khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá cây lá dứa (pandanus amaryllifolius. roxb)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA
CỦA CAO CHIẾT LÁ CÂY LÁ DỨA
(Pandanus amaryllifolius. Roxb)

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

TS. ĐÁI THỊ XUÂN TRANG

NGUYỄN TƯỜNG QUYÊN

BỘ MÔN SINH – KHOA KHTN

MSSV: 3092367
SINH HỌC K.35

Cần Thơ, 2012


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
Cô Ts. Đái Thị Xuân Trang đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức quý

báu, chỉnh sửa luận văn, góp ý cách xử lý các số liệu, quan tâm và động viên tôi
trong suốt quá trình thực hiện luân văn này.
Hai bạn Hồ Ngọc Phụng và Nguyễn Phạm Phương Thảo sinh viên lớp cử
nhân Sinh học K35 – trường Đại Học Cần Thơ đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá
trình thực hiện đề tài.
Quý Thầy, Cô Bộ môn Sinh, Bộ môn Hóa – Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Viện
Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại Học Cần Thơ đã tạo
điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luân văn này.
Tập thể các bạn lớp cử nhân Sinh học K35 (2009- 2013) đã chia sẻ, giúp đỡ
tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn.
Quý Thầy, Cô Khoa Khoa Học Tự Nhiên, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học
Ứng Dụng, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển ông Nghệ Sinh Học, Ban giám hiệu
trường Đai Học Cần Thơ đã giảng dạy, truyền thụ những kiến thức quý báu cũng
như tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập.
Tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc, chân thành đến gia đình, người thân và những
người bạn đã luôn động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập
Cần Thơ, ngày 12 tháng 12 năm 2012

Nguyễn Tường Quyên

i


LỜI BẢN QUYỀN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của
giáo viên hướng dẫn. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và
chưa từng được cá nhân hay tổ chức nào công bố trong bất kì công trình nào trước
đây. Nếu cá nhân hay tổ chức nào muốn sử dụng tài liệu trong luận văn phải được sự
đồng ý của tác giả hoặc giáo viên hướng dẫn.

Người hướng dẫn khoa học

Tác giả luận văn

Ts. Đái Thị Xuân Trang

Nguyễn Tường Quyên

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN.................................................................................................................i
LỜI BẢN QUYỀN ....................................................................................................... ii
MỤC LỤC HÌNH..........................................................................................................v
MỤC LỤC BẢNG........................................................................................................vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... vii
TÓM TẮT .................................................................................................................. viii
PHẦN 1. GIỚI THIỆU ................................................................................................1
PHẦN 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU...........................................................................3
2.1. Sơ lược về chất chống oxy hóa ...........................................................................3
2.1.1. Stress oxy hóa ...............................................................................................3
2.1.2. Khái niệm về chất chống oxy hóa................................................................4
2.2. Đại cương về cây Lá Dứa....................................................................................7
2.2.1. Khóa phân loại ..............................................................................................7
2.2.2. Mô tả cây.......................................................................................................7
2.2.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái của cây .......................................................8
2.3. Các nghiên cứu về cây Lá Dứa ...........................................................................8
2.4. Đại cương về những bệnh liên quan đến stress oxy hóa .................................10
2.4.1. Bệnh tiểu đường..........................................................................................10

2.4.1.1. Phân loại bệnh tiểu đường...................................................................10
2.4.1.2. Biến chứng bệnh tiểu đường ...............................................................10
2.4.1.3 Mối liên hệ giữa stress oxy hóa và bệnh tiểu đường. .........................11
2.3.2. Bệnh tăng huyết áp .....................................................................................11
2.3.2.1 Bệnh cao huyết áp.................................................................................11
2.3.2.2 Biến chứng của bệnh tăng huyết áp.....................................................12
2.3.2.3. Mối liên hệ giứa stress oxy hóa và bệnh tăng huyết áp.....................12
PHẦN 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................14
3.1. Phương tiện nghiên cứu.....................................................................................14
3.1.1. Địa điểm và thời gian thực hiện.................................................................14

iii


3.1.2. Dụng cụ và thiết bị......................................................................................14
3.1.3. Hóa chất và vật liệu ....................................................................................14
3.2. Phương pháp nghiên cứu...................................................................................15
3.2.1. Phương pháp khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết cây Lá Dứa
in vitro............................................................................................................................15
3.2.1.1. Phương pháp trích cao cây Lá Dứa bằng dung môi ethanol .............15
3.2.1.2. Khảo sát sự chống oxy hóa tổng số (Total Antioxidant Status (TAS)
assay) in vitro của các cao chiết cây Lá Dứa ..............................................................16
3.2.2. Thống kê phân tích số liệu .........................................................................17
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................18
4.1. Xác định độ ẩm của mẫu cây ............................................................................18
4.2. Phân lập và tinh chế các hợp chất từ cao ethanol ............................................18
4.3. Khảo sát khả năng chống oxy hóa của các cao chiết cây Lá Dứa in vitro .....19
4.3.1. Khảo sát khả năng chống oxy hóa tổng số (Total Antioxidant Status
(TAS) assay) in vitro ....................................................................................................19
4.3.2. Khả năng chống oxy hóa tổng số cao chiết petroleum ether lá ...............21

4.3.3. Khả năng chống oxy hóa tổng số cao chiết ethyl acetate lá.....................22
4.3.4. Khả năng chống oxy hóa tổng số cao chiết n-butanol lá..........................22
4.3.5. Đánh giá hàm lượng chất chống oxy hóa có trong cao petroleum ether,
ethyl acetate và n-butanol.............................................................................................23
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................................27
5.1. Kết luận ..............................................................................................................27
5.2. Đề nghị ...............................................................................................................27

iv


MỤC LỤC HÌNH

Hình 2.1

Cây Lá Dứa.....................................................................................7

Hình 3.1

Quy trình chiết các cao thô ..........................................................17

Hình 4.1

Đường chuẩn khảo sát khả năng chống oxy hóa tổng số
in vitro của Trolox........................................................................20

Hình 4.2

Phần trăm lượng ROS còn lại sau phản ứng với chất chống oxy
hóa có trong các cao chiết lá cây Lá Dứa ...................................25

v


MỤC LỤC BẢNG
Bảng 4.1

Độ ẩm của mẫu cây......................................................................19

Bảng 4.2

Khả năng chống oxy hóa tổng số cao chiết petroleum ether, etyl
acetat và n-butanol từ lá cây Lá Dứa ..........................................21

Bảng 4.3

So sánh khả năng chống oxy hóa tổng số cao chiết petroleum
ether, etyl acetat và n-butanol từ lá cây Lá Dứa.........................24

vi


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
NADPH: Nicotinamide adenine dinucleotic phosphate oxidase
NOx: Nitơ oxidase
SOD: Superoxide dismutase
XO: Xanthine oxidase
CAT: Catalase
GPX: Glutathione peroxidase
AVEs: Advanced Glycation End product

PKC: Protein kinase C
AR: Aldose reductase
EDTA: Disodium dihydrogen ethylenediaminetetraacetate
HA: Huyết áp
OD: Mật độ quang phổ
ROS: Reactive Oxygen Species
TAS: Total Antioxidant Status
TBA: Acid thiobarbituric
TBA-RS: Thiobarbituric acid reactive substances
Trolox: 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid

vii


TÓM TẮT
Stress oxy hóa là nguyên nhân và tham gia vào sự phát triển của nhiều bệnh nguy
hiểm như tiểu đường, tăng huyết áp, ung thư, lão hóa. Các dược liệu dân gian được
nghiên cứu khả năng chống oxy hóa để tìm ra một phương pháp chữa bệnh an toàn,
hiệu quả và chi phí thấp. Đề tài “ Khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết lá
cây Lá Dứa (Pandanus amaryllifolius. Roxb)” được thực hiện nhằn đánh giá khả năng
chống oxy hóa của cây Lá Dứa. Khảo sát khả năng chống oxy hóa được thực hiện
bằng phương pháp TAS (Total Antioxidant Status). Cao petroleum ether lá , cao etyl
acetate lá và cao n-butanol lá được tách từ cao ethanol lá. Sự làm sach gốc tự do của
các cao chiết được khảo sát ở các nồng độ 2 mg/ml; 1 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,25
mg/ml; 0,125 mg/ml; 0 mg/ml và kết quả thu được sau khi đo ở bước sóng 532 nm.
Kết quả nghiên cứu cho thấy cao petroleum ether, cao etyl acetate và cao n-butanol
đều có khả năng chống oxy hóa cao hơn cao ethanol. Khả năng chống oxy hóa của
ba loại cao lá giảm dần theo thứ tự cao n-butanol – cao petroleum ether – cao etyl
acetate.

Từ khóa: Tiểu đường, tăng huyết áp, ung thư, lão hóa, cây Lá Dứa, cao chiết, chống
oxy hóa, TAS, cao petroleum ether, cao etyl acetate, n-butanol.

viii


ix


CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
Stress oxy hóa là hiện tượng xuất hiện trong cơ thể sinh vật khi có sự phá vỡ
cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do (reactive oxygen species - ROS) và hoạt
động của các chất chống oxy hóa (Lại Thị Ngọc Hà và Vũ Thị Thư, 2009). Theo
nghiên cứu của các nhà khoa học cho thấy stress oxy hóa ở người tham gia vào sự
phát triển của nhiều bệnh hoặc có thể làm trầm trọng thêm các triệu chứng của bệnh
(Peter et al, 1989). Những bệnh bao gồm ung thư, bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer,
xơ vữa động mạch, suy tim, cơ tim nhồi máu có nguyên nhân là stress oxy hóa
(Halliwell et al, 2007; Singh, 1995). Tuy nhiên, các gốc tự do có thể có lợi, vì chúng
được sử dụng bởi miễn dịch hệ thống như là một cách để tấn công và tiêu diệt mầm
bệnh (Kennedy et al, 2005). Vì vậy tìm hiểu về tác động của chất oxy hóa đến sức
khỏe của con người đang được quan tâm nghiên cứu.
Chất chống oxy hóa là một phân tử ức chế quá trình oxy hóa của các phân tử
khác. Quá trình oxy hóa là một phản ứng hóa học chuyển electron hoặc hydro từ
một chất một chất oxy hóa. Phản ứng oxy hóa có thể sản xuất các gốc tự do. Chất
chống oxy hóa chấm dứt các phản ứng dây chuyền bằng cách loại bỏ trung gian gốc
tự do và ức chế các phản ứng oxy hóa khác (Sies et al, 1997). Chất chống oxy hóa tự
nhiên hiện diện trong thực vật có khả năng làm sạch các gốc tự do có hại cho cơ thể
(Pal et al., 2011). Các hợp chất chống oxy hóa như axit phenolic, polyphenol và
flavonoid có khả năng làm sạch các gốc tự do như peroxide, hydroperoxide hoặc
lipid peroxyl và do đó ức chế cơ chế oxy hóa (Prakash et al., 2000). Theo các nghiên

cứu cho thấy tăng cường khả năng chống oxy hóa tự nhiên trong cơ thể hay bổ sung
chất chống oxy hóa qua chế độ ăn uống có thể làm giảm nguy cơ của các bệnh mãn
tính và ngăn chặn tiến triển của bệnh (Pal et al., 2011). Hợp chất phenol và
polyphenol có nguồn gốc thực vật, chẳng hạn như flavonoid đã được chứng minh
làm sạch các gốc oxy hóa. Tuy nhiên, hàm lượng các hợp chất polyphenol trong rễ
và vỏ của hệ thực vật nhiệt đới và cận nhiệt đới chưa được nghiên cứu nhiều (Pal et
al., 2011).

x


Ở nước ta, cây Lá Dứa là một loại cây được trồng hoặc mọc hoang dại có
sinh khối rất lớn. Tuy nhiên, cây Lá Dứa chỉ được ứng dụng chủ yếu trong lĩnh vực
thực phẩm như tạo hương, tạo màu … Ngoài ra, trong dân gian còn dùng lá dứa nấu
nước uống như một vị thuốc nam để chữa trị các bệnh như lợi tiểu, hạ đường
huyết… Tuy nhiên chưa có bằng chứng khoa học nào chứng minh những tác dụng
chữa bệnh của cây Lá Dứa. Do đó, đề tài được thực hiện nhằm khai thác tiềm năng
chữa bệnh của cây Lá Dứa và quan trọng hơn góp phần tìm ra cách thức ức chế
nguyên nhân của một số bệnh như tiểu đường, tim mạch … những bệnh đang phát
triển với tốc độ cao trong xã hội hiện đại.
Mục tiêu của đề tài là đánh giá khả năng chống oxy hóa của cao chiết cây Lá
Dứa. Khả năng chống oxy hóa của cao chiết Lá Dứa được đánh giá in vitro bằng
phương pháp TAS (Total Antioxidant Status).
Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm
- Trích các chất bằng dung môi ethanol 99% từ cây Lá Dứa.
- Tách cao petroleum ether, ethyl acetate và n-butanol từ cao ethanol.
- Sử dụng phương pháp TAS để xác định khả năng chống oxy hóa của cây Lá
Dứa in vitro.

xi

CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về chất chống oxy hóa
2.1.1. Stress oxy hóa
Stress oxy hóa được định nghĩa là sự phá vỡ cân bằng giữa quá trình oxy hóa
và quá trình khử trong cơ thể sống (Ziyatdinova et al., 2006).
Quá trình trao đổi chất và stress oxy hóa tạo ra một số sản phẩm trung gian là
các gốc tự do (ROS: Reactive oxygen species). Bên cạnh sự cần thiết cho cơ thể con
người, ROS cũng tham gia vào quá trình lão hóa và sự phát triển của nhiều bệnh
thoái hóa, bao gồm bệnh Alzheimer và Parkinson. Một vài nghiên cứu đã chứng
minh rằng stress oxy hóa là nguyên nhân chính của tăng đường huyết gây ra sự tạo
thành các gốc tự do đóng góp vào sự phát triển và tiến trình của bệnh tiểu đường và
những biến chứng phức tạp. Sự hoạt động của ROS gây rối loạn chức năng nội mô
dẫn đến phát triển bệnh tim mạch (Tripathi and Chandra, 2009). ROS gây nguy
hiểm cho cấu trúc tế bào và phân tử chức năng (như là ADN, protein và lipid) khi
các tác nhân oxy hóa hoặc các gốc tự do hoạt động mạnh (Ganske and Dell, 2006).
Các gốc tự do là các phân tử có một điện tử riêng lẻ ở lớp ngoài cùng (Riley,
1994). Cấu hình này không ổn định và luôn có xu hướng lấy điện tích của các phân
tử liền kề như protein, chất béo, carbohydrate và acid nucleic. Trong hệ thống sinh
học, các gốc tự do có nguồn gốc từ nitơ, oxy và các phân tử lưu huỳnh. Những gốc
tự do trong nhóm này được gọi là dạng oxy phản ứng (ROS: Reactive oxygen
species), dạng nitơ phản ứng (RNS: Reactive nitrogen species) và dạng lưu huỳnh
phản ứng (RSS: Reactive sulfua species).
ROS bao gồm các gốc tự do như superoxide (O2), hydroxyl (-OH), nitric
oxide (NO) và các loại khác như hydrogen peroxide (H2O2), acid hypochlorous
(HOCl) và peroxyl nitrite (ONOO).
RNS được bắt nguồn từ NO thông qua các phản ứng với O2 để hình thành
ONOO. RSS có thể dễ dàng hình thành từ các phản ứng của ROS.
xii

Phần lớn các gốc tự do hoạt động mạnh và gây nhiều tổn hại cho cơ thể nhất
là ROS. Oxy là nguyên tố không thể thiếu để đảm bảo sự sống, mọi tế bào đều cần
oxy để chuyển hóa chất dinh dưỡng thành năng lượng. Oxy mà con người hít thở
hằng ngày là chất cần thiết nhưng chính nó cũng là trở thành gốc tự do. ROS luôn
được sinh ra trong cơ thể và cũng có vai trò tích cực đối với cơ thể. ROS có vai trò
trong biểu hiện gen và vận chuyển ion. Tuy vậy, gốc tự do cũng ảnh hưởng xấu đến
cơ thể khi số lượng tăng lên quá nhiều.
Chúng ta có thể thấy rõ tác hại này qua sự gỉ sét hay còn gọi là sự oxy hóa.
Những quá trình tương tự như vậy cũng đang xảy ra trong co thể, nó luôn tạo ra gốc
tự do. Hiện tượng thực bào là hiện tượng vi khuẩn, virus bị tế bào bạch cầu trong cơ
thể tiêu diệt hay là hiện tượng hô hấp trong tế bào hoặc hiện tượng giải độc ở gan
đều là các hoạt động sinh ra gốc tự do. Các loại phản ứng oxy hóa như superoxide
(O2), hydroxyl radical (HO). Các gốc tự do được hình thành bởi quá trình giảm
electron của phân tử oxy.
ROS có thể được phát sinh trong quá trình chiếu xạ ánh sáng tia cực tím, tia
X và tia gamma, trong các phản ứng xúc tác kim loại, các chất ô nhiễm trong không
khí, được sản xuất bởi bạch cầu trung tính và đại thực bào trong quá trình viêm
nhiễm và là sản phẩm của ty thể xúc tác phản ứng vận chuyển điện tử, là sản phẩm
của những căng thẳng mệt mỏi, thuốc lá, dược phẩm, những thói quen ăn uống
không khoa học , thực phẩm có chất màu tổng hợp, nước có nhiều chlorine
(Candenas, 1989; Halliwell, 1991; Armstrong, 2002 ).
Trong cơ thể khỏe mạnh, gốc tự do sinh ra có giới hạn, không đủ để gây hại.
Vì bên cạnh các gốc tự do luôn có hệ thống các chất chống oxy hóa vô hiệu hóa các
gốc tự do có hại.
2.1.2. Khái niệm về chất chống oxy hóa
Các chất chống oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản
hoặc đảo ngược quá trình oxy hóa các hợp chất có trong tế bào của cơ thể
(Jovanovic and Simic, 2000; Lachman et al, 2000; Singh and Rajini, 2004). Dựa

xiii


trên nguyên tắc hoạt động, các chất chống oxy hóa được phân thành hai loại là các
chất chống oxy hóa bậc một và các chất chống oxy hóa bậc hai. Các chất chống oxy
hóa bậc một khử hoặc kết hợp với gốc tự do, do đó nó kìm hãm pha khởi phát hoặc
bẻ gãy dây chuyền phản ứng của quá trình oxy hóa. Các chất chống oxy hóa bậc hai
kìm hãm sự tạo thành các gốc tự do (hấp thụ tia cực tím; tạo phức với các kim loại
kích hoạt sự tạo gốc tự do như Cu, Fe) (Singh and Rajini, 2004; Rolland, 2004).
Các chất chống oxy hóa hoạt động theo các phương thức sau:
- Các chất này trực tiếp trung hòa các gốc tự do bằng cách cho đi điện tử (e)
để kết hợp với điện tử lẻ của các gốc tự do.
- Làm giảm nồng độ peroxide và sửa chữa các màng bị oxy hóa.
- Tác động đến hệ thống chống oxy hóa nội sinh để làm tăng hoạt động chống
oxy hóa của cơ thể.
Ở mức độ tế bào, chất chống oxy hóa có thể làm giảm gốc tự do bằng cách
làm giảm hoạt động của các enzyme tạo ra gốc tự do như nicotinamide adenine
dinucleotic phosphate oxidase, nitơ oxidase và xanthine oxidase hoặc bằng cách
tăng cường các hoạt động và biểu hiện của các enzyme chống oxy hóa như
superoxide dismutase, catalase và glutathione peroxidase. Tế bào đông vật có chứa
enzyme SOD có thể chuyển đổi O2 thành H2O2 và O2. Tiếp theo đó H2O2 được
enzyme catalase chuyển đổi thành H2O2 và O2. Các chất chống oxy hóa có thể phản
ứng trực tiếp với các gốc tự do và phá hủy chúng, sau đó các chất chống oxy hóa sẽ
trở thành các gốc tự do mới nhưng hoạt động ít hơn và ít nguy hiểm hơn so với các
gốc tự do mà nó đã vô hiệu hóa (Berger, 2005).
Chất chống oxy hóa hiệu quả nhất trong cơ thể là các enzyme như:
glutathione peroxidase, catalase và superoxide dismutase (Mates et al., 1999).
Hệ thống các chất chống oxy hóa của cơ thể người có nguồn gốc từ bên ngoài
(chất chống oxy hóa ngoại sinh) và bên trong (chất chống oxy hóa nội sinh). Các
chất chống oxy hóa nội sinh bao gồm các protein (ferritine, tranaferrine, albumine)

và các enzyme chống oxy hóa (superoxyde diamutase, glutathion peroxydase). Các

xiv


chất chống oxy hóa ngoại sinh là các phân tử nhỏ được đưa vào cơ thể, bao gồm
vitamin E, Vitamin C, các carotenoid và các hợp chất phenolic (Niki et al., 1995;
Pincemail et al., 1998; Lachman et al., 2000; Vanaant et al., 2004).
Hợp chất chống oxy hóa trong thực phẩm đóng vai trò quan trọng như một
yếu tố bảo vệ sức khỏe. Bằng chứng khoa học cho thấy chất chống oxy hóa làm
giảm nguy cơ các bệnh mãn tính như ung thư và bệnh tim (Prakash et al, 2000;
Deshmukh, 2009), viêm và lão hóa (Uttara et al, 2009). Nguồn chính của chất chống
oxy hóa tự nhiên là ngũ cốc, trái cây và rau quả. Thực phẩm chống oxy hóa có
nguồn gốc thực vật như vitamin C, vitamin E, caroten, axit phenolic, phytate và
estrogen thực vật đã được chứng minh có khả năng làm giảm nguy cơ mắc bệnh
(Prakash et al., 2000).
Đặc điểm chính của chất chống oxy hóa là khả năng phục hồi các gốc tự do.
Có một số nghiên cứu cho thấy rằng các chất chống oxy hóa trong trái cây, chè, rau
quả và rượu vang làm giảm tỉ lệ mắc các bệnh mãn tính như bệnh tim và một số
bệnh ung thư (Prakash et al, 2000). Thực vật là nguồn chống oxy hóa tiềm năng của
tự nhiên. Thực vật có thể chống lại ROS nhờ tạo thành các hợp chất chống oxy hóa.
Như vậy, chất chống oxy hóa không chỉ bảo vệ thực phẩm mà còn bảo vệ các tế bào
chống lại thiệt hại do oxy hóa (Zin et al., 2002).
Ngày nay các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên được quan tâm sử dụng rộng
rãi trên thế giới vì tính hiệu quả, an toàn và ít bị ô nhiễm hơn các sản phẩm nhân tạo.
Vì vậy, việc điều tra và xác định các chất chống oxy hóa tự nhiên từ thực vật là quan
trọng và cần thiết (Zin et al., 2002).

xv

2.2. Đại cương về cây Lá Dứa
2.2.1 Khóa phân loại
Giới: Plantae
Bộ: Pandanales
Họ: Pandanaceae
Giống: Pandanus
Loài: P. amaryllifolius
2.2.2. Mô tả cây

Hình 2.1: Cây Lá Dứa
(Nguồn: />Theo Đỗ Tất Lợi (1982), cây Lá Dứa (Pandanus amaryllifolius. Roxb) thuộc
họ Pandanceae.
Cây Lá Dứa thuộc cây thân bụi, có đời sống lâu năm. Đường kính thân cây 13 cm, cây cao đến 1 m, thân rộng, thân cây có màu xanh đậm chia ra nhiều nhánh.
Lá có dạng lá đơn, láng, mọc thành cụm hình hoa thị. Lá dài và có hình dạng giống
mũi mác mép lá không có gai, mặt dưới lá có màu nhạt. Lá dứa có mùi thơm dịu,
không có lông, lá xếp theo hình máng xối, dài khoảng 40-50 cm, rộng 3-4 cm, lá có
nhiều gân cách nhau 1 mm, không thấy có hoa. Lá dứa có mùi thơm như mùi cơm
nếp mà các loài Pandanus khác không có.
xvi


2.2.3. Đặc điểm phân bố và sinh thái của cây
Cây Lá Dứa được phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới khắp các
châu lục. Cây thường được trồng và sử dụng như một loại cây gia vị được dùng
trong ẩm thực vì nó có mùi thơm và màu xanh đặc trưng.
Ở Việt Nam, cây Lá Dứa được trồng và mọc hoang phổ biến. Trên thế giới
cây Lá Dứa được trồng nhiều ở miền nhiệt đới Đông Nam Á như Thái Lan,
Malaysia, Philippines... (Phạm Hoàng Hộ, 2003).
2.4. Các nghiên cứu về cây Lá Dứa

Hiện nay trong công nghiệp thực phẩm lá dứa thơm được dùng để tạo mùi
thơm cho gạo, tạo hương thơm nếp cho các loại bánh kẹo và các loại nước uống giải
khát... (Buttery et al., 1983). Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về hàm
lượng acid amin có trong lá dứa như 2-acetyl-1-pyrrolin gồm có proline và ornithine
được sử dụng trong thực phẩm để làm các loại bánh (Weenen et al., 1997).
Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành trên rễ cây Lá Dứa (Heimsch et al.,
2008). Những nghiên cứu đã chứng minh rằng gốc rễ và thân rễ của cây Lá Dứa có
hiệu quả trong điều trị bệnh tiểu đường trên chuột (Phongboonrod et al., 1976).
Theo sách y học của Philippine, rễ cây Lá Dứa được sử dụng trong điều trị bệnh tiểu
đường (Michael, 1980).
Một số nghiên cứu đã chứng minh được hợp chất 4-hydroxybenzoic acid có
tác dụng làm hạ đường huyết trên chuột (Peungvicha et al., 1998). Hợp chất này chủ
yếu tập trung ở rễ cây Lá Dứa.
Ngoài ra, nhiều nghiên cứu khảo sát các thành phần hóa học khác có trong lá
dứa như hợp chất alkaloids, thành phần có trong hợp chất này là
pandamarilactonine-A, pandanmarilactone-1, pandanamine, pandamarilactonineB,norpandamarilactonine A và norpandamarilactonine-B (Takayama et al., 2001).
Từ rễ của cây Lá Dứa hợp chất alkaloids mới tiếp tục nghiên cứu và đặt tên
pandamarilactonine-H (Mario et al., 2010). Nhiều hợp chất khác có trong lá dứa
được nghiên cứu như 2-acetyl-1-pyrroline (Buttery et al., 1983; Kantilal et al.,

xvii


2009), phenol, sterol và terpenoit (Mohsin et al., 2008), palmitic acid, linoleic acid,
steric acid (Chong et al., 2010).
Rễ cây Lá Dứa chứa các hợp chất phân cực, tan đều trong nước có khả năng
làm giảm đường huyết. Cơ chế hoạt động tương tự insulin hoặc thông qua sự tiết
insulin từ tuyến tụy (Peungvicha et al., 1996; Limviwakill et al., 2001).
Dịch chiết lá dứa có khả năng ức chế khối u (Meyer et al., 1982). Theo y học
hiện đại lá dứa có phytosterol tác dụng làm giảm hiệu ứng và giảm bệnh tim mạch

vành (Ling et al., 1995; Tapiero et al., 2003). Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng
phytosterol có thể có khả năng chống lại hoạt động của khối u, sterol thực vật có khả
năng chống lại tế bào ung thư, đặc biệt đối với các tế bào ung thư vú (Awad et al.,
2000).
Theo nghiên cứu của Yan et al. (2010) khảo sát hoạt động chống oxy hóa trên
phản ứng DPPH của lá dứa tươi và bột lá dứa, cho thấy lá dứa có khả năng chống
oxy hóa.
Ngoài ra, nhiều nghiên cứu hiện nay khảo sát được từ cây Lá Dứa tìm ra
nhiều hợp chất mới, an toàn hơn để kháng khuẩn (Kaiser et al., 2011).
Theo các tác giả Đào Hùng Cường và Nguyễn Thị Thanh Tú (2010) đã khảo
sát sơ bộ các nhóm hoạt chất chính của cây Lá Dứa. Thành phần dễ bay hơi một số
chất gây mùi chính của cây là 2-acetyl-1-pyrrolin (17,7%), Limone (5,5%); 3methyl-2(5H)furanone (4,83%); 2,4,4 trimethylbut-2-enolide (1,28%) có mùi thơm
giống như gạo nếp.
Trong dịch chiết có một số chất gây mùi thơm có nhiệt độ sôi trên 100C nằm
trong dịch chiết đó là các ester và aldehyl như 9-octadecen-12-noic acid, methyl,
bicyclo 3.3.1 nonan-2-one và 9-isopropylidene. Ngoài ra, nghiên cứu còn phân lập
được một chất thuộc họ alkaloid có tên gọi là Padamarilactonine-A.
Trong rễ và lá cây Lá Dứa có chứa chất chống oxy hóa (Nguyễn Tường
Quyên và Nguyễn Phạm Phương Thảo, 2012).

xviii


2.5 Đại cương về những bệnh liên quan đến stress oxy hóa
2.5.1 Bệnh tiểu đường
2.5.1.1 Phân loại bệnh Tiểu Đường
Bệnh tiểu đường thường được chia làm hai loại là bệnh tiểu đường tuýp 1 và
bệnh tiểu đường tuýp 2.
Bệnh Tiểu Đường tuýp 1 chủ yếu do sự tiêu hủy để tự miễn dịch qua trung
gian của các tế bào β tại các tiểu đảo ở tuyến tụy (đảo tụy), dẫn đến tình trạng thiếu

insulin tuyệt đối (Zimmet et al., 2001). Những người bị tiểu đường tuýp 1 phải sử
dụng insulin ngoại sinh để ngăn chặn sự phát triển của các thể keto (ketoacidosis)
(Zimmet., 2001). Bệnh tiểu đường tuýp 1 chiếm tỉ lệ khoảng 5- 10% trong tổng số
người mắc bệnh tiểu đường. Bệnh tiểu đường tuýp 1 thường được phát hiện trước 40
tuổi . Đa số các trường hợp được chẩn đoán bệnh tiểu đường tuýp 1 thường là người
có thể trạng gầy. Người bị bệnh tiểu đường sẽ có đời sống phụ thuộc insulin hoàn
toàn (Nguyễn Thị Bay, 2007).
Bệnh tiểu đường tuýp 2 được đặc trưng bởi sự kháng insulin (Zimmet et al.,
2001) nghĩa là đối với tiểu đường tuýp 2 insulin vẫn tiết bình thường nhưng cơ thể
không sử dụng được. Những người bị bệnh tiểu đường không phụ thuộc vào insulin
ngoại sinh (Zimmet et al., 2001). Phần lớn người bị bệnh tiểu đường thuộc tuýp 2
chiếm khoảng 90% trong tổng số người mắc bệnh (Zimmet et al., 2001) và thường
được phát hiện sau 40 tuổi.
2.5.1.2 Biến chứng bệnh tiểu đường
Bệnh tiểu đường thường có những biến chứng sau: biến chứng tim, hoại tử do
bệnh tiểu đường, hôn mê, biến chứng thần kinh, biến chứng mắt, biến chứng thận,
biến chứng răng, biến chứng ngoài da….

xix


2.5.1.3 Mối liên quan của stress oxy hóa và bệnh tiểu đường
Stress oxy hóa được xem là nguyên nhân chính của bệnh tiểu đường. Tăng
đường huyết có thể gây ra stress oxy hóa thông qua hình thành AVEs (Advanced
Glycation End product- AGEs), gia tăng sự hoạt hóa protein kinase C (PKC) và gia
tăng sự vận chuyển các dẫn xuất axit amin của đường hexose (Tripathi and Chandra,
2009).
Khi đường huyết tăng các gốc superoxide trong chuỗi dẫn truyền điện tử ở ty
thể tăng là nguyên nhân gây ra stress oxy hóa. Sự hình thành superoxide và tiếp theo
là sự gia tăng stress oxy hóa có thể dẫn đến rối loạn chức năng nội mạc và cuối cùng

là các bệnh tim mạch thông qua một số cơ chế khác nhau (Tripathi and Chandra,
2009). Bệnh tiểu đường làm thay đổi hoạt động của các enzyme có vai trò trong sự
chống oxy hóa và làm giảm lượng Gutathion (Gutathion được biết có khả năng
chống lại stress oxy hóa).
AGEs có thể sản sinh ra ROS, gắn vào thụ thể thúc đẩy stress oxy hóa và kích
hoạt các cơ chế sản sinh ra chất oxy hóa trong nội bào. Sự gia tăng vận chuyển
đường đa trong sự tăng đường huyết là do tăng hoạt động của enzyme phân giải
đường aldose (Aldose reductase- AR) trong mô tim. AR được chứng minh gia tăng
chuyển hóa Glutathione do đó làm giảm Glutathione và tiếp đó là gia tăng stress oxy
hóa (Tripathi and Chandra, 2009).
Sự hoạt động của ROS dẫn đến rối loạn chức năng nội mô , một tiền chất để
phát triển các bệnh tim mạch. Vì vậy kiểm soát hoạt động của ROS được xem là
cách tiếp cận hợp lí để chống lại các biến chứng mạch máu phức tạp của bệnh tiểu
đường.
2.5.2 Bệnh tăng huyết áp
2.5.2.1 Bệnh cao huyết áp
Theo Tổ chức Y tế Thế giới, bệnh do tăng huyết áp là nguyên nhân gây tử
vong cao nhất trên thế giới (WHO, 2002). Tăng huyết áp hoặc huyết áp cao ảnh

xx


hưởng đến ít nhất một tỷ người trên toàn thế giới (Kearney et al., 2005). Cao huyết
áp là một rối loạn phổ biến ảnh hưởng lớn đến sức khỏe của cộng đồng. Bệnh cao
huyết áp thường không có triệu chứng và được phát hiện khi kiểm tra sức khỏe định
kì hoặc sau khi xảy ra các biến chứng như một cơn đau tim hoặc đột quỵ (Lip,
2003). Hơn 95% bệnh nhân tăng huyết áp có nguyên nhân thiết yếu hoặc vô căn và
chỉ có một tỷ lệ nhỏ có một nguyên nhân nhận dạng (tăng huyết áp thứ cấp).
Theo lời khuyên của các chuyên gia của Mỹ và Châu Âu, huyết áp vượt trên
mức huyết áp tối ưu dù nhỏ thì cũng làm gia tăng biến cố tim mạch (Chobanian et

al, 2003; Mancia et al., 2007). Đã có nhiều nghiên cứu đánh giá tác hại của tăng
huyết áp trên các hệ thống tim mạch, thận, não. Cao huyết áp là yếu tố nguy cơ
chính gây bệnh tim và đột quỵ và nguy cơ tim mạch tăng gấp đôi với mỗi độ tăng
huyết áp 20/10mmHg HA tâm thu và tâm trương (Lewington et al, 2002).
2.5.2.2 Biến chứng của bệnh tăng huyết áp
Bệnh cao huyết áp thường dẫn đến các biến chứng về tim mạch như cơ tim
phì đại, tai biến mạch máu não, nhũn não, thiếu máu não, hẹp động mạch. Ngoài ra
còn dẫn đến biến chứng về thận như hư màng lọc của các tế bào thận, hẹp động
mạch thận, suy thận…
2.5.2.3 Mối liên quan của stress oxy hóa và bệnh tăng huyết áp
Nghiên cứu cho thấy, stress oxy hóa là nguyên nhân của bệnh tăng huyết
áp, một yếu tố nguy cơ chính cho tỷ lệ tử vong bệnh tim mạch (Rodrigo et al.,
2007). ROS có ảnh hưởng đến mạch máu và sự phát triển của tăng huyết áp
(Lassègue, Griendling, 2004; Touyz, Schiffrin, 2004).
Stress oxy hoá có thể làm rối loạn chức năng nội mô và là hậu quả của tăng
huyết áp (John, Schmieder, 2003). Nghiên cứu cho thấy, ROS làm tăng huyết áp và
hình thành superoxide trong mạch máu được cải thiện nhờ chất chống oxy hóa ngoại
sinh được nghiên cứu trên mô hình động vật (Chen et al., 2001; Hoagland et al.,
2003) và tăng huyết áp trên người (Duffy et al, 2001; Boshtam M et al., 2002). Một
số nghiên cứu cho thấy stress oxy hóa và ROS là nguồn gốc của tăng huyết

xxi


áp.Nghiên cứu cho thấy tăng huyết áp thúc đẩy sản xuất của ROS trong não, thận,
mạch máu (Harrison, 2009).

xxii

CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Địa điểm và thời gian thực hiện
Địa điểm thực hiện :
Phòng Thí Nghiệm Sinh Học, Khoa Khoa Học Tự Nhiên
Phòng Sinh Học Phân tử, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển CNSH
Thời gian thực hiện: từ tháng 8/2012 đến tháng 12/2012
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị
Sử dụng máy móc và thiết bị liên quan đến nghiên cứu hiện có tại Bộ môn
Sinh học và Hóa học – Khoa Khoa học tự nhiên và Viện Nghiên cứu & Phát triển
Công nghệ Sinh học trường Đại học Cần Thơ.
Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu gồm máy cô quay chân không
Heidolph (Đức), máy ly tâm lạnh Mikro 220R (Đức), máy đo pH Metler Toledo,
máy ủ, máy đo quang phổ, máy khuấy từ, máy vortex, cân phân tích AB104
(Switzerland), bình lắng (Trung Quốc). Một số dụng cụ hỗ trợ trong các thí nghiệm
như eppendorf, pipette, đầu côn, kim mũi giáo, cân điện tử, ống đong, bình tam giác,
găng tay, giấy bạc và tủ sấy.
3.1.3. Hóa chất và vật liệu
Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm gồm ethanol (Việt Nam), hydrogen
peroxide (H2O2) (Merck ), acid acetic (Merck),
disodium dihydrogen ethylenediaminetetraacetate (EDTA) (Merck), ammonium
iron (II) sunfate hexahydrate (Fe(NH4)2(SO4)2) (Merck –), sodium benzoate (Trung
Quốc), acid thiobarbituric (TBA) (Merck), Trolox (Denmark), methanol (Trung
Quốc), ethanol 99o (Trung Quốc), n-butanol (Trung Quốc), ethyl acetate (Trung
Quốc), petroleum ether (Trung Quốc).

xxiii


Vật liệu thí nghiệm là 3 kg lá của cây Lá Dứa được thu hái ở tỉnh Vĩnh Long.

3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Phương pháp khảo sát khả năng chống oxy hóa của cao chiết cây
Lá Dứa in vitro
3.2.1.1 Phương pháp trích cao cây Lá Dứa bằng dung môi ethanol
Nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm lá của cây Lá Dứa
(Pandanus amaryllifolius. Roxb) được thu hái ở tỉnh Vĩnh Long. Mẫu sau khi thu
dựa vào các đặc điểm hình thái của thực vật như rễ, lá,… và tham khảo tài liệu từ bộ
sách cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ (2003) để định danh. Mẫu lá của cây Lá
Dứa, chỉ lấy những lá màu xanh bóng, không sử dụng những lá quá non hay quá già.
Mẫu được rửa sạch bằng nước với trọng lượng mẫu tươi là 3 kg. Mẫu cây
được cắt nhỏ, phơi khô cho đến khi trọng lượng không đổi và cân lại lần nữa để xác
định trọng lượng mẫu khô. Độ ẩm của nguyên liệu là sự chênh lệch giữa trọng lượng
tươi và trọng lượng khô và được tính theo công thức sau:

Trọng lượng tươi – Trọng lượng khô
 100 %
Trọng lượng tươi

Mẫu sau khi phơi cho vào túi nylon sạch, ghi nhãn, bảo quản ở nhiệt độ
phòng để sử dụng cho nghiên cứu.
Lá của cây Lá Dứa khô (250g) được ngâm trong dung môi ethanol 99% trong
7 ngày ở nhiệt độ phòng. Sau 7 ngày phần nước ngâm mẫu được lọc và cô cạn bằng
hệ thống máy cô quay để loại bỏ dung môi ethanol.
Quy trình chiết cao được trình bày như trong Hình 3.1.

xxiv