chỉ thị phân tử AFLP

Đa hình độ dài các đoạn khuyếch đại
Amplified fragment length polymorphisms
(AFLPs)

LOGO

Kỹ thuật dựa trên cơ sở PCR
www.trungtamtinhoc.edu.vn


Ứng dụng
1

Đánh giá đa dạng di truyền

2

Phân tích độ dài di truyền

3

Kiểm tra dấu hiệu di truyền

4

5

6

Company Logo
www.trungtamtinhoc.edu.vn

Phân tích bộ sưu tập nguồn gene

Xây dựng bản đồ gene

Quản lí các chỉ thị thăm dò


Example 1
Clostridium perfringens

www.trungtamtinhoc.edu.vn


Introduction

Clostridium perfringens là một trực khuẩn yếm khí

Là một trong những tác nhân gây bệnh
đường tiêu hóa ở vật nuôi

Có khả năng sinh hơn 14 loại độc tố

4 loại độc tố chính là: alpha, beta, epsilon
và iota

www.trungtamtinhoc.edu.vn


Title

Use of single-enzyme amplified fragment length polymorphism for
typing Clostridium perfringens isolated from diarrheic piglets

1. Để mô tả sự hiện diện của các độc tố alpha, beta, epsilon, iota bằng PCR của các
chủng

C. perfringens

2. Phân tích sự da dạng di truyền của các chủng C. perfringens thông qua AFLP

www.trungtamtinhoc.edu.vn


Vật liệu và phương pháp
1
Bacterial strains: Dạng sinh học A, Dạng sinh học B, Dạng sinh học C,

Dạng

sinh học D

2
Tách chiết DNA

3

Phản ứng phát hiện gen độc
độc tố:
tố:

Các phản ứng được thực hiện trong 25 làn gel chứa:






5,0 ml của mẫu DNA
1,5 mM MgCl2
200 mM của mỗi dNTP, 250 pmol của mỗi mồi oligonucleotide
1,25 U của Taq DNA polymerase

Phản ứng ở 95ºC trong 1 phút, 55ºC trong 1 phút, và 72ºC trong 1 phút.
Thực hiện trong 35 chu kì

www.trungtamtinhoc.edu.vn


Cắt bằng Enzyme hạn chế, gắn adapter

4

Cắt hạn chế: Ủ 10 mg DNA 16 giờ ở 37ºC với 24 unit Hind III trong đệm và nước cất
(tổng thể tích 20 ml).

Gắn adapter:




5 ml DNA;
0,2 mg mỗi oligonucleotide adapter
ADH1-5' ACGGTATGCGACAG 3'
ADH2- 3'GAGTGCCATACGCTGTCTCGA 5‘





1U của T4 DNA ligase, đệm ligase, và nước (tổng thể tích 20 ml)

Ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 h.
Ligase DNA đã được đun nóng đến 80ºC trong 10 phút, pha loãng 1/5 trong nước
cất vô trùng, và 5 ml được sử dụng cho mỗi phản ứng.

www.trungtamtinhoc.edu.vn


5






PCR

5 ml của DNA ligase
2.5 mM MgCl2
300 ng HIG- 5'GGTATGCGACAGAGCTTG 3‘

1,25 U của Taq DNA polymerase
Tổng thể tích là 50ml
Các sản phẩm khuếch đại được phân tích trên gel agarose 2,0%, nhuộm với

ethidium bromide (0,5 mg / ml), quan sát bởi transilumination UV, chụp ảnh.

6

Phân tích thống kê

Phân tích các mô hình dải đã được thực hiện với phần mềm NTSYS (Numerical phân loại
và hệ thống phân tích đa biến) với hệ số Jaccard.

www.trungtamtinhoc.edu.vn


Kết quả




Mỗi chủng có chứa từ 4 đến 12 mảnh vỡ DNA (band) khoảng 380-2,072 bp.
Chủng tìm thấy là khác nhau liên quan đến sự hiện diện hay vắng mặt của ít nhất một band, và chiều dài của một band
khoảng 1.050 và 1.450 bp.

www.trungtamtinhoc.edu.vn


Thảo luận

 Phát hiện gen mã hóa độc tố C. perfringens bằng phương pháp PCR đã được thực

hiện bởi một số tác giả, vì nó không cần sử dụng động vật trong phòng thí nghiệm và
không phụ thuộc vào sự hình thành bào tử trong ống nghiệm của cơ thể

 Typing là một công cụ dịch tễ học quan trọng đối với việc công nhận các ổ dịch, phát

hiện ô nhiễm chéo và xác định nguồn lây nhiễm, nhận dạng của các chủng độc lực
cao và giám sát các chương trình tiêm chủng.

www.trungtamtinhoc.edu.vn


Example 2

Cây điều
www.trungtamtinhoc.edu.vn


Introduction

 Cây điều: Anacardium occidentale .
+ thuộc lớp cây hai lá mầm (Dicotyledoneae)
+ lớp phụ Archichlamideae
+ bộ Sapindales
+ họ Xoài (Anacardiaceae)
+ chi Anacardium
+ loài Occidentale.

www.trungtamtinhoc.edu.vn

Vật liệu – phương pháp

 Vật liệu nghiên cứu gồm 26 mẫu DNA li trích từ lá điều.
 Dựa vào các thông tin về nguồn gốc và các tính trạng của các mẫu lá điều đã được li trích DNA
(bảng 1)

www.trungtamtinhoc.edu.vn


www.trungtamtinhoc.edu.vn


www.trungtamtinhoc.edu.vn


Phương pháp



www.trungtamtinhoc.edu.vn

Từ nguồn nguyên liệu DNA được li trích sẵn, DNA sẽ được kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ bằng
phương pháp điện di trên gel agarose 1,4% và quang phổ kế.


EcoRI

Cắt thử DNA và chạy kt

trên gel 1,5%

Enzyme cắt hạn chế

Msel

0
Ủ 2h, 37 C làm bất hoạt enzyme
0
ở 70 C trong khoảng 15’

3X buffer T4 ligase

Kiểm tra DNA

www.trungtamtinhoc.edu.vn


0,0025M NaCl
0,0625X buffer T4

0,005mg BSA
Chuẩn bị hỗn hợp enmzy

Enzyme MseI

T4 ligase
Enzyme EcoRI

www.trungtamtinhoc.edu.vn

Phản ứng cắt và gắn adaptor

g
un
d
i
Nộ

01

1X buffer T4 ligase có ATP; 0,05M NaCl; 0,05mg BSA; 1µl adaptor MseI;
1µl adaptor EcoRI; 2µl hỗn hợp enzyme (chuẩn bị ở trên); 600ng DNA
mẫu

i
Nộ

i
Nộ

d

g
un

02

0

Ủ ở 2 giờ ở 37 C

d

g
un

03

Pha loãng phản ứng cắt gắn này bằng TE 1X để được thể tích
200µl

www.trungtamtinhoc.edu.vn


Nhân bản tiền chọn lọc

01

4µl sản phẩm của phản ứng cắt và gắn đã
pha loãng.

www.trungtamtinhoc.edu.vn

02

1µl primer nhân bản tiền chọn lọc

03

15µl hỗn hợp core mix AFLP


Hỗn hợp phản ứng này được khuếch đại

0
Biến tính ở 94 C
trong 30s

0
Hồi tính ở 56 C
trong 30s

PCR

Kéo dài ở 72+0 C
trong 1’

0
Ủ ở 60 C trong
30’ và giữ lạnh ở
0
4 C.
www.trungtamtinhoc.edu.vn


Nhân bản chọn lọc

1
3µl sản phẩm nhân bản

tiền chọn lọc đã pha loãng

3

www.trungtamtinhoc.edu.vn

2

5µM primer MseI-CNN

4

1µM primer EcoRI-ANN

15µl hỗn hợp

chất phát huỳnh quang

core mix AFLP


Xử lí dữ liệu

 Phần mềm MSTATC được sử dụng để tuyển chọn các tổ hợp primer chọn lọc (Primer cho kết quả


khuếch đại cao).

Kích thước của các sản phẩm khuếch đại thu được sau khi điện di bằng máy giải trình tự gen được
mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1.

 Khi có sản phẩm khuếch đại thì mã hóa thành 1 và không có sản phẩm khuếch đại thì mã hóa thành
0.

www.trungtamtinhoc.edu.vn


Phân tích

 Với 64 tổ hợp primer nhân bản chọn lọc trên 4 mẫu PG5, PG6, TU9 và TU20. Kết quả khuếch đại
chọn lọc được trình bày qua bảng 1.

www.trungtamtinhoc.edu.vn


www.trungtamtinhoc.edu.vn