Nghiên cứu tầm soát và chẩn đoán trước sinh bệnh alpha và bêta thalassemia

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN

NGHIÊN CỨU TẦM SOÁT
VÀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH
BỆNH ALPHA VÀ BÊTA THALASSEMIA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN

NGHIÊN CỨU TẦM SOÁT
VÀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH
BỆNH ALPHA VÀ BÊTA THALASSEMIA

Chuyên ngành: MÔ PHÔI THAI HỌC
Mã số: 62.72.01.01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
1. GS. TS. TRƯƠNG ĐÌNH KIỆT
2. PGS. TS. BS. LÂM THỊ MỸ

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2012


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu
và kết quả nêu trong luận án này là trung thực và chưa từng có ai công bố
trong bất kỳ công trình nào khác.

Nguyễn Khắc Hân Hoan


i

MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Mục lục ................................................................................................................ i
Danh mục các chữ viết tắt ................................................................................ iii
Ký hiệu các đột biến gen globin......................................................................... v
Danh mục các bảng ..........................................................................................vii
Danh mục biểu đồ .............................................................................................. x
Danh mục các sơ đồ ........................................................................................... x

Danh mục các hình ............................................................................................xi
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1. Các gen globin và sinh tổng hợp hemoglobin............................................ 3
1.2. Phân loại bệnh thalassemia ........................................................................ 5
1.3. Tầm soát và chẩn đoán trước sinh............................................................ 14
1.4. Các quy trình tầm soát và chẩn đoán trước sinh ...................................... 24
1.5. Tình hình nghiên cứu tầm soát và chẩn đoán trước sinh thalassemia tại
Việt Nam ............................................................................................... 28
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 31
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 31
2.1.1. Tiêu chuẩn chọn vào mẫu nghiên cứu .................................................. 31
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ ................................................................................ 31
2.1.3. Cỡ mẫu .................................................................................................. 32
2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 33
2.2.1. Biến số sử dụng trong nghiên cứu......................................................... 33
2.2.2. Phương pháp tiến hành .......................................................................... 35
2.2.3. Thu thập và phân tích số liệu ................................................................ 50


ii

2.2.4. Y đức ..................................................................................................... 51
2.2.5. Lợi ích mong đợi từ nghiên cứu............................................................ 51
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................... 52
3.1. Đặc điểm dịch tễ học của các đối tượng nghiên cứu ................................ 52
3.2. Tỉ lệ các loại alen đột biến và kiểu gen thalassemia ở các đối tượng
nghiên cứu .............................................................................................. 55
3.3. Khả năng tầm soát phát hiện đột biến thalassemia của chỉ số MCV và
MCH ...................................................................................................... 70

3.4. Kiểu hình huyết học của các kiểu gen thalassemia ở các đối tượng
nghiên cứu .............................................................................................. 75
3.4.1. Kiểu hình huyết học của các kiểu gen -thalassemia ............................ 76
3.4.2. Kiểu hình huyết học của các kiểu gen -thalassemia ............................ 81
3.4.3. Kiểu hình huyết học của các kiểu gen -thalassemia kèm thalassemia ............................................................................................. 86
Chương 4: BÀN LUẬN ................................................................................. 89
4.1. Đánh giá về phương pháp nghiên cứu ...................................................... 89
4.2. Đặc điểm dịch tễ học của các đối tượng nghiên cứu ................................ 92
4.3. Tỉ lệ các loại alen đột biến -thalassemia và -thalassemia .................... 94
4.4. Tỉ lệ phát hiện đột biến -thalassemia và -thalassemia của chỉ số
MCV và MCH...................................................................................... 101
4.5. Kiểu hình huyết học của các kiểu gen -thalassemia, -thalassemia,
-thalassemia kèm -thalassemia ........................................................ 105
KẾT LUẬN .................................................................................................. 119
KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 121
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
TÀI LIỆU THAM KHẢO


iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt
-3.7
-4.2
--MED
--SEA


19

31
(832)
CS
QS
αTα
ααT
WS

0
+
-28
cd17
cd26
cd41
cd43
cd71
cd95
cd119
del1393
del9.6
E
Ivs1
Ivs2
tail
thal

Ý nghĩa
đột biến xóa đoạn 3,7 kb α+-thalassemia
đột biến xóa đoạn 4,2 kb α+-thalassemia
đột biến xóa đoạn Mediterranean α0-thalassemia

đột biến xóa đoạn South East Asia α0-thalassemia
gen globin alpha
alen gen globin 1 và 2 bình thường
đột biến điểm gen globin α1 tại codon 19, CGC>GGC
đột biến điểm gen globin α2 tại codon 31 AGG>TGG
đột biến điểm gen globin α2 tại vị trí +832 G>A
đột biến điểm gen globin α2 tạo Hb Constant Spring
đột biến điểm gen globin α2 tạo Hb Quong Sze
đột biến điểm gen globin α2
đột biến điểm gen globin α1
đột biến điểm gen globin α2 tạo Hb Westmead
gen globin beta, alen gen globin  bình thường
đột biến 0-thalassemia không tổng hợp chuỗi globin β
đột biến +-thalassemia giảm tổng hợp chuỗi globin β
đột biến điểm gen globin  tại vị trí -28 A>G
đột biến điểm gen globin  tại codon 17AAG>TAG
đột biến điểm gen globin  tại codon 26 GAG>TAG
đột biến điểm gen globin  tại codon 41/42 -TCTT
đột biến điểm gen globin  tại codon 43 GAG>TAG
đột biến điểm gen globin  tại codon 71/72 +A
đột biến điểm gen globin  tại codon 95 +A
đột biến điểm gen globin  tại codon 119 -G
đột biến xóa đoạn gen globin  Del 1393 bp
đột biến xóa đoạn gen globin  Del 9,6 kb
đột biến gen globin  tạo HbE (codon 26 GAG>AAG)
đột biến điểm gen globin  tại IVS 1-1 G>T
đột biến điểm gen globin  tại IVS 2-654 C>T
đột biến điểm gen globin  tại poly A tail T>C
đột biến -thalassemia giảm hoặc không tổng hợp chuỗi globin β,

iv



()del


ARMS
BVTD
CĐTS
ĐB
DCIP
ddNTP
DEAE
ĐLC
dNTP
Hb
HbCS
HbE
Hct
HgB
HGVS
HS
IVS
MCH
MCV
MLPA
NESTROFT
OF

PCR
sequencing
SLHC
TMNS
WHO
wt
XN

không bao gồm đột biến E (codon 26 GAG>AAG).
gen globin delta
alen gen  bình thường
đột biến xóa đoạn DNA chứa gen  và 
gen globin gamma
gen globin zetta
amplification refractory mutation system: hệ thống khuếch đại đột
biến có tính chất trơ
bệnh viện Từ Dũ
chẩn đoán trước sinh
đột biến
dichlorophenolindophenol
dideoxynucleotide triphosphat
diethyl aminoethyl
độ lệch chuẩn
deoxynucleotide triphosphat
hemoglobin: huyết sắc tố
hemoglobin Constant Spring
hemoglobin E
hematocrit: dung tích huyết cầu
khối lượng hemoglobin
Human Genome Variation Society: Hiệp hội Đa dạng Bộ gen người

hypersensitive site: vị trí rất nhạy cảm
intervening sequence: trình tự chèn hay intron
mean corpuscular hemoglobin: số lượng Hb trung bình hồng cầu
mean corpuscular volume: thể tích trung bình hồng cầu
multiplex ligation-dependent probe amplification: khuếch đại nhiều
đoạn dò phụ thuộc kết nối
naked eye single tube red cell osmotic fragility test: xét nghiệm sức
bền thẩm thấu hồng cầu 1 ống quan sát bằng mắt thường
osmotic fragility: xét nghiệm sức bền thẩm thấu
polymerase chain reaction: phản ứng kéo dài chuỗi
giải trình tự
số lượng hồng cầu
thiếu máu nhược sắc
World Health Organisation: Tổ chức Y tế Thế giới
wild type: kiểu gen bình thường
xét nghiệm


v

KÝ HIỆU CÁC ĐỘT BIẾN GEN GLOBIN
Ký hiệu
Ý nghĩa
Đột biến gen globin α
--SEA
Đột biến xóa đoạn DNA khoảng 20 kb chứa 2 gen α và không tạo ra
được mRNA. Loại đột biến α0-thalassemia. Danh pháp HGVS:
NG_000006.1:g.26264_45564del19301
Thai
-Đột biến xóa đoạn DNA khoảng 34 – 38 kb chứa 2 gen α và không

tạo ra được mRNA. Loại đột biến α0-thalassemia. Danh pháp
HGVS: NG_000006.1:g.10664_44164del33501.
Dutch 2
-Đột biến xóa đoạn hoàn toàn nhóm gen có chiều dài gần 70 kb và
không tạo ra được mRNA. Loại đột biến α0-thalassemia.
Đột biến xóa đoạn DNA dài 3,7 kb bao gồm đầu 3’ gen α2 và đầu 5’
-3.7
gen α1. Loại đột biến α+-thalassemia. Danh pháp HGVS:
NG_000006.1:g.34164_37967del3804.
Đột biến xóa đoạn DNA dài 4,2 kb làm mất hoàn toàn gen α2. Loại
-4.2
đột biến α+-thalassemia.
Đột biến ở gen α2 tại codon 142, TAA (Stop) đổi thành CAA, làm
CS
kéo dài thêm 31 codon tạo ra chuỗi globin Constant Spring variant.
Loại đột biến α+-thalassemia. Danh pháp HGVS: HBA2:c.427T>C
Đột biến ở gen α2 tại codon 125, CTG (Leucine) đổi thành CCG
QS
(Proline) tạo ra chuỗi globin Quong Sze variant rất kém bền. Loại
đột biến α+-thalassemia. Danh pháp HGVS: HBA2:c.377T>C.
Đột biến ở gen α2 tại codon 122, CAC (Histidine) đổi thành CAG
WS
(Glutamine) tạo ra chuỗi globin Westmead variant. Loại đột biến α+thalassemia. Danh pháp HGVS: HBA2:c.369C>G
1 Codon 19 Đột biến ở gen α1 tại codon 19, CGC (Arginine) đổi thành GGC
(Lysine). Loại đột biến α+-thalassemia.
CGC>GGC
2 Codon 31 Đột biến ở gen α2 tại codon 31, AGG (Arginine) đổi thành TGG
(Tryptophan). Loại đột biến α+-thalassemia. Danh pháp HGVS:
AGG>TGG
HBA2:c.94A>T.

2 +832 G>A Đột biến ở gen α2 tại vị trí +832, A đổi thành G. Loại đột biến α+thalassemia. Danh pháp HGVS: HBA2:c.*+107A>G.
Đột biến gen globin β
-28 A>G
Đột biến vùng promoter, vị trí -28, A đổi thành G làm giảm phiên
mã gen β. Loại đột biến: β+. Danh pháp HGVS: HBB:c.-78A>G.
Codon 17
Đột biến ở codon 17 thuộc exon 1, AAG (Lysine) đổi thành TAG
AAG>TAG
(Stop) làm dừng dịch mã gen β tại codon 17. Loại đột biến: β0. Danh
pháp HGVS: HBB:c.52A>T.


vi

Codon 26
GAG>AAG

Codon 26
GAG>TAG
IVS 1-1 G>T

Codon 41/42
-TCTT

Codon 43
GAG>TAG
Codon 71/72
+A
Codon 95 +A

IVS 2-654
C>T
Codon 119 -G
Poly A tail
T>C
Del 9,6 kb
Del 1393 bp
()del

Đột biến ở codon 26 thuộc exon 1, GAG (Glutamate) đổi thành
AAG (Lysine). Đột biến tạo ra chuỗi globin E variant đồng thời tạo
ra vị trí ghép nối bất thường với đầu 5’ của IVS-1. Kiểu gen dị hợp
tử chỉ gây ra thiếu máu nhẹ. Kiểu gen đồng hợp tử là rối loạn lành
tính. Dị hợp tử kép HbE và đột biến β-thalassemia gây thiếu máu
nặng. Danh pháp HGVS: HBB:c.79G>A
Đột biến ở codon 26 thuộc exon 1, GAG (Glutamate) đổi thành
TAG (Stop), làm dừng dịch mã gen β tại codon 26. Loại đột biến:
β0. Danh pháp HGVS: HBB:c.79G>T.
Đột biến ở intron 1 tại vị trí 1, G đổi thành T (AGGTTGGT>AGTTTGGT), làm thay đổi GT của vị trí ghép nối bình thường
nên không tạo được mRNA. Loại đột biến: β0. Danh pháp HGVS:
HBB:c.92+1G>T.
Đột biến ở codon 41 và 42 thuộc exon 2, mất đi TTC.TTT
(phenyl.phenyl) và đổi thành ----TT, làm lệch khung dịch mã và tạo
ra codon 59 mới (Stop). Loại đột biến: β0. Danh pháp HGVS:
HBB:c.126_129delCTTT.
Đột biến ở codon 43 thuộc exon 2, AAG (Axít Glutamic) đổi thành
TAG (Stop). Làm dừng dịch mã gen β tại codon 43. Loại đột biến:
β0. Danh pháp HGVS: HBB:c.130G>T.
Đột biến chèn thêm A ở giữa codon 71 và 72 thuộc exon 2, làm
lệch khung dịch mã và tạo ra codon 73 mới (TGA : Stop). Loại đột

biến: β0. Danh pháp HGVS: HBB:c.216_217insA.
Đột biến chèn thêm A vào codon 95 thuộc exon 2, làm lệch khung
dịch mã và dừng dịch mã ở codon 101 (TGA : Stop). Loại đột biến:
β0. Danh pháp HGVS: HBB:c.287_288insA.
Đột biến ở intron 2 tại vị trí 654, C đổi thành T (AAGGCAATA>AAGGTAATA), tạo ra vị trí ghép nối mới. Loại đột biến: β+
nặng. Danh pháp HGVS: HBB:c.316-197C>T.
Đột biến ở codon 119 thuộc exon 3, mất đi G làm lệch khung dịch
mã. Danh pháp HGVS: HBB:c.360_361delG.
Đột biến ở đuôi poly A, AATAAA đổi thành AACAAA làm quá
trình tách và gắn đuôi poly(A) không hiệu quả. Loại đột biến: β+.
Danh pháp HGVS: HBB:c.*+110T>C
Xóa đoạn 9,6 kb của nhóm gen globin β, từ HBB 11982-L12805
đến 9.6 kb dw' HBB11980-L12803. Loại đột biến: β0.
Xóa đoạn gen  dài 1393 nucleotide cách codon bắt đầu khoảng
500 pb đến phân nửa IVS 2. Loại đột biến: β0.
Đột biến xóa đoạn DNA chứa gen  và gen , gây kiểu hình thalassemia với HbF tăng.


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
STT

Tên bảng

Trang

1

Bảng 1.1. Đặc điểm huyết học trên 171 bệnh nhi HbH tại Việt

Nam.

9

2

Bảng 1.2. Đặc điểm các thông số huyết học theo kiểu gen αthalassemia.

10

3

Bảng 1.3. Các đột biến -thalassemia phổ biến ở một số quần
thể trên thế giới.

11

4

Bảng 1.4. Chẩn đoán, kiểu gen và đặc điểm kiểu hình của thalassemia.

12

5

Bảng 1.5. Kiểu hình huyết học của kiểu gen HbE.

13

6

Bảng 1.6. Các phương pháp tầm soát thalassemia dựa trên
MCV và MCH.

16

7

Bảng 1.7. Năng lực của NESTROFT trong các nghiên cứu.

16

8

Bảng 1.8. Các kỹ thuật phân tử chẩn đoán -thalassemia và thalassemia.

19

9

Bảng 1.9. Tỉ lệ các loại đột biến -thalassemia ở người Việt
Nam.

29

10

Bảng 2.1. Tỉ lệ mang gen bệnh -thalassemia, -thalassemia và
HbE của người Việt Nam trong một số nghiên cứu.

33

11

Bảng 2.2. Định nghĩa các biến số của nghiên cứu.

34

12

Bảng 2.3. Các biến số kết cục và biến số nền của nghiên cứu .

35

13

Bảng 2.4. Các thông số phản ứng giải trình tự gen globin 2 và
1.

46

14

Bảng 2.5. Các thông số phản ứng giải trình tự gen globin .

48

15

Bảng 2.6. Trình tự các mồi sử dụng trong giải trình tự gen 1,

2 và .

49

16

Bảng 3.1. Đối tượng tham gia và loại mẫu xét nghiệm chẩn
đoán đột biến gen.

52

17

Bảng 3.2. Đặc điểm dịch tễ học của các đối tượng nghiên cứu.

53

18

Bảng 3.3. Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen đột biến thalassemia
được phát hiện.

55


viii

STT

Tên bảng

Trang

19

Bảng 3.4. Tỉ lệ đột biến thalassemia trong 44.439 thai phụ
khám thai tại BVTD.

55

20

Bảng 3.5. Số lượng và tỉ lệ các alen đột biến được phát hiện.

56

21

Bảng 3.6. Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen thalassemia.

62

22

Bảng 3.7. Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen -thalassemia ở thai
phụ và chồng.

63

23

Bảng 3.8. Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen -thalassemia ở thai.

64

24

Bảng 3.9. Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen -thalassemia ở thai
phụ và chồng.

65

25

Bảng 3.10. Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen -thalassemia ở thai.

66

26

Bảng 3.11. Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen -thalassemia kèm thalassemia ở thai phụ và chồng.

67

27

Bảng 3.12. Số lượng và tỉ lệ các kiểu gen -thalassemia kèm thalassemia ở thai.

68

28

Bảng 3.13. So sánh phân bố đột biến gen -thalassemia và thalassemia ở thai phụ và chồng.

69

29

Bảng 3.14. So sánh phân bố đột biến gen -thalassemia và thalassemia ở thai.

69

30

Bảng 3.15. Tỉ lệ phát hiện và tỉ lệ dương tính giả của các công
thức tầm soát đối với thai phụ và chồng được xét nghiệm tìm
đột biến thalassemia.

70

31

Bảng 3.16. Tỉ lệ phát hiện đột biến của các công thức tầm soát
theo kiểu gen -thalassemia.

71

32

Bảng 3.17. Tỉ lệ phát hiện đột biến của các công thức tầm soát

theo kiểu gen -thalassemia.

72

33

Bảng 3.18. Tỉ lệ phát hiện đột biến của các công thức tầm soát
theo kiểu gen -thalassemia kèm -thalassemia.

74

34

Bảng 3.19. Đặc điểm các chỉ số huyết đồ và ferritin của thai
phụ và chồng được chẩn đoán tìm đột biến gen.

75

35

Bảng 3.20. Đặc điểm huyết học và ferritin theo kiểu gen thalassemia ở thai phụ.

76

36

Bảng 3.21. Đặc điểm huyết học và ferritin theo kiểu gen thalassemia ở chồng.

77

ix

STT

Tên bảng

Trang

37

Bảng 3.22. Đặc điểm thành phần Hb theo kiểu gen thalassemia ở thai phụ.

78

38

Bảng 3.23. Đặc điểm thành phần Hb theo kiểu gen thalassemia ở chồng.

79

39

Bảng 3.24. Tỉ lệ các trường hợp chỉ bị đột biến -thalassemia
có HbA2 > 3,5%.

80

40

Bảng 3.25. Đặc điểm huyết học và ferritin theo kiểu gen thalassemia ở thai phụ.

81

41

Bảng 3.26. Đặc điểm huyết học và ferritin theo kiểu gen thalassemia ở chồng.

82

42

Bảng 3.27. Đặc điểm thành phần Hb theo kiểu gen thalassemia ở thai phụ.

83

43

Bảng 3.28. Đặc điểm thành phần Hb theo kiểu gen thalassemia ở chồng.

84

44

Bảng 3.29. Tỉ lệ các trường hợp đột biến -thalassemia và HbE
có HbA2  3,5%.

85

45

Bảng 3.30. Đặc điểm huyết học và ferritin theo kiểu gen thalassemia ở thai phụ và chồng đột biến -thalassemia kèm dị
hợp tử -thalassemia hoặc HbE.

86

46

Bảng 3.31. Đặc điểm thành phần Hb theo kiểu gen thalassemia ở thai phụ và chồng đột biến -thalassemia kèm dị
hợp tử -thalassemia hoặc HbE.

87

47

Bảng 3.32. Đặc điểm tỉ lệ HbE theo kiểu gen -thalassemia ở
thai phụ và chồng đột biến -thalassemia kèm dị hợp tử HbE.

88


x

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
STT
1

Tên biểu đồ
Biểu đồ 3.1. Tỉ lệ âm tính giả của các tiêu chuẩn tầm soát ở
người đột biến E/.

Trang
73

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
STT

Tên sơ đồ

Trang

1

Sơ đồ 1.1. Quy trình xét nghiệm tầm soát thalassemia tại Hy
Lạp.

24

2

Sơ đồ 1.2. Quy trình tầm soát và chẩn đoán thalassemia tại
Canada.

25

3

Sơ đồ 1.3. Quy trình tầm soát thalassemia dựa trên OF/DCIP
tại Thái Lan.

27

4

Sơ đồ 2.1. Quy trình chọn mẫu nghiên cứu.

37

5

Sơ đồ 2.2. Xác định thể thalassemia dựa trên huyết đồ, ferritin,
điện di Hb.

37

6

Sơ đồ 2.3. Tiến trình thực hiện chẩn đoán đột biến thalassemia.

45

7

Sơ đồ 2.4. Tiến trình thực hiện chẩn đoán đột biến thalassemia.

47


xi

DANH MỤC CÁC HÌNH
STT

Tên hình

1

Hình 1.1. Nhóm gen globin α và β và sự tổng hợp globin,
hemoglobin ở các giai đoạn phát triển.
Hình 1.2. Sơ đồ đột biến xóa đoạn +-thalassemia.
Hình 1.3. Sơ đồ đột biến xóa đoạn 0-thalassemia (a) và xóa
đoạn HS-40 (b).
Hình 1.4. Đặc điểm hồng cầu và đại thể thai chết lưu của bệnh
Hb Bart’s.
Hình 1.5. Kết quả xét nghiệm DCIP mẫu E/ và mẫu bình
thường.
Hình 1.6. Sơ đồ minh họa tầm soát HbE bằng DEAE.
Hình 1.7. Nguyên lý của kỹ thuật ARMS.
Hình 1.8. Nguyên lý của kỹ thuật gap-PCR.
Hình 1.9. Nguyên lý của kỹ thuật MLPA.
Hình 1.10. Kết quả điện di mao quản xác định trình tự DNA
gen globin .
Hình 2.1. Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Hình 3.1. Kết quả dò tìm đột biến --SEA, -4.2, -3.7 bằng Multiplex
Gap-PCR.
Hình 3.2. Kết quả xác định đột biến --SEA bằng Gap-PCR.
Hình 3.3. Kết quả dò tìm đột biến điểm CS bằng enzyme cắt
giới hạn Mse I.
Hình 3.4. Kết quả dò tìm đột biến xóa đoạn -thalassemia bằng
MLPA

Hình 3.5. Kết quả dò tìm đột biến trên gen globin 2 bằng giải
trình tự.
Hình 3.6. Kết quả dò tìm đột biến codon 17 AAG>TAG bằng
ARMS.
Hình 3.7. Kết quả xác định đột biến codon 17 AAG>TAG bằng
giải trình tự.
Hình 3.8. Kết quả dò tìm đột biến trên gen globin  bằng giải
trình tự.

2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19

Trang
3

6
7
8
17
18
20
21
22
23
39
58
58
59
59
60
60
61
61


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh thalassemia gây thiếu máu tan máu là bệnh thường gặp trẻ em Việt
Nam và cũng là bệnh đơn gen phổ biến nhất trên thế giới, tạo gánh nặng lớn
cho gia đình và xã hội. Nguyên nhân của thalassemia là do đột biến gen
globin làm giảm tổng hợp một hoặc nhiều các tiểu đơn vị globin để tạo
hemoglobin bình thường. Tổ chức Y tế Thế giới đã xác định thalassemia là
vấn đề sức khỏe nghiêm trọng và khuyến cáo các nước Đông Nam Á nên
chọn thalassemia là một trong những ưu tiên về di truyền người.

Vấn đề quản lý bệnh thalassemia bao gồm việc phòng ngừa các trường
hợp bệnh mới, điều trị và quản lý lâu dài bệnh nhân đã có. Tuy nhiên, cải
thiện kết quả điều trị và quản lý lâu dài đòi hỏi rất nhiều nguồn lực. Ngoài ra,
tầm soát toàn bộ quần thể là việc khó khả thi. Vì thế, chương trình kiểm soát
thalassemia thường được tiến hành ở mức độ phòng ngừa cấp hai với trọng
tâm là tầm soát và chẩn đoán trước sinh nhằm phòng ngừa các trường hợp
bệnh mới và giảm tần suất hiện mắc của bệnh. Các quốc gia có tần suất bệnh
thalassemia cao như Síp, Ý, Hy Lạp, Thái Lan, Hồng Kông đã xây dựng các
chương trình phòng chống bệnh rất thành công thông qua việc tầm soát và
chẩn đoán trước sinh. Đến nay, các phương thức tầm soát đơn giản và hiệu
quả chủ yếu dựa trên các chỉ số của xét nghiệm huyết đồ như thể tích trung
bình của hồng cầu (MCV) và Hb trung bình của hồng cầu (MCH). Việc xác
định các loại alen đột biến thalassemia phổ biến trong quần thể cũng giúp cho
công tác chẩn đoán xác định được hiệu quả, nhanh chóng và chính xác.
Do có tỉ lệ thalassemia lưu hành cao, Việt Nam rất cần một chương trình
phòng chống thalassemia. Đến nay, các nghiên cứu về tầm soát và chẩn đoán
trước sinh còn rất ít và quy mô nghiên cứu nhỏ. Một số nghiên cứu đã xác lập


2

được các kỹ thuật dò tìm, phát hiện đột biến gen, bước đầu đã khảo sát một số
đột biến và đặc điểm huyết học và đề nghị sử dụng chỉ số MCV và MCH để
tầm soát thalassemia như khuyến cáo của Tổ chức Y tế Thế giới và một số
quốc gia khác. Tuy nhiên, nhiều câu hỏi về tầm soát, chẩn đoán trước sinh
vẫn chưa được làm rõ như: khả năng sử dụng chỉ số MCV, MCH vào tầm soát
thalassemia đạt hiệu quả ra sao? Tỉ lệ đột biến -thalassemia, -thalassemia là
bao nhiêu, loại nào thường gặp hơn? Đặc điểm kiểu hình của các đột biến
thalassemia phổ biến này ra sao? Nếu triển khai áp dụng vào tầm soát và chẩn
đoán trước sinh -thalassemia và -thalassemia sẽ có hiệu quả như thế nào?

Vì thế chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài ‘Nghiên cứu tầm soát và chẩn đoán
trước sinh bệnh -thalassemia và -thalassemia’.
CÂU HỎI NGHIÊN CỨU
Khả năng tầm soát phát hiện -thalassemia, -thalassemia ở phụ nữ
mang thai và chồng của chỉ số MCV, MCH như thế nào; đặc điểm kiểu hình
huyết học của các đột biến thalassemia ra sao?
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1. Xác định tỉ lệ đột biến thalassemia và tỉ lệ các loại alen đột biến thalassemia và -thalassemia ở phụ nữ mang thai và chồng.
2. Xác định tỉ lệ phát hiện đột biến -thalassemia và -thalassemia và tỉ
lệ dương tính giả của tiêu chuẩn MCV < 80 fL và tiêu chuẩn MCH < 27 pg ở
phụ nữ mang thai và chồng.
3. Xác định kiểu hình huyết học của các kiểu gen -thalassemia, thalassemia, -thalassemia kèm -thalassemia ở phụ nữ mang thai và chồng.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÁC GEN GLOBIN VÀ SINH TỔNG HỢP HEMOGLOBIN
1.1.1. Đặc điểm chung của các gen globin
Các gen globin nằm trong 2 nhóm gen (gene cluster) globin  và globin  (hình 1.1).

tuần

Hình 1.1. Nhóm gen globin α và β và sự tổng hợp globin, hemoglobin ở các giai
đoạn phát triển.
“Nguồn: Nguyen Khac Hoan, 2005” [76]

Đặc điểm chung của các gen globin là có 3 exon mã hóa trình tự chuỗi
protein, 2 intron chứa chuỗi xen không mã hóa và vùng khởi động (promoter)

4

đầu 5’ của gen. Các exon mã hóa cho 141 axít amin của chuỗi giống  và 146
axít amin của chuỗi giống . Các intron dài từ 117 đến 1264 nucleotid. Đặc
biệt, intron 2 ở gen  có vai trò quan trọng trong quá trình gắn đuôi poly(A),
giải phóng mRNA khỏi khuôn mẫu và vận chuyển ra bào tương [104].
1.1.2. Nhóm gen globin α
Nhóm gen globin  dài gần 28 kb, nằm cách 170 – 430 kb đến đầu tận cánh
ngắn nhiễm sắc thể 16 (16pter-p13.3; MIM ID: HBA1,+141880 và HBA2,
+141850). Tính từ thượng nguồn (5’) đến hạ nguồn (3’), nhóm gen globin  bao
gồm: gen , vùng HVR (hypervariation region) , gen  giả, 1 cặp gen  giả, 1 cặp
gen  chức năng, gen  không biểu hiện và cuối cùng là một vùng HVR khác
[104]. Người bình thường có 4 gen  globin (/) và 2 gen  globin (/). Gen
1 và 2 chỉ khác nhau 2 vị trí ở intron 2 và vùng 3’ không mã hóa. Tuy mã hóa
cùng 1 loại protein nhưng gen 2 tổng hợp lượng globin  cao gấp 3 lần gen 1,
nên đột biến (ĐB) gen 2 cho kiểu hình thiếu máu nghiêm trọng hơn [104].
Nằm ở thượng nguồn cách nhóm gen globin  40 kb – 50 kb là vùng
điều khiển nhóm gen chứa các trình tự MCS-R1 đến MCS-R4 tương ứng với
các vị trí rất nhạy với DNAse 1 đặc hiệu hồng cầu là HS-48, HS-40, HS-33 và
HS-10. Trong số này, HS-40 (MCS-R2) nằm cách vị trí mũ chụp mRNA của
gen ζ 40 kb đóng vai trò thiết yếu trong kiểm soát biểu hiện nhóm gen α [90].
1.1.3. Nhóm gen globin β
Nhóm gen globin  nằm trên nhiễm sắc thể 11 (11p15.4; MIM ID: HBB,
+141900) dài gần 50kb, gồm 1 gen  phôi thai, 2 gen  thai, 2 gen  và 
người lớn, 1 gen giả , và sắp xếp theo thứ tự 5’ -  - G - A -  -  -  3’. Kiểu gen của người bình thường là /, /, / và GA/GA [104].


5

Cách gen  khoảng 5 – 25 kb về phía thượng nguồn là LCR (locus
control region) điều hòa nhóm gen . LCR chứa các HS được đánh số từ
5’HS1 đến 5’HS5, chứa các motif gắn các yếu tố hoạt hóa phiên mã giúp điều
khiển mở các domain của nhóm gen  và tăng cường biểu hiện gen [90].
1.1.4. Sinh tổng hợp globin
Ở người, sự tổng hợp các chuỗi globin thay đổi theo các giai đoạn phát
triển, loại chuỗi globin ở giai đoạn sau thay thế cho loại chuỗi globin ở giai
đoạn trước (hình 1.1) [76],[97]. Giai đoạn phôi sớm, túi noãn hoàng sản xuất
chuỗi globin  và  để tạo thành các hemoglobin (Hb) chính của phôi là Hb
Gower 1 (22), Hb Gower 2 (22), Hb Portland 1 (22) và Hb Portland 2
(22). Khi thai khoảng 4 tháng, sự sản xuất globin  bị ngừng lại [104].
Từ tuần thai thứ 6, globin  và  bắt đầu được sản xuất, HbF (22) tăng
trở thành Hb chính. HbA (22) bắt đầu được sản xuất khi thai 28 tuần. Đến
khi sinh, tỉ lệ HbA chiếm khoảng 15% tổng số Hb, HbA2 (22) chiếm tỉ lệ
rất nhỏ, phần lớn còn lại là HbF. Tuy nhiên, chuỗi  và HbF giảm nhanh sau
sinh, thường ổn định khoảng 1 tuổi nhưng đôi khi kéo dài đến 2 tuổi [104].
Ở người lớn bình thường, HbA chiếm đa số với tỉ lệ khoảng 96%, HbA2
có tỉ lệ 2,5% - 3%, HbF ít hơn 1%. Tỉ số HbA2 : HbA ở mức 1:40 [17].
1.2. PHÂN LOẠI BỆNH THALASSEMIA
Thalassemia là một nhóm bệnh do ĐB gen globin làm giảm sản xuất một
hoặc nhiều các tiểu đơn vị globin để tổng hợp các Hb bình thường. Dựa trên
loại globin bị ảnh hưởng mà bệnh được phân thành 2 loại chính là thalassemia và -thalassemia. Ngoài ra còn có các loại thalassemia hiếm như


6

-, -, - và -thalassemia, và hội chứng tồn lưu HbF di truyền (HPFH)
có HbF cao kéo dài suốt đời do bất thường quá trình chuyển đổi từ HbF sang
HbA. [104]. Ở nhiều quần thể, thalassemia cùng tồn tại với các Hb variant tạo

ra kiểu hình bệnh rất đa dạng [8],[45].
1.2.1. Bệnh -thalassemia
Sự giảm tổng hợp globin  là do ĐB ở gen  làm mất chức năng gen
hoặc xóa một đoạn DNA chứa 1 hoặc 2 gen α. Tùy vào số gen bị ảnh hưởng
mà ĐB được phân loại thành α0-thalassemia (ĐB 2 gen, ký hiệu --) hoặc α+thalassemia (ký hiệu -α nếu xóa 1 gen, αTα nếu là ĐB điểm gen α2 hoặc ααT
nếu là ĐB gen α1). Đến nay đã có 128 ĐB gây -thalassemia với hơn 40 ĐB
xóa đoạn. Loại xóa đoạn rất phổ biến và thường phân bố theo địa lý [55].
Trong nhóm các ĐB gây α+-thalassemia (hình 1.2), -3.7 và -4.2 là 2 ĐB
thường gặp nhất [56] hiện diện ở mọi quần thể, đặc biệt tần suất cao 60% 80% ở Saudi Arabia, Ấn Độ, Thái Lan, Papua New Guinea, Melanesia [104].

Hình 1.2. Sơ đồ đột biến xóa đoạn +-thalassemia.
“Nguồn: Harteveld, 2010”[56]

Trong nhóm ĐB gây α0-thalassemia (hình 1.3), có 3 kiểu phổ biến nhất
là --SEA ở vùng Đông Nam Á, --MED và --20.5 ở vùng Địa Trung Hải. Một số


7

ĐB ở vùng điều khiển nhóm gen HS-40 cũng cho kiểu hình như ĐB α0thalassemia [56].

Hình 1.3. Sơ đồ đột biến xóa đoạn 0-thalassemia (a) và xóa đoạn HS-40 (b).
“Nguồn: Harteveld, 2010”[56]

Các loại ĐB điểm thường xảy ra trên gen α2 và gây α+-thalassemia. ĐB
tạo Hb Constant Spring (HbCS - ký hiệu αCSα) khá phổ biến ở vùng Đông
Nam Á với tỉ lệ có thể đến 5%. Đột biến HbCS xảy ra ở codon kết thúc gen
α2, term Codon TAA (stop)  CAA (Glutamine) làm dịch mã kéo dài đến bộ
ba kết thúc mới ở codon 173 tạo chuỗi globin Constant Spring variant dài 172
axít amin. Người dị hợp tử αCSα/αα có HbCS trong máu khoảng 1%, thấp

hơn so với các loại chuỗi globin α variant khác, thường ở mức 25% [35].


8

Trên lâm sàng, bệnh -thalassemia được chia làm 4 mức độ gồm bệnh
Hb Bart’s, bệnh HbH, -thalassemia 1 và -thalassemia 2.
1.2.1.1. Bệnh hemoglobin Bart’s
Bệnh Hb Bart’s xảy ra do xóa mất 4 gen α-globin hay đồng hợp tử 0thalassemia rất phổ biến ở Đông Nam Á và Địa Trung Hải với kiểu gen phổ
biến nhất là --SEA/--SEA và --MED/--MED. Thành phần Hb Bart’s chiếm khoảng
80%. Thai bị bệnh này thường tử vong ở tuần 23 – 38 hoặc sớm sau sinh với
đặc điểm thiếu máu rất nặng, gan lách to, phù toàn thân, suy tim, đôi khi kèm
theo các dị tật bẩm sinh khác, hồng cầu nhược sắc, hình dạng và kích thước
rất thay đổi, nhiều hồng cầu nhân (hình 1.4) [20],[104].
Phụ nữ mang thai bệnh Hb Bart’s có thể bị nhiều biến chứng trong thai
kỳ như: tăng huyết áp (61%), tiền sản giật (30%), xuất huyết bất thường trước
sinh (11%). Các biến chứng khác có thể xảy ra như: suy thận, suy tim tắc
nghẽn, nhau bong non, thiểu ối, sinh khó, sót nhau và băng huyết sau sinh.
Nếu không được quản lý tốt, tỉ lệ tử vong mẹ có thể đến 50%. [17],[68].

Hình 1.4. Đặc điểm hồng cầu và đại thể thai chết lưu của bệnh Hb Bart’s.
“Nguồn: Harteveld, 2010”[56]


9

1.2.1.2. Bệnh hemoglobin H
Bệnh HbH do ĐB 3 gen α (tương tác giữa 0-thalassemia và +thalassemia). Kiểu gen thường gặp ở Đông Nam Á là --SEA/-α3.7 và --SEA/αCSα.
Ở một vài trường hợp đặc biệt hiếm, bệnh HbH do đồng hợp tử ĐB điểm trên
gen α2 (αTα/ αTα) hoặc đồng hợp tử -α3.7II (-α3.7II/-α3.7II) [104]. Biểu hiện lâm

sàng của bệnh HbH cực kỳ đa dạng, thay đổi từ không có triệu chứng đến
thiếu máu nặng phải truyền máu thường xuyên. Đặc điểm của bệnh HbH điển
hình gồm thiếu máu nhược sắc (TMNS) hồng cầu nhỏ, lách to, HbH từ 2 –
40%, Hb Bart’s khoảng 25% giai đoạn sơ sinh và giảm còn một lượng nhỏ khi
trưởng thành. HbA2 có thể bình thường hoặc tăng nhẹ [17],[34].
Năm 1996, Dương Bá Trực và cộng sự đã mô tả một số đặc điểm biểu
hiện kiểu hình của 171 bệnh nhi HbH tại bệnh viện Nhi trung ương (bảng
1.1). Tuy nhiên nghiên cứu này không xác định được kiểu gen [15].
Bảng 1.1. Đặc điểm huyết học trên 171 bệnh nhi HbH tại Việt Nam.
“Nguồn: Dương Bá Trực, 1996” [15]
Thành phần Hb

HbA (n=111) (%)

Giá trị trung bình
85,1 ± 6,4

HbA2 (n=111) (%)

1,4 ± 0,7

HbH (%)

11,6 ± 5,7

Hb Bart’s (n=111) (%)
MCV (n=46) (fL)
MCH (n44) (pg)

78,6 ± 7,8

21,8 ± 3,8

Khoảng phân bố
73 – 97,6
vết
0,3 – 3
1,2 – 24
0
vết
1 – 11,6
56,4 – 83,6
15,8 – 28,5

Tỉ lệ (%)
100
16,2
83,7
100
19,8
36,9
42,3

1.2.1.3. Bệnh -thalassemia 1
Bệnh -thalassemia 1 xảy ra do ĐB 2 gen  in cis (--/) hoặc in trans
(-/-, -/T, T/T). Kiểu gen --SEA/αα, -3.7/-3.7 và -α3.7/αCSα khá phổ
biến ở Đông Nam Á. Người bệnh không có triệu chứng lâm sàng, ngoại trừ


10

một số thay đổi về chỉ số huyết học. Trẻ sơ sinh có Hb Bart’s tăng 5 – 10%.
Người lớn có các chỉ số MCH và MCV giảm, HbA2 và HbF bình thường, tỉ lệ
tổng hợp globin  so với  giảm còn khoảng 0,7 – 0,8 [17]. Năm 1998,
Galanello và cộng sự đã mô tả đặc điểm huyết học trên 526 người lớn mang 1
hoặc 2 alen ĐB -thalassemia (bảng 1.2) [49].
Bảng 1.2. Đặc điểm các thông số huyết học theo kiểu gen α-thalassemia.
“Nguồn: Galanello, 1998” [49]
Kiểu gen

-α3.7/αα
-α3.7/-α3.7
αNα/αα
αHα/αα
-α3.7/αNα
αNα/αNα
--MED/αα
-α3.7/-α4.2
-α4.2/αα
-α20.5/αα
ααN/αα
-α3.7/αHα
αNα/ αHα

Giới
tính

Nam
Nữ
Nam
Nữ

Nam
Nữ
Nam
Nữ
Nam
Nữ
Nam
Nữ
Nam
Nữ
Nam
Nữ
Nam
Nữ
Nam
Nữ
Nữ
Nam
Nữ
Nữ

Cỡ
mẫu
141
110
72
61
40
31
10

10
6
5
2
5
5
2
1
3
1
1
3
1
2
1
2
1

Hb
(g/dL)
14,40,9
12,01,0
13,60,8
11,80,9
14,31,1
12,20,8
14,41,1
12,31,0
13,30,6
12,10,9

12,4-13,2
11,20,7
13,91,3
12,411,1
13,0
10,61,3
14,7
11,3
12,01,3
10,0
12,6-11,0
12,0
11,210,6
11,0

SLHC
(x 1012/L)
5,70,4
4,80,5
5,61,0
5,00,4
5,60,4
4,80,4
5,50,5
4,70,5
6,10,3
4,80,6
5,9-5,9
5,20,3
6,60,6

5,65,5
5,7
4,80,3
5,8
5,0
6,10,5
4,75
4,9-4,2
5,8
5,15,3
5,5

MCV
(fL)

MCH
(pg)

HbA2
(%)

75,44,8

25,42,1

2,50,3

71,33,0

23,82,0

2,40,3

75,72,8

25,51,4

2,50,3

76,63,8

26,11,4

2,50,4

66,11,6

21,60,7

2,50,3

63,72,6

21,61,3

2,50,2

65,03,3

21,01,3

2,40,1

67,23,5

22,51,6

2,30,2

77,5
64,1

25,3
20,4

2,5
2,4

67,80,9

21,01,0

2,30,7

79,0-77,6

25,5-26,2

24-2,5

63,72,9

20,81,0

2,3

59,7

19,9

2,7

1.2.1.4. Bệnh -thalassemia 2
Bệnh -thalassemia 2 hầu như không có triệu chứng với kiểu gen thường
gặp là -3.7/ và CS/. Hb Bart’s có thể tăng nhẹ 1% – 2% ở trẻ sơ sinh.


11

Người lớn bình thường hoặc có chỉ số huyết học ở dạng thalassemia với
HbA2 và HbF ở mức bình thường (bảng 1.2) [26],[49]. Kiểu gen CS/ có
thể có HbCS ở mức 0,1 – 1,5% trên điện di Hb có độ nhạy cao. Tỉ lệ tổng hợp
globin  so với globin  ở hồng cầu lưới ngoại vi khoảng 0,8 – 0,9 [17].
1.2.2. Bệnh -thalassemia
Bệnh β-thalassemia xảy ra do ĐB gen β dẫn đến không tổng hợp chuỗi
globin β (0-thalassemia, ký hiệu 0) hoặc giảm tổng hợp (+-thalassemia, ký
hiệu +) hoặc giảm rất ít (β silent) [96]. Đến nay, hơn 200 ĐB β-thalassemia
đã được mô tả nhưng mỗi quần thể chỉ có một vài ĐB β-thalassemia phổ biến
(bảng 1.3). Trên lâm sàng, -thalassemia được phân thành 3 thể major,
intermedia và minor tùy theo mức độ thiếu máu (bảng 1.4) [21],[96].

Bảng 1.3. Các đột biến -thalassemia phổ biến ở một số quần thể trên thế giới.
“Nguồn: Nguyen Khac Han Hoan, 2005” [76]
Quần thể

Việt Nam

Trung Quốc

Địa Trung Hải

Đột biến
-28 A>G
Codon 17 AAG>TAG
Codon 26 GAG>AAG
Codon 41/42 –TTCT
Codon 71/72 +A
IVS 2-654 C>T
Codon 95 +A
-28 A>G
Codon 17 AAG>TAG
Codon 26 GAG>AAG
Codon 41/42 –TTCT
Codon 71/72 +A
IVS 2-654 C>T
IVS 1-1 G>A
IVS 1-6 T>C
IVS 1-110 G>A
Codon 39 CAG>TAG
IVS 2-745 C>G

Quần thể

Đông Nam Á

Trung Đông

Ấn Độ

Đột biến
-28 A>G
Codon 17 AAG>TAG
Codon 26 GAG>AAG
IVS 1-5 G>C
Codon 41/42 –TTCT
IVS 2-654 C>T
Codon 8 –AA
Codon 8/9 +G
IVS 1-5 G>C
Codon 39 CAG>TAG
Codon 44 –C
IVS 2-1 G>A
Codon 8/9 +G
IVS 1-1 G>T
IVS 1-5 G>C
Codon 41/42 –TTCT
619 bp deletion