoạt động chống loét dạ dày”

chỉ ra khả năng bảo vệ dạ dày rất hiệu quả của cây Ô Rô (Mani et al., 2011).
2.3 Sơ lƣợc về chất kháng oxy hóa
2.3.1 Stress oxy hóa
Stress oxy hóa (oxidative stress) là sự rối loạn cân bằng giữa các chất
kháng oxy hóa và các chất oxy hóa trong cơ thể theo hƣớng tạo ra nhiều các
chất oxy hóa. Stress oxy hóa là kết quả của sự hình thành gốc tự do vƣợt quá
mức kiểm soát của hệ thống kháng oxy hóa trong cơ thể. Stress oxy hóa là
nguyên nhân gây ra sự phát triển của ung thƣ, lão hóa, bệnh Parkinson, bệnh
Alzheimer, xơ vữa động mạch, suy tim, nhồi máu cơ tim, đái tháo đƣờng
(Singh et al., 1995; Halliwell, 2007; Valko et al., 2007).
Các gốc tự do là các phân tử có một điện tử riêng lẻ ở lớp ngoài cùng
(Riley, 1994). Cấu hình này không ổn định và luôn có xu hƣớng lấy điện tích
của các phân tử liền kề nhƣ protein, lipid, carbohydrate và axit nucleic. Trong
hệ thống sinh học, các gốc tự do có nguồn gốc từ nitơ, oxy và các phân tử lƣu
huỳnh. Những gốc tự do trong nhóm này đƣợc gọi là dạng oxy phản ứng
(ROS), dạng nitơ phản ứng (RNS: reactive nitrogen species) và dạng lƣu
huỳnh phản ứng (RSS: Reactive sulfua species).
ROS bao gồm các gốc tự do nhƣ superoxide (O2), hydroxyl (-OH),
nitricoxide (NO) và các loại khác nhau nhƣ hydro peroxide (H2O2), axit
hypochlorous (HOCL) và peroxyl nitrite (ONOO).
RNS đƣợc bắt nguồn từ NO thông qua các phản ứng với O2 để hình
thành ONOO. RSS có thể dễ dàng hình thành từ các phản ứng của ROS.
Phần lớn các gốc tự do hoạt động mạnh và gây nhiều tổn hại cho cơ thể,
nhất là ROS. Oxy là nguyên tố không thể thiếu để đảm bảo sự sống, mọi tế
bào đều cần oxy để chuyển hóa chất dinh dƣỡng thành năng lƣợng. Oxy cần
thiết cho hoạt động hô hấp ở ngƣời cũng trở thành gốc tự do. ROS luôn đƣợc
6


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

sinh ra trong cơ thể và cũng có vai trò tích cực đối với cơ thể. ROS có vai trò
trong biểu hiện gen và vận chuyển ion. Tuy vậy, gốc tự do cũng ảnh hƣởng
xấu đến cơ thể khi số lƣợng tăng lên quá nhiều (Pal et al., 2011; Proctor,
1989).
ROS có thể đƣợc phát sinh trong quá trình chiếu xạ tia cực tím, tia X và
tia gamma, trong các phản ứng xúc tác kim loại, các chất ô nhiễm trong không
khí đƣợc sản xuất bởi bạch cầu trung tính và các đại thực bào trong quá trình
viêm nhiễm và là sản phẩm của ty thể xúc tác các phản ứng vận chuyển điện
tử, là sản phẩm của sự căng thẳng, mệt mỏi, thuốc lá, dƣợc phẩm, những thói
quen ăn uống thiếu khoa học, thực phẩm có chứa màu tổng hợp, nƣớc có nhiều
chlorine (Amstrong, 2002).
Trong cơ thể khỏe mạnh, gốc tự do sinh ra có giới hạn, không đủ để gây
hại. Vì bên cạnh gốc tự do luôn có hệ thống các chất kháng oxy hóa nhằm vô
hiệu hóa các gốc tự do có hại.
2.3.2 Chất kháng oxy hóa
Chất kháng oxy hóa là những hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn
chặn hoặc làm đảo ngƣợc quá trình oxy hóa của các hợp chất có trong tế bào
cơ thể (Halliwell và Barry, 2007). Dựa trên nguyên tắc hoạt động có thể chia
chất kháng oxy hóa thành hai loại: chất kháng oxy hóa bậc một và chất kháng
oxy hóa bậc hai. Chất kháng oxy hóa bậc một khử hoặc kết hợp với các gốc tự
do nên kìm hãm pha khởi phát hoặc bẽ gãy dây chuyền phản ứng của quá trình
oxy hóa. Chất kháng oxy hóa bậc hai kiềm hãm sự tạo thành gốc tự do
(Rolland, 2004). Hệ thống các chất kháng oxy hóa của cơ thể có nguồn gốc
nội sinh và ngoại sinh. Những chất kháng oxy hóa có nguồn gốc nội sinh bao
gồm các protein (ferritine, transferrine, albumin) và các chất enzyme kháng
oxy hóa (superoxide dismutase, glutathione peroxydase, catalase). Các chất
kháng oxy hóa có nguồn gốc ngoại sinh là các dạng cấu tử nhỏ đƣợc đƣa vào

cơ thể qua thức ăn bao gồm vitamin E, vitamin C, các carotenoid và các hợp
chất phenolic, các chất này đƣợc tìm thấy trong nhiều loại thực phẩm bao gồm
trái cây và rau quả (Babu et al., 2001).
2.3.3 Hoạt động của chất kháng oxy hóa
Các chất kháng oxy hóa hoạt động theo các phƣơng thức sau: (1) Trực
tiếp trung hòa các gốc tự do bằng cách cho đi điện tử (e-) để kết hợp với điện
tử lẻ của các gốc tự do; (2) làm giảm nồng độ peroxide và sửa chữa các màng
bị oxy hóa; (3) tác động đến hệ thống kháng oxy hóa nội sinh để làm tăng hoạt
động kháng oxy hóa của cơ thể.
7


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

Ở mức độ tế bào, chất kháng oxy hóa có thể làm giảm các gốc tự do bằng
cách làm giảm hoạt động của các enzyme tạo ra gốc tự do nhƣ nicotinamide
adenine dinucleotide phosphate oxidase (NADPH), nitơ oxydase (NOx) và
xanthine oxydase (XO) hoặc bằng cách tăng cƣờng các hoạt động và biểu hiện
của các enzyme kháng oxy hóa nhƣ superoxide dismutase (SOD), catalase
(CAT) và glutathion peroxidase (GPX). Tế bào động vật có chứa enzyme SOD
có thể chuyển đổi O2 thành H2O2 và O2. Tiếp theo đó H2O2 đƣợc enyme
catalase chuyển đổi thành H2O và O2. Các chất kháng oxy hóa có thể phản ứng
trực tiếp với các gốc tự do và phá hủy chúng, sau đó các chất kháng oxy hóa
sẽ trở thành các gốc tự do mới nhƣng hoạt động ít hơn và ít nguy hiểm hơn so
với các gốc tự do mà nó đã vô hiệu hóa. Chất kháng oxy hóa hiệu quả nhất
trong cơ thể là các enzyme nhƣ GPX, CAT, SOD (Mates et al., 1999).
Hợp chất kháng oxy hóa trong thực phẩm đóng vai trò quan trọng nhƣ
một yếu tố bảo vệ sức khỏe. Bằng chứng khoa học cho thấy, chất kháng oxy

hóa làm giảm nguy cơ các bệnh mãn tính nhƣ ung thƣ, bệnh tim mạch
(Deshmukh, 2009). Các chất kháng oxy hóa ngoại sinh đã đƣợc chứng minh
làm giảm nguy cơ mắc bệnh. Đặc điểm chính của chất kháng oxy hóa là khả
năng năng phục hồi các gốc tự do. Có một số nghiên cứu cho thấy, các chất
kháng oxy hóa trong trái cây, trà, rau quả và rƣợu vang làm giảm tỉ lệ mắc các
bệnh mãn tính (Prakash et al., 2000). Thực vật là nguồn kháng oxy hóa tiềm
năng của tự nhiên. Thực vật có khả năng kháng lại ROS nhờ tạo thành các hợp
chất kháng oxy hóa (Zin et al., 2002).
2.4 Đại cƣơng những bệnh liên quan đến stress oxy hóa
2.4.1 Bệnh cao huyết áp
Cao huyết áp là một rối loạn phổ biến ảnh hƣởng đến sức khỏe con
ngƣời, bệnh có các triệu chứng đa dạng và rất nguy hiểm (Đào Duy An, 2007).
Đã có nhiều nghiên cứu đánh giá tác hại của của tăng huyết áp trên các hệ
thống tim mạch, thận, não. Cao huyết áp là yếu tố nguy cơ chính gây bệnh tim,
đột quỵ và nguy cơ tim mạch tăng gấp đôi với độ tăng huyết áp 20/10 mmHg
huyết áp tâm thu và tâm trƣơng (Rodrigo et al., 2003).
Nghiên cứu cho thấy stress oxy hóa là nguyên nhân của bệnh tăng huyết
áp, một yếu tố nguy cơ chính cho tỉ lệ tử vong bệnh tim mạch. ROS có ảnh
hƣởng đến mạch máu và sự phát triển của tăng huyết áp. ROS làm tăng huyết
áp và hình thành superoxide trong mạch máu đƣợc cải thiện nhờ chất kháng
oxy hóa ngoại sinh đƣợc nghiên cứu trên mô hình động vật (Chen et al.,
2001).
8


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

2.4.2 Bệnh đái tháo đƣờng

Bệnh đái tháo đƣờng thƣờng đƣợc chia thành hai loại là bệnh đái tháo
đƣờng tuýp 1 và bệnh đái tháo đƣờng tuýp 2.
Bệnh đái tháo đƣờng tuýp 1: do tế bào  bị phá hủy, gây nên sự thiếu hụt
insulin tuyệt đối cho cơ thể (nồng độ insulin giảm thấp hoặc mất hoàn toàn).
Đái tháo đƣờng tuýp 1 phụ thuộc vào yếu tố gen (di truyền) chiếm tỷ lệ 5-10%
bệnh đái tháo đƣờng trên thế giới. Ngƣời bệnh đái tháo đƣờng tuýp 1 sẽ có đời
sống phụ thuộc insulin hoàn toàn (Zimmet et al., 2001; Nguyễn Thị Bay,
2007).
Bệnh đái tháo đƣờng tuýp 2: do kháng insulin ở cơ quan đích kèm theo
suy giảm miễn dịch chức năng tế bào  hoặc do suy giảm chức năng tế bào 
kèm theo kháng insulin của cơ quan đích. Đái tháo đƣờng tuýp 2 không phụ
thuộc nhiều vào yếu tố di truyền chiếm tỷ lệ khoảng 90% bệnh đái tháo đƣờng
trên thế giới. Ngƣời bệnh đái tháo đƣờng tuýp 2 có thể điều trị bằng cách thay
đổi thói quen, kết hợp dùng thuốc để kiểm soát đƣờng huyết. Tuy nhiên, nếu
quá trình này đƣợc thực hiện không tốt thì bệnh nhân cũng phải điều trị bằng
cách dùng insulin (Zimmet et al., 2001; Nguyễn Thị Bay, 2007).
Bệnh đái tháo đƣờng thƣờng có những biến chứng sau: biến chứng tim,
biến chứng thần kinh, biến chứng thận, biến chứng ngoài da, hoại tử do đái
tháo đƣờng,… (Hoàng Thị Ngọc Bích, 2001).
Stress oxy hóa đƣợc xem là nguyên nhân chính của bệnh đái tháo đƣờng.
Tăng glucose huyết có thể gây ra stress oxy hóa gia tăng sự hoạt hóa protein
kinase C (PKC) và gia tăng sự vận chuyển các dẫn xuất axit amin của đƣờng
hexose. Khi glucose huyết tăng, các gốc superoxide trong chuỗi dẫn truyền
điện tử ở ty thể tăng là nguyên nhân gây ra stress oxy hóa. Sự hình thành
superoxide và tiếp theo là sự gia tăng stress oxy hóa có thể dẫn đến rối loạn
chức năng nội mạc và cuối cùng là các bệnh tim mạch thông qua một số cơ
chế khác nhau. Bệnh đái tháo đƣờng có thể là thay đổi hoạt động của các
enzyme có vai trò trong sự kháng oxy hóa và làm giảm lƣợng glutation (chất
có khả năng kháng lại stress oxy hóa) (Nguyễn Quốc Chính, 2007; Tripathi et
al., 2009).

2.4.3 Bệnh ung thƣ
Ung thƣ là một nhóm các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một
cách vô tổ chức và những tế bào đó có khả năng xâm lấn những mô khác bằng
cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển đến nơi xa (di căn).
Hiện có khoảng 200 loại ung thƣ (Jemal et al., 2005). Chất gây ung thƣ hoặc
9


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

việc sản sinh ung thƣ bao gồm ba bƣớc chủ yếu là bắt đầu, tiến triển và sự bộc
phát. Vai trò của các gốc tự do trong các bƣớc phát triển khác nhau của chất
ung thƣ cũng đƣợc chứng minh đầy đủ. Một số loài nhạy cảm với oxy và nitơ
và các phản ứng của chúng có thể tạo điều kiện phát triển ung thƣ do làm tổn
hại DNA hoặc phân tử sinh học khác (Halliwell và Barry, 2007). Thực vật có
chứa chất kháng oxy hóa cho thấy khả năng ức chế ung thƣ (Wang et al.,
2011). Một số nghiên cứu đã phát hiện ra các hợp chất kháng oxy hóa có liên
quan đến hoạt động sinh học khác. Chẳng hạn nhƣ, gây độc tế bào in vitro ở
các khối u, gây độc tế bào trong cơ thể động vật và kháng ung thƣ trong thí
nghiệm (Murugan et al., 2010; Suganuma et al., 2011).
Có rất nhiều cơ chế về các chất kháng oxy hóa nhƣ kháng ung thƣ, chẳng
hạn nhƣ: bằng cách làm sạch gốc tự do (Jia et al, 2012), bằng cách tạo enzyme
kháng oxy hóa (Nirmala et al., 2011), bằng cách điều chỉnh chuỗi phản ứng
chuyển đổi các enzyme protein kinase và lipid kinase (Liu et al., 2011).

10

Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

CHƢƠNG 3
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian, địa điểm, và phƣơng tiện
3.1.1 Thời gian
Đề tài luận văn đƣợc thực hiện từ tháng 7 năm 2014 đến tháng 2 năm
2015.
3.1.2 Địa điểm
Phòng thí nghiệm Sinh Học, Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học Tự
nhiên, Đại học Cần Thơ.
Phòng thí nghiệm Hóa Sinh, Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên,
Đại học Cần Thơ.
Phòng thí nghiệm Khoa Học Đất, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng
Dụng, Đại học Cần Thơ.
3.1.3 Phƣơng tiện
3.1.3.1 Đối tƣợng
Cao methanol thân Ô rô nƣớc ngọt (Acanthus ilicifolius L.) do Bộ môn
Sinh học Khoa Khoa học Tự nhiên cung cấp.
3.1.3.2 Hóa chất
Vitamin C (L-Ascorbic acid), Na2H2PO4 (Trung Quốc), Na2HPO4 (Trung
Quốc), Hexan (CH3(CH2)4 (Trung Quốc), Clorofom (CHCl3) (Trung Quốc),
Etyl axetat (CH3COOC2H5) (Trung Quốc), Sodium benzoate (C7H5O2Na)
(Trung Quốc), Hydrogen peroxide 30% (H2O2) (Merck), EDTA
(C10H14N2Na2O8.2H2O) (Merck), acid thiobarbituric (TBA) (Merck-Germany),
Natri hydroxit (NaOH), ammonium iron (II) sunfate hexanhydrate
(Fe(NH4)2(SO4)2) (Merck-Germany), Acid acetic (CH3COOH), nƣớc cất.
3.1.4 Dụng cụ và thiết bị

Thiết bị: máy đo quang phổ, máy cô quay chân không Heidoph (Đức),
máy vortex, máy khuấy từ, máy ổn định nhiệt, máy li tâm, cân phân tích, máy
đo pH, tủ sấy, tủ hút, tủ lạnh trữ mẫu.
Dụng cụ: bình cầu thủy tinh, eppendorf 1,5 ml và 2 ml, micropipette (10100 l; 100-1000 l), đầu cone (100 l; 1000 l), cốc thủy tinh, ống đong,
11


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

chai thủy tinh (50 ml; 250 ml; 1000 ml), găng tay, giấy bạc và một số dụng cụ
khác trong phòng thí nghiệm.
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1 Phƣơng pháp tách phân đoạn cao từ cao tổng
Nguyên liệu đƣợc sử dụng là cao methanol thân Ô Rô nƣớc ngọt. Từ cao
methanol tách phân đoạn thành các cao hexan, chloroform, ethyl acetate
(Hỉnh.1).
Bƣớc 1: cao tổng methanol đƣợc hòa tan với dung môi hexan sau đó tiến
hành lọc hỗn hợp thu đƣợc phần dung dịch và phần cao thô. Phần dung dịch
đƣợc tiến hành cô quay ở nhiệt độ và áp suất cố định, sau đó loại bỏ lƣợng
dung môi hexan thu đƣợc cao phân đoạn hexan.
Bƣớc 2: phần rắn còn lại của bƣớc 1 đƣợc hòa tan với dung môi
chloroform và tiến hành lọc, cô quay tƣơng tự bƣớc 1. Thu đƣợc cao phân
đoạn chloroform.
Bƣớc 3: phần rắn thu từ bƣớc 2 đƣợc hòa tan với dung môi ethyl acetate
và tiến hành lọc, cô quay tƣơng tự bƣớc 1. Thu đƣợc cao phân đoạn ethyl
axetate.

12

Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

Cao tổng methanol

Ly trích trong
hexan
Các hợp chất tan
trong hexan

Các hợp chất không
tan trong hexan

Làm khan, cô quay

Ly trích trong chloroform

Cao hexan
Các hợp chất không
tan trong chloroform

Các hợp chất tan
trong chloroform

Ly trích trong
ethyl acetate

Làm khan, cô quay
Cao chloroform

Các hợp chất tan
trong ethyl acetate

Các hợp chất không
tan trong ethyl acetate

Làm khan, cô quay
Cao ethyl acetate

Hình 3.1: Quá trình tách phân đoạn cao thứ từ cao tổng
Cao tách phân đoạn hexan, chloroform, ethyl acetate đƣợc trữ trong tủ
lạnh để sử dụng cho các thí nghiệm sau.
13


Luận văn tốt nghiệp Đại học

Sinh học k37

3.2.2 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa tổng số (Total Antioxidant
Status (TAS) assay) in vitro cao tách phân đoạn
TAS đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Koracevic et al., (2000) có
hiệu chỉnh nhƣ sau: 10 L cao tách phân đoạn thân Ô Rô nƣớc ngọt pha loãng
trong 490 L dung dịch đệm phosphate natri 100 mM pH 7,4 đƣợc cho vào
hỗn hợp gồm 0,5 mL dung dịch benzoate natri 10 mM với 0,2 mL Fe – EDTA
đƣợc pha từ 2 mM dung dịch EDTA với 2 mM dung dịch Fe(NH 4)2(SO4)2).
Sau đó 0,2 mL H2O2 0,1 M đƣợc cho vào hỗn hợp phản ứng, lắc đều và ủ ở

37C trong 60 phút. Sau khi ủ, 1 mL acid acetic 20% và TBA 0,8% trong
NaOH đƣợc thêm vào ống nghiệm. Hỗn hợp phản ứng sau khi ủ ở 100C trong
30 phút đƣợc để nguội ở nhiệt độ phòng. Độ hấp thu quang phổ của phản ứng
đƣợc đo ở bƣớc sóng 532 nm.
3.2.3 IC50 (Inhibition concentration of 50%, khả năng loại bỏ 50%
gốc tự do)
3.2.3.1 Định nghĩa
IC50 là khả năng loại bỏ gốc tự do của chất kháng oxy hóa trong thí
nghiệm biến thiên tuyến tính với nồng độ khảo sát nên phƣơng trình hồi quy
tuyến tính đƣợc lập ra có dạng y = ax + b qua tất cả các điểm (với y là % ức
chế và x là nồng độ). Tuy nhiên, do hoạt tính của mẫu chỉ biến thiên đến một
nồng độ nhất định thì sẽ đạt giá trị tiệm cận (dù có tiếp tục tăng nồng độ cao
chiết thì hoạt tính cũng không tăng). Vì thế, hiệu quả loại bỏ gốc tự do của
chất kháng oxy hoá tuyến tính đƣợc chọn (với giá trị R2 ≥ 95%) nhƣng vẫn
phải đảm bảo đoạn đó chứa các giá trị ức chế có giá trị % ức chế từ thấp hơn
đến lớn hơn 50%.
3.2.4 Thống kê và phân tích số liệu
Kết quả xử lí thống kê theo phƣơng pháp ANOVA bằng phần mềm
minitab 16.1.1 và trình bày bằng Microsoft Office 2007.

14