Nghiên cứu tuyển chọn rhodotorula có khả năng sinh tổng hợp beta carotene trên môi trường bán rắn làm thức ăn bổ sung cho gà đẻ trứng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN RHODOTORULA CÓ
KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BETA-CAROTENE
TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN LÀM THỨC ĂN
BỔ SUNG CHO GÀ ĐẺ TRỨNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN RHODOTORULA CÓ
KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BETA-CAROTENE
TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN LÀM THỨC ĂN
BỔ SUNG CHO GÀ ĐẺ TRỨNG

CHUYÊN NGÀNH

: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG

MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH : 62.54.02.01
Phản biện độc lập 1

: PGS.TS NGUYỄN THỊ XUÂN SÂM

Phản biện độc lập 2

: PGS.TS LƯU HỮU MÃNH

Phản biện 1

: PGS. TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Phản biện 2

: PGS. TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN

Phản biện 3

: PGS. TS NGUYỄN TIẾN THẮNG
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS.TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO
2. TS. NGUYỄN HỮU PHÚC


TÓM TẮT LUẬN ÁN
Kết quả của nghiên cứu là đã phân lập được trên bề mặt lá lúa lấy tại Tân An, Long
An, Việt Nam một chủng nấm men Rhodotorula sp.3 có khả năng sinh tổng hợp
carotenoid giàu beta-carotene trên môi trường nuôi cấy bán rắn. Chủng giống này đã
được giải trình tự 28S ADN. Thành phần để phối trộn 100 Kg môi trường nuôi cấy
bán rắn nấm men Rhodotorula sp.3 gồm gạo tấm = 45%; nước = 55 đến 60% , bã đậu
nành = 3% (% Klg). Gạo sau khi hồ hóa với nước, trộn với bã đậu nành rồi lần lượt bổ
sung 1% (ml/g) dầu cọ thô, các chất dinh dưỡng tối ưu gồm: saccharose = 8700; nitơ
(NaNO3) = 8500; phospho (KH2PO4)= 3300; lưu huỳnh (MgSO4.7H2O) = 500 (ppm).
Tiến hành lên men bán rắn ở điều kiện nhiệt độ phòng trên các khay lên men với các

thông số nuôi cấy tối ưu như sau: độ ẩm môi trường = 65%; độ dày lớp môi trường =
1,5 cm; tỷ lệ giống = 9 x 107 CFU/g môi trường. Vào ngày nuôi cấy thứ 7, tiến hành xử
lý vi bao tòan bộ canh trường nuôi cấy với 5% bột gạo và sấy ở nhiệt độ 50 ± 1 oC đến
độ ẩm 11-12% để thu nhận chế phẩm sinh học từ Rhodotorula sp.3 (gọi tắt là βCR).
Chế phẩm βCR đã được thử nghiệm dùng làm nguyên liệu thức ăn nuôi gà đẻ trứng
công nghiệp IsaBrown. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi khẩu phần thức ăn có đáp
ứng nhu cầu năng lượng trao đổi ME ở mức (2893 ± 10) Kcal/Kg, hàm lượng protein
thô đạt (18,27 ± 0,35) %Klg và hàm lượng carotenoid tổng ở mức (131,57 ± 17,46)
ppm gà mái sẽ cho năng suất trứng đạt trên 94%. Các chỉ tiêu chất lượng trứng như
màu của lòng đỏ, kết cấu albumin của lòng trắng trứng đặc, độ dày vỏ cùng với hàm
lượng beta-carotene và vitamin A trong lòng đỏ trứng được cải thiện đáng kể, đặc biệt
hàm lượng vitamin A (µg %) trong lòng đỏ trứng đạt (895,26 ± 66,96) so với trứng gà
ở lô đối chứng là (468,24 ± 52,48).


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các
kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Nghiên cứu sinh

NGUYỄN THỊ MINH NGUYỆT


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên xin bày tỏ lòng tri ân đến Cô PGS.TS. Đống Thị Anh Đào và Thầy TS.
Nguyễn Hữu Phúc đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi
hoàn thành nghiên cứu này.
Chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm - Khoa Kỹ

thuật Hóa học, quý Thầy Cô trong Hội đồng bảo vệ các chuyên đề NCS và đặc biệt là
Thầy PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn đã có những đóng góp, những nhận xét chân thành cho
kết quả đạt được của luận án.
Đồng cảm ơn Ban lãnh đạo cùng giảng viên, nhân viên Viện Công nghệ Thực phẩm –
Sinh học, Trường Đại học Công Nghiệp TP. HCM; Bộ môn chăn nuôi chuyên khoa,
Khoa Chăn nuôi – Thú y trường Đại học Nông Lâm TP. HCM; Khoa Hóa học và Công
nghệ Thực phẩm trường Đại học Bà Rịa-Vũng Tàu đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
học tập, nghiên cứu.
Cảm ơn anh Trần Văn Nam, chủ cơ sở Mai Thủy, thành phố Vũng Tàu, tỉnh Bà RịaVũng Tàu đã tạo điều kiện cho tôi làm thực nghiệm trên đàn gà đẻ trứng IsaBrown của
cơ sở.
Xin gửi lời cảm ơn đến Thạc sĩ Nguyễn Thị Tú Minh, Tạ Đăng Khoa, Nguyễn Đình
Thịnh và cử nhân Nguyễn Minh Nhựt đã hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình tiến hành
thực nghiệm.
Xin cảm ơn Ba, Mẹ và các Anh Chị trong đại gia đình Đức Hải đã giúp con có được sự
thành đạt ngày hôm nay.
Lời cuối cùng tôi xin cảm ơn anh Phan Trung Viên đã luôn cận kề, động viên, chia sẻ,
tạo mọi điều kiện về vật chất lẫn tinh thần cho tôi học tập và nghiên cứu. Cảm ơn hai
con Phan Trung Thành Nhân và Phan Nguyễn Minh Tâm đã ngoan, khỏe mạnh và học
giỏi trong những năm mẹ học tập.


MỤC LỤC
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
MỤC LỤC
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các sơ đồ và hình
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 NẤM MEN RHODOTORULA .............................................................................. 3
1.1.1 Giới thiệu chung và đặc điểm phân loại ........................................................ 3
1.1.2 Đặc điểm sinh lý, hình thái ............................................................................ 5
1.1.3 Đặc điểm sinh hóa........................................................................................... 6
1.1.4 Khả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula ................................ 6
1.1.5 Khả năng sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất khác của Rhodotorula
............................................................................................................................ 13
1.2 KỸ THUẬT NUÔI CẤY BÁN RẮN ...............................................................14
1.2.1 Khái quát về lên men bán rắn ...................................................................... 14
1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bán rắn ................................ 15
1.2.3 Phương pháp định lượng sinh khối trong lên men bán rắn ....................... 17
1.2.4 Lên men bán rắn nấm men Rhodotorula ..................................................... 19
1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula ...... 19
1.3 VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ CHẤT DINH DƯỠNG ĐỐI VỚI GÀ ĐẺ TRỨNG .
.....................................................................................................................................23
1.3.1 Vai trò dinh dưỡng của protein và acid amin .............................................. 24


1.3.2 Vai trò của sắc tố carotenoid đối với gà đẻ ................................................. 25
1.3.3 Vai trò của enzym phytase .......................................................................... 26
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH NẤM MEN RHODOTORULA .....................29

2.1.1 Vật liệu phân lập .......................................................................................... 29
2.1.2 Môi trường phân lập ..................................................................................... 29
2.1.3 Các thí nghiệm định danh nấm men ............................................................ 30
2.2

THU NHẬN CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM MEN RHODOTORULA

THEO KỸ THUẬT NUÔI CẤY BÁN RẮN ............................................................ 30
2.2.1 Khảo sát phương pháp phá vỡ thành tế bào nấm men ...............................30
2.2.2 Thành phần môi trường cơ bản cho quá trình LBR Rhodotorula ............. 34
2.2.3

Tối ưu hàm lượng các chất dinh dưỡng bổ sung cho quá trình sinh tổng

hợp beta-carotene của nấm men Rhodotorula theo qui hoạch thực nghiệm BoxHunter ............................................................................................................................ 36
2.2.4 Tối ưu điều kiện nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula ........................ 38
2.2.5 Phương pháp khảo sát động học sinh tổng hợp sinh khối và các sản phẩm
trao đổi chất khác ......................................................................................................... 39
2.2.6 Khảo sát quá trình sấy và thu nhận chế phẩm ............................................. 40
2.2.7 Các phương pháp phân tích hóa lý ............................................................. 41
2.3 THỬ NGHIỆM TÍNH AN TOÀN CỦA CHẾ PHẨM TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ
NGHIỆM .......................................................................................................................42
2.3.1 Đối tượng thí nghiệm.................................................................................... 42
2.3.2 Thành phần thức ăn đối chứng ..................................................................... 43
2.3.3 Bố trí thí nghiệm trên chuột ....................................................................... 43
2.3.4 Các chỉ tiêu và phương pháp khảo sát ......................................................... 44


2.4 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM TRÊN GÀ ĐẺ TRỨNG ....46
2.4.1 Đối tượng và địa điểm thí nghiệm .............................................................. 46
2.4.2 Thành phần thức ăn đối chứng .................................................................... 46
2.4.3 Các nguyên liệu phối trộn thức ăn thí nghiệm ............................................ 47
2.4.4 Bố trí thí nghiệm trên đàn gà........................................................................ 47
2.4.5 Các chỉ tiêu khảo sát năng suất và phẩm chất trứng ................................... 49
2.4.6 Quan sát sự tiêu huỷ của tế bào nấm men Rhodotorula .............................. 52

2.4.7

Xác định mối tương quan giữa tổng hàm lượng carotenoid trong thức ăn

với năng suất cho trứng của gà ................................................................................... 52
2.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ................................................................... 53
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1

KẾT QUẢ CHỌN RHODOTORULA CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP

BETA-CAROTENE TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN ..........................................54
3.1.1 Phân lập các nấm men sinh sắc tố carotenoid ........................................... 54
3.1.2 Tuyển chọn và định danh các nấm men thuộc giống Rhodotorula trên cơ
sở thực hiện các thí nghiệm theo khoá phân loại của Kreger-van Rij ....................... 54
3.1.3 Chọn chủng nấm men nghiên cứu chính từ các chủng phân lập được trên
cơ sở khả năng sinh tổng hợp beta-carotene ............................................................... 57
3.2

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM

MEN RHODOTORULA THEO PHƯƠNG PHÁP BÁN RẮN ............................... 59
3.2.1 Khảo sát các phương pháp phá vỡ thành tế bào nấm men ......................... 59
3.2.2

Tối ưu hàm lượng các chất dinh dưỡng bổ sung cho quá trình sinh tổng

hợp beta-carotene của Rhodotorula ............................................................................ 63
3.2.3

Điều kiện nuôi cấy tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp beta-carotene của

nấm men Rhodotorula ................................................................................................ 71


3.2.4

Khảo sát khả năng sinh tổng hợp sinh khối, phytase, carotenoid tổng và

beta-carotene của nấm men Rhodotorula theo thời gian ........................................... 77
3.2.5 Khảo sát quá trình sấy và hoàn thiện chế phẩm ......................................... 81
3.2.6 Đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm ......................................................... 82
3.2.7 Phân tích thành phần dinh dưỡng của chế phẩm ....................................... 83
3.3

KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM TÍNH AN TOÀN CỦA CHẾ PHẨM TRÊN

ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM ........................................................................................ 87
3.4

KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẾ PHẨM TRÊN GÀ ĐẺ

TRỨNG ........................................................................................................................ 90
3.4.1 Công thức thức ăn cho gà đẻ trứng sử dụng trong thí nghiệm................... 90
3.4.2 Năng suất trứng ............................................................................................. 92
3.4.3 Mối tương quan giữa hàm lượng carotenoid tổng và năng suất trứng gà ....
............................................................................................................................ 93
3.4.4 Tỷ lệ gà sống ............................................................................................... 94
3.4.5 Các chỉ tiêu phẩm chất trứng ....................................................................... 94
3.4.6 Hàm lượng beta-carotene và vitamin A trong lòng đỏ trứng ..................... 97

Chương 4:

KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ

4.1 KẾT LUẬN .......................................................................................................... 99
4.2 ĐỀ NGHỊ .............................................................................................................. 99
TÀI LIỆU THAM KHẢO
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CB

: cân bằng

CFU

: đơn vị hình thành khuẩn lạc

CK

: chất khô

cs

: cộng sự

DM

: dung môi

ĐC

: đối chứng

HSPL

: hệ số pha loãng

KL

: khuẩn lạc

Klg

: khối lượng

LBR

: lên men bán rắn

% Klg

: phần trăm khối lượng

MT

: môi trường

ME

: năng lượng trao đổi

NT

: nghiệm thức

OD

: mật độ quang

TB

: trung bình

TYT

: tối ưu các yếu tố toàn phần

TN

: thí nghiệm

Sac.

: đường saccharose

UI

: đơn vị hoạt độ


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1

Các sắc tố chính do nấm men Rhodotorula tổng hợp ......................... 10

Bảng 1.2

Các nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp carotenoid và beta-

carotene của nấm men Rhodotorula theo phương pháp nuôi cấy chìm ................. 12
Bảng 1.3

Sắc tố carotenoid do Rhodotorula glutinis DBVPG 3853 tổng hợp

được sau 120 giờ trên môi trường nước ép nho ở các nhiệt độ khác nhau............. 22
Bảng 2.1

Các nguồn phân lập nấm men sinh sắc tố carotenoid.......................... 29

Bảng 2.2

Bố trí thí nghiệm khảo sát phương pháp phá vỡ thành tế bào ............ 32

Bảng 2.3

Thành phần nguyên liệu sử dụng .......................................................... 35

Bảng 2.4

Mức khảo sát của hàm lượng saccharose, nitơ, phospho và lưu

huỳnh để tìm thí nghiệm tại tâm ............................................................................... 36
Bảng 2.5

Ma trận qui hoạch thực nghiệm 4 yếu tố theo phương án quay bậc 2
................................................................................................................ 37

Bảng 2.6

Mức biến thiên hàm lượng saccharose, nitơ, phospho và lưu huỳnh

(ppm)

................................................................................................................ 37

Bảng 2.7

Các mức khảo sát độ ẩm, độ dày lớp môi trường và tỷ lệ giống để

tìm thí nghiệm tại tâm................................................................................................ 38
Bảng 2.8

Ma trận qui hoạch thực nghiệm tối ưu 3 yếu tố theo phương án toàn

phần

................................................................................................................ 38

Bảng 2.9

Mức biến thiên của các yếu tố điều kiện nuôi .................................... 39

Bảng 2.10 Thành phần dinh dưỡng của thức ăn đối chứng cho chuột ................ 43
Bảng 2.11 Thành phần dinh dưỡng thức ăn đậm đặc GD 26 Star Feed ............... 47
Bảng 2.12 Công thức thức ăn cho gà đẻ trứng đối chứng ..................................... 48
Bảng 3.1

Đặc điểm tế bào và tốc độ phát triển của 8 chủng Rhodotorula phân

lập được

................................................................................................................ 55


Bảng 3.2

Kết quả khảo sát đặc điểm sinh lý và sinh hóa của 8 nấm men

Rhodotorula phân lập được ....................................................................................... 56
Bảng 3.3

Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của các chủng nấm men

Rhodotorula trên môi trường cơ bản ………........................................................... 58
Bảng 3.4

Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm

lượng saccharose khác nhau ..................................................................................... 64
Bảng 3.5

Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm

lượng nitơ khác nhau ................................................................................................ 65
Bảng 3.6

Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm

lượng phospho khác nhau ......................................................................................... 66
Bảng 3.7

Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula ở các hàm

lượng lưu huỳnh khác nhau ...................................................................................... 67
Bảng 3.8

Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula từ thực

nghiệm tối ưu dinh dưỡng ........................................................................................ 68
Bảng 3.9

Các hằng số bj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu dinh dưỡng . 69

Bảng 3.10 Các hệ số hồi qui tj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu dinh
dưỡng

….. .......................................................................................................... 69

Bảng 3.11 Các phương sai và F theo các số liệu thực nghiệm tối ưu dinh
dưỡng bổ sung ............................................................................................................ 70
Bảng 3.12 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene ở các mức độ ẩm ban đầu
khác nhau

................................................................................................................ 72

Bảng 3.13 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene ở các lớp môi trường có độ
dày khác nhau ............................................................................................................ 72
Bảng 3.14 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene ở các tỷ lệ giống khác nhau.. 73
Bảng 3.15 Khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của Rhodotorula từ thực
nghiệm tối ưu điều kiện nuôi cấy ............................................................................. 74
Bảng 3.16 Các hằng số bj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu điều kiện
nuôi cấy ………. ....................................................................................................... 75


Bảng 3.17 Các hệ số hồi qui tj tính theo các số liệu thực nghiệm tối ưu điều
kiện nuôi cấy ............................................................................................................ 75
Bảng 3.18 Các phương sai và F theo số liệu thực nghiệm tối ưu điều kiện nuôi
cấy

................................................................................................................ 75

Bảng 3.19 Kết quả xác định hàm lượng beta-carotene, carotenoid tổng theo
thời gian LBR ............................................................................................................ 79
Bảng 3.20 Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng của chế phẩm CR ......... 84
Bảng 3.21 Thành phần acid amin trong chế phẩm βCR … ................................... 85
Bảng 3.22 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm βCR biểu hiện lên chuột 87

Bảng 3.23 Công thức thức ăn gà đẻ sử dụng trong thí nghiệm............................. 91
Bảng 3.24 Kết quả trung bình khảo sát các chỉ tiêu chất lượng trứng qua các
tuần thí nghiệm........................................................................................................... 95
Bảng 3.25 Hàm lượng beta-carotene và vitamin A trong lòng đỏ trứng ở các lô
thí nghiệm ................................................................................................................ 97


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH
Trang

Sơ đồ
Sơ đồ 2.1

Sơ đồ khảo sát và thu nhận chế phẩm sinh học CR từ Rhodotorula .. 33

Sơ đồ 3.1

Tóm tắt quy trình thu nhận chế phẩm βCR .......................................... 83

Hình (hình, biểu đồ, đồ thị)
Hình 1.1

Hình thái tế bào và hình thức sinh sản nẩy chồi Rhodotorula

glutinis

................................................................................................................ 5

Hình 1.2

Sự chuyển hóa beta-carotene dưới tác dụng của nhiệt, ánh sáng và

bức xạ

.............................................................................................................. 7

Hình 1.3

Con đường mevalonate sinh tổng hợp isoprenoid ............................. 8

Hình 1.4

Quá trình sinh tổng hợp carotenoid từ isoprenoid ............................... 9

Hình 1.5

Quá trình sinh tổng hợp beta-carotene, torulene và torularhodin của

Rhodoturula ................................................................................................................ 11
Hình 1.6

Sự sắp xếp của cơ chất rắn ẩm và pha khí liên tục trong hệ thống

lên men bán rắn đối với nấm sợi và vi sinh vật đơn bào ......................................... 14
Hình 1.7

Thành phần thể tích của dòng khí đi vào và đi ra trong lên men bán

rắn

................................................................................................................ 16

Hình 2.1

Gạo tấm và bã đậu nành dùng trong nghiên cứu ................................ 34

Hình 2.2

Chuột nhắt trắng dùng trong nghiên cứu ............................................. 42

Hình 2.3

Gà IsaBrown tại trại thực nghiệm ........................................................ 46

Hình 2.4

Trứng gà đập trên mặt phẳng kính ....................................................... 50

Hình 2.5

Quạt so màu lòng đỏ trứng ................................................................... 51

Hình 3.1

Các nấm men giả định sinh sắc tố carotennoid phân lập được ........... 54

Hình 3.2

Giống nấm men Rhodotorula phân lập được ....................................... 55

Hình 3.3

Trình tự nucleotid đoạn 28S ADN ....................................................... 59


Hình 3.4

Giải trình tự 28S ADN của chủng MN12 ............................................ 59

Hình 3.5

Kết quả tra cứu trình tự 28S ADN của chủng MN12 .......................... 59

Hình 3.6

Biểu đồ biểu diễn hàm lượng beta-carotene thu được theo các

phương pháp phá vỡ tế bào ...................................................................................... 61
Hình 3.7

Đồ thị biểu diễn khả năng sinh tổng hợp sinh khối của Rhodotorula

theo thời gian ............................................................................................................. 77
Hình 3.8

Biểu đồ biểu diễn khả năng sinh tổng hợp phytase theo thời gian .... 78

Hình 3.9

Biểu đồ biểu diễn khả năng sinh tổng hợp beta-carotene và

carotenoid tổng theo thời gian ................................................................................... . 80
Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của thời gian tự phân đến hàm lượng
beta-carotene giữa hai nghiệm thức có bổ sung và không bổ sung chitinase ........ 81
Hình 3.11 Khay lên men bán rắn Rhodotorula và chế phẩm βCR thu được .... 82
Hình 3.12 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của chế phẩm βCR lên hàm lượng
canxi, phospho trong xương và phospho trong phân của chuột thí nghiệm........... 88
Hình 3.13 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của chế phẩm βCR lên hàm lượng
hemoglobin, beta-carotene và vitamin A trong huyết thanh chuột......................... 88
Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn năng suất cho trứng (%) của gà qua các tuần khảo
sát

................................................................................................................ 92

Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa hàm lượng carotenoid tổng với
năng suất cho trứng ................................................................................................... 93
Hình 3.16

Quan sát hệ vi sinh vật trong phân gà của lô thí nghiệm và lô đối

chứng

................................................................................................................ 96


1

MỞ ĐẦU
Nhu cầu phải có thức ăn sạch, an toàn, đảm bảo dinh dưỡng và sức khỏe cộng đồng để
cải thiện và phát triển thể lực, trí lực của các thế hệ người Việt trong tương lai là một

đòi hỏi cấp thiết cho ngành công nghệ thực phẩm. Trong khẩu phần thức ăn của người,
ngoài nền tảng tinh bột như cơm, ngô, khoai.., lượng đạm cơ bản được cung cấp chủ
yếu từ các sản phẩm vật nuôi và cây trồng như thịt, trứng, sữa, rau, đậu, … đặc biệt
trong đó là các sản phẩm từ chăn nuôi. Theo số liệu thống kê, trong những năm đầu của
thế kỷ 21, ước tính tổng giá trị gia cầm đã đóng góp khoảng 5% GDP của Việt Nam
[139]. Tiềm năng và kỳ vọng đóng góp của ngành chăn nuôi này vào việc cung cấp đủ
nhu cầu thức ăn đáp ứng tiêu chuẩn và cho sự phát triển của nền kinh tế đất nước trong
tương lai là rất lớn. Tuy nhiên, tại Việt Nam, gà đẻ trứng chủ yếu được nuôi bằng
nguồn thức ăn tự nhiên sẵn có thiếu hoặc không cân đối về dinh dưỡng hay bằng nguồn
thức ăn nhập từ nước ngoài với giá cao [6].
Thức ăn là vấn đề quan trọng nhất trong chăn nuôi, nó quyết định trực tiếp đến năng
suất, chất lượng và giá thành của các sản phẩm thịt, trứng, sữa,... Đặc biệt, sắc tố
carotenoid là yếu tố cần phải có trong thức ăn. Ngoài tác dụng cung cấp chất tiền
vitamin A, sắc tố carotenoid còn là chất chống oxi hóa sinh học để bảo vệ tế bào,
buồng trứng, làm tăng năng suất và sản lượng trứng [9, 84, 97]. Tuy nhiên nguồn thức
ăn thực vật dồi dào tại Việt Nam như tấm, khoai mì, cám, v.v… dùng trong chăn nuôi
gia cầm nói chung hay gà đẻ hầu như không có sắc tố carotenoid. Do đó, gia cầm bị
thiếu sắc tố vàng nên sức đề kháng yếu, dễ sinh bệnh tật, giảm tỷ lệ đẻ và chất lượng
trứng kém [9].
Trong số các vi sinh vật có khả năng tổng hợp carotenoid thì giống nấm men
Rhodotorula có khả năng sản xuất carotenoid [14, 37-39, 55-59] trong đó có betacarotene [91, 116] đang được nghiên cứu sản xuất ở quy mô công nghiệp để làm chất
màu thực phẩm [51] và đã được dùng làm thức ăn chăn nuôi [80, 110].


2

Luận án: “Nghiên cứu tuyển chọn Rhodotorula có khả năng sinh tổng hợp betacarotene trên môi trường bán rắn làm thức ăn bổ sung cho gà đẻ trứng” được thực
hiện nhằm phân lập, tuyển chọn, tối ưu môi trường nuôi cấy bán rắn dòng vi sinh vật
để sản xuất nguồn thức ăn giàu beta-carotene và sản phẩm này sử dụng có hiệu quả cho
chăn nuôi gia cầm đẻ trứng.

CÁC NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHÍNH CỦA LUẬN ÁN
- Phân lập và chọn từ tự nhiên các nấm men sinh sắc tố carotenoid thuộc giống
Rhodotorula có khả năng tổng hợp sinh khối giàu beta-carotene trên môi trường bán
rắn.
- Xác định các thông số kỹ thuật của quá trình nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula
và thu nhận chế phẩm.
- Khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm sinh học đến năng suất và chất lượng cho trứng
của gà đẻ.
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Tuyển chọn được một chủng nấm men Rhodotorula có khả năng tổng hợp carotenoid
giàu beta-carotene, sinh khối và phytase trên môi trường bán rắn.
- Tối ưu thành phần dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula
trên cơ chất chính là gạo tấm và bã đậu nành với hàm mục tiêu là hàm lượng betacarotene, đồng thời đã đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm sinh học có giá trị dinh
dưỡng cao từ nấm men Rhodotorula theo phương pháp bán rắn.
- Thử nghiệm dùng chế phẩm làm nguyên liệu bổ sung nuôi gà đẻ trứng cho kết quả
tăng năng suất và chất lượng trứng.
- Tìm ra phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa hàm lượng carotenoid tổng trong
thức ăn và năng suất cho trứng của gà chuyên trứng IsaBrown.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 NẤM MEN RHODOTORULA
1.1.1 Giới thiệu chung và đặc điểm phân loại
Hiện nay có hai cách phân loại vi sinh vật. Cách thứ nhất dựa vào đặc điểm sinh lý,
sinh hoá; cách thứ hai dựa vào cơ sở cấu trúc phân tử của tế bào. Nấm men thuộc giới
(Regnum) nấm (Fungi). Giới này bao gồm nấm và nấm lớn (hay nấm quả thể). Ước tính
có khoảng 1,5 triệu loài nấm [74] và giới này cho đến nay vẫn còn là điều bí ẩn [106].

Đại diện tiêu biểu của giới nấm là nấm mốc (Mold), nấm men (Yeast) và nấm lớn
(Mushroom). Nấm men được chia thành 2 ngành là nấm túi (Ascomycota) và nấm đảm
(Basidiomycota) [15]. Trong mỗi ngành (Phylum) có các lớp (Classis), trong mỗi lớp
chia thành các bộ (Ordo), trong mỗi bộ chia thành nhiều họ (Familia), trong mỗi họ
chia thành nhiều giống (Genus), trong mỗi giống có nhiều loài (Species) và loài là đơn
vị cơ bản của hệ thống phân loại.
Năm 1928, Harrison F.C. phân lập và định danh được loài Rhodotorula mucilaginosa
và một số loài khác thuộc giống này. Sau đó giống nấm men trên được đặt tên là nấm
men Rhodotorula Harrison [54]. Theo Harrison, nấm men Rhodotorula có vị trí trong
hệ thống phân loại như sau [129]:
 Giới:
 Ngành :
 Lớp:
 Bộ:
 Họ:
 Giống:
Theo thời gian, đã

Fungi
Basidiomycota
Urediniomycetes
Sporidiales
Sporidiobolaceae
Rhodotorula
hình thành và tồn tại nhiều khoá phân loại và định danh nấm men.

Đầu tiên là khóa phân loại của Hensen (đầu thế kỷ 20) sau đó là khóa của Lodder và
Kreger-van Rij (1952), Lodder (1971), Kreger-van Rij (1984) và hiện nay là khóa phân

4

loại của Barnett và cs (1990) hay Kurtzman và Fell (1998). Trong nghiên cứu này,
khóa phân loại của Kreger-van Rij (1984) được sử dụng để định danh nấm men. Theo
khóa phân loại này, nấm men gồm 60 giống, trong đó có 25 giống xếp vào nhóm có
khả năng tạo và không tạo bào tử, và giống Rhodotorula thuộc nhóm này. Đặc điểm
phân loại của Rhodotorula theo mô tả của Kreger-van Rij như sau [95]:
-

Không hình thành bào tử và không sinh sản hữu tính;

-

Nẩy chồi theo nhiều hướng;

-

Tạo sắc tố đỏ, hồng, cam hay vàng;

-

Khuẩn lạc nhầy;

-

Không lên men các loại đường;

-

Có hay không đồng hóa nitrat NO3- ;

-

Không đồng hoá nguồn carbon inositol, đây là nét đặc trưng khác nhau cơ bản

nhất giữa giống Rhodotorula và giống Cryptococcus.
Theo Lodder và Kreger-van Rij, cơ sở để xếp Rhodotorula vào một giống riêng là do
sự hiện diện của sắc tố carotenoid có các màu từ vàng đến đỏ bên trong tế bào và
không có khả năng đồng hóa nguồn carbon inositol.
Thực tế, khóa phân loại của Lodder và Kreger-van Rij được sử dụng khá phổ biến ở
Việt Nam. Tuy nhiên, hiện tại phương pháp phân loại nấm men chính xác là phương
pháp dựa trên cơ sở vật chất di truyền [75]. Theo Swarajit và cs (2001) việc định danh
các loài nấm men thuộc giống Rhodotorula phải trên cơ sở cấu trúc của rARN [143].
Guinet F. (2007) cho rằng khi định danh giống Rhodotorula nếu chỉ dựa vào kết quả
phản ứng từ bộ test- KIT thì chỉ chính xác khoảng 72%. Nếu kết hợp với các quan sát
đại thể, vi thể về đặc trưng hình thái, các phản ứng sinh hóa trên thạch đĩa sẽ nâng độ
chính xác lên 87,8% [69]. Thực tế hiện nay, một số loài thuộc giống Rhodotorula và
Rhodosporidium tuy có tên gọi khác nhau nhưng có cấu trúc ADN giống nhau [16,
134]. Nghiên cứu của Belloch C. và cs (2007) cũng kết luận rằng giống Rhodotorula đã
xuất hiện nhiều loài mới và nhiều chủng mới ngay trong cùng một loài do đó khi định


5

danh nấm men cần phải có sự hỗ trợ của sinh học phân tử để xác định cấu trúc của
nhân tế bào [21].
1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý
1.1.2.1 Đặc điểm hình thái
Tế bào nấm men Rhodotorula là tế bào sinh dưỡng ở thể đơn bào, quan sát dưới kính
hiển vi có dạng hình tròn, hình oval, tế bào có thể bị kéo dài và bị uốn cong. Kích

thước tế bào nấm men trung bình khoảng 5µm x 8m [4, 10].

Hình 1.1 Hình thái tế bào và hình thức sinh sản nẩy chồi của Rhodotorula glutinis [95]
Thành tế bào nấm men Rhodotorula bao gồm nhiều lớp, thành phần chủ yếu là các
polysaccharid như: 1,3-alpha-glucan; mannan; 1,3-beta-1,6-beta-glucan và chitine (nacetyl glucosamine). Các cấu tử tham gia vào cấu tạo của tế bào nấm men Rhodotorula
thường khác nhau ở các loài, đa số các loài có thành phần cấu tạo gồm glucose,
mannose, galactose và fucose [18, 95].
Khuẩn lạc Rhodotorula phát triển nhanh, bề mặt trơn nhẵn, bóng sáng hoặc mờ đục,
đôi khi gồ ghề, mịn và nhớt. Bờ khuẩn lạc Rhodotorula không có răng cưa, có màu từ
kem, hồng đến đỏ san hô, cũng có khi có màu vàng và đỏ cam thuộc nhóm sắc tố
carotenoid [10, 89, 129]. Kích thước khuẩn lạc tuỳ thuộc vào thành phần môi trường
dinh dưỡng và nhiệt độ nuôi cấy. Đường kính khuẩn lạc Rhodotorula có thể từ 1 đến
10 mm [109]. Trên bề mặt dịch chúng tạo thành các vòng có màu từ vàng đến đỏ [10].
1.1.2.2 Đặc điểm sinh lý
Đa số các loài thuộc giống Rhodotorula sinh sản bằng cách nẩy chồi đa cực, một số
loài sinh sản theo kiểu nẩy chồi có cực. Ngoài ra, Rhodotorula còn sinh sản theo kiểu


6

phân đôi nhưng giống Rhodotorula không có hình thức sinh sản theo kiểu hữu tính [3,
18]. Nấm men Rhodotorula không hình thành sợi nấm, một số loài có sinh sợi nấm giả
nhưng rất kém phát triển, không hình thành bào tử túi [4, 10].
Theo Phaff và cs (1969), khả năng hình thành sắc tố carotenoid là một đặc điểm sinh lý
quan trọng dùng trong phân loại của các giống Rhodotorula và Cryptococcus [117].
1.1.3 Đặc điểm sinh hóa
Ngoài các đặc điểm sinh hoá dùng để phân loại giống nấm men Rhodotorula theo
Kreger-van Rij (mục 1.1.1.), nấm men này còn có một số đặc điểm sinh hóa sau:
-

Không tạo ra acid acetic [91];

-

Sinh enzyme urease [91];

-

Có hoạt tính protease ngoại bào trên các nguồn cơ chất khác nhau [121];

-

Đồng hóa tốt các hydrocarbon dầu mỏ [10, 91, 122].

-

Không sinh enzyme amyloglucosidase và cellulase [93, 121];

-

Không hình thành hợp chất loại tinh bột [18, 95];

-

Sinh tổng hợp enzyme D-amino-acid oxidase (EC 1.4.3.3) [16, 60, 96, 153, 155];

-

Có chứa enzyme khử bão hòa (desaturase), đặc biệt có khả năng chuyển hóa acid

oleic (C18:1) thành acid linolenic (C18:3) [154].
1.1.4 Khả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula
1.1.4.1 Sơ lược về carotenoid
Các carotenoid chủ yếu được tách từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên như thực vật và vi
sinh vật nhưng có chức năng sinh lý đặc hiệu đối với cơ thể người và động vật. Số
lượng các carotenoid tìm thấy trong tự nhiên lên đến 700 loại với các màu sắc khác
nhau. Carotenoid được tổng hợp từ các tiền chất isoprenoid (C5), hợp chất này sau đó
chuyển thành geranyl diphosphat (C20). Sau đó, chuỗi phân tử 20 nguyên tử carbon
này liên kết đuôi – đuôi để tạo thành chuỗi C40. Do đó các carotenoid còn được gọi là
tetraterpenoid [35].


7

Các carotenoid được sử dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm dưới dạng các chất
màu bổ sung vào thức ăn chăn nuôi cá hồi [34], gia cầm [84]. Trong số hàng trăm loại
carotenoid được biết thì beta-carotene được xem là tiền chất cao nhất của vitamin A
[20]. Phân tử beta-carotene có cấu tạo cân đối, được hình thành do một chuỗi prolene
và 2 vòng beta-ionone ở hai đầu, khi thủy phân cho hai phân tử vitamin A. Dưới tác
dụng của nhiệt độ cao, ánh sáng và bức xạ, beta-carotene bị mất màu do xảy ra quá
trình chuyển hóa như hình 1.2.

Hình 1.2 Sự chuyển hóa beta-carotene dưới tác dụng của nhiệt độ, ánh sáng và bức xạ [35]
1.1.4.2 Sinh tổng hợp carotenoid ở nấm men
Nấm men sinh tổng hợp sắc tố carotenoid qua hai giai đoạn. Giai đoạn đầu sinh tổng
hợp các isoprenoid gồm dimethyallyl-pyrophosphat (DMAPP) và isopentenyl-5pyrophosphat (IPP) từ acetyl-CoA. Giai đoạn tiếp theo, DMAPP và IPP sẽ tham gia
vào quá trình sinh tổng hợp carotenoid [137, 144].
- Giai đoạn 1: Sinh tổng hợp isoprenoid (DMAPP và IPP)
Sau phát minh ra con đường mevalonate về quá trình sinh tổng hợp isopenoid ở sinh
vật [20], các tác giả Boll M. và cs (1975) [32], Trocha và cs (1976) [146], Ratledge

(1982) [119], Servouse M. và cs (1986) [132] khẳng định quá trình sinh tổng hợp
isoprenoid IPP của nấm men cũng theo hướng mevalonate. Nghiên cứu của Chappell
(1995), McGarvey và Croteau (1995) về quá trình đồng phân hóa isoprene (C5) chuyển
IPP thành DMAPP do enzyme isomerase xúc tác cho thấy tất cả các sinh vật từ vi
khuẩn đến người đều tổng hợp các isoprenoid theo con đường mevalonate [20, 36, 41,


8

82]. Theo Ratledge C. (2002) [119], giống Rhodotorula và Rhodosporidium sinh tổng
hợp carotenoid theo hướng mevalonate. Như vậy, con đường sinh tổng hợp tiền chất
isoprenoid ở Rhodotorula diễn ra như hình 1.3.

Hình 1.3 Con đường mevalonate sinh tổng hợp isoprenoid [20]
Nghiên cứu của Rohmer và cs (1993) [127], tiếp đến là của Broers (1994) [36],
Schwarz (1994) cho rằng vi khuẩn, thực vật tổng hợp diệp lục tố và sinh vật quang
dưỡng còn có thể tổng hợp các tiền chất IPP không theo hướng mevalonate (nonmevalonate pathway). Các nghiên cứu tiếp theo của Lichtenthaler và cs (1997, 1999),
Eisenreich và cs (1998, 2001), Rohmer (1999) đã khẳng định thực vật và vi sinh vật
trong nhiều trường hợp có thể tổng hợp các tiền chất IPP không theo hướng
mevalonate. Do đó, con đường non-mevalonate còn có tên gọi là Rohmer pathway –
tên của chính tác giả tìm ra và sau này đổi tên thành methylerythritol 4-phosphat
pathway (MEP pathway) [127]. Hiện tại chúng tôi chưa tìm thấy công trình nghiên
cứu nào cho khẳng định rằng quá trình sinh tổng hợp isoprenoid ở nấm men xảy ra theo
hướng non-mevalonate.
- Giai đoạn 2: Sinh tổng hợp carotenoid từ DMAPP và IPP
Ở giai đoạn này (như hình 1.4), các isoprenoid DMAPP và IPP (còn gọi là
hemiterpenes – C5) tham gia trực tiếp vào quá trình sinh tổng hợp GGPP. Hai phân tử
GGPP kết hợp tạo ra carotenoid (tetraterpenes – C40) có tên là phytoene, phân tử này
không màu. Quá trình khử phytoene sẽ hình thành lycopene, là một chuỗi các nối đôi

9

liên hợp có màu đỏ. Lycopene bị đóng vòng để hình thành beta-carotene có màu vàng
[41, 83].

Hình 1.4 Quá trình sinh tổng hợp carotenoid từ isoprenoid [83]
Chú thích: IPP- isopentenyl diphosphat, acetyl-CoA - acetyl coenzym A, HMG-CoA3-hydroxi-3-methylglutaryl coenzym A, DMAPP- dimethylallyl diphosphat; FPPfarnesyl diphosphat, GPP- geranyl diphosphat, GGPP- geranylgeranyl diphosphat.
Sự hình thành các carotenoid của nấm men xảy ra theo kiểu chuỗi từ nhiều tiền chất
bão hòa giống các sinh vật tổng hợp carotenoid khác. Theo Daisuke Umeno và cs
(2003) [43], các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp carotenoid không được phân
loại cụ thể bằng cách dựa vào cơ chất. Theo Simpson và cs (1964) [137], Kocková
(1990) [89], Visser H. và cs (2003) [152] từ phytoene sẽ xảy ra các quá trình khử, tạo
vòng và oxi hóa để tạo ra các carotenoid riêng biệt và các quá trình này ở nấm men có
thể xảy ra theo nhiều hướng khác nhau.
1.1.4.3 Khả năng sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula
Khả năng hình thành sắc tố carotenoid là một đặc điểm sinh lý quan trọng dùng để
phân loại giống Rhodotorula [18, 19, 91, 95]. Carotenoid hình thành được kết hợp với
màng tế bào và chỉ tồn tại bên trong tế bào. Các sắc tố carotenoid ở Rhodotorula có


10

khả năng hấp thu ánh sáng ở bước sóng rộng từ 450 đến 550 nm [39]. Theo Kocková
và cs [89], các carotenoid có tác dụng bảo vệ tế bào nấm men chống lại ảnh hưởng có
hại của tia cực tím. Cường độ màu của nấm men sinh sắc tố tăng lên rất nhiều so với
các giống men trắng khi chúng sống ở các vùng địa lý có tia cực tím mạnh. Tuy nhiên,
khi cường độ bức xạ quá cao, các carotenoid không còn khả năng che chở cho tế bào.
Bảng 1.1 Các sắc tố chính do nấm men Rhodotorula tổng hợp [116]
Các carotenoid thu được

Chủng nghiên cứu
I

II

III

IV

V

VI

VII

VIII

IX

X

Rho. bacarum CBS 6526
+
Rho. bogoriensis CBS 4101
+
Rho .fujisanensis CBS 4551
+
Rho. acheniorum CBS 6384
+ +

Rho. araucariae CBS 6031
+ + + +
Rho. glutinis CBS 20
+ + + +
Rho. graminis CBS 2826
+ + + +
Rho. lactosa CBS 5826
+ + + +
Rho. mucilaginosa CBS 17
+ + + +
Rho. armeniaca CBS 8076
+ + +
+ +
+
Rho. aurantiaca CBS 317
+ + +
+ +
+ +
Rho. hasegawae CBS 8253
+ + +
+
+
+ +
Rho. minuta CBS 319
+ + +
+
+ +
Chú thích: I- beta-carotene, II- beta-zeacarotene, III- torulene, IV- torularhodin, Vplectaniaxanthin, VI- hydroxyplectaniaxanthin, VII và VIII- dẫn xuất của torulene, IXchưa xác định, X- beta-carotenone.
Các carotenoid do Rhodotorula tổng hợp nên chủ yếu là -carotene, -carotene,
torulene và torularhodin [59], trong đó torulene thường chiếm tỷ lệ cao hơn [91]. Tuy

nhiên, Buzzini và cs (2000) [38] khi nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp carotenoid
của Rhodotorula glutinis DBVPG 3853 trên môi trường nước ép nho ở các nhiệt độ
khác nhau lại thu được các carotenoid chính là -carotene, torulene và torularhodin,
trong đó torularhodin luôn chiếm tỷ lệ cao hơn. Theo Sakaki H. và cs (2000) [130],