Ứng dụng kỹ thuật tế bào dòng chảy để đánh giá tồn lưu tế bào ác tính trong bệnh bạch cầu cấp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN PHƯƠNG LIÊN

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT TẾ BÀO DÒNG CHẢY
ĐỂ ĐÁNH GIÁ TỒN LƯU TẾ BÀO ÁC TÍNH
TRONG BỆNH BẠCH CẦU CẤP

Chuyên ngành: Huyết học
Mã số: 62.72.25.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Nguyễn Tấn Bỉnh
2. PGS. Bửu Mật
TP. HỒ CHÍ MINH – NĂM 2012


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng
được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận án

NGUYỄN PHƯƠNG LIÊN

i

Mục lục
Trang
Danh mục chữ viết tắt và nghóa tiếng Việt

iii

Danh mục các bảng

v

Danh mục các hình

viii

Danh mục các biểu đồ

ix

Danh mục các sơ đồ

x

ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Y VĂN

4

1.1. Lòch sử
1.2. Giới thiệu kỹ thuật tế bào dòng chảy và dấu ấn miễn dòch
tế bào (DAMDTB)
1.3. Chẩn đoán và phân loại dưới nhóm bệnh bạch cầu cấp bằng
DAMDTB
1.4. Đánh giá tồn lưu ác tính trong bệnh lý bạch cầu cấp bằng
DAMDTB
1.5. Những vấn đề ảnh hưởng đến chẩn đoán TBTLAT bằng kỹ
thuật DAMDTB
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

4
7

11

21

36
42

2.1. Đối tượng nghiên cứu

42

2.2. Phương pháp nghiên cứu

43

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ

54

3.1. Đặc điểm chung lúc mới chẩn đoán

55

3.2. Khảo sát sự xuất hiện các kiểu hình DAMD bất thường

59


ii

Trang
3.3. Bạch cầu cấp dòng lympho B

65

3.4. Bạch cầu cấp dòng tủy

73

3.5. Bạch cầu cấp dòng lympho T

80

3.6. Bạch cầu cấp “biphenotype”

85

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN

87

4.1. Đặc điểm chung lúc mới chẩn đoán

87

4.2. Khảo sát sự xuất hiện các kiểu hình DAMD bất thường

90

4.3. Bạch cầu cấp dòng lympho B

98

4.4. Bạch cầu cấp dòng tủy

108

4.5. Bạch cầu cấp dòng lympho T

118

4.6 Bạch cầu cấp “biphenotype”

122

4.7. Ưu điểm và hạn chế của nghiên cứu

123

KẾT LUẬN

124

KIẾN NGHỊ

127

Danh mục các công trình nghiên cứu của tác giả
Tài liệu tham khảo
Phụ lục 1: Danh sách bệnh nhân
Phụ lục 2: Phiếu thu thập số liệu
Phụ lục 3: Tóm tắt các phác đồ điều trò tấn công bệnh bạch cầu cấp
Phụ lục 4: Một số hình ảnh minh họa kết quả
Phụ lục 5: Một số hình ảnh minh họa trang thiết bò


iii

Danh mục chữ viết tắt và dòch nghóa tiếng Việt
AML

Acute myeloid leukemia (Bạch cầu cấp dòng tủy)

AML – M0

AML minimally differentiated leukemia

AML – M1

AML without maturation

AML – M2

AML with maturation

AML – M3

Acute promyelocyte leukemia

AML – M4

Acute myelomonocytic leukemia

AML – M5

Acute monoblastic/monocytic leukemia

AML – M6

Acute erythroblast leukemia

AML – M7

Acute megakaryoblast leukemia

APC

Allophycocyanin

AUL
B-ALL

Acute undifferentiated leukemia (Bạch cầu cấp khó xác đònh
dòng)
B Acute lymphoblastic leukemia (Bạch cầu cấp dòng lympho B)

BC

Bạch cầu

BCC

Bạch cầu cấp

BCĐNTT

Bạch cầu đa nhân trung tính

BI-AL

Biphenotyping leukemia (BCC “biphenotype”)

CD

Cluster differetiation

Cy

Cytoplasm (thuộc tế bào chất)

DAMDTB

Dấu ấn miễn dòch tế bào

EGIL

European Group for the Immunological Characterization of
Leukemia


iv

FAB

French – American – Bristish

FISH

Fluorescent in situ hybridization

FITC

Fluorescein Isothiocyanate

FSC

Forward scatter (tia phát tán chiều dọc)

Ig

Immunoglobulin (globulin miễn dòch)

KN

Kháng nguyên

LAP

Leukemia associated phenotype (kiểu hình DAMD bất thường)

MPO

Myeloperoxidase

PCR

Polymerase chain reaction

PE

Phycoerythrin

PE-Cy7

Phycoerythrin-cyanine 7

Per CP

Peridin chlorophyl

SJCRH

St.Jude Children’s Reaseach Hospital

Sm

Surface membrane (trên bề mặt màng tế bào)

SSC

Sideward scatter (tia phát tán bên)

T-ALL

T Acute lymphoblastic leukemia (Bạch cầu cấp dòng lympho
dòng lympho T)

TLTBAT

Tồn lưu tế bào ác tính

TCR

T cell recepter (thụ thể tế bào T)

TdT

Terminal deoxynucleotidyl transferase

TMHH

Truyền Máu Huyết Học

TP.HCM

Thành phố Hồ Chí Minh

WHO

World Health Organization


v

Danh mục các bảng

Bảng

Nội dung

Trang

1.1

Bảng tổng hợp những kháng thể đơn dòng trong chẩn đoán bệnh

10

bạch cầu và lymphoma
1.2

Bảng phân loại dưới nhóm BCC dòng lympho B dựa vào DAMD

13

1.3

Bảng phân loại dưới nhóm BCC dòng lympho T dựa vào DAMD

15

1.4

Tiêu chuẩn chẩn đoán BCC dòng tủy dựa vào DAMD

19

1.5

Thang điểm EGIL để xác đònh BCC “biphenotype”.

20

1.6

So sánh tần xuất hiện diện các kiểu hình DAMD bất thường

31

trong bệnh BCC dòng tủy.
2.1

Phác đồ sàng lọc.

45

2.2

Phác đồ xác đònh dòng tế bào.

46

2.3

Phác đồ đánh giá TBTLAT

47

2.4

Tiêu chuẩn phân loại mức độ TBTLAT

51

3.1

Phân bố các nhóm bệnh theo tuổi (ở giai đoạn 1)

55

3.2

Đặc điểm sinh học của quần thể nghiên cứu (GĐ.1)

56

3.3

So sánh kết quả phân biệt dòng giữa DAMD và tủy đồ (GĐ.1).

57

3.4

Đối chiếu phân dưới nhóm BCC dòng tủy DAMD và tủy đồ

58

(GĐ.1)

Bảng

Nội dung

Trang


vi

3.5

Tần suất các phương pháp đánh giá khác nhau (GĐ.1)

59

3.6

So sánh quần thể blast và quần thể blast mang kiểu hình bất

60

thường
3.7

Tỷ lệ của các quần thể tế bào blast sau hóa trò

61

3.8

So sánh tỷ lệ blast giữa tủy đồ và DAMDTB

62

3.9

Tần suất các phương thức đánh giá kiểu hình bất thường (GĐ.2)

63

3.10

Mức độ TLTBAT sau hóa trò tấn công

63

3.11

Mật độ dương tính của các dấu ấn non trong bệnh BCC dòng

67

lympho B
3.12

Mật độ dương tính của các dấu ấn dòng B trong bệnh BCC dòng

67

lympho B
3.13

Tần suất các phương thức đánh giá trên BCC dòng lympho B

69

3.14

Tế bào blast có CD45âm

70

yếu

trên các phân nhóm BCC dòng

lympho B
3.15

Những kiểu hình KN không đồng bộ trên BCC dòng lympho B

70

3.16

Những kiểu hình có KN tăng cao nồng độ trên BCC dòng

71

lympho B
3.17

Mức độ TBTLAT và tỉ lệ tái phát trên nhóm bệnh BCC dòng

72

lympho B sau hóa trò
3.18

So sánh các phương thức đánh giá TBTLAT trước và sau hóa trò

73

BCC dòng lympho B
3.19
Bảng

Mật độ dương tính các dấu ấn non trên tế bào blast dòng tủy
Nội dung

75
Trang


vii

3.20

Mật độ dương tính của các dấu ấn đặc trưng dòng tủy

76

3.21

Mật độ dương tính của 5 dấu ấn chẩn đoán dòng mono

76

3.22

Tỉ lệ xuất hiện các phương thức đánh giá trên BCC dòng tủy

77

3.23

Các mức độ TBTLAT trên nhóm BCC dòng tủy sau hóa trò

79

3.24

So sánh các phương thức đánh giá trước và sau hóa trò BCC dòng

79

tủy
3.25

Phân bố mật độ dương tính các dấu ấn non trên blast dòng

81

lympho T
3.26

Phân bố mật độ dương tính của các dấu ấn đặc trưng dòng

81

lympho T
3.27

Kết quả khảo sát bộ đôi CD4/CD8 trên tế bào blast dòng lympho

82

T
3.28

Sự hiện diện KN khác dòng trên BCC dòng lympho T

84

3.29

Các mức độ TBTLAT trên nhóm BCC dòng T sau hóa trò

84

3.30

So sánh các chiến lược đánh giá TBTLAT trước và sau hóa trò

85

BCC dòng lympho T


viii

Danh mục các hình

Hình

Nội dung

Trang

1.1

Sơ đồ hóa mối liên kết kháng nguyên - kháng thể - chất

7

huỳnh quang.
1.2

Minh họa sự chuyển đổi tín hiệu analog thành những chấm

8

trên biểu đồ.

1.3

Minh họa ý nghóa hai thông số FSC và SSC.

7

1.4

Vò trí các quần thể tế bào non ác tính trên biểu đồ SSC-

11

CD45.
1.5

Sơ đồ phát triển DAMD bình thường của tế bào dòng

12

lympho B bình thường trong tủy xương.
1.6

Sơ đồ phát triển DAMD bình thường của dòng lympho T.

14

1.7

Sơ đồ phát triển DAMD của tế bào dòng hạt bình thường.

16

1.8

Sơ đồ phát triển DAMD tế bào dòng mono bình thường.

17

1.9

Sơ đồ phát triển của hồng cầu bình thường.

18

1.10

Sơ đồ mô tả “vùng trống” trong bệnh BCC dòng lympho B

26

theo BIOMED - 1
1.11

Minh họa một trường hợp phát hiện TBTLAT trên bệnh

28

nhân BCC dòng lympho T, so sánh với một mẫu tủy bình
thường.
1.12

Mô tả một số kiểu phân tích “vùng trống” trên bệnh nhân TALL.

29


ix

Hình

Nội dung

Trang

1.13

Minh họa quá trình theo dõi TBTLAT liên tục bằng

32

CD117/CD15 hoặc CD34/CD7 từ mẫu tủy xương của hai
bệnh nhân.
1.14

Theo dõi tái phát một trường hợp BCC dòng lympho B thông

37

qua phức hợp CD10-TdT.
3.1

Minh họa một vài trường hợp có một CD tăng cao bất

71

thường.
3.2

Những kiểu hình CD4/CD8 trong chẩn đoán BCC dòng

82

lympho T.
3.3

Giới thiệu kết quả phân tích một trường hợp BCC

86

“biphenotype” (dòng tủy và dòng lympho B).
4.1

Tế bào blast dòng lympho B có CD45âm yếu.

102

4.2

Sơ đồ phát triển các DAMD trên tế bào lympho bình thường.

105

4.3

Sơ đồ mô tả mật độ các dấu ấn dòng hạt trên tế bào hạt.

116

Danh mục các biểu đồ

Biểu đồ

Nội dung

Trang

1.1

So sánh tỉ lệ tái phát giữa 4 mức độ nguy cơ trên bệnh BCC

35

dòng tủy.
1.2

So sánh tỉ lệ sống toàn bộ theo mức độ tồn lưu trên bệnh
BCC dòng tủy.

35

x

Biểu đồ

Nội dung

Trang

3.1

Phân bố tuổi theo các nhóm bệnh BCC theo tuổi (ở giai

55

đoạn 1)
3.2

Số lượng kiểu hình DAMD bất thường trên từng bệnh nhân.

60

3.3

Biểu đồ Kaplan Meier theo dõi thời gian tái phát

64

3.4

Phân loại dưới nhóm bệnh nhân BCC dòng lympho B.

66

3.5

Những KN khác dòng trên bệnh BCC dòng lympho B.

69

3.6

Phân loại dưới nhóm của bệnh nhân BCC dòng tủy.

74

3.7

Phân bố MPO trong tế bào blast BCC dòng tủy.

75

3.8

Những KN khác dòng trên BCC dòng tủy.

77

3.9

So sánh nồng độ CD45 giữa 2 nhóm bệnh BCC dòng tủy và

78

BCC dòng lympho B.
3.10

So sánh sự hiện diện của cyCD3 và smCD3

80

3.11

Phân bố nồng độ CD45 trong bệnh BCC dòng lympho T.

81

Danh mục các sơ đồ

Sơ đồ

Nội dung

Trang

2.1

Các giai đoạn nghiên cứu.

44

3.1

Mô tả qui trình thu thập mẫu.

54

3.2

Các thành phần tế bào khác nhau trên cùng một quần thể

61

blast (sau hóa trò)


xi


1

UẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay trên thế giới, việc nhận diện các dấu ấn miễn dòch tế bào trên tế
bào bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy, hay còn được gọi là kỹ thuật dấu ấn miễn
dòch tế bào (DAMDTB) đã trở thành xét nghiệm thường qui nhằm hỗ trợ xác đònh
chính xác dòng tế bào ác tính và phân loại dưới nhóm của bệnh bạch cầu cấp
(BCC), góp phần đònh hướng điều trò và tiên lượng bệnh trước điều trò.
Bệnh BCC thường được đánh giá lui bệnh khi quần thể tế bào non dưới 5%
tế bào bạch cầu (BC) trong tuỷ xương (là giới hạn thấp nhất để phát hiện bằng
hình thái học tế bào). Tuy nhiên, bệnh nhân BCC có khoảng 1012 tế bào BC ác

tính lúc chẩn đoán, thì vào giai đoạn lui bệnh theo tiêu chuẩn hình thái học vẫn
còn hơn 1010 tế bào BC ác tính không phát hiện được, là tiềm năng gây tái phát
bệnh, nên còn được gọi là tồn lưu tế bào ác tính (TLTBAT).[29],[103] Hiện nay, các
xét nghiệm như FISH, PCR và tế bào dòng chảy đều có khả năng phát hiện
TLTBAT với độ nhạy cao hơn, cho phép đánh giá tốt hơn về khối lượng tế bào
BC ác tính, giúp chọn lựa phương thức điều trò thích hợp.[31],[32]
Ứng dụng của kỹ thuật tế bào dòng chảy trong việc phát hiện TLTBAT ở
bệnh nhân BCC đã đạt lui bệnh về hình thái là dựa vào việc xác đònh những kiểu
DAMDTB bất thường chỉ hiện diện trên tế bào BC ác tính và không hiện diện
hoặc hiện diện không thường xuyên trên tế bào tạo máu bình thường. Kỹ thuật
này cho phép phát hiện 1 tế bào BC ác tính/10.000 tế bào tuỷ xương bình thường,
có thể ứng dụng cho tối thiểu 2/3 số bệnh nhân bệnh BCC. Nhiều nghiên cứu tiến
cứu trên bệnh nhân BCC đã chỉ ra rằng có sự tương quan mạnh giữa mức độ
TLTBAT bằng DAMDTB trong thời kỳ lui bệnh lâm sàng và kết quả điều trò.[32]


2

Mục tiêu của những nghiên cứu TLTBAT nhằm cải thiện khả năng đánh
giá sự hiện diện của tế bào BC ác tính còn sót lại trong suốt thời kỳ lui bệnh sau
điều trò, là chỉ điểm cho sự tiến triển và đánh giá độ nhạy của thuốc đối với bệnh
nhân, giúp chọn lựa phương thức điều trò thích hợp tiếp theo. Lợi ích của việc
đánh giá TLTBAT trong điều trò bao gồm: xác đònh sớm những bệnh nhân có
nguy cơ tái phát và phát hiện tình trạng tái phát sắp xảy ra. Ngoài ra có thể sử
dụng để so sánh hiệu quả điều trò của các phác đồ hóa trò liệu khác nhau.
Ở Việt Nam, xác đònh DAMDTB bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy chỉ mới
triển khai khoảng 15 năm tại một số trung tâm lớn như Viện Truyền Máu Huyết
Học Trung Ương, bệnh viện Truyền Máu Huyết Học (TMHH), bệnh viện Nhi
Trung Ương, bệnh viện quân đội 108. Đa phần các đơn vò sử dụng kỹ thuật này
để phân loại bệnh BCC, tuy nhiên chưa có những ứng dụng sâu hơn. Và hiện nay

chưa có số liệu báo cáo về tỉ lệ TLTBAT sau hóa trò ở bệnh BCC bằng kỹ thuật
tế bào dòng chảy tại Việt nam.
Tại bệnh viện TMHH (TP.HCM), chúng tôi bắt đầu áp dụng kỹ thuật xác
đònh DAMDTB trong chẩn đoán và phân loại bệnh BCC vào năm 1995. Từ năm
2005, chúng tôi sử dụng kỹ thuật này thường qui với bộ kháng thể đơn dòng 19
dấu ấn kết hợp với kiểu nhuộm 3 màu nhằm phát hiện các kháng nguyên trên
màng tế bào.
Hiện tại, với nghiên cứu này, chúng tôi mong muốn triển khai kỹ thuật
nhuộm 4-5 màu và bổ sung bước làm tăng tính thấm màng tế bào để phát hiện
các kháng nguyên (KN) đặc trưng của từng dòng nằm trong bào tương hoặc trong
nhân, giúp hiểu rõ hơn về sự hiện diện của các DAMDTB trong bệnh BCC, góp
phần làm tăng độ chính xác trong chẩn đoán. Từ đó, tiến tới chọn lựa và xác đònh


3

những kiểu hình DAMDTB bất thường thích hợp nhằm mục đích theo dõi
TLTBAT sau điều trò.
Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu tổng quát
như sau: “Ứng dụng kỹ thuật tế bào dòng chảy xác đònh DAMDTB trong chẩn
đoán, phân loại bệnh BCC, từ đó chọn lựa các phương thức và kiểu hình
DAMDTB phù hợp để đánh giá TLTBAT bằng dàn kháng thể đơn dòng hiện có
tại bệnh viện TMHH”.
Để đạt được kết quả trên cần phải thực hiện các mục tiêu sau:
1. Xác đònh tỉ lệ các phân nhóm bệnh BCC bằng DAMDTB.
2. Xác đònh tỉ lệ các kiểu hình DAMDTB bất thường để đánh giá
TLTBAT.
3. Xác đònh tỉ lệ TLTBAT trong các bệnh BCC sau điều trò tấn công.

4

Chương 1: TỔNG QUAN Y VĂN

1.1.

LỊCH SỬ
 Thế giới
Trước năm 1976, việc chẩn đoán và phân loại bệnh bạch cầu cấp hoàn

toàn dựa trên hình thái học và hoá học tế bào theo tiêu chuẩn phân loại của FAB
(French - American - British).[21]
Từ 1976 đến 1986, các nhà khoa học đã miệt mài nghiên cứu, tìm hiểu sơ
đồ phát triển DAMDTB bình thường cũng như bất thường của các tế bào trong cơ
thể nói chung và đặc biệt là các tế bào thuộc hệ tạo máu bằng những thế hệ máy
đầu tiên của công nghệ tế bào dòng chảy.
Năm 1986, Foon và Todd chính thức công bố trên tạp chí Blood bài báo
“Phân loại miễn dòch học trong bệnh Bạch cầu và Lymphoma”.[46] Khoảng 10
năm sau, năm 1995, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã công nhận DAMDTB là
một tiêu chuẩn chẩn đoán bắt buộc, hỗ trợ phân loại chính xác các bệnh lý tăng
sinh ác tính có liên quan đến tế bào tạo máu.[42]
Tiếp đến vào năm 1997, Foon và Jenning tiếp tục giới thiệu một ứng dụng
khá quan trọng của kỹ thuật DAMDTB là việc phát hiện TLTBAT. Như vậy, hơn
30 năm qua kỹ thuật tế bào dòng chảy đã tự khẳng đònh là một phương tiện không
thể thiếu trong chẩn đoán và theo dõi các bệnh lý huyết học ác tính.[59],
Sự cải tiến không ngừng của kỹ thuật tế bào dòng chảy từ phương pháp
nhuộm một màu đến nhiều màu, sự phát hiện ngày càng nhiều các kháng nguyên
trên màng tế bào, trong bào tương hoặc trong nhân đã góp phần hoàn thiện sự

5

hiểu biết sơ đồ phát triển DAMDTB bình thường của tế bào tạo máu, làm nền
tảng vững chắc cho việc chẩn đoán và phân loại dưới nhóm bệnh bạch cầu cấp
(như BCC dòng lympho B, dòng lympho T, dòng tủy,…) đặc biệt là những trường
hợp không biệt hóa, kém biệt hóa, hỗn hợp nhiều dòng. Bên cạnh đó còn giúp
chẩn đoán phân biệt với nhiều bệnh lý khác: tăng sinh bạch cầu mạn tính,
lymphoma, đa u tủy,…
Suốt 3 thập kỷ qua, kỹ thuật tế bào dòng chảy đã phát triển không ngừng
với nhiều ứng dụng khác nhau phục vụ cho nhiều chuyên khoa, mà đặc biệt là
huyết học và ung thư học. Đánh giá TLTBAT bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy là
một trong những kỹ thuật đang được các chuyên gia ung thư học quan tâm nghiên
cứu để giúp tiên lượng sớm và chính xác hơn khả năng tái phát bệnh. Có nhiều cơ
sở lý thuyết để đánh giá TLTBAT như: xác đònh dấu ấn miễn dòch bất thường,
phân tích chất lượng DNA, đánh giá khả năng tế bào tự chết,… Nhưng kỹ thuật
xác đònh kiểu hình DAMDTB bất thường là phương pháp đang được nhiều nơi
trên thế giới ứng dụng rộng rãi.
 Trong nước
Từ những năm 1992, các chuyên gia Việt nam đã biết đến kỹ thuật tế bào
dòng chảy, nhưng chỉ được tiếp cận thông qua kỹ thuật miễn dòch huỳnh quang
bằng kính hiển vi để phân biệt BCC dòng lympho B và T, kế đến là xác đònh
dòng tủy tại Viện Truyền máu Huyết học Trung ương, bệnh viện Nhi Trung
ương,… Năm 1995, bệnh viện Truyền máu Huyết học (TP.HCM) là bệnh viện
đầu tiên được trang bò máy FASC Calibur (3 màu) để phân biệt các dòng tế bào
tạo máu khác nhau trong bệnh lý BCC và thực hiện đếm tế bào CD4 cho bệnh
nhân HIV. Những năm sau đó, nhiều trung tâm nghiên cứu trong cả nước đã quan
tâm đầu tư máy móc thiết bò mở rộng các lãnh vực nghiên cứu. Viện các bệnh


6

truyền nhiễm Trung ương (năm 1998) và Viện Pasteur TP.HCM (năm 2000) là
những đơn vò kế tiếp sử dụng máy tế bào dòng chảy 3-4 màu trong lónh vực
nghiên cứu về CD3/CD4/CD8 ở bệnh nhân HIV. Nhu cầu đếm CD4 lan rộng trên
cả nước và thế giới nên có những dòng máy đơn giản và rẻ tiền hơn thay thế. Từ
đó, trào lưu sử dụng máy tế bào dòng chảy trong nghiên cứu tế bào đã được quan
tâm rộng rãi từ Bắc chí Nam, trên nhiều lónh vực khác nhau như: DAMDTB trong
bệnh BCC, bệnh lymphoma, đếm tế bào gốc CD34, xác đònh CD55/CD59 ở bệnh
tiểu huyết sắt tố kòch phát về đêm,… (bệnh viện TMHH TP.HCM, bệnh viện 108,
Đại học Y Dược TP.HCM, Viện Nhi Trung ương, Viện Huyết học Truyền máu
Trung ương,…); nghiên cứu về tế bào và cytokin trong các bệnh virus như
Dengue, sốt rét, HIV (trung tâm Welcome Trust TP.HCM, bệnh viện Phạm Ngọc
Thạch, Oxfort Hà nội); những năm 2005 trở lại đây, kỹ thuật tế bào dòng chảy
đã đóng một vai trò quan trọng trong các nghiên cứu về tế bào gốc máu cuống
rốn, đặc biệt là tế bào trung mô (Đại học Y khoa Hà nội, Đại học khoa học tự
nhiên TP.HCM,…). Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, công nghệ ngày
càng được đổi mới tiên tiến hơn với những dòng máy có từ 4, 6 hoặc 8 màu đã ra
đời và được các đơn vò nghiên cứu quan tâm đầu tư để tăng thêm độ chính xác,
giúp nghiên cứu những quần thể tế bào rất nhỏ (bệnh viện TMHH TP.HCM năm
2009 đã có thêm máy 6 màu, Viện Hải dương học Nha trang,…)
Riêng đối với lãnh vực huyết học, trọng tâm nghiên cứu là khảo sát
DAMDTB, đònh danh các dòng tế bào tạo máu trong tủy xương hoặc máu ngoại
vi, kế đến là đếm tế bào gốc tạo máu CD34+ là một bước quan trọng trong quá
trình ghép tế bào gốc tạo máu điều trò bệnh huyết học ác tính. Gần đây là những
ứng dụng liên quan đến đánh giá sự tồn lưu của tế bào ác tính sau hóa trò các
bệnh ác tính (mà đi đầu là bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM).
1.2. GIỚI THIỆU KỸ THUẬT TẾ BÀO DÒNG CHẢY VÀ DAMDTB


7

1.2.1. Sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể - chất phát huỳnh quang
Hình 1.1: Sơ đồ hóa mối
liên kết kháng nguyên kháng thể - chất huỳnh
quang.

(Nguồn:

Tác

giả

Nguyễn Phương Liên)

Kỹ thuật tế bào dòng chảy nhận diện DAMDTB, là các kháng nguyên của
tế bào, gián tiếp thông qua mật độ các chất huỳnh quang gắn với các kháng thể
đặc trưng tương ứng với từng loại kháng nguyên. Kháng nguyên cần khảo sát có
thể là một protein, immunoglobulin, cytokine,… nằm trên màng tế bào, trong bào
tương, hoặc thậm chí trong nhân tế bào.[118]
1.2.2. Nguyên lý hoạt động của máy tế bào dòng chảy
Máy tế bào dòng chảy hoạt động bằng cách sử dụng thủy lực để buộc các
tế bào đã được nhuộm huỳnh quang di chuyển thành hàng một trong dòng chảy,
đi ngang qua một tia sáng tới, thông thường được phát ra từ một nguồn sáng laser.
Sau khi tương tác với tia laser, tế bào sẽ phát xạ trở lại. Những hạt photon của tia
sáng phát xạ từ tế bào sẽ được phân tích ra thành những bước sóng nhỏ hơn nhờ
vào rất nhiều gương lọc và gương phản chiếu. Những tia sáng đã được phân chia
này sẽ chạm vào những bộ phận nhận sóng và phát ra xung điện (hay những tín
hiệu analog), tỉ lệ thuận với số lượng tia sáng tới đập vào bộ phận dò sóng. Mỗi
một tín hiệu analog được chuyển thành tín hiệu digital và được tích lũy trong
bảng phân bố tần suất hoặc biểu đồ. Vì vậy, số lượng tín hiệu digital tổng hợp sẽ

tỉ lệ thuận với số lượng tia sáng phát ra từ các tế bào riêng lẻ (Hình 1.2).[75]


8

Hình 1.2: Minh họa sự chuyển đổi tín hiệu Hình 1.3: Minh họa ý nghóa hai thông số
analog thành những chấm trên biểu đồ.[75] FSC và SSC.[75] (Nguồn: Hector Nolla, Đại học
(Nguồn: Hector Nolla, Đại học California, Berkeley, Mỹ)

California, Berkeley, Mỹ)

1.2.3. Các yếu tố nội tại
Bản thân một tế bào không được nhuộm với các kháng thể có gắn huỳnh
quang cũng có thể phát ra những tia phản xạ, được các bộ phận nhận sóng ghi
nhận, từ đó phản ánh hai thông số: SSC và FSC, còn gọi là hai yếu tố nội tại của
tế bào (Hình 1.3). Các gương (G.1) ở vò trí trước nguồn sáng laser sẽ đón nhận
những tia sáng thẳng tới từ tế bào (nên được ký hiệu FSC), phản ánh kích thước
tế bào. Hàng loạt các gương nằm ở các ví trí khác (Gn) đón nhận những tia phản
xạ từ tế bào (nên được ký hiệu SSC), sẽ phản ánh tính chất phức tạp của tế bào
như: sự nhấp nhô của màng tế bào, bản chất không hạt, ít hạt hay nhiều hạt của
bào tương,… [75],[118]
1.2.4. Kỹ thuật xử lý mẫu
Yêu cầu về mẫu xét nghiệm: là các loại mẫu tươi, được giữ ở dạng huyền
phù bằng thuốc chống đông, tốt nhất là EDTA. Mẫu được nhuộm càng sớm càng
tốt để tránh tế bào bò chết quá nhiều làm ảnh hưởng đến kết quả. Hiện nay,
phương pháp nhuộm với nhiều màu huỳnh quang được đánh giá cao vì cho phép


9

phát hiện đồng thời nhiều DAMDTB cùng lúc và phản ánh mối quan hệ mật thiết
giữa các dấu ấn đó.
Thông thường để quan sát các kháng nguyên trên bề mặt tế bào, chỉ cần ủ
mẫu tủy hoặc mẫu máu với kháng thể đơn dòng có gắn huỳnh quang khoảng 1015 phút. Vì chẩn đoán bệnh BCC chủ yếu tập trung vào nghiên cứu tế bào có
nhân, nên phải sử dụng ammonium chloride hoặc các dung dòch có tác dụng
tương tự để loại bỏ hồng cầu trưởng thành (hồng cầu không nhân). Lưu ý: các tế
bào thuộc dòng hồng cầu chưa trưởng thành có nhân sẽ không bò phá hủy vì đề
kháng với ammonium chloride.
Khi cần khảo sát thêm những dấu ấn nằm trong bào tương hay trong nhân
tế bào, người ta cần làm tăng tính thấm bề mặt tế bào để đưa kháng thể xuyên
qua màng tế bào đến gắn với kháng nguyên đích bên trong tế bào. Các kháng
nguyên bên trong tế bào thông dụng là: TdT, chuỗi nhẹ hoặc chuỗi nặng, cyCD3,
cyCD22, cyCD79a, MPO, bcl-2, cyclin-D1, ZAP-70.[17]
1.2.5. Các kháng thể đơn dòng
Ngày nay, đa phần các kháng thể gắn huỳnh quang có sẵn trên thò trường.
Việc chọn lựa các kháng thể vào danh mục sử dụng thường qui phải dựa vào nhu
cầu thực tế của từng phòng thí nghiệm (mục đích chẩn đoán, số lượng mẫu, giá
thành). Do đó không có sự thống nhất về danh mục kháng thể. Tuy nhiên nên
thiết kế bộ kháng thể cần dùng theo phương pháp bậc thang: bắt đầu bằng một số
kháng thể có thể gợi ý đến dòng tế bào nào đó; từ những kết quả ban đầu, tiếp
tục nhuộm thêm những kháng thể cần thiết;… Bằng cách này có thể tiết kiệm chi
phí thuốc thử, song kéo dài thời gian hơn. Dưới đây chúng tôi giới thiệu một số
kháng thể đơn dòng cho nhiều thông tin hữu ích trong chẩn đoán bệnh BCC và
lymphoma.


10

Bảng 1.1: Bảng tổng hợp những kháng thể đơn dòng trong chẩn đoán
bệnh bạch cầu và lymphoma[17],[59],[64],[84],[109]

Dòng tế bào

Kháng thể đơn dòng
CD34, CD38,

Các dấu ấn non

CD117 (dòng tủy),
TdT và CD10 (dòng lympho),
HLA.DR (dòng hạt và lympho T)

Dòng lympho B

CD19, cyCD22, smCD22, cyCD79a, CD79b, CD20,
CD5, HLA.DR, CD38, CD138, CD23, CD24, CD25,
CD103, Igκ/λ, IgM, CD43, FMC-7

Dòng lympho T

CD2, CyCD3, smCD3,
CD4, CD5, CD7, CD8, CD1a

Tế bào giết tự nhiên (NK cell)

CD56, CD57, CD16, CD2, CD7, CD8

Dòng hạt

MPO, CD13, CD33, CD15, CD11b, CD16, CD64,…

Dòng mono

tương tự dòng hạt và đặc trưng riêng:
CD14, CD36, CD64, CD4, HLA.DR

Dòng hồng cầu

CD71, CD235a, CD36.

Dòng mẫu tiểu cầu

CD61, CD41, CD42

Tóm lại, để đạt được kết quả chính xác và khách quan, cần áp dụng một dàn
kháng thể đơn dòng đủ lớn và bao quát để có thể phân biệt được các dòng tế bào
với nhau, đồng thời đánh giá được giai đoạn trưởng thành của từng dòng.


11

1.3. CHẨN ĐOÁN VÀ PHÂN LOẠI DƯỚI NHÓM BỆNH BẠCH CẦU CẤP
BẰNG DAMDTB
1.3.1 DAMDTB đặc trưng cho các loại tế bào non
Điều quan trọng trong chẩn đoán bệnh BCC là xác đònh quần thể tế bào
non (còn gọi là tế bào blast). Các dấu ấn non không phụ thuộc dòng tế bào gồm:
CD34, CD38, TdT. Tuy nhiên, mỗi dòng tế bào sẽ có thêm những dấu ấn non
khác nhau.
Đa số các tế bào non có nguồn gốc từ dòng tủy (như myeloblast,
monoblast, erythroblast, megakaryoblast) đều có chung một số đặc điểm về
DAMDTB như: CD34, HLA.DR và CD38, CD117 rất cao. Đặc biệt là CD117

ngày nay được xem là có ý nghóa hơn cả phức hợp CD13/CD33 trong việc xác
đònh myelo/monoblast vì luôn hiện diện với mật độ ổn đònh trong các tế bào tiền
thân dòng tủy. TdT có thể gặp trong một số ít BCC dòng tủy.[17],[83],[84]
Đối với dòng lympho, các dấu ấn non bao gồm: CD34, CD38, TdT, CD10.
Ngoài các dấu ấn kể trên còn có thể thấy sự hiện diện của HLA.DR và CD1a trên
tế bào non dòng lympho T. Lưu ý: HLA.DR không phải là một dấu ấn non đối với
dòng mono và lympho B, bởi vì trong quá trình phát triển bình thường HLA.DR
xuất hiện tăng dần từ đầu dòng đến cuối dòng.[17],[84],[109]

Hình 1.4: Vò trí các quần thể tế bào non ác tính trên biểu đồ SSC-CD45
(quần thể tế bào non màu đỏ - P1, bên trái là 1 ca bệnh BCC dòng lympho, ở giữa và bên
phải là 2 ca bệnh BCC dòng tủy) (Nguồn: Bộ phận DAMDTB, bệnh viện TMHH)


12

Quan sát trên biểu đồ SSC-CD45 có thể thấy lymphoblast có nồng độ
CD45 thay đổi từ âm tính đến trung bình, trong khi SSC luôn giữ ở mức thấp;
myeloblast có đặc tính SSC thay đổi từ thấp đến cao và CD45 thường mạnh hơn
lymphoblast (Hình 1.4).
1.3.2. Đặc điểm DAMDTB của bệnh BCC dòng lympho B
Trên sơ đồ phát triển bình thường của các tế bào lympho B (Hình 1.8),
chúng ta nhận thấy DAMDTB trên tế bào lympho B thay đổi qua năm giai đoạn
khác nhau (Hình 1.8). Trong đó, các DAMDTB xuất hiện sớm và có nồng độ ổn
đònh từ đầu dòng đến cuối dòng là cyCD79a, cyCD22, smCD22, CD19, HLA-DR.
Các dấu ấn trưởng thành hơn là CD20, cyIgM, smIgM, Igκ hoặc Igλ. Tương bào
là một giai đoạn đặc biệt của dòng B: không có CD22 và CD20; CD19 và CD45
rất yếu; thường đặc trưng bởi CD38 và CD138 với nồng độ cao. [17],[84],[109] Từ năm
1976, người ta đã đưa ra tiêu chuẩn chẩn đoán và phân loại dưới nhóm của bệnh
BCC dòng lympho B dựa vào DAMDTB phải có sự hiện diện của các kháng

nguyên liên quan đến dòng B bên cạnh các dấu ấn non, đồng thời không xuất
hiện các dấu ấn đặc trưng của các dòng khác.

Hình 1.5: Sơ đồ phát triển DAMDTB bình thường của tế bào dòng lympho B[109]