Ứng dụng kỹ thuật PCR tìm gen DYZ1 để xác định NST Y cho các bệnh nhân chưa rõ giới tính docx

ứng dụng kỹ thuật PCR tìm gen DYZ1 để xác định NST Y
cho các bệnh nhân cha rõ giới tính
Nguyễn Thanh Thuý
1
, Vũ Triệu An
1
, Văn Đình Hoa
1
Nguyễn Thị Phợng
2
, Vũ Chí Dũng
2
1
Bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh, trờng Đại học Y Hà Nội
2
Khoa Nội tiết - Chuyển hoá - Di truyền, Viện Bảo vệ sức khoẻ trẻ em

Sau khi tiến hành PCR tìm gen TDF để chẩn đoán giới tính và đối chiếu với kết quả nuôi cấy
NST cho 40 bệnh nhân thì thấy 95% phù hợp tức là có mặt song hành TDF và NST Y và ngợc lại,
còn lại 5 % (2 bệnh nhân) không phù hợp: 46XX nhng TDF (+) và 46XY/46Xr (X) nhng TDF (-).
Để khẳng định cho hai trờng hợp này chúng tôi tiến hành PCR tìm gen DYZ là gen trên nhánh dài
để phát hiện NST Y kết quả cho thấy không tìm thấy gen DYZ trên cả hai bệnh nhân này, do đó
kết luận là không có mặt NST Y.

I. Đặt vấn đề
ở ngời và động vật có vú thì nhiễm sắc thể
Y là một trong những nhiễm sắc thể ngắn nhất.
Ngời ta đã tiến hành nghiên cứu trên một số
cá thể có bộ nhiễm sắc thể: 46,XY; 47,XXY và
47,XYY đều có tinh hoàn và là nam. Trong khi
đó 46,XX, 47,XXX và 45,XO có kiểu hình là nữ.

Do đó, có thể kết luận là kiểu hình nam phụ
thuộc vào nhiễm sắc thể Y. Ngày nay ngòi ta
đi sâu hơn và đã tìm ra ở nhánh ngắn của NST
Y thì có gen mã cho yếu tố TDF (Testis
Determining Factor = Yếu tố quyết định tinh
hoàn), còn nhánh dài thì có gen mã cho sự
sinh tinh trùng AZF (Azoospermie factor) các
gen này chiếm khoảng 2 - 3% NST Y. Còn lại
là các trình tự lặp đi lặp lại một cách đặc hiệu
và chỉ có ở NST Y. Ngời ta gọi đó là vùng
Heterochromatin, gen DYZ nằm ở vùng này (D
= DNA; Y = NST Y; Z = Repetive copy DNA -
Đoạn lặp lại trên NST Y). Do NST Y có chức
năng và cấu trúc đặc biệt nh vậy, nên việc
xác định NST Y có vai trò quan trọng, quyết
định trong việc chẩn đoán giới tính.
Năm 1972, Pearson và cs [ 4 ] bằng kỹ
thuật nhuộm huỳnh quang các tế bào niêm
mạc miệng, tế bào lympho ở metaphase đã
thấy các tế bào lấy từ đối tợng là nam giới có
bắt màu huỳnh quang ở nhánh dài NST Y
ngời ta gọi đó là vật thể Y. Số lợng vật thể Y
chính bằng số NST Y có trong tế bào, nhng
chỉ có khoảng 15% các tế bào 47,XYY và
48,XXYY có hai vật thể Y và 0,05% nam
46,XY bình thờng về giới không có vật thể Y.
Do vậy kỹ thuật này có độ nhạy kém.
Kỹ thuật nuôi cấy xếp bộ NST là một trong
kỹ thuật khá chính xác do Tjio và Levan tìm ra
năm 1956 [7] và sau đó năm 1972 đợc hội

nghị ở Pari thống nhất gọi tên các loại băng, từ
đó đến nay nó là kỹ thuật chính để xác định
NST Y [5] trong mọi trờng hợp. Phơng pháp
này nhiều khi phải làm đi làm lại nhiều lần do
kết quả nghi ngờ trong các trờng hợp khó:
bệnh nhân kiểu hình là nam, có bất thờng bộ
phận sinh dục, 46,XX TDF (+) do TDF nằm
trên NST X, hay có một mẩu NST X hoặc
NST mất đoạn thì dễ nhầm với NST Y.
Vì vậy năm 1992 Kaoru Suzumori và cs đã
ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử tìm gen
DYZ trong máu mẹ để chẩn đoán giới tính cho
thai nhi. [3]. Đây là gen đợc tạo nên bản sao 5
nucleotide (TTCCA) lặp lại 3000 lần trên Y,
nếu có mặt thì chắc chắn đó là NST Y.
ở nớc ta cha một nghiên cứu nào đề cập
đến việc xác định NST Y qua gen này. Chính vì
vậy chúng tôi tiến hành đề tài này với các mục
tiêu sau:


41
1. Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi SY
160 tìm gen DYZ để xác định NST Y cho các
bệnh nhân cha rõ giới tính.
2. Tiến hành kỹ thuật PCR tìm DYZ để
khẳng định sự có mặt hay không có mặt của
NST Y trong trờng hợp không có sự phù hợp
giữa PCR tìm TDF và caryotype.
II. Đối tợng và phơng pháp

nghiên cứu:
1. Đối tợng:
40 bệnh nhân có chẩn đoán là mập mờ giới
tính đợc vào khoa Nội tiết chuyển hoá di
truyền viện Bảo vệ sức khoẻ trẻ em.
2. Phơng pháp nghiên cứu:
Chúng tôi tiến hành chiết tách ADN từ bạch
cầu lympho máu ngoại vi của 40 bệnh nhân, sau
đó tiến hành xác định giới tính cho bệnh nhân
này bằng kỹ thuật PCR xác định gen TDF, kỹ
thuật này đã đợc chuẩn cho phản ứng chính xác
100% các trờng hợp [8]. Khi có kết quả TDF thì
chúng tôi đối chiếu với caryotype của bệnh nhân
sẽ xảy ra hai trờng hợp sau:
- Nếu kết quả TDF phù hợp với caryotype
(TDF luôn có mặt cùng NST Y và ngợc lại) thì
chúng tôi lấy làm nhóm chứng để chuẩn kỹ
thuật PCR tìm gen DYZ để xem độ chính xác
của kỹ thuật.
- Nếu kết quả TDF không phù hợp với
caryotype của bệnh nhân thì dựa trên kết quả
PCR tìm DYZ, là kỹ thuật đã đợc chuẩn ở trên
để kiểm tra lại và kết luận xem thật sự có hay
không có mặt NST Y.
3. Kỹ thuật:
* Kỹ thuật PCR: tiến hành tại bộ môn Miễn
dịch - Sinh lý bệnh. Trờng Đại học Y Hà Nội.
- Chiết tách ADN từ bạch cầu lympho máu
ngoại vi theo phơng pháp chelex.
- Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi của

gen TDF để xác định giới và PCR với cặp mồi
của gen DYZ để xác định NST Y.
- Sau đó kiểm tra kết quả bằng điện di trên
gen thạch agarose 2%.

- Đọc kết quả bằng đèn tử ngoại =310nm
nh sau:
TDF (+) cho sản phẩm là 425bp.DYZ (+)
cho sản phẩm là 236pb.
Phân tích kết quả: TDF (+) nam; TDF (-) nữ.
Nếu DYZ (+): có mặt NST Y.
DYZ (-): không có NST Y.
TDF (+), DYZ (-): TDF nằm trên NST X.
TDF (-), DYZ (+): TDF bị mất đoạn trên Y.
Chứng nam: TDF (+); DYZ (+); NST 46,XY.
Chứng nữ: TDF (-); DYZ(-); NST 46,XX.
* Kỹ thuật nuôi cấy tế bào định
caryotype: đợc tiến hành tại bộ môn Y sinh
học - Di truyền, trờng Đại học Y Hà Nội.
III. Kết quả
Bảng 1: PCR tìm gen TDF để xác định giớí
cho 40 bệnh nhân cha rõ giới.
TDF n %
Dơng tính
24 60%
Âm tính
16 40%

40 100%

Các bệnh nhân cha rõ giới tính đợc
nghiên cứu thì 40 % là nữ bị nam hoá, còn 60%
là nam bị nữ hoá.
Bảng 2: Đối chiếu giữa kết quả PCR và
caryotype của 40 bệnh nhân
PCR Caryotype n %
46, XX 15 37,5 TDF (-)
n = 16
46, XY/ 46, X(r)X
1 2,5
46, XY
46, XX/ 46, XY
45, XO/ 46, XY
47, XXY
19
1
2
1


57,5

TDF (+)
n = 24
46, XX
1 2,5


40 100
Nhận xét:

- 15/40 số trờng hợp chiếm 37,5 % gen
TDF (-) có kết quả phù hợp với kết quả NST là
46,XX. Đợc sử dụng làm nhóm chứng cho
PCR tìm DYZ.
- 23/40 số trờng hợp chiếm 57,5 % gen
TDF (+) phù hợp với kết quả NST là 46,XY.

42
Đợc sử dụng làm nhóm chứng cho PCR tìm
DYZ.
- 1/40 số trờng hợp chiếm 2,5 % gen TDF
(-) nhng kết quả nuôi cấy NST là 46, XY /46,
Xr(X).
- 1 /40 số trờng hợp chiếm 2,5% gen TDF
(+) nhng kết quả nuôi cấy NST là 46,XX.
Bảng 3: Xác định NST Y bằng PCR tìm DYZ
ở nhóm chứng.
TDF(+), 46, XY TDF(-), 46, XX

n % n %
DYZ(-) 0 0 15 100
DYZ(+) 23 100 0 0

Nhận xét: với 38 trờng hợp có kết quả phù
hợp giữa TDF và caryotype để làm chứng cho
cho kỹ thuật PCR tìm DYZ để xác định NST Y
cho kết quả chính xác 100%, không có trờng
hợp nào dơng tính hay âm tính giả.
Bảng 4: Kết quả PCR tìm DYZ ở nhóm bệnh
nhân có kết quả không phù hợp giữa TDF

và caryotype.
Caryotype Kết quả DYZ
TDF (+); 46,XX Âm tính
TDF (-); 46,XY/46,Xr(X) Âm tính

Nhận xét: cả hai trờng hợp đếu có DYZ âm
tính, chứng tỏ không có mặt NST Y.
IV. Bàn luận:
Trong tổng số 40 bệnh nhân nghiên cứu sau
khi đối chiếu giữa TDF và NST Y thì chúng tôi thấy
có 95% phù hợp đã đợc bàn luận trong nghiên
cứu trớc của chúng tôi [9] còn 5% không phù hợp
đó là: trờng hợp thứ nhất có gen TDF nhng nuôi
cấy NST là 46,XX và trờng hợp thứ hai là không
có gen TDF nhng khi nuôi cấy NST là 46,XY/46,
Xr(X) (nhiễm sắc thể X hình nhẫn do mất đoạn
nhánh ngắn và nhánh dài). Khi tiến hành kiểm tra
PCR với SY160 để tìm gen DYZ số bệnh nhân (38
bệnh nhân) có sự phù hợp TDF và nuôi cấy NST
thì có kêt quả phù hợp với DYZ, nghĩa là, DYZ
dơng tính thì caryotype có NST Y và DYZ âm tính
thì caryotype không có Y. Hai trờng hợp còn lại
thì đều có DYZ (-) chứng tỏ không có mặt NST Y.
Các kết quả trên đợc lý luận nh sau:
- Theo Cook và cs [2] 1976 đã thấy
khoảng 50-70% vùng không bổ cứu trên NST
Y bao gồm các đoạn ADN lặp đi lặp lại và chỉ
xuất hiện trên NST Y, hoàn toàn đặc hiệu
cho NST Y, nó kh trú trên nhánh dài NST Y
ở vùng heterochromatin. Ngời ta gọi nó là

gen DYZ1 và DYZ2. DYZ là chỉ sự nhắc lại
trên NST Y, số 1 và 2 để chỉ trình tự phát
hiện ra. DYZ 1 có kích thớc 3,4kb với 5
nucleotit đợc lặp lại TTCCA (khoảng 3000
bản lặp lại) còn DYZ 2 thì có 2000 bản lặp
lại. Do vậy ngời ta lợi dụng tính chất này để
xác định NST Y bằng kỹ thuật PCR khi khó
xác định nó bằng phơng pháp nuôi cấy
NST, hay khi gen TDF không nằm trên NST
Y. Các tác giả nớc ngoài đã sử dụng kỹ
thuật này trong chẩn đoán giới nh Kaoru
Suzumori và cộng sự 1992 [3] đã áp dụng
trong việc chẩn đoán giới tính thai nhi từ máu
mẹ, ngoài ra còn đợc Tanoue A. và cộng sự
năm 1992 [6] áp dụng để nghiên cứu trên đối
tợng 46,XX nam và 46,XX ái nam ái nữ thật
(có mặt đồng thời cả tinh hoàn và buồng
trứng) đã phát hiện ra TDF (+),và DYZ (-).
- Từ bảng 4 cho thấy một bệnh nhân là
46,XX có gen TDF (+) chiếm 2,5% số trờng
hợp. ở bệnh nhân này gen TDF nằm hoàn
toàn trên NST X vì kết quả DYZ (-). Do đó
phù hợp về lâm sàng bệnh nhân này có
ngoại hình nam hoàn toàn, có tinh hoàn,
nhng vào viện vì có tật lỗ đái thấp. Kết quả
nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với một số
nghiên cứu của các tác giả khác trong y văn
[6]. Bằng phơng pháp lai tại chỗ (FISH)
Abbas N. et al 1993 [1] đã chứng minh
nguyên nhân của các trờng hợp này là do

trên nhánh ngắn NST X(Xp22) của bệnh
nhân có mang gen TDF và vùng giả NST
thờng (pseudo autosome region). NST X
bệnh lý này là do cha truyền cho con, vì
ngời ta đã tìm thấy ở cha bệnh nhân này có
2 gen TDF một trên NST Y và một gen trên
NST X. [1]
- Ngoài ra từ bảng 4 còn thấy 1 bệnh
nhân khác chiếm 2,5% số trờng hợp không
có sự phù hợp giữa kết quả PCR với nuôi

43
cấy NST: bộ NST đọc là 46,XY/46,Xr (X) có
mặt NST Y nhng khi tiến hành PCR thì kết
quả cho thấy TDF (-); DYZ (-) tức là hoàn
toàn không có mặt NST Y và các gen trên
nó. Trờng hợp này khi đối chiếu với lâm
sàng của bệnh nhân thì phù hợp: bệnh nhân
có ngoại hình nữ hoàn toàn, có tử cung và
buồng trứng vào viện vì chiều cao chậm phát
triển có ngoại hình gần giống hội chứng
Turner. Do đó sơ bộ chúng tôi khẳng định
rằng trong caryotype của bệnh nhân này
không có NST Y. Nhận xét này của chúng tôi
phù hợp hoàn toàn với y văn, vì nếu
46,XY/46,Xr(X) mà TDF (-) nghĩa là có sự đột
biến 2 dòng tế bào trên cùng một hợp tử thì
rất hiếm gặp.

V. Kết luận

1. ở 38 bệnh nhân cha rõ giới (chiếm 95
% tổng số) có kết quả phù hợp giữa PCR tìm
TDF và caryotype đã sử dụng làm nhóm
chứng cho chuẩn kỹ thuật PCR tìm gen DYZ
để xác định nhiễm sắc thể Y cho kết quả
chính xác 100% không có trờng hợp nào âm
tính hay dơng tính giả.
2. Còn 2 bệnh nhân (chiếm 5 %) có kết
quả PCR tìm TDF và caryotype không phù
hợp đều không tìm thấy gen DYZ, do đó
khẳng định là không có mặt NST Y trong 2
trờng hợp này.
3. Phát hiện và khẳng định một trờng
hợp TDF trên NST X đầu tiên ở Việt Nam.

Tài liệu tham khảo
1. Abbas N.; McElreavey K.; Fellous M.;
et al (1993). Familial case of 46,XX male and
46,XX true hermaphrodite associated with
paternal -derived SRY -bearing X
chromosome. C.R.Acad. Sci. III 1993;
316(4): 375-383.



2. Cooke HJ.(1976). Repeated sequence
specific to human males. Nature 262:182-
186.
3. Kaoru Suzumori et al (1992) Fetal cell
in maternal circulation; detection of Y

sequence by gene amplification.
Obstet.gynecol. 1992;80:150-60
4. Pearson P. et al (1972). The use of
new staining techniques for human
chromosome identification. J.Med.Genet 9;
264 - 75.
5. Polani P.E. et al (1981). Abnormal sex
development in man. The mecanisme of the
sex differentiation in animals and man.
(Austin C.R. et Edwards R.G.; eds); 465 -
547. Academic Press London.
6. Tanoue A., Nakamura T., Endo F. et al
(1992). Sex determining region Y (SRY) in a
patient with 46 XX true hermaphroditism.
Jpn. J. Hum. Genet. DEC; 37 (4); 311 - 20.
7. Tjio J.H. et Levan A. (1956). The
chromosome number of man. Hereditas; 42:
1 - 6.
8. Nguyễn Thanh Thuý, Vũ Triệu An, Trần
Thị Chính và cs (1997). Bớc đầu hoàn chỉnh
kỹ thuật PCR và áp dụng trong việc xác định
giới tính. Tạp chí nghiên cứu Y học. Đại học
Y Hà Nội. Tập 4. Số 4: 33-35.
9. Nguyễn Thanh Thuý, Vũ Triệu An,Văn
Đình Hoa, Nguyễn Thị Phợng, Vũ Chí Dũng.
(2002). áp dụng kỹ thuật PCR tìm gen TDF
và gen Amelogenin để xác định giới tính cho
bệnh nhân cha rõ giới tính và đối chiếu với
kết quả nuôi cấy NST. Tạp chí Nghiên cứu y
học. Đại học Y Hà Nội 18.số 2. 6/2002. tr 3-

6.

44
Summary
The application of the PCR technique to find the DYZ
gene for the Y chromosome determination

(We would like to thank Dr.McElreavey Ken for your help)
The authors studied DNA samples with were extracted from the peripheral blood by the PCR
technique with the primers TDF (to amplify the TDF gene on the short arm of the Y chromosome)
and compared this PCR result with their karyotype:
95% accord with karyotype and except 5%: 46XX, TDF(+) and 46XY/Xr(X) TDF(-). The authors
amplified the DYZ gene with primers SY160 to determine the Y chromosome in this 5% and the
results showed that:
- DYZ(-) in both 2 cases.
- TDF (+) on the X chromosome.


45