Chương 5 Tạo dòng genomic DNA của eukaryote và xây dựng thư viện genomic DNA

Nội dung
Tạo dòng genomic DNA của eukaryote và xây dựng
thư viện genomic DNA

Thư viện genomic DNA
Khái niệm
Xây dựng thư viện : 4 giai đoạn





RE


I.

Cắt genomic DNA bằng các RE

RE
Genomic DNA

Các đoạn DNA

RE thường có trình tự nhận
biết 4bp

5’…GATC…3’
3’…CTAG…5’

Không

Không ph
phả
ảii lúc
lúc nào
nào cũng
cũng thu
thu đ
đượ
ượcc 1
1 gen
gen nguyên
nguyên vv ẹ
ẹn
n

n
nằ
ằm
m trên
trên 1
1 đo
đo ạ
ạn
n DNA.
DNA.


* Phản ứng cắt từng phần genomic DNA
* Thông thường
Dùng lượng tối thiểu RE + ủ trong thời gian ngắn ( vừa đủ) sao cho mọi vị trí nhận

biết không bị cắt đồng thời

tăng khả năng gen được bảo toàn nguyên vẹn (ngay khi nó chứa vị trí nhận
biết trong gen)

T
Tậ
ập
ph
hợ
ợp
p các
các vector
vector ch
chứ
ứa
a
các
các đo
đoạ
ạn
n genomic
genomic DNA
DNA

 Th
Thư
ư vi
việ
ện

n genomic
genomic DNA
DNA


II. Tạo dòng các đoạn DNA để xây dựng thư viện
genome

DNA ligase

Trong đó
RE

RE


Vector

Năm đưa vào sử dụng

Vật chủ

Cấu trúc

Kích thước đoạn chèn (kb)

Plasmid

1974

E. coli

Mạch vòng

<10

Phage λ

1977

E. coli

Mạch thẳng

15-23

Cosmid

1978

E. coli

Mạch vòng

35-45

BAC

1992

E. coli

Mạch vòng

<300

YAC

1987

S. cerevisiae

Nhiễm sắc thể mạch thẳng

100-2000


III.

Đóng gói in vitro DNA tái tổ hợp và xâm nhiễm vào tb vật ch ủ

V
Vớ
ớii vector
vector là
là bacteriophage
bacteriophage lamda,
lamda, cosmid,
cosmid, th
th ể

ể tái
tái tt ổ
ổ h
hợ
ợp
p
tr
trầ
ần
n ccủ
ủa
a2
2 lo
loạ
ạii này
này không
không th
thể
ể chuy
chuyể
ển
n vào
vào VK.
VK.

Đóng
Đóng gói
gói in
in vitro
vitro DNA

DNA


Nguyên lý sự đóng gói in vitro
Giai đoạn xâm nhiễm


IV. Phân tích genomic DNA bằng lai Southern

Định nghĩa
Mục đích : Kỹ thuật lai Southern

*Xác định có hay không sự hiện diện của gen ?
*Xác định số bản sao của gen đó trong genome
Nguyên tắc: Dựa vào sự lai phân tử


Cách tiến hành lai Southern : 3 bước

Phân
Phân tách
tách các
các đo
đoạ
ạn
n ccắ
ắtt h
hạ
ạn
n ch

chế
ế ccủ
ủa
a genomic
genomic DNA
DNA

Chuyển DNA từ agarose gel lên màng lai

3
2
1

Lai các nucleic acid được cố định trên màng v ới
các mẫu dò được đánh dấu


-

-

Cắt bằng EcoRI
Tinh sạch đoạn chèn DNA từ agarose gel

Cắt bằng EcoRI
Điện di agarose gel

Đánh dấu

***

Biến tính mẫu dò

LAI

-

Biến tính
Trung hòa
Thẩm tích

Cố định DNA

?


Phân tách các đoạn cắt hạn chế của genomic DNA

Genomic DNA được cắt bằng 1 hoặc 1 vài RE  tập hợp các đoạn DNA được phân tách theo kích thước bằng điện di
agarose gel

Lượng mẫu:
- 2-10µg đối với genomic DNA
- Nếu mẫu DNA được tạo dòng trong plasmid hoặc phage  1 lượng ít hơn nhiều (khoảng vài picogram)


- SM: Chỉ thị kích thước chuẩn của DNA. DNA của
bacteriophage λ được phân cắt bằng HindIII hoăăc 1-kb
ladder DNA là các chỉ thị kích thước chuẩn của DNA thông
dụng nhất cho Southern blot.

- PC: đối chứng dương tính (đoạn DNA làm mẫu
dò).
- Các đường 1-6: các mẫu genomic DNA được cắt
bằng enzyme hạn chế.
SM PC 1

2 3

4

5 6

Hình . Hình ảnh điện di của genomic DNA sau khi được phân
cắt bằng enzyme hạn chế.


2. Chuyển DNA từ agarose gel lên màng lai

Gđ: Biến tính

Giai đoạn này cần thiết khi phân tích
Southern các đoạn DNA có kích th ước lớn

DNA được khử purin = dd
HCl loãng

Hạn chế : khó kiểm soát và dễ làm
mất các đoạn DNA nhỏ

Gđ: Thẩm tích

Màng lai

Màng nylon

Màng nitrocellulose

Cao

Thấp

(chiếu xạ UV 2000J)

0
(Đun 80 C, chân không)

Thời gian tạo liên kết đồng

Ngắn

Dài

hóa trị

1-2 phút

2h

-

Sức chịu đựng

Khả năng gắn các đoạn
DNA ngắn(<500bp)


Cathode (-)

Giấy lọc

SSơ
ơđ
đồ
ồ th
thẩ
ẩm
m tích
tích n
nử
ửa
a khô
khô

Gel
Màng lai
Giấy lọc

Anode (+)
Vật nặng 500 g

Giấy bổi
Giấy lọc
Màng

SSơ
ơđ
đồ
ồ th
thẩ
ẩm
m tích
tích mao
mao d
dẫ
ẫn
n

Gel
Giấy lọc
Đệm chuyển


3. Lai mẫu dò – các DNA được cố định
C
Cườ
ường
ng llự
ựcc ion
ion cao

cao
Mẫu dò-màng lai: dd Denhardt, sữa
khô không chất béo hoặc chất tấy SDS

Các điều kiện tiền lai và lai
Các
Các tác
tác nhân
nhân ngăn
ngăn ch
chặ
ặn
n lk
lk
không
không đ
đặ
ặcc hi
hiệ
ệu
u

Mẫu dò-DNA không là chuỗi đích:
Salmon sperm DNA hoặc thymus DNA

T
của mẫu dò và DNA
Tm
m của mẫu dò và DNA
ssợ

ợii đôi
đôi

Tối đa phản ứng lai đặc hiệu của mẫu dò với DNA chuỗi đích

Tối thiểu các lk không đặc hiệu với màng lai và DNA không phải
chuỗi đích


Nhiệt độ nóng chảy của DNA sợi đôi  
o
o
Tm( C) = 81,5 C + 16,6 (log10M) + 0,41 (%G + C) - 0,72 (%f ) - 500/n

Nhiệt độ nóng chảy được dung cho thể lai RNA-DNA:
 
o
o
2
Tm ( C) = 79,8 C + 18,5 (log10M) + 0,58 (%G + C) - 11,8 (%G + C)
- 0,56 (%f ) - 820/n
Trong đó
+
M là nồng đô phân tử của các cation hóa trị 1 (đặc trưng là Na )
(%G + C) là nồng đô phần trăm của guanine và cytosine
(%f) là % của formamide (t/n làm mất sự ổn định của xoắn đôi)
n là chiều dài của thể lai (theo base).

Áp
Áp d

dụ
ụng
ng vvớ
ớii các
các DNA
DNA ssợ
ợii đôi
đôi dài
dài h
hơ
ơn
n 100-200
100-200 nucleotide
nucleotide

 


* Cường lực dùng trong các TN lai là số nghịch đảo của giá trị chuẩn C
C = Tm – Ti
Thông thường các các phản ứng lai và các bước rửa đầu tiên được tiến hành ở
điều kiện cường lực thấp (~ C cao) và tăng dần ở các bước tiếp theo

Chú ý :Tm của các mẫu dò oligonucleotide ngắn h ơn 50 nucleotide th ường
được tính bằng biểu thức:
o
Tm ( C) = 4 (G + C) + 2(A + T)


LAI

*Các thí nghiệm lai trên màng thường được tiến hành bằng cách đánh dấu mẫu dò bằng 32P
*Tuy nhiên,các phương pháp không dùng đồng vị phóng xạ (ví dụ: digoxigenin-dUTP) ngày càng đ ược
sử dụng phổ biến

Ưu điểm

•
•
•

an toàn hơn
tạo ra các mẫu dò có thể được bảo quản trong thời gian dài tr ước khi dùng
kết quả phát hiện các tín hiệu lai nhanh hơn.


A) Hình ảnh phóng xạ tự ghi trên phim X-quang
với mẫu dò được đánh dấu

32

P.

B) Hình ảnh bắt màu trên màng lai Hybond-N với mẫu dò
được đánh dấu digoxigenin-dUTP.

Hình 5.7. Hình ảnh phân tích Southern blot của hai thí nghiệm khác nhau. Các băng màu đen là tín hiệu lai

giữa DNA đích và mẫu dò.

*V. Sàng lọc thư viện genomic DNA
Plasmid
Plasmid hoặc
hoặc

Khuẩn lạc

BAC,YAC
BAC,YAC

Nguồn gốc các
vector
Sinh tan tế bào bị xâm
Virus
Virus

nhiễm Vết tan
(plaque)


Chứa các gen chỉ thị cho phép chọn lọc những tế
bào vật chủ mang vector

Các vector trong tạo
dòng

Chứa các gen bổ sung

*VI. Các phương pháp đánh dấu đoạn DNA bằng phóng xạ
1. Đánh dấu ở đuôi

2. Đánh dấu bằng dịch chuyển điểm đứt

3. Đánh dấu bằng kéo dài primer