Nghiên cứu xác lập các điều kiện thích hợp để cố định nấm men saccharoyces cerevisiae trong gel alginate và trên cellulose vi khuẩn nhằm ứng dụng lên men rượu vang nho

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

T NN

NGHI N C
C

ÁC

Đ NH N

TR NG G
NH

INH NG

CÁC ĐI

T

I N TH CH H

Đ

N SACCHAROMYCES CEREVISIAE
GIN T

NG

NG

TR N C
N

N RƯ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT

TP. HỒ CHÍ MINH NĂM 2014
i

I
NG NH

H

N


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

T NN

INH NG

T

NGHI N C
ÁC

CÁC ĐI
I N TH CH H
Đ
C Đ NH N
N SACCHAROMYCES CEREVISIAE
TRONG GEL ALGINATE V TR N C
I H N
NH
NG
NG
N
N RƯ
NG NH

Chuyên ngành: C

T

Đ

Mã số chuyên ngành: 62540201

Phản biện độc lập 1: G
Phản biện độc lập 2:

Phản biện 1: G

T

G

T

Phản biện 2:

G

T

Phản biện 3:

G

T

H

Đ

T

H

N

B

H
T
N

T
T

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

H

G T

ii


ỜI C

Đ

N

Tác giả xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tác giả. Các kết
quả nghiên cứu và các kết luận trong luận án này là trung thực, và không sao chép từ
bất kỳ một nguồn nào và dưới bất kỳ hình thức nào. Việc tham khảo các nguồn tài liệu
đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng theo yêu cầu.

Tác giả luận án
T

N

N

iii


TÓ

TẮT

N ÁN

Với m c đích so sánh khả n ng lên men của nấm men cố đ nh trong gel alginate và
nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n trong quá trình lên men chính sản xuất rượu
vang nho, nội dung nghiên cứu của luận án gồm c bốn phần chính.
Phần 1:

ác đ nh các thông số thích hợp cho quá trình cố đ nh nấm men trong h t

gel alginate và trên chất mang cellulose vi khu n b ng phư ng pháp quy ho ch thực
nghiệm trực giao hai yếu tố, hàm m c tiêu là hiệu suất cố đ nh tế bào. Nguyên liệu s
d ng đ làm chất mang đ u c nguồn gốc nội đ a.
Phần 2: So sánh khả n ng lên men rượu vang của nấm men cố đ nh trong gel
alginate, nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n và nấm men tự do thông qua khả
n ng sinh trư ng, s d ng c chất và sinh t ng hợp sản ph m.
Phần 3: Nghiên cứu quá trình tái s d ng của các lo i nấm men cố đ nh đ lên men
rượu vang. Việc tái s d ng nấm men cố đ nh được tiến hành liên t c trong 1 chu kỳ
lên men. Động h c quá trình lên men

một số chu kỳ đã được trình bày chi tiết.

Chúng tôi so sánh khả n ng tái s d ng của hai lo i nấm men cố đ nh trong gel

alginate và trên cellulose vi khu n dựa trên th i gian lên men, tốc độ s d ng đư ng,
tốc độ sinh t ng hợp ethanol, t lệ tế bào thoát kh i chất mang, độ b n của chất mang
qua các chu kỳ tái s d ng.
Phần : Thiết lập các phư ng trình cân b ng vật chất của quá trình lên men chính
trong sản xuất rượu vang nho với nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n, nấm men
cố đ nh trong h t gel alginate và nấm men tự do.
Kết quả nghiên cứu đã kh ng đ nh ưu thế của nấm men cố đ nh so với nấm men tự
do và sự n i trội của nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n trong quá trình lên men
vang. Cả hai lo i nấm men cố đ nh đ u c th tái s d ng ít nhất 1 chu kỳ và ho t
tính lên men của chúng luôn luôn cao h n so với ho t tính lên men của nấm men tự do.

iv


ABSTRACT

The objective of this research was to compare the fermentation performance of the
immobilized yeast in alginate gel and the immobilized yeast on bacterial cellulose during the
primary fermentation in wine-making. The experimentation consisted of four sections.
Section 1 – Determination of technological parameters for yeast immobilization in
alginate gel and for yeast immobilization on bacterial cellulose by Face Centered Central
Composite Design with two factors. The dependent variable was yield of cell immobilization.
The supports like sodium alginate and bacterial cellulose used in this study were originated
from our country.
Section 2 – Comparison of fermentation ability in wine-making of the immobilized yeast
in alginate gel, the immobilized yeast on bacterial cellulose and the free yeast: Yeast growth,
substrate uptake and metabolite production were evaluated and compared.
Section 3 – Investigation of the reuse of immobilized yeast in wine fermentation: The
fixed yeast in alginate gel and the fixed yeast on bacterial cellulose were reused for 10 cycles
in the repeated batch fermentation. The fermentation kinetics of several cycles were presented

in detail. The fermentation performance of the two immobilized yeasts was evaluated and
compared by the fermentation time, sugar uptake rate, ethanol formation rate, level of number
of cells escaped from the support, stability of the support during the reuse.
Section 4 – Establishment of stoichiometric equations of the primary fermentation in wine
– making for the immobilized yeast in alginate gel, the immobilized yeast on bacterial
cellulose and the free yeast.
The experimental results showed that the fixed yeast always exhibited higher fermentation
performance than the free yeast in wine-making; the fermentation activities of the
immobilized yeast on bacterial cellulose were better than those of the immobilized yeast in
alginate gel. Both the two fixed yeasts could be reused at least for 10 cycles in the repeated
batch fermentation and the fermentation activities of them were always higher than those of
the free yeast.

v


ỜI CÁ

ƠN

Thực hiện và hoàn thành luận án trong một khoảng th i gian khá dài với nh ng
kh kh n chung và riêng, tôi ngh r ng mình s không bao gi làm được nếu như bên
c nh tôi không c nh ng quan tâm và giúp đ của thầy cô, gia đình và b n b . Không
th nào k ra được hết nh ng gì mà tôi đã nhận được khi thực hiện luận án. Tôi rất
cảm kích và biết n vì tất cả nh ng đi u ấy
L i cảm n trân tr ng nhất xin g i đến PGS.TS. Lê V n Việt Mẫn, thầy hướng dẫn
luận án và c ng là chủ nhiệm bộ môn Công nghệ Thực ph m. Từ nh ng công sức mà
thầy đã dành cho, tôi cảm nhận sâu s c câu không thầy đố mầy làm nên .
in cảm n PGS.TS. Nguy n Thúy Hư ng đã cho giống vi sinh vật c ng với cách
chu n b chất mang cellulose vi khu n đ cố đ nh nấm men. Nh ng

kiến đ ng g p

chân tình của cô đã giúp tôi rất nhi u trong quá trình nghiên cứu.
in cảm n PGS.TS. Ngô Đ ng Ngh a đã cung cấp chất mang alginate s d ng
trong luận án.
in cảm n các thầy cô, các b n đồng nghiệp t i bộ môn Công nghệ Thực ph m đã
luôn động viên, g p

kiến, h trợ và gánh bớt công việc đ tôi hoàn thành luận án.

in cảm n sự giúp đ của các thầy cô Khoa K thuật H a h c, ph ng Đào t o Sau
Đ i h c, các đ n v h trợ phân tích: Trung tâm H a Dầu, Trung tâm s c k Hải Đ ng,
ph ng thí nghiệm Công nghệ cao, Viện Công nghệ H a h c.
in cảm n sự giúp đ của các em sinh viên, h c viên trong việc thực hiện các
thực nghiệm, x l số liệu kết quả thí nghiệm, công bố các bài báo
Cuối c ng, xin cảm n m và gia đình đã ủng hộ tinh thần và c ng là động lực cho
tôi cố g ng. Hoàn tất luận án, tr thành một TS, không ch là mong muốn của cá nhân
mà c ng là sự mong đợi và ni m tự hào của m tôi.
Tôi s cất gi sự biết n này trong l ng mãi mãi
Nghiên cứu sinh
Tôn N
vi

N


M CL C
M Đ U ......................................................................................................................... 1
Chư ng 1.

1.1

TỔNG QUAN .......................................................................................... 3

Nấm men vang .................................................................................................. 3

1.1.1

Phân lo i nấm men vang .............................................................................3

1.1.2

Quá trình lên men rượu vang ......................................................................3

1.2

Các phư ng pháp cố đ nh tế bào nấm men vang .............................................. 4

1.2.1

Chất mang trong k thuật cố đ nh tế bào ....................................................4

1.2.2

Các phư ng pháp cố đ nh tế bào nấm men vang ........................................6

1.2.3

Nấm men vang cố đ nh ...............................................................................7

1.3

Cố đ nh nấm men vang trong gel aglinate ........................................................ 8

1.3.1

Alginate .......................................................................................................8

1.3.2

Các phư ng pháp cố đ nh vi sinh vật trong gel alginate ............................. 9

1.3.3

Ưu nhược đi m của phư ng pháp cố đ nh nấm men trong gel alginate ...11

1.4

Cố đ nh nấm men vang trên cellulose vi khu n .............................................. 12

1.4.1

Cellulose vi khu n .....................................................................................12

1.4.2

Các phư ng pháp cố đ nh vi sinh vật trên chất mang cellulose vi khu n .13

1.4.3 Ưu nhược đi m của phư ng pháp cố đ nh nấm men trên cellulose vi
khu n ...................................................................................................................14

nh hư ng của các yếu tố công nghệ đến quá trình lên men rượu vang ....... 14

1.5
1.5.1

nh hư ng của hàm lượng đư ng ............................................................ 15

1.5.2

nh hư ng của pH ....................................................................................16

1.5.3

nh hư ng của hàm lượng SO2 ................................................................ 16

1.5.4

nh hư ng của hàm lượng tannin ............................................................. 17

1.6

ng d ng nấm men cố đ nh trong quá trình lên men vang t nh nhi u chu kỳ 18

1.7

Nh ng ứng d ng khác của vi sinh vật cố đ nh trong sản xuất rượu vang ...... 20

1.8

T ng hợp tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước v hướng đ tài ........... 21

Chư ng 2.
2.1

NGU

N LI U V PHƯ NG PHÁP NGHI N C U ......................24

Nguyên liệu ..................................................................................................... 24

2.1.1

Nấm men ...................................................................................................24

2.1.2

Alginate .....................................................................................................24

2.1.3

Cellulose vi khu n .....................................................................................25

2.1.4

Nho ............................................................................................................25

2.1.5

Các lo i h a chất khác...............................................................................25

2.2

Nội dung nghiên cứu....................................................................................... 26
vii


2.3

Phư ng pháp nghiên cứu thực nghiệm ........................................................... 26

2.3.1

Phư ng pháp c đi n .................................................................................26

2.3.2

Phư ng pháp quy ho ch thực nghiệm trực giao hai yếu tố ....................... 26

2.4

S đồ thí nghiệm ............................................................................................. 27

2.5

Bố trí thí nghiệm ............................................................................................. 28

2.5.1

ác đ nh các đi u kiện thích hợp đ cố đ nh nấm men trong gel alginate28

2.5.2

ác đ nh đi u kiện thích hợp đ cố đ nh nấm men trên cellulose vi khu n .
...................................................................................................................30

2.5.3 Khảo sát và so sánh ho t động của nấm men tự do, nấm men cố đ nh
trong gel alginate và trên cellulose vi khu n trong quá trình lên men rượu vang .33
2.5.4 Khảo sát và so sánh khả n ng tái s d ng nấm men cố đ nh trong gel
alginate và trên cellulose vi khu n đ lên men rượu vang theo phư ng pháp t nh,
nhi u chu kỳ ..........................................................................................................34
2.5.5 Thiết lập phư ng trình cân b ng vật chất của quá trình lên men vang s
d ng nấm men cố đ nh và nấm men tự do............................................................. 36
2.6

Phư ng pháp phân tích ................................................................................... 37

2.6.1

Phư ng pháp phân tích vi sinh .................................................................37

2.6.2

Phư ng pháp phân tích h a l ..................................................................38

2.7

Phư ng pháp x l số liệu .............................................................................. 39

2.8

Các công thức tính toán .................................................................................. 39

2.8.1

Hiệu suất cố đ nh nấm men, H ..................................................................39

2.8.2

Th i gian lên men,  ..................................................................................39

2.8.3

Tốc độ sinh trư ng riêng cực đ i,

2.8.4

Tốc độ s d ng đư ng trung bình, Ks ....................................................... 40

2.8.5

Tốc độ sinh t ng hợp ethanol trung bình, Kp ............................................40

2.8.6

Hiệu suất sinh t ng hợp ethanol,  ........................................................... 40

2.8.7

T lệ thành phần nguyên tố của nấm men, c chất, sản ph m lên men ....40

Chư ng 3.

KẾT QU V B N LUẬN..................................................................41

3.1

max

.....................................................40

ác đ nh các đi u kiện thích hợp đ cố đ nh nấm men trong gel alginate ..... 41

3.1.1 Khảo sát ảnh hư ng của các yếu tố trong quá trình cố đ nh nấm men
trong gel alginate b ng quy ho ch c đi n ............................................................ 41
3.1.2
ác đ nh các đi u kiện thích hợp đ cố đ nh nấm men trong gel alginate
b ng quy ho ch thực nghiệm .................................................................................49
3.2

ác đ nh các đi u kiện thích hợp đ cố đ nh nấm men trên cellulose vi khu n51

3.2.1

Cố đ nh nấm men trên cellulose vi khu n theo phư ng pháp hấp ph .....51

3.2.2

Cố đ nh nấm men trên cellulose vi khu n b ng phư ng pháp hấp ph –ủ ....
...................................................................................................................59
viii

3.2.3 So sánh ho t tính lên men của nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n s
d ng hai phư ng pháp cố đ nh: hấp ph và hấp ph – ủ .......................................60
3.3 Khảo sát và so sánh ho t động của nấm men tự do, nấm men cố đ nh trong
gel alginate và trên cellulose vi khu n trong quá trình lên men rượu vang .............. 62
3.3.1

Khảo sát quá trình sinh trư ng của nấm men tự do và nấm men cố đ nh .62

3.3.2
đ nh

Khảo sát quá trình chuy n h a c chất của nấm men tự do và nấm men cố
...................................................................................................................66

3.3.3 Khảo sát quá trình sinh t ng hợp sản ph m của nấm men tự do và nấm
men cố đ nh ...........................................................................................................71
3.4 Khảo sát và so sánh khả n ng tái s d ng nấm men cố đ nh trong gel alginate
và trên cellulose vi khu n đ lên men vang theo phư ng pháp t nh, nhi u chu kỳ... 78
3.4.1 Khảo sát hiệu quả của giải pháp ngâm h t gel alginate chứa nấm men cố
đ nh trong dung d ch CaCl2 trong quá trình tái s d ng .......................................78
3.4.2 So sánh khả n ng tái s d ng của nấm men cố đ nh trong gel alginate và
trên cellulose vi khu n trong quá trình lên men vang theo phư ng pháp t nh,
nhi u chu kỳ ..........................................................................................................85
3.5 Thiết lập phư ng trình cân b ng vật chất cho quá trình lên men vang s d ng
nấm men cố đ nh và nấm men tự do .......................................................................... 94
Chư ng .

KẾT LUẬN V KIẾN NGHỊ ............................................................... 99

4.1

Kết luận ........................................................................................................... 99

4.2

Kiến ngh ....................................................................................................... 100

DANH M C C NG T

NH Đ C NG BỐ ............................................................101

T I LI U THAM KH O ...........................................................................................102

ix


NH

C BẢNG

Bảng 1.1 ng d ng của nấm men cố đ nh trong sản ph m thức uống chứa ethanol ......4
Bảng 1.2 Một số chất mang s d ng đ cố đ nh nấm men trong sản xuất rượu vang ....5
Bảng 1.3. Các ứng d ng của vi sinh vật cố đ nh trong sản xuất rượu vang ..................20
Bảng 2.1. Thành phần của các d ch nho sau khi ép....................................................... 25
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hư ng các yếu tố đến hiệu quả cố đ nh
nấm men trong gel Ca alginate ......................................................................................28
Bảng 2.3. Các chất b sung vào d ch nho Red Cardinal đ thực hiện quá trình lên men
s d ng của nấm men cố đ nh trong gel Ca alginate .....................................................29

Bảng 2. . Bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hư ng các yếu tố đến hiệu quả cố đ nh
nấm men trên cellulose vi khu n ...................................................................................31
Bảng 2. . Bố trí thí nghiệm so sánh khả n ng lên men của nấm men tự do và cố đ nh
trong quá trình lên men rượu vang ................................................................................34
Bảng 3.1. nh hư ng của nồng độ alginate tới độ cứng của h t gel alginate chứa nấm
men cố đ nh ...................................................................................................................42
Bảng 3.2. nh hư ng của nồng độ alginate tới tốc độ sinh t ng hợp ethanol g L.h của
nấm men cố đ nh trong chu kỳ lên men .....................................................................42
Bảng 3.3. nh hư ng của nồng độ alginate tới t lệ thoát bào
so với số tế bào ban
đầu trong h t gel trong chu kỳ lên men .....................................................................42
Bảng 3. . nh hư ng của nồng độ alginate tới t lệ h t gel alginate b v
so với số
h t ban đầu trong chu kỳ lên men .............................................................................43
Bảng 3. . nh hư ng của mật độ tế bào trong huy n ph giống tới độ cứng của h t gel
alginate chứa nấm men cố đ nh .....................................................................................45
Bảng 3. . nh hư ng của mật độ tế bào trong huy n ph giống tới tốc độ sinh t ng
hợp ethanol g L.h của nấm men cố đ nh trong chu kỳ lên men ............................... 45
Bảng 3. . nh hư ng của mật độ tế bào trong huy n ph giống tới t lệ thoát bào
so với số tế bào ban đầu trong h t gel trong chu kỳ lên men ....................................45
Bảng 3. . nh hư ng của mật độ tế bào trong huy n ph giống tới t lệ h t gel
alginate b v
so với số h t ban đầu trong chu kỳ lên men .................................46
Bảng 3. . nh hư ng của nồng độ dung d ch CaCl2 tới độ cứng của h t gel alginate
chứa nấm men cố đ nh ...................................................................................................47
Bảng 3.1 . nh hư ng của nồng độ dung d ch CaCl2 tới tốc độ sinh t ng hợp ethanol
g L.h của nấm men cố đ nh trong chu kỳ lên men...................................................48
Bảng 3.11. nh hư ng của nồng độ dung d ch CaCl2 tới t lệ thoát bào
so với số tế
bào ban đầu trong h t gel trong chu kỳ lên men ....................................................... 48

Bảng 3.12. nh hư ng của nồng độ dung d ch CaCl2 tới t lệ h t gel alginate b v
so với số h t ban đầu trong chu kỳ lên men .............................................................. 48
Bảng 3.13. Ma trận quy ho ch cấu trúc có tâm cấp hai và kết quả thực nghiệm ..........49
Bảng 3.14. Các hệ số của phư ng trình hồi quy Y1 ......................................................50
Bảng 3.1 . nh hư ng của mật độ tế bào ban đầu trong huy n phù giống đến mật độ tế
bào và hiệu suất cố đ nh trên chất mang cellulose vi khu n .........................................52
Bảng 3.16. nh hư ng của kích thước chất mang đến mật độ tế bào và hiệu suất cố
đ nh trên chất mang cellulose vi khu n .........................................................................52

x


Bảng 3.1 . nh hư ng của khối lượng chất mang đến mật độ tế bào và hiệu suất cố
đ nh trên chất mang cellulose vi khu n .........................................................................54
Bảng 3.1 . nh hư ng của pH huy n ph giống đến mật độ tế bào và hiệu suất cố đ nh
trên chất mang cellulose vi khu n .................................................................................54
Bảng 3.1 . nh hư ng của tốc độ l c đảo đến mật độ tế bào và hiệu suất cố đ nh trên
chất mang cellulose vi khu n ........................................................................................ 55
Bảng 3.2 . nh hư ng của th i gian hấp ph nấm men đến mật độ tế bào và hiệu suất
cố đ nh trên chất mang cellulose vi khu n ....................................................................56
Bảng 3.21. Ma trận quy ho ch cấu trúc có tâm cấp hai và kết quả thực nghiệm ..........57
Bảng 3.22. Các hệ số của phư ng trình hồi quy Y ........................................................ 58
Bảng 3.23. Biến đ i của mật độ tế bào nấm men cố đ nh theo th i gian ủ ...................59
Bảng 3.24. nh hư ng của mật độ tế bào cố đ nh trên chất mang cellulose vi khu n
đến quá trình lên men vang ........................................................................................... 61
Bảng 3.25. Sự thay đ i tốc độ sinh trư ng riêng cực đ i của nấm men cố đ nh và tự do
trong quá trình lên men vang khi hàm lượng đư ng ban đầu trong d ch nho thay đ i .64
Bảng 3.26. nh hư ng của hàm lượng đư ng ban đầu đến th i gian lên men vang s
d ng nấm men cố đ nh và nấm men ..............................................................................67
Bảng 3.27. nh hư ng của hàm lượng đư ng ban đầu đến tốc độ s d ng đư ng trung

bình của nấm men cố đ nh và tự do trong quá trình lên men vang ............................... 68
Bảng 3.28. nh hư ng của hàm lượng đư ng ban đầu đến hàm lượng ethanol trong
vang non s d ng nấm men cố đ nh và tự do ................................................................ 72
Bảng 3.29. nh hư ng của hàm lượng đư ng ban đầu đến tốc độ sinh t ng hợp
ethanol trung bình trong quá trình lên men vang s d ng nấm men cố đ nh và tự do ..73
Bảng 3.30. nh hư ng của hàm lượng đư ng ban đầu đến hiệu suất sinh t ng hợp
ethanol trong quá trình lên men vang s d ng nấm men cố đ nh và tự do ...................74
Bảng 3.31. nh hư ng của hàm lượng đư ng ban đầu đến sự t o thành các hợp chất
hư ng chính của rượu vang non sau quá trình lên men vang s d ng nấm men cố đ nh
và tự do .......................................................................................................................... 77
Bảng 3.32 Th i gian lên men h của nấm men cố đ nh trong gel alginate trong quá
trình tái s d ng .............................................................................................................78
Bảng 3.33. Hàm lượng ethanol trong vang non v v sau m i chu kì lên men của nấm
men cố đ nh trong gel alginate ......................................................................................83
Bảng 3.3 . Hàm lượng các hợp chất hư ng trong vang non các chu kỳ 1,3, , ,1 ..94
Bảng 3.3 . T lệ c chất đã được nấm men s d ng và hàm lượng sản ph m do nấm
men sinh ra trong vang non khi lên men vang s d ng nấm men cố đ nh và nấm men
tự do ............................................................................................................................... 95
Bảng 3.36. Công thức phân t của các thành phần trong d ch lên men và vang non khi
lên men vang s d ng nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n, trong gel alginate và
nấm men tự do ...............................................................................................................95
Bảng 3.37. Số mol c chất hoặc sản ph m tính theo 1mol đư ng lên men trong quá
trình lên men vang s d ng nấm men cố đ nh và nấm men tự do .................................96
Bảng 3.38. Hiệu suất t ng hợp sinh khối và sản ph m
tính theo đư ng lên men)
trong quá trình lên men vang s d ng nấm men cố đ nh và nấm men tự do ................97

xi

C

C HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc của alginate ......................................................................................9
Hình 1.2. Sự hình thành gel của alginate với ion Ca2+ ..................................................9
Hình 1.3. C chế t o gel của alginate từ bên ngoài (trái) từ bên trong (phải) ..............10
Hình 1.4. Cấu trúc cellulose vi khu n (trái) và cellulose thực vật (phải) .....................12
Hình 1.5. Cấu trúc cellulose vi khu n I trái và cấu trúc cellulose vi khu n II phải 12
Hình 3.1. Bi u đồ bi u di n ảnh hư ng của nồng độ dung d ch alginate tới hiệu suất cố
đ nh nấm men trong gel alginate ...................................................................................41
Hình 3.2. Bi u đồ bi u di n ảnh hư ng của mật độ tế bào nấm men trong huy n ph
giống tới hiệu suất cố đ nh nấm men trong gel alginate................................................44
Hình 3.3. Bi u đồ bi u di n ảnh hư ng của nồng độ dung d ch CaCl2 tới hiệu suất cố
đ nh nấm men trong gel alginate ...................................................................................48
Hình 3.4. nh hư ng của mật độ tế bào trong huy n phù giống và nồng độ dung d ch
alginate đến hiệu suất cố đ nh nấm men trong gel alginate...........................................50
Hình 3.5. Hình ch p S M h t gel alginate sau khi cố đ nh tế bào nấm men ................51
Hình 3.6. nh hư ng của mật độ tế bào trong huy n phù giống và th i gian hấp ph
đến hiệu suất cố đ nh nấm men trên cellulose vi khu n ................................................58
Hình 3.7. Hình ch p SEM chất mang cellulose vi khu n sau khi cố đ nh b ng phư ng
pháp hấp ph ..................................................................................................................60
Hình 3.8. Hình ch p SEM chất mang cellulose vi khu n sau khi cố đ nh b ng phư ng
pháp hấp ph -ủ, th i gian ủ 2 ngày ...............................................................................60
Hình 3.9. Hình ch p SEM chất mang cellulose vi khu n cố đ nh b ng phư ng pháp
hấp ph -ủ sau quá trình lên men vang th i gian ủ là 2 ngày ......................................62
Hình 3.10. Sự thay đ i mật độ tế bào nấm men cố đ nh và tự do trong quá trình lên
men vang khi hàm lượng đư ng ban đầu trong d ch nho thay đ i ................................ 63
Hình 3.11. Sự thay đ i tốc độ sinh trư ng riêng của nấm men cố đ nh và tự do trong
quá trình lên men vang khi hàm lượng đư ng ban đầu trong d ch nho thay đ i ..........64

Hình 3.12. Sự thay đ i hàm lượng đư ng trong quá trình lên men vang s d ng nấm
men cố đ nh và tự do khi hàm lượng đư ng ban đầu trong d ch nho thay đ i .............66
Hình 3.13. Sự thay đ i hàm lượng nit amin tự do trong quá trình lên men vang s
d ng nấm men cố đ nh và tự do khi hàm lượng đư ng ban đầu trong d ch nho thay đ i
.......................................................................................................................................69
Hình 3.14. Sự thay đ i hàm lượng nit ammonium trong quá trình lên men vang s
d ng nấm men cố đ nh và tự do khi hàm lượng đư ng ban đầu trong d ch nho thay đ i
.......................................................................................................................................71
Hình 3.15. Sự thay đ i hàm lượng ethanol trong quá trình lên men vang s d ng nấm
men cố đ nh và tự do khi hàm lượng đư ng ban đầu trong d ch nho thay đ i .............72
Hình 3.16. Sự thay đ i hàm lượng acid t ng trong quá trình lên men vang s d ng nấm
men cố đ nh và tự do khi hàm lượng đư ng ban đầu trong d ch nho thay đ i .............75
Hình 3.17. Sự thay đ i hàm lượng acid d bay h i trong quá trình lên men vang s
d ng nấm men cố đ nh và tự do khi hàm lượng đư ng ban đầu trong d ch nho thay đ i
.......................................................................................................................................76
Hình 3.18. T lệ nấm men thoát ra kh i h t gel alginate so với t ng số nấm men trong
d ch lên men qua các chu kỳ tái s d ng .......................................................................81
xii


Hình 3.1 . Hình ch p S M h t gel alginate chứa nấm men cố đ nh trước khi lên men
chu kỳ 1 ......................................................................................................................... 81
Hình 3.2 . Hình ch p S M h t gel alginate chứa nấm men cố đ nh trong trư ng hợp
không ngâm h t trong dung d ch CaCl2 trước khi lên men chu kỳ 7 ............................ 82
Hình 3.21. Hình ch p S M h t gel alginate chứa nấm men cố đ nh trong trư ng hợp
c ngâm trong dung d ch CaCl2 trước khi lên men chu kỳ 7 ........................................82
Hình 3.22. Tốc độ sinh t ng hợp ethanol trung bình của nấm men cố đ nh trong gel
alginate qua các chu kỳ tái s d ng ...............................................................................83
Hình 3.23. Sự biến đ i pH của vang non khi tái s d ng nấm men cố đ nh trong gel
alginate........................................................................................................................... 84

Hình 3.2 . Sự thay đ i mật độ tế bào trong canh trư ng s d ng nấm men cố đ nh
các chu kỳ tái s d ng thứ 1, 3, , , 1 ........................................................................85
Hình 3.25. T lệ tế bào nấm men thoát kh i chất mang so với t ng số nấm men trong
d ch lên men qua các chu kỳ tái s d ng .......................................................................86
Hình 3.26. Tốc độ sinh trư ng trung bình của nấm men cố đ nh các chu kỳ tái s
d ng thứ 1, 3, , , 1 ....................................................................................................87
Hình 3.2 . Hình ch p SEM b mặt h t gel alginate trái và miếng cellulose vi khu n
phải trước khi lên men chu kỳ 1 .................................................................................88
Hình 3.2 . Hình ch p SEM b mặt h t gel alginate trái và miếng cellulose vi khu n
phải trước khi lên men chu kỳ 7 .................................................................................88
Hình 3.2 . Hình ch p SEM mặt c t h t gel alginate trái và mặt c t miếng cellulose vi
khu n phải trước khi lên men chu kỳ 7.......................................................................88
Hình 3.30. Sự thay đ i hàm lượng đư ng trong quá trình lên men vang của nấm men
cố đ nh các chu kỳ tái s d ng thứ 1,3, , ,1 ............................................................ 89
Hình 3.31. Th i gian lên men của nấm men cố đ nh các chu kỳ tái s d ng ............90
Hình 3.32. Tốc độ s d ng đư ng trung bình của nấm men cố đ nh qua các chu kỳ tái
s d ng .......................................................................................................................... 91
Hình 3.33. Sự thay đ i hàm lượng ethanol trong quá trình lên men vang của nấm men
cố đ nh trong quá trình lên men vang các chu kỳ tái s d ng thứ 1,3, ,7,10 ...........92
Hình 3.3 . Hàm lượng ethanol trong vang non sau quá trình lên men chính s d ng
nấm men cố đ nh qua các chu kỳ tái s d ng ................................................................ 92
Hình 3.35. Tốc độ sinh t ng hợp ethanol trung bình của nấm men cố đ nh trong quá
trình lên men vang qua các chu kỳ tái s d ng ............................................................. 93
Hình 3.3 . Hiệu suất sinh t ng hợp ethanol trung bình của nấm men cố đ nh trong quá
trình lên men vang qua các chu kỳ tái s d ng ............................................................. 93

xiii


NH

ADH

C

T

TH

T NG

CH

I T TẮT

: Alcohol dehydrogenase

DCM
: Delignin ied cellulose material, cellulose đã tách lignin
DEAE-cellulose : Diethylaminoethyl-cellulose
GAE

: Gallic acid equivalents, hàm lượng được tính theo acid gallic

MLF

: Malolactic fermentation, quá trình lên men malolactic

Nmcđ A

: Nấm men cố đ nh trong gel alginate

Nmcđ Akn

: Nấm men cố đ nh trong gel alginate không được ngâm trong dung
d ch CaCl2 sau m i chu kỳ tái s d ng

Nmcđ An

: Nấm men cố đ nh trong gel alginate được ngâm trong dung d ch
CaCl2 sau m i chu kỳ tái s d ng

Nmcđ B
Nmtd
SEM

: Nấm men cố đ nh trên cellulose vi khu n
: Nấm men tự do
: Scaned electronic microscope, kính hi n vi điện t quét

-xiii-


Đ
ượu vang là một thức uống lên men từ d ch nho s

d ng nấm men

Saccharomyces cerevisiae [1], [2]. ượu vang được nhi u ngư i ưa thích do hư ng v
hết sức đặc trưng và nh ng tác d ng c lợi cho sức kh e [3], [4].

ếu tố quyết đ nh chất lượng của một sản ph m rượu vang, bên c nh nguyên liệu
nho, là giống nấm men. Giống nấm men được xem là mấu chốt công nghệ đ t o ra
nh ng lo i rượu vang c chất lượng khác nhau. Nh ng chủng nấm men vang thuộc
loài Saccharomyces cerevisiae đã được phân lập từ nho trong quá trình lên men rượu
vang tự nhiên và được cấy chuy n lưu gi đ ph c v cho ngành công nghiệp rượu
vang. Hiện nay, hầu hết các nhà máy sản xuất rượu vang, bao gồm nh ng nhà máy
Việt Nam, vẫn s d ng nấm men Saccharomyces cerevisiae d ng tự do đ lên men
rượu vang. Mặc d chất lượng sản ph m đã n đ nh h n so với rượu vang lên men tự
nhiên, nhưng việc s d ng nấm men tự do đ lên men rượu vang vẫn c n khá nhi u
nhược đi m. Đặc biệt khi tiến hành lên men trong nh ng đi u kiện không thuận lợi thì
sự sinh trư ng c ng như khả n ng sinh t ng hợp sản ph m trao đ i chất của nấm men
tự do b ức chế r rệt [5], [6], [7].
Một trong nh ng giải pháp đ kh c ph c các nhược đi m trên là s d ng nấm men
cố đ nh. Các nghiên cứu v s d ng nấm men cố đ nh trong sản xuất rượu vang đ u
cho thấy nấm men cố đ nh c nhi u ưu đi m h n h n so với nấm men tự do [8], [9].
Ngoài ra, khả n ng tái s d ng của nấm men cố đ nh c n đem l i nhi u lợi ích v mặt
kinh tế vì chi phí sản xuất giảm.
Đ cố đ nh nấm men lên men rượu vang, phư ng pháp keo t tế bào t ra không
thích hợp vì nh ng tế bào n m t i v ng tâm của khối keo t kh tiếp xúc với c chất
[10], [11] phư ng pháp nhốt tế bào b ng màng membrane hay vi bao c ng ít được s
d ng vì membrane d b t t ngh t b i các chất keo c trong d ch nho [12]. Đối với
phư ng pháp nhốt tế bào trong cấu trúc gel, nhi u lo i chất mang đã được s d ng như
alginate [13], [14], agar [15], gelatin [16], -carrageenan [17], polyacrylamide [18],
polystyrene [19]. Alginate là vật liệu được s d ng ph biến nhất; h n

các nghiên

cứu v cố đ nh tế bào trên thế giới đã s d ng alginate. Chế ph m nấm men cố đ nh

-1-

trong gel alginate đã được thư ng m i h a và được ứng d ng trong quy trình sản xuất
rượu vang

quy mô lớn.

Nấm men cố đ nh b ng phư ng pháp hấp ph trên b mặt chất mang xốp như
kissiris [20], [21], vải cotton [22], mẫu thủy tinh xốp [23], ceramic [24], [25], hay trên
chất mang giàu cellulose như bã mía [26], miếng trái cây [27]

c ng được ứng d ng

đ lên men rượu vang. Trong vài n m gần đây, c hai công bố khoa h c v việc s
d ng cellulose vi khu n làm chất mang cố đ nh nấm men đ ứng d ng trong quá trình
lên men sản xuất rượu vang và ethanol [28], [29]. Tuy nhiên, đến nay vẫn chưa c các
nghiên cứu chuyên sâu v nấm men vang cố đ nh trên chất mang cellulose vi khu n.
Chất mang cellulose vi khu n và chế ph m tế bào cố đ nh trên cellulose vi khu n vẫn
chưa được thư ng m i h a

th trư ng trong và ngoài nước.

Chúng tôi thực hiện đ tài: N
Saccharomyces cerevisiae
, với:
cải thiện hiệu quả kinh tế của quá trình lên men rượu vang b ng
giải pháp s d ng nấm men cố đ nh trên chất mang mới rút ng n th i gian lên men,
tái s d ng nấm men và n đ nh chất lượng sản ph m).
: so sánh hiệu quả s d ng hai chế ph m nấm men vang
cố đ nh, trong đ c một chất mang đã được s d ng ph biến alginate và một chất

mang mới cellulose vi khu n trong quá trình lên men chính rượu vang nho.
chúng tôi s tìm đi u kiện thích hợp đ cố đ nh nấm men
trên hai lo i chất mang alginate và cellulose vi khu n, so sánh khả n ng lên men rượu
vang của nấm men cố đ nh trên hai lo i chất mang c ng với nấm men tự do, so sánh
khả n ng tái s d ng của nấm men cố đ nh và thiết lập phư ng trình cân b ng vật chất
cho quá trình lên men chính rượu vang nho cho cả hai lo i nấm men cố đ nh và nấm
men tự do.
Kế thừa kết quả đã công bố của một số nhà khoa h c trong nước, trong nghiên cứu
này, chúng tôi s d ng chất mang alginate và cellulose vi khu n c nguồn gốc t i Việt
Nam.

-2-


C

1 TỔNG QUAN

1.1 N m men
ấ

1.1.1 Nấm men

vang

Nấm men c th được chia thành hai nhóm là Saccharomyces và nấm men bản đ a.
Saccharomyces cerevisiae là loài nấm men chủ lực thực hiện quá trình lên men
ethanol trong sản xuất rượu vang. Chính vì thế, Saccharomyces cerevisiae c n được
g i là nấm men vang [1], [2], [30].
ấ

bao gồm một số giống nấm men khác trong d ch nho lên men

như Kloeckera, Metschnikowia, Torulaspora, Hanseniaspora, Zygosaccharomyces,
Candida, Pichia, Cryptococcus. Hầu hết các loài thuộc nấm men bản đ a không c khả
n ng tồn t i khi nồng độ ethanol cao h n

v v, ngo i trừ Brettanomyces bruxellensis

c th phát tri n trong môi trư ng c nồng độ ethanol lên đến 12 . Trước đây, nấm
men bản đ a được xem là các vi sinh vật gây hư h ng rượu vang. Tuy nhiên, nh ng
nghiên cứu gần đây cho thấy r ng, một số loài nấm men bản đ a c lợi cho chất lượng
sản ph m, làm đa d ng h a hư ng v của rượu vang [5], [31].
1.1.2 Q á ì
Lên men

l

u vang
v

ự

là quá trình lên men vang xảy ra tự nhiên mà không

cần cấy giống. Thư ng thì các giống nấm men bản đ a như Kloeckera, Hanseniaspora
và Candida chiếm t lệ cao trong giai đo n đầu của quá trình lên men.
theo, Pichia và Metschnikowia chiếm ưu thế.

giai đo n tiếp

giai đo n lên men cuối c ng, ch c n

l i Saccharomyces cerevisiae tồn t i nh khả n ng ch u được nồng độ ethanol cao. Các
giống nấm men khác như Torulaspora, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces,
Zygosaccharomyces, Brettanomyces c ng c th sống s t trong quá trình lên men và là
nguyên nhân gây nên nh ng khuyết tật liên quan đến giá tr cảm quan của sản ph m
[3], [7], [32].
Lên men

vang

ấ

bao gồm quá trình x l d ch nho

b ng SO2 nh m h n chế sự phát tri n không mong muốn của một số loài nấm men bản
đ a, và chủ động cấy giống Saccharomyces cerevisiae đ kh i đầu quá trình lên men.
Nh vậy, quá trình lên men vang di n ra nhanh h n, an toàn h n và c th t o ra rượu
-3-


vang với hư ng v đặc trưng n đ nh. Tuy nhiên, một số ít phân xư ng sản xuất vang
quy mô nh vẫn s d ng phư ng pháp lên men tự nhiên vì quy trình đ n giản mặc d
chất lượng sản ph m kém n đ nh [6], [30].
1.2 C

nh t bào n m men

K thuật cố đ nh tế bào nấm men được ứng d ng trong ngành công nghiệp thức

uống lên men như rượu vang nho, vang táo, bia và nước trái cây lên men có nồng độ
ethanol thấp. M c đích chính của việc s d ng nấm men cố đ nh là đ rút ng n th i
gian lên men, tái s d ng nấm men và n đ nh chất lượng sản ph m. Bảng 1.1 t m t t
một số ứng d ng của nấm men cố đ nh trong sản xuất thức uống chứa ethanol.
Bảng 1.1

ng d ng của nấm men cố đ nh trong sản ph m thức uống chứa ethanol

Sản ph m
Vang nho

Vang táo
Vang dứa
Bia ngh o ethanol
Bia
Bia nồng độ cao

Vi sinh vật
S. cerevisiea
S. cerevisiea
S. bayanus
C. stellata + S. cerevisiae
S. cerevisiea
S. cerevisiea
S. cerevisiea
S. cerevisiea
S. cerevisiea
S. cerevisiea
S. cerevisiea+L. oenos
S. bayanus+L. oenos

S. cerevisiea
S. cerevisiae
S. cerevisiae
S. cerevisiae
S. cerevisiae
S. cerevisiae

1.2.1 Chất mang trong kỹ thuật c

Chất mang
DEAE-cellulose
Khoáng kissiris
Ca-alginate
Ca-alginate
Mảnh -alumina
Miếng táo
Cellulose vi khu n
H t lúa mì
V nho, l i b p
Ca-alginate
Ca-alginate
Ca-alginate
Miếng dứa
DEAE-cellulose
-caraageenan
Ca-alginate
DEAE-cellulose
Ca-alginate

Nguồn

Lommi H. et al., 1990 [33]
Bakoyianis V. et al., 1992 [20]
Busova K.et al., 1994 [34]
Ferraro L. et al., 2000 [35]
Loukatos P.et al., 2000 [36]
Kourkoutas Y. et al., 2001 [27]
Nguyen T.H. et al., 2008 [28]
Kandylis P., 2010 [37]
Genisheva Z., 2011 [38]
Kassim H.C, 2012 [39]
Cabranes C. et al., 1998 [40]
Nedovic V.A. et al., 2000 [41]
Diep T.X. et al.,2009 [42]
Van Iersel M., 1995 [43]
Smogrovicova D., 1999 [44]
Patkova J., 2000 [45]
Kourkoutas Y. et al., 2004 [46]
Tran Q. H., et al., 2008 [47]

nh tế bào

Chất mang vô cơ: chúng c độ b n c h c và h a h c cao. Tuy nhiên sản ph m lên
men thu được thư ng b lẫn các t p chất c xuất xứ từ chất mang. Chất mang vô c
thư ng gặp là h t thủy tinh, ceramic d ng khối tr hay d ng h t, các kissiris khoáng,
gamma-alumina
Chất mang hữu cơ: chúng không làm cho sản ph m lên men b lẫn t p chất, b n
nhiệt và tư ng đối n đ nh v mặt h a h c trong đi u kiện lên men. Chất mang h u c
cố đ nh nấm men bao gồm các polymer t ng hợp như gel polyvinylalcohol,
polyvinylchloride, màng polyethylene, các chất mang tự nhiên bản chất polysaccharide
-4-

như agar, alginate, chitosan, pectin, carrageenan, dẫn xuất diethylaminoethylen của
cellulose (DEAE-cellulose), cellulose đã tách lignin (Delignified cellulose), cellulose
vi khu n Bacterial cellulose , h t lúa mì, lúa m ch, các miếng trái cây như miếng táo,
lê, mộc qua, quince, sung, nho
nho, bã nho ép, v dưa hấu

một số lo i phế liệu như bã malt, bã mía, l i b p, v

và các chất mang tự nhiên bản chất protein như gelatin,

viên gluten Bảng 1.2
Bảng 1.2 Một số chất mang s d ng đ cố đ nh nấm men trong sản xuất rượu vang
Chất mang
Chất mang
vô c

Lo i chất mang
Montmorilonite, polygorskite
Thủy tinh
Kissiris
-alumina

Chất mang
h uc

Hydroxyapatite ceramics
-carrageenan
Acid pectic, agar

Alginate

Cellulose vi khu n
Cellulose đã tách lignin
Gelatin
Gluten
Polyvinyl alcohol
Polystyren
Miếng lê
Miếng mộc qua
Miếng táo
Nho khô
Quả sung
Miếng i
H t lúa mì, h t lúa m ch
Củ cải đư ng
V nho
V dưa hấu
Bã mía
V kén t m
Thân, gốc cây b p
Chất mang
kết hợp

Nội nh h t
Đ a thủy tinh phủ alginate

Nguồn
Ageeva N.M. et al., 1985 [48]
Hamdy M.K., 1990 [49]

Bakoyianis V. et al., 1992,1997 [20], [21]; Argiriou T. et
al.,1996 [50]; Loukatos P. et al., 2003 [51]
Bakoyianis V. et al.,1997 [21]; Loukatos P. et al., 2000 [36];
Galanakis M.C. et al., 2012 [52]
Rapoport A., et al.,2011 [25]
Nakanishi K. et al.,1987 [53]; Goødia F. et al.,1991 [54]
Nakanishi K. et al.,1987 [53]
Mori S., 1987 [55]; Fumi M.D. et al.,1987,1988,1989 [56],
[57], [58]; Rosini G. et al.,1993 [59], Yokotsuka K. et
al.,1993,1997,2003 [60], [61], [62]; Busova K. et al.,1994
[34]; Suzzi G. et al.,1996 [63]; Bakoyianis V. et al.,1997 [21];
Ferraro L. et al.,2000 [35]; Silva S. et al., 2002,2003 [64],
[65]; Kassim H.C., 2012 [39]
Nguyen T.H. et al., 2008 [28]; Yao W. et al., 2011 [29]
Bardi E.P. et al.,1996 [66]; Balli D. et al., 2003 [67];
Loukatos P. et al., 2003 [51]; Mallouchos A. et al., 2003 [68]
Parascandola P. et al.,1992 [16]
Bardi E.P. et al.,1996,1997 [66], [69]; Iconomopoulou M. et
al., 2002 [70]; Plessas S. et al., 2005 [71]
Martynenko N.N. et al., 2004 [72]
Tran T.H.C. et al., 2012 [19]
Mallios P., et al.,2004 [73]
Kourkoutas Y. et al., 2002,2003,2005 [74], [75], [76]
Kourkoutas Y. et al., 2001,2002,2006 [27], [77], [78]
Tsakiris A. et al., 2004 [79]
Bekatorou A. et al., 2002 [80]
Reddy V.L. et al., 2006 [81]
Kandylis P. et al., 2010, 2012 [37], [82]
Vucurovic M.V. et al., 2012 [83]
Mallouchos A. et al., 2002,2003 [84], [85]

Reddy V.L. et al., 2008 [86]
Yu J. et al., 2010 [26]
Rattanapan A. et al., 2011 [87]
Vucurovic M.V. et al., 2008 [88]; Razmovski R. et al., 2012
[89]
Kopsahelis N. et al., 2007 [90]
Ogbonna J.C. et al.,1989 [91]

-5-


1.2.2 Cá

ơ

á

nh tế bào nấm men

Cố định tế bào bằng cách gắn trên bề mặt chất mang rắn: Tế bào nấm men c th kết
dính trên b mặt chất mang r n nh nh ng tư ng tác vật l như lực mao quản, liên kết
t nh điện, liên kết ion, liên kết kỵ nước, hoặc liên kết cộng hóa tr . Phư ng pháp này
yêu cầu b mặt chất mang phải có cấu trúc xốp hoặc có chứa nhi u nhóm chức h a h c
khác nhau như h t thủy tinh xốp, thanh ceramic, DEAE-cellulose, bã mía, h t gluten,
miếng trái cây [23], [25], [26], [33], [70], [81].
Cố định tế bào bằng cách nhốt trong khung mạng xốp: Các tế bào được đưa vào bên
trong một khung m ng xốp đ ng n cản tế bào khuếch tán ra môi trư ng xung quanh
nhưng vẫn cho phép tế bào hấp thu các chất dinh dư ng và trao đ i chất. Chất mang
thư ng là các lo i polysaccharide (alginate, -carrageenan, agar, chitosan, pectin),
protein (gelatin, collagen), polymer t ng hợp (polyacrylamide, polyvinylalcohol,

polyurethane, polyvinylchloride, polystyrene). Chất mang thư ng c cấu trúc khung
m ng gel (ion gel, covalent gel, non-covalent gel, cryogel) [39], [46], [72], [92], [93],
[94].
Cố định tế bào bằng cách keo tụ: Các tế bào nấm men S. cerevisiae có khả n ng tự
bám chặt với nhau và hình thành nên khối bao gồm hàng ngàn tế bào nh các tư ng
tác vật lý hay hóa h c. Có 2 ki u keo t tế bào: keo t tự nhiên không s d ng h a
chất và keo t nhân t o s d ng h a chất đ t o liên kết gi a các tế bào . Phư ng
pháp cố đ nh này ít s d ng cho nấm men vì các tế bào

bên trong khối nấm men khó

tiếp xúc với các chất dinh dư ng c trong canh trư ng [46].
Cố định tế bào bằng cách nhốt bên trong một màng chắn: Sự khuếch tán của tế bào ra
môi trư ng bên ngoài được ng n chặn b ng cách bao b c chúng vào trong các
membrane nhưng vẫn đảm bảo quá trình trao đ i chất gi a chúng với môi trư ng.
Chất mang là sợi thủy tinh, nylon và một số màng bán thấm khác như polyvinyl
chloride, cellulose acetate, polyamide. Phư ng pháp này ít được s d ng cho nấm men
d ng đ lên men vang vì màng membrane d b ngh t b i các hợp chất keo trong d ch
nho khi thực hiện quá trình lên men vang [29], [46], [95], [96], [97], [98], [99].

-6-


á c

1.2.3 Nấm men
1.2.3.1

nh

hững tha đổi về đặc điểm sinh học của nấm men cố định

Việc cố đ nh tế bào s làm thay đ i hình thái, sinh l và các ho t động trao đ i chất
của nấm men [46], [100].
K

ă

: Nấm men cố đ nh thư ng c khả n ng sinh trư ng kém

h n so với nấm men tự do vì khả n ng hấp thu oxy giảm. Tế bào nấm men cố đ nh c
hình d ng và kích thước không đồng đ u. Nhi u nghiên cứu cho thấy nấm men cố đ nh
sinh trư ng đến một giới h n nhất đ nh và gi nguyên lượng sinh khối cho đến khi kết
thúc quá trình lên men [101], [102], [103].
H

ấ : Nấm men cố đ nh c tốc độ s d ng glucose, tốc độ sinh

t ng hợp ethanol và glycerol cao h n nhi u so với nấm men tự do vì nấm men khi
được cố đ nh trên chất mang s c nh ng thay đ i v đặc tính sinh l , ho t tính
en yme và c pH nội bào thấp h n so với nấm men tự do [21], [100], [104], [105].
K

ă

l

ế

ấ l

trong

á ì

lên men: Nấm

men cố đ nh c khả n ng ch u được sự ức chế của c chất và sản ph m trao đ i chất
cao h n nấm men tự do [106], [107], [108], [109].

nh ng đi u kiện lên men cực

đoan thì nấm men cố đ nh c ng th hiện ưu thế do chất mang đã bảo vệ tế bào trước
các tác động bất lợi của d ch lên men [110], [111], [112], [113], [114], [115], [116],
[117], [118], [119], [120], [121], [122].
ự

ấ

ơ

So với nấm men tự do, nhìn chung nấm men cố

đ nh t o thành nhi u ester h n, t o thành ít diacetyl, acetaldehyde, methanol, acid d
bay h i và rượu bậc cao h n. Lo i chất mang, phư ng pháp cố đ nh c ng c ảnh
hư ng đến khả n ng t o thành hợp chất hư ng và các sản ph m ph khác [46], [85],
[123], [124], [125], [126], [127].
1.2.3.2 Ưu thế của nấm men cố định trong quá trình lên men vang
Việc s d ng tế bào nấm men cố đ nh đ lên men vang c nhi u thuận lợi. Chất
mang đ ng vai tr tác nhân bảo vệ tế bào trước nh ng tác động bất lợi từ môi trư ng

lên men như sự thay đ i v nhiệt độ, pH, nồng độ c chất ban đầu và sản ph m cuối,
từ đ làm n đ nh và kéo dài ho t tính lên men. Quá trình trao đ i chất của tế bào cố
đ nh biến đ i theo chi u hướng t ng hiệu quả s d ng c chất, sản ph m được t o ra
-7-


nhi u h n. Mật độ tế bào nấm men cố đ nh trên một đ n v th tích canh trư ng cao
nên làm giảm th i gian lên men [46], [109], [112], [122].
Khi s d ng nấm men cố đ nh đ lên men vang, quá trình l c, tách nấm men ra
kh i d ch lên men được thực hiện nhanh và d dàng, từ đ làm giảm chi phí cho việc
thu hồi và hoàn thiện sản ph m [81], [84].
Nấm men cố đ nh c th tái s d ng được nhi u chu kỳ và c nhi u khả n ng ứng
d ng trong quy trình lên men liên t c

quy mô công nghiệp, từ đ mang l i hiệu quả

kinh tế cao h n cho nhà sản xuất [21], [102].
Tuy vậy, s d ng nấm men cố đ nh c ng c n một số h n chế khi hiện tượng tế bào
thoát ra kh i chất mang quá nhi u, cấu trúc chất mang b phá hủy trong quá trình s
d ng, sự khuếch tán c chất đến tế bào

trung tâm của khối chất mang b h n chế

[46], [128].
1.3 C

nh n m men trong gel aglinate

1.3.1 Alginate
Alginate hay algin là tên g i thư ng được s d ng cho muối alginic acid. Alginate

hiện diện trong thành tế bào của các loài rong nâu (Phaeophyceae), chiếm đến
khối lượng chất khô và thư ng

d ng muối alginate của calcium, magnesium và

sodium. Mặc d c một vài nguồn gốc khác nhau, tuy nhiên tất cả các alginate thư ng
m i hiện nay đ u c nguồn gốc từ rong bi n và d ng Ca alginate là thích hợp nhất đ
t o khung m ng gel cố đ nh nấm men đ lên men rượu vang [129].
1.3.1.1 Đặc điểm cấu tạo của alginate
Alginate là một copolymer không phân nhánh, bao gồm các monomer -Dmannuronic acid (M) và -L-guluronic acid G liên kết với nhau thông qua liên kết
1,4-glycoside. Các monomer này phân bố trong m ch alginate theo các block.
T lệ của mannuronic acid và guluronic acid M G của alginate từ rong bi n dao
động trong một khoảng rộng t y theo loài rong và m a thu ho ch. T lệ này ảnh
hư ng đến độ b n gel Ca alginate [129], [130], [131].

-8-


Hình 1.1. Cấu trúc của alginate [129]
(a-các monomer của alginate b-chu i alginate c-sự phân bố các block

1.3.1.2 Cơ chế tạo gel của alginate
Alginate c khả n ng kết hợp với các cation kim lo i h a tr cao đ t o gel. Ái lực
của alginate đối với các ion h a tr 2 giảm theo trình tự: Pb2+ - Cu2+ - Cd2+ - Ba2+ Sr2+ - Ca2+ - Co2+ - Ni2+ - Zn2+ - Mn2+. T y thuộc vào lo i ion liên kết và nguồn gốc
alginate mà gel t o thành c tính chất khác nhau. Thông thư ng, ngư i ta thư ng s
d ng Ca2+ đ làm ion t o gel [131], [132].

Hình 1.2. Sự hình thành gel của alginate với ion Ca2+
1.3.2 Cá

ơ

á

1.3.2.1 C c h ơng h

v

vậ

[129]

l l

tạ g alginate

C hai phư ng pháp t o gel alginate: t o gel từ ngoài và t o gel từ trong.
Phư ng pháp t o gel từ ngoài ph biến h n vì t o gel nhanh và thao tác đ n giản.
Khi nh gi t dung d ch alginate vào dung d ch c chứa cation, thư ng là Ca 2+, b mặt
ngoài của h t alginate s lập tức b gel h a. Sau đ , các cation tiếp t c khuếch tán vào
bên trong h t làm cho các phân t alginate bên trong tiếp t c b gel h a [129], [133].
-9-


Phư ng pháp t o gel từ trong mang l i tính đồng nhất và đa d ng v hình thức cho
cấu trúc gel. Cho muối chứa Ca2+ d ng không tan như CaCO3, CaSO4, DTA-Ca, Ca
citrate

vào dung d ch alginate, sau đ thay đ i độ h a tan của muối b ng cách ch nh

pH dung d ch. Ca2+ giải ph ng dần và t o gel với alginate [134], [135], [136].
Đa số các nghiên cứu v cố đ nh tế bào nấm men trong gel alginate đ u s d ng
phư ng pháp t o gel từ ngoài. Sinh khối nấm men s được thêm vào dung d ch
alginate rồi nh gi t vào dung d ch CaCl2. Các h t gel chứa tế bào nấm men vừa t o
thành s được tiếp t c ngâm trong dung d ch CaCl2 một th i gian đ

n đ nh cấu trúc

trước khi được s d ng trong quá trình lên men [13], [14], [137].
Löïc ñaåy

Na-Alginate

Ca
CaCl2

CaCO3
Ca

Ca

NaAlginate

Ca

Ca

Ca

H+

Na-Alginate

Ca

Ca

HCO3

GDL

CO2

H+
H2O

Ca
Haït gel Cacium Alginate

Hình 1.3. C chế t o gel của alginate từ bên ngoài trái từ bên trong phải [129]
1.3.2.2
Khối

nh h

ng của c c điều i n tạ g đến độ ền g v

u t nh n m n

ợng hân tử a ginat : khối lượng phân t alginate ảnh hư ng nhi u đến độ

b n gel. M ch alginate càng dài thì cấu trúc gel càng b n, nhưng ít ảnh hư ng đến khả
n ng khuếch tán của glucose, tốc độ lên men và sự t o thành ethanol của nấm men cố
đ nh trong gel alginate [133], [138].
Tỷ

M/G: là phần mol của D-mannuronic acid M so với L-guluronic acid (G).

Alginate c hàm lượng G nh h n 2 -2

s không t o gel được. Alginate c hàm

lượng G lớn s t o thành gel xốp, ch c, không biến d ng và gi được độ cứng trong
một th i gian dài. Alginate c hàm lượng M cao t o thành gel m m, ít xốp và d b rã
h n. Gel alginate giàu G thích hợp đ cố đ nh nấm men h n vì gel này ít gây cản tr
đến khả n ng khuếch tán của glucose và h n chế sự sinh trư ng của tế bào nấm men
sau khi cố đ nh [130], [132], [138], [139].
ồng độ a ginat : nồng độ alginate không ảnh hư ng đến kích thước, hình d ng
h t gel nhưng ảnh hư ng đến độ b n của h t gel. Khi t ng nồng độ dung d ch alginate
s t ng độ b n h t gel, khả n ng gi nước của gel c ng tốt h n nhưng tốc độ lên men
-10-


và sinh t ng hợp ethanol l i giảm đáng k . Nồng độ alginate thích hợp đ cố đ nh nấm
men thư ng là 2% [133], [140], [141].
H tạ g : Cấu trúc h t gel alginate không b ảnh hư ng b i pH trong khoảng từ
– 1 . Khi pH nh h n , th tích của h t s giảm; khi pH cao h n 1 , th tích của h t
t ng; pH nh h n 2, các h t gel rất nh và không đàn hồi. pH của dung d ch alginate
thích hợp cho quá trình t o gel cố đ nh tế bào nấm men n m trong khoảng từ , đến
, . N m ngoài khoảng này, khả n ng khuếch tán của glucose và độ b n gel đ u giảm.

hi t độ tạ g : nhiệt độ thích hợp cho quá trình t o gel là thấp h n 2 oC. Trong
đi u kiện này, độ b n gel và khả n ng khuếch tán của glucose gần như không b ảnh
hư ng. Các tính chất này s giảm nhanh khi nhiệt độ t o gel cao h n 2 oC [138], [142]
ồng độ cati n tạ g : khi t ng nồng độ cation t o gel thì gel t o thành s b n
ch c h n. Bản chất của cation t o gel c ng ảnh hư ng đến độ b n gel. Độ b n gel t o
thành từ các cation kim lo i s t ng dần theo thứ tự: Co2+ - Ca2+ - Sr2+ - Ba2+ - Cd2+ Cu2+. Ion Ca2+ thư ng được s d ng đ t o gel cố đ nh tế bào nấm men. Nồng độ
CaCl2 thích hợp cho việc t o gel alginate thư ng là 2 . Nếu giá tr này lớn h n 1
thì tốc độ t ng trư ng của Saccharomyces cerevisae b ức chế [132], [136].
Kích th ớc hạt g : kích thước h t gel ảnh hư ng đến sự truy n khối trong quá
trình lên men. Các h t c đư ng kính n m trong khoảng , - , mm là thích hợp cho
quá trình phát tri n của tế bào c ng như hiệu quả lên men [135].
Mật độ tế

t ng hạt g : khi t ng mật độ tế bào ban đầu trong h t gel trong một

giới h n xác đ nh thì tốc độ lên men t ng lên nhưng hiệu suất sinh t ng hợp ethanol s
giảm đi [46].
1.3.3 Ư

ểm c

ơ

á

ấ

l l

Nấm men cố đ nh trong gel alginate đã được nghiên cứu và s d ng rộng rãi trong

các quy trình sản xuất rượu vang chu kỳ hay liên t c do quá trình cố đ nh d thực hiện,
hiệu suất cố đ nh và mật độ tế bào trong h t gel cao, đi u kiện cố đ nh ôn h a, không
phải x l nhiệt hay x l h a chất nên các tế bào cố đ nh không b mất ho t tính lên
men. Ngoài ra, alginate là chất mang tr v mặt h a h c, an toàn, độ xốp của m ng gel
thuận lợi cho việc khuếch tán c chất và sản ph m, gel alginate khá b n khi lên men
nhiệt độ cao [46], [117].

-11-