Nghiên cứu chuyển gen tạo protein tái tổ hợp HIV 1 p24 vào lục lạp cây cà chua (lycopersicon esculentum mill )

Lu n án ti n s : Sinh h c

M CL C
TRANG PH BÌA
L I CAM OAN
M C L C ...……………………………………………………………………………….1
DANH M C CÁC B NG ................................................................................................... 3
DANH M C CÁC HÌNH..................................................................................................... 4
DANH M C CÁC KÝ T VI T T T ............................................................................... 6
M
U .............................................................................................................................. 8
CH NG 1: T NG QUAN TÀI LI U............................................................................. 11
1.1.
i t ng nghiên c u: cây Cà Chua ......................................................................... 12
1.2. Virus HIV type 1........................................................................................................ 14
1.3. L p th - bào quan s ng trong t bào th c v t ........................................................... 16
1.4. S n xu t protein d c li u t th c v t ....................................................................... 26
1.5. Công ngh chuy n gen l c l p ................................................................................... 29
1.5.1. Nh ng thành t u c a công ngh chuy n gen l c l p ........................................ 29
1.5.2. Nh ng u đi m và khó kh n c a công ngh chuy n gen l c l p ...................... 30
1.5.3. Thi t k m t vector chuy n gen l c l p ............................................................. 32
1.6. Các ph ng pháp chuy n gen vào l c l p ................................................................. 37
1.7. Các ph ng pháp lo i b gen ch n l c ...................................................................... 37
1.8. Nh ng công trình chuy n gen c a HIV vào th c v t .................................................. 40
1.9. Chuy n gen vào l c l p cà chua................................................................................... 42
1.9.1. L c l p cà chua ................................................................................................. 42
1.9.2. So sánh v i b gen l c l p thu c lá ................................................................... 44
1.9.3. Nh ng công trình chuy n gen vào l c l p cà chua thành công ......................... 46
1.9.4. Vector chuy n gen vào l c l p pITB-HIV-1-p24 .............................................. 50
CH NG 2: V T LI U & PH NG PHÁP NGHIÊN C U......................................... 52
2.1. Kh o sát môi tr ng tái sinh ...................................................................................... 54

2.2. Kh o sát tính kháng spectinomycin c a mô lá th t, t di p ...................................... 55
2.3. Tách chi t DNA plasmid ........................................................................................... 56
2.4. Chuy n gen HIV-1-p24 vào l c l p cà chua b ng ph ng pháp b n gen .................. 57
2.5. Tách chi t DNA t ng s t th c v t .......................................................................... 61
2.6. Ph ng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ..................................................... 61
2.7. Southern blot ............................................................................................................. 66
U

U

U

1


Lu n án ti n s : Sinh h c

2.8. Tr ng cây cà chua trong v n m ........................................................................... 73
2.9. Tách chi t protein t ng s .......................................................................................... 74
2.10.
nh l ng protein t ng b ng ph ng pháp Bradford ........................................... 74
2.11. SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel Electrophoresis) ........... 75
2.12. Western blot .............................................................................................................. 78
2.13. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) .................................................... 81
CH NG 3: K T QU VÀ TH O LU N...................................................................... 86
3.1. Xác đ nh t l tái sinh ................................................................................................. 87
3.1.1. Xác đ nh t l tái sinh c a t di p ..................................................................... 87
3.1.2. Xác đ nh t l tái sinh c a lá th t ....................................................................... 90
3.2. K t qu kh o sát nh h ng c a n ng đ kháng sinh................................................ 94
3.2.1. nh h ng c a spectinomycin lên kh n ng tái sinh c a lá th t ...................... 94

3.2.2. nh h ng c a spectinomycin lên kh n ng tái sinh c a t di p ..................... 95
3.3. K t qu b n gen ......................................................................................................... 96
3.3.1. Thí nghi m b n gen và n ng đ spectinomycin ban đ u 50mg/l ..................... 96
3.3.2. Thí nghi m b n gen và ch n l c trên môi tr ng tái sinh tr c ti p................. 100
3.4. Ki u hình cây cà chua chuy n gen l c l p ............................................................... 103
3.5. K t qu phân tích PCR dòng cây cà chua kháng spectinomycin ............................. 108
3.5.1. K t qu phân tích PCR gen aadA ................................................................... 108
3.5.2. K t qu phân tích PCR gen HIV-1-p24 .......................................................... 109
3.6. Xác đ nh gen HIV-1-p24 vào trong b gen l p th cà chua ..................................... 111
3.6.1. K t qu phân tích PCR dòng cà chua chuy n n p gen ................................... 111
3.6.2. K t qu phân tích Southern blot dòng cà chua chuy n n p gen ...................... 113
3.7. Phân tích Western blot ............................................................................................ 117
3.7.1. Hàm l ng protein t ng s trong các m u kh o sát ....................................... 117
3.7.2. Phân tích Western blot nh ng dòng cà chua chuy n n p gen l c l p ............. 119
3.7.3. So sánh Western blot cây thu c lá và cây cà chua chuy n n p gen l c l p ..... 122
3.8. ELISA ..................................................................................................................... 125
CH NG 4: K T LU N VÀ KI N NGH .......................................................................... 132
TÀI LI U THAM KH O ...................................................................................................... 136
PH L C 1 ............................................................................................................................ 155
PH L C 2 ............................................................................................................................ 164

2


Lu n án ti n s : Sinh h c

DANH M C CÁC B NG
B
B
B

B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B

ng 1.1: Nh ng protein d c li u tái t h p đ c t o ra t th c v t .............................. 27
ng 1.2: Nh ng công trình chuy n gen vào l c l p dùng aadA làm gen ch n l c ........... 35
ng 1.3: Nh ng k t qu chuy n gen t o protein HIV-1 vào th c v t ............................... 41
ng 1.4: So sánh b gen l c l p c a thu c lá v i b gen l c l p cà chua ....................... 44
ng 1.5: So sánh đ t ng đ ng c a các gen trong l c l p cà chua, thu c lá................. 45
ng 2.1: Thành ph n cho m t ph n ng PCR 50µl .......................................................... 70
ng 2.2: Thành ph n c a resolving gel và stacking gel ................................................... 77
ng 3.1: K t qu t l tái sinh t di p trên các môi tr ng kh o sát sau 6 tu n .............. 87
ng 3.2: K t qu t l tái sinh lá th t trên các môi tr ng kh o sát sau 6 tu n ............... 92
ng 3.3: Thí nghi m b n gen và n ng đ spectinomycin ch n l c ban đ u 50mg/l......... 97
ng 3.4: K t qu OD c a các n ng đ BSA dùng làm đ ng chu n ............................. 117
ng 3.5: Hàm l ng protein t ng trong các m u kh o sát ............................................ 119
ng 3.6: K t qu OD các n ng đ protein p24 (AG 6054) dùng làm đ ng chu n ...... 125
ng 3.7: N ng đ protein t ng và protein HIV-1-p24 trong m u kh o sát .................... 126
ng 3.8: Ph n tr m n ng đ protein HIV-1-p24 trên protein t ng ................................ 129

3

Lu n án ti n s : Sinh h c

DANH M C CÁC HÌNH
Hình 1.1: C u trúc Virus HIV. ............................................................................................ 15
Hình 1.2: S hi n di n c a protein HIV-1-p24 trong huy t thanh theo th i gian .............. 16
Hình 1.3: S bi t hóa c a l c l p t ti n l p th ................................................................ 18
Hình 1.4: C u t o l c l p.................................................................................................... 20
Hình 1.5: S đ DNA l p th .............................................................................................. 23
Hình 1.6: S đ mRNA c a l p th . .................................................................................... 26
Hình 1.7: S đ c u t o m t vector chuy n gen l c l p ..................................................... 36
Hình 1.8: S đ c u trúc b gen l c l p cà chua. ............................................................... 42
Hình 1.9: Vector mang gen aadA c a Ruf S. et al. 2001 .................................................... 47
Hình 1.10: Vector chuy n gen c a nhóm Wurbs et al. n m 2007....................................... 47
Hình 1.11: Vector chuy n gen c a nhóm Apel và Bock n m 2009 ..................................... 49
Hình 1.12: Vector chuy n gen c a nhóm Zhou F. et al. n m 2008 .................................... 49
Hình 1.13: C u trúc vector pITB-HIV-1-p24 c a tác gi Nguy n Th Thanh .................... 50
Hình 2.1: S đ thí nghi m. ................................................................................................ 57
Hình 2.2: B Hepta adaptor (Bio-Rad, M ). ...................................................................... 57
Hình 2.3: H th ng súng b n gen PDS-1000/He (Bio-Rad, M ). ....................................... 58
Hình 2.4: M u lá chu n b b n gen .................................................................................... 59
Hình 2.5: Ph n ng PCR t o Probe DIG ........................................................................... 66
Hình 2.6: S đ miêu t ph ng pháp Southern blot. ........................................................ 69
Hình 2.7: S đ s n ph m DNA sau khi x lý b ng enzyme BglII...................................... 71
Hình 2.8: Nguyên lý c a Western blot ................................................................................ 78
Hình 2.9: Chuy n protein qua màng b ng Semi-dry blotter............................................... 80
Hình 2.10: Nguyên lý c a ELISA Sandwich ....................................................................... 82
Hình 3.1: K t qu t l tái sinh t di p trên các môi tr ng kh o sát sau 6 tu n............... 88
Hình 3.2: K t qu t l tái sinh lá th t trên các môi tr ng kh o sát sau 6 tu n ............... 93

Hình 3.3: Kh o sát kh n ng tái sinh c a lá th t trên môi tr ng có spectinomycin ........ 94
Hình 3.4: Kh o sát kh n ng tái sinh c a t di p trên môi tr ng có spectinomycin ....... 95
Hình 3.5: a,b,c: Mô s o s ng trên môi tr ng có Spectinomycin ....................................... 99
Hình 3.6: a,b,c: Mô s o chuy n màu xanh khi đ c chuy n ra sáng.................................. 99
Hình 3.7: a,b,c,d,e: Ch i chuy n gen hình thành trên môi tr ng tái sinh....................... 100
Hình 3.8: Quy trình chuy n gen vào l c l p cà chua b ng ph ng pháp b n gen .......... 102

4


Lu n án ti n s : Sinh h c

Hình 3.9: So sánh dòng kháng spectinomycin v i cây đ i ch ng không chuy n gen ...... 103
Hình 3.10: Các dòng cây cà chua chuy n gen in vitro ..................................................... 104
Hình 3.11: Cây cà chua tr ng trong Versatile Environmental Test Chamber 2 tu n ....... 105
Hình 3.12: Các dòng cây cà chua chuy n gen tr ng trong v n m 30 ngày ............... 106
Hình 3.13: Cây cà chua 386 và cà chua chuy n gen ra trái trong v n m .................. 106
Hình 3.14: H t cây cà chua chuy n gen n y m m trên môi tr ng có spectinomycin..... 107
Hình 3.15: K t qu đi n di s n ph m PCR c a gen aadA. ............................................... 109
Hình 3.16: K t qu phân tích PCR gen HIV-1 p24. ......................................................... 110
Hình 3.17: K t qu phân tích PCR b ng c p m i gen l c l p cây cà chua...................... 112
Hình 3.18: PCR probe lai DNA c a gen l c l p psaB. .................................................... 113
Hình 3.19: i n di gel agarose các m u phân tích Southern blot.................................... 114
Hình 3.20: K t qu Southern blot các dòng cà chua chuy n gen ..................................... 116
Hình 3.21: Tái t h p ngay trong b gen l c l p.............................................................. 117
Hình 3.22:
th đ ng chu n BSA ................................................................................ 118
Hình 3.23: SDS-PAGE nh ng dòng cà chua chuy n gen HIV-1-p24 vào l c l p ............ 120
Hình 3.24: Western blot nh ng dòng cà chua chuy n gen HIV-1-p24 vào l c l p .......... 121
Hình 3.25: SDS-PAGE dòng cà chua và thu c lá chuy n gen HIV-1-p24 ....................... 123

Hình 3.26: Western blot cây cà chua và thu c lá chuy n gen HIV-1 p24 ........................ 124
Hình 3.27:
ng chu n protein HIV-1 p24 (AG 6054 Aalto Bio Reagents) .................. 125
Hình 3.28:
th bi u di n hàm l ng protein HIV-1-p24 trong các m u kh o sát….. 127
Hình 3.29:
th bi u di n ph n tr m protein HIV-1-p24 trên protein t ng s ............. 130

5


Lu n án ti n s : Sinh h c

DANH M C CÁC KÝ T

VI T T T

aadA

aminoglycoside 3'-adenylytransferase gene

AIDS

Acquired Immune Deficiency Syndrome

APS

Ammonium persulfate

BA

Benzyl Adenine

bp

Base pairs

BSA

Bovine Serum Albumin

DIG

Digoxigenin

DIG-AP

Digoxigenin-Alkaline Phosphatase

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTPs

deoxyribonucleotide triphosphates

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

ELISA

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

HEPES

4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid

HIV

Human Immunodeficiency Virus

HRP

Horseradish peroxidase

IAA

Indole-3-acetic acid

IR

Inverted Repeat

kDa

Kilo Dalton

6


Lu n án ti n s : Sinh h c

LB

Luria Broth

LSC

Large Single Copy

MS

Murashige and Skoog

NAA

1-Naphthaleneacetic acid

NT

Nghi m th c

PBS

Phosphate Buffer Saline

PBST

Phosphate Buffer Saline Tween 20

PCR

Polymerase Chain Reaction

PMSF

Phenylmethanesulfonyl fluoride

pNPP

p-Nitrophenyl Phosphate

Prrn

ribosomal RNA operon promoter

PVDF

Polyvinylidene difluoride

RNA

Ribonucleic acid

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

SSC

Saline Sodium Citrate

SSC

Small Single Copy

TBS

Tris Buffered Saline

TBST

Tris Buffered Saline Tween 20

UTR

Untranslated region

7

Lu n án ti n s : Sinh h c

M

U

Lu n án “Nghiên c u chuy n gen t o protein tái t h p HIV-1-p24 vào l c l p
cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.)” đ

c th c hi n t i Phòng Công ngh

Gen, Phòng thí nghi m tr ng đi m phía Nam v công ngh t bào th c v t - Vi n Sinh
h c Nhi t đ i, v i s tài tr kinh phí t V n phòng các Ch
Công ngh tr ng đi m c p Nhà n

c, ban ch nhi m Ch

ng trình Khoa h c và

ng trình KC.04/06-10.

Tính c p thi t c a lu n án
H i ngh qu c t v AIDS l n th 19 nhóm h p t i Washington D.C. t ngày
22-27 tháng 7 n m 2012 đ a ra tuyên b chung “Together we will end AIDS”

[71]

v n

cho th y m i quan tâm c a toàn nhân lo i đ i v i đ i d ch HIV/AIDS. T i Vi t Nam,
tính đ n ngày 31 tháng 12 n m 2011,
đã phát hi n có ng

t t c 63 t nh, 98% s huy n và 77% s xã đ u

i nhi m HIV. T ng s các ca tích l y t khi ghi nh n ca nhi m

HIV đ u tiên cho đ n th i đi m này là 249.660 ca, v i 197.335 ng

i nhi m HIV hi n

v n còn s ng và 52.325 ca t vong liên quan đ n AIDS [4].
Cùng đóng góp trong vi c tìm ra ph

ng pháp phòng ch ng b nh HIV/AIDS,

công ngh chuy n gen th c v t đã có nhi u công trình chuy n gen t o ra nhi u dòng
cây mang gen t o protein tái t h p c a HIV (b ng 1.3). N i b t, tìm ra vaccine phòng
ch ng HIV m t trong nh ng h

ng nghiên c u đang đ

c ti n hành và protein HIV-1-

p24 là m t thành ph n không th thi u trong vaccine phòng ch ng HIV. Do v y, h
nghiên c u t o protein tái t h p HIV-1-p24 đ
nhu c u v l

ng protein HIV-1-p24 tinh s ch đ

ng

c quan tâm phát tri n. Bên c nh đó,
ng d ng trong các kit ch n đoán và

t o mi n d ch thu nh n kháng th đ n dòng luôn luôn có.
Lu n án h
con đ

ng đ n vi c t o ra protein tái t h p HIV-1-p24 t th c v t b ng

ng chuy n gen.

8


Lu n án ti n s : Sinh h c

Tuy nhiên, m t trong nh ng r i ro r t đáng lo ng i trong vi c phát tri n th c v t
chuy n gen là s phát tán gen ra ngoài môi tr
Ph

ng qua h t ph n c a cây chuy n gen.

ng pháp chuy n gen vào l c l p gi i quy t tình tr ng phát tán gen do c ch di

truy n theo m . Hay nói cách khác, h t ph n cây chuy n gen l c l p không mang gen
đ

c chuy n n p.
Vì v y, nghiên c u t o protein HIV-1 p24 tái t h p t th c v t b ng ph

ng

pháp chuy n gen vào l c l p đáp ng tính c p thi t c a lu n án.
M c đích c a lu n án
Chuy n gen HIV-1-p24 vào l c l p cây cà chua.
N i dung c a lu n án
1. Xác đ nh t l tái sinh cho lá th t và t di p cây cà chua
n ng đ các ch t đi u hòa sinh tr

các môi tr

ng có

ng th c v t khác nhau. Kh o sát ng

ng c

ch kh n ng tái sinh và gây ch t c a spectinomycin đ i v i lá th t, t di p cà
chua.
2.

xu t qui trình chuy n gen vào l c l p cây cà chua b ng ph

ng pháp b n

gen.
3. Minh ch ng v m t di truy n nh ng dòng cây cà chua chuy n gen l c l p b ng

k thu t sinh h c phân t (PCR, Southern blot) và phân tích bi u hi n gen HIV1- p24 trong cây cà chua chuy n gen l c l p b ng ph

ng pháp Western blot và

ELISA.
Ý ngh a khoa h c và th c ti n c a lu n án
ng d ng thành công k thu t chuy n gen vào l c l p đ t o ra cây cà chua
chuy n gen l c l p đ ng l p th mang gen HIV-1-p24. Vi c xây d ng quy trình chuy n
gen vào l c l p hoàn ch nh, t khâu b n gen đ n ch n l c m u sau b n gen và tái sinh
thành cây hoàn ch nh, m ra h

ng ng d ng k thu t chuy n gen vào l c l p trên
9


Lu n án ti n s : Sinh h c

nh ng đ i t

ng khác c ng nh v i nh ng gen h u d ng khác.

i v i công tác nghiên c u khoa h c, lu n án đóng vai trò góp xây d ng, hoàn
thi n quy trình chuy n gen vào l c l p trong đi u ki n Vi t Nam. V i b n thân, sau khi
th c hi n lu n án, đã n m v ng k thu t chuy n gen b ng ph

ng pháp b n gen, và

đúc k t nhi u kinh nghi m đ th c hi n t t các k thu t phân tích sinh h c phân t ,
sinh hóa nh PCR, Southern blot, Western blot, ELISA.
Tính m i c a lu n án

ây là công trình nghiên c u chuy n gen HIV-1-p24 vào l c l p cây cà chua
đ u tiên t i Vi t Nam.
Bên c nh vi c dùng lá th t nh các nghiên c u chuy n gen vào l c l p cà chua
c a các tác gi n

c ngoài, lu n án đã nh n đ

c dòng cà chua chuy n gen khi dùng t

di p làm m u chuy n gen.
C u trúc c a lu n án
Lu n án đ
li u 40 trang; ch

c chia thành các ph n: m đ u 3 trang; ch
ng 2: V t li u và ph

qu và th o lu n 45 trang; ch

ng 1: T ng quan tài

ng pháp nghiên c u 33 trang; ch

ng 3: K t

ng 4: K t lu n và ki n ngh 3 trang; tài li u tham kh o

20 trang; ph l c 10 trang.
Lu n án có 15 b ng s li u; 52 hình bao g m s đ , đ th , hình nh; 189 tài li u
tham kh o b ng hai th ti ng Vi t và Anh.

Có 6 công trình nghiên c u liên quan đ n lu n án đ
và h i ngh chuyên ngành trong n

c.

10

c đ ng trong các t p chí


Lu n án ti n s : Sinh h c

CH

NG 1: T

NG QUAN TÀI LI U

11


Lu n án ti n s : Sinh h c

1.1.

it

ng nghiên c u: cây Cà Chua

1.1.1. Ngu n g c và phân lo i

Cà chua thu c h cà (Solanaceae), chi Lycopersicon. Chi này g m 12 loài, có 2
chi ph : chi ph Eriopericon (qu luôn có màu xanh, có s c tía, có lông, h t nh ) và
chi ph Eulycopersicon (qu chín đ ho c vàng, hoa to). Chi ph th hai có 2 loài:
Lycopersicon esculentum - cà chua thông th

ng và Lycopersicon pimpinellifolium - cà

chua bán hoang d i, cà chua nho. Loài cà chua Lycopersicon esculentum Mill. là loài
l n nh t, các bi n ch ng và gi ng c a loài này có kh n ng thích nghi r ng nên chúng
đ

c tr ng r ng rãi

nhi u n i trên th gi i.

Cà chua có ngu n g c

vùng trung và nam Châu M . Mêhicô là đ t n

tiên tr ng loài cây này. T Châu M , cà chua đ
Ban Nha chuy n sang tr ng

c các th

ng gia B

ào Nha và Tây

Châu Âu và Châu Á. Sau đó, t Châu Âu, nó đ

chuy n sang Châu Phi nh nh ng ng

i th c dân đi khai phá l c đ a. Tr

ta cho r ng cà chua là cây có ch t đ c b i vì nó cùng h v i cây cà đ c d
có màu s c qu đ p nên nó đ

đ

c kia, ng

c
i

c, nh ng do

c tr ng nh cây c nh.

Mãi đ n n m 1750, cà chua m i đ
th XVIII, cà chua b t đ u đ

cđ u

c tr ng

c dùng làm th c ph m
các n

Anh. Cu i th k

c thu c Liên Xô c .

c nh p vào t nh ng n m 1860 và cùng th i gian này cà chua c ng đ
Pháp. M t s nhà nghiên c u cho r ng cà chua đ

M , cà chua
c phát tri n

c du nh p vào Vi t Nam t th i

gian th c dân Pháp chi m đóng [1,2].
1.1.2.

ng d ng
Cà chua đ

c dùng nh rau cung c p vitamin, ch t khoáng và có nhi u tác d ng

v m t y h c nh có v ng t, tính mát, t o n ng l

ng, ti p ch t khoáng, t ng s c s ng,

làm cân b ng t bào, khai v , gi i nhi t, ch ng ho i huy t, b huy t, kháng khu n,
ch ng đ c, ki m hoá máu có d acid, l i ti u, hoà tan và th i urê, đi u hoà bài ti t,

12


Lu n án ti n s : Sinh h c

giúp tiêu hóa d các lo i b t và tinh b t. N

c ép cà chua kích thích gan, gi d dày và

ru t trong đi u ki n t t. Cà chua làm gi m nguy c b nh tim m ch. Ngoài ra, lycopene,
ch t ch ng oxy hoá t nhiên liên quan t i vitamin A, ch t có kh ng n ng a s hình
thành các g c t do gây ung th , đã đ

c ch ng minh là có kh n ng ng n ng a b nh

ung th tuy n ti n li t. Cà chua có màu s c càng đ thì càng ch a nhi u lycopene [1,2].
1.1.3. Gi ng cà chua 386
Gi ng cà chua 386 là gi ng cà chua F1 TG105 CTS386 (tên g i khác là F1
Hybrid Tomato TG105 CTS-386) có xu t x t Thái Lan đ

c nh p kh u b i công ty

TNHH-TM Trang Nông.
Gi ng cà chua 386 phát tri n vô h n, chi u cao cây trung bình 1,2-1,3m, tr ng
l

ng trái trung bình 90-100g. Gi ng cà chua này tr ng quanh n m trên c n

cv i

hai th i v chính và ph . T i mi n nam, th i v chính tr ng tháng 11 và 12, th i v
ph tr ng

các tháng 3,4,5,6,7,8,9.

1.1.4. Cây cà chua và chuy n gen l c l p
Công ngh chuy n gen l c l p thành công v i đ i t
protein tái t h p đã đ

ng cây thu c lá. Nhi u

c t o ra t cây thu c lá. Tuy nhiên, đ s d ng nh ng protein

này, c n ph i có quy trình tách chi t, tinh s ch, lo i b nicotine
trình ph c t p. Trong xu h

ng mong mu n t o vaccine n đ

[56]

.

ây là m t quá

c, các nhà khoa h c

trên th gi i mu n chuy n gen vào l c l p cây cà chua, m t cây cùng h v i cây thu c
lá. Khi nh ng trái cà chua mang protein tái t h p, chúng có th đ

c dùng nh m t

lo i vaccine n. Vaccine lo i này s không c n b o qu n l nh, không c n kim tiêm,
không c n ph i qua quá trình tách chi t tinh s ch, đ

c vách t bào th c b o v , gây

mi n d ch khi đ n thành ru t và phù h p áp d ng cho các n

c nghèo [35,131].

Chuy n gen t o protein tái t h p vào l c l p cây cà chua đ mong mu n có
đ

c hàm l

ng protein tái t h p cao h n trong cây cà chua chuy n vào gen nhân.

13


Lu n án ti n s : Sinh h c

1.2.

Virus HIV type 1
Virus HIV (human immunodeficiency virus) có đ c đi m chung c a h

Retroviridae. Virus hoàn ch nh có c u trúc g m 3 l p: l p v ngoài, l p v trong và
ph n lõi [49,176] (hình 1.1).
1.2.1. L p v ngoài (v peplon)
L p này là m t màng lipid kép có kháng nguyên chéo v i màng nguyên sinh ch t
t bào. G n lên màng này là các phân t Glycoprotein có tr ng l

ng phân t 160 kDa

(gp160). L p v này g m có 2 ph n:
-

Glycoprotein màng ngoài có tr ng l

ng phân t là 120 kDa (gp120). GP120

là kháng nguyên d bi n đ i nh t, gây khó kh n cho ph n ng b o v c th
và ch t o vaccine phòng b nh.
-

Glycoprotein xuyên màng có tr ng l

ng phân t 41 kDa (gp41).

1.2.2. V trong (v capsid) v này g m 2 l p protein:
-

L p ngoài hình c u, c u t o b i các protein có tr ng l

ng phân t 17 kDa

(p17).
-

L p trong hình tr , c u t o b i các protein có tr ng l

ng phân t là 24 kDa

(p24). ây là kháng nguyên r t quan tr ng đ ch n đoán nhi m HIV/AIDS.

1.2.3. Lõi
Là nh ng thành ph n bên trong c a v capsid, bao g m hai phân t ARN đ n,
là b gen di truy n c a virus HIV. B gen c a HIV ch a 3 gen c u trúc: Gag (group
specific antigen) là các gen mã hoá cho các kháng nguyên đ c hi u l p v capsid c a
virus; Pol (polymerase) mã hoá cho các Enzyme: reverve transcriptase (RT: Enzyme
sao mã ng

c), protease và endonuclease (còn g i kháng nguyên integrase); và EnV

(envelop) mã hoá cho glycoprotein l p v peplon c a HIV.

14


Lu n án ti n s : Sinh h c

Hình 1.1: C u trúc Virus HIV.

1.2.4. Protein HIV-1-p24
Kháng nguyên HIV-1-p24 xu t hi n s m, m t th i gian ng n sau khi nhi m
HIV và duy trì trong su t th i gian c p (s m) c a nhi m HIV. Sau đó kháng nguyên
p24 gi m d n đ ng th i có s xu t hi n kháng th p24.

i u này báo hi u giai đo n

không tri u ch ng c a b nh nhân nhi m HIV. Vài tháng t i vài n m sau nhi m HIV,

15

Lu n án ti n s : Sinh h c

kháng th p24 m t đi và kháng nguyên p24 tái xu t hi n, báo hi u giai đo n tri u
ch ng c a b nh. S gia t ng c a HIV t

ng ng v i s gia t ng s l

ng c a kháng

nguyên p24 (hình 1.2). Do v y, xét nghi m tìm kháng nguyên HIV-1-p24 đ làm c s
d ng phác đ đi u tr phù h p cho t ng giai đo n c a các b nh nhân nhi m HIV.

Hình 1.2: S hi n di n c a protein HIV-1-p24 trong huy t thanh theo th i gian
Hi n nay, protein HIV-1-p24 đ
khu n E.coli

[47,60,61,116,192]

tr thành s n ph m th

c s n xu t và tinh s ch t quá trình nuôi c y vi

ho c n m men

[19,70]

. Protein HIV-1-p24 sau khi tinh s ch

ng m i (ví d : Protein tái t h p HIV-1-p24, mã s AG 6054,

công ty Aalto) dùng trong các nghiên c u khoa h c và ch n đoán.

áp ng nhu c u

c n ch n đoán HIV s m, nhanh, chính xác, r t nhi u công ty trên th gi i s n xu t kit
th

ng m i ch n đoán HIV b ng ph

ng pháp Elisa (ví d : Kit Genscreen Plus HIV

Ag-Ab, Bio-Rad). Bên c nh đó, protein HIV-1-p24 dùng đ gây mi n d ch t o kháng
th HIV-1-p24 đ n dòng. ây là lo i kháng th đ n dòng không th thi u trong các kit
Elisa ch n đoán b nh HIV.
1.3.

L p th - bào quan s ng trong t bào th c v t

1.3.1. T ng quát v l p th

16


Lu n án ti n s : Sinh h c

L p th là nhóm bào quan c a t bào th c v t có ngu n g c t quá trình n i
c ng sinh c a vi khu n lam cyanobacterium [140,183]. T t c các l p th c a th c v t đ u
xu t phát t ti n l p th có trong các t bào mô phân sinh c a r và ch i c ng nh
trong t bào phôi non và các t bào non đang phân chia. Ti n l p th c ng hi n di n
trong các t bào th c v t và mô s o nuôi c y in vitro. Ti n l p th có kích th

c nh ,

chi u dài kho ng 1–2 µm và có ít ho c không có s c t khi quan sát b ng kính hi n vi
hu nh quang

. Ti n l p th c ng có l p màng kép đ c tr ng, bên trong ch a m t

[90]

ph n nh h th ng màng thylakoid và h ribosome riêng. Tùy vào đi u ki n môi
tr

ng và lo i mô t bào mà ti n l p th bi t hoá thành các lo i l p th khác nhau. L c

l p là lo i l p th quan tr ng đ

c bi t hóa d

i tác đ ng c a ánh sáng. C u trúc c a

l c l p g m h th ng màng thylakoid. Trên màng thylakoid có ch a nh ng ph c h p
protein mang nh ng phân t chlorophyll có vai trò thu nh n ánh sáng và chuy n hóa
n ng l

ng

. Ti n l p th còn đ

[108]

c bi t hóa thành vô s c l p (leucoplast) g m b t

l p (amyloplast), elaioplast, proteinoplast. B t l p là n i l u tr tinh b t trong m t th i
gian dài và là lo i l p th đ

c tìm th y trong các n i nh c a h t, c và các mô d tr

liên k t v i r . Tinh b t ch a trong các h t và c ho c đ
đ

c t ng h p tr c ti p ho c

c chuy n t các c quan quang h p vào các mô d tr . Elaioplast là m t lo i l p

th ít g p, ít ph bi n có ch a lipid bên trong stroma, có nhi u
trong th c v t. Tuy nhiên, trong m t vài tr
elaioplast t ng lên đáng k

mô c n d tr lipid

ng h p c n tích tr ch t béo, s l

. S c l p (chromoplast) đ

[137]

c tìm th y

ng

cánh hoa, th t

qu và trong nhi u mô có s c t c a hoa. S c l p phát tri n t l c l p và c ch này
đ

c quan sát trong su t quá trình chín trái. D dàng nh n th y nh t

xanh ch a l p th s chuy n thành s c l p khi chín đ

17

[107,182]

.

cà chua, trái còn


Lu n án ti n s : Sinh h c

Hình 1.3: S bi t hóa c a l c l p t ti n l p th

Ánh sáng kích thích s hình thành l c l p, tuy nhiên trong h t đang n y m m
hay nh ng cây phát tri n

đi u ki n thi u sáng, l c l p không đ

và hình thành m t lo i l p th khác, đó là etioplast
l

ng nh màng thylakoid và tinh b t.

[138]

c phát tri n đ y đ

(hình 1.3). Etioplast ch a m t

c tr ng chính trong c u trúc c a etioplast là

m ng tinh th g i là th prolamellar. Trong th c v t h t kín, quá trình t ng h p
chlorophyll đòi bu c có ánh sáng, đ c bi t trong giai đo n cu i. N u không có ánh
sáng,

enzyme

protochlorophyllide

reductase

protochlorophyllide thành chlorophyllide.

ây là b

(POR)

không

th

chuy n

c áp chót c a quá trình t ng h p

chlorophyll.
Th prolamellar là ph c h p gi a m t l
và lipid. Khi đ

c chi u sáng, ph n

ng l n enzym POR v i c ch t c a nó

ng xúc tác b i enzyme POR x y ra và th

prolamellar b phá v , lúc này etioplast tr thành l c l p. Vai trò c a etioplast trong t
nhiên là th y u khi th c v t phát tri n d

i ánh sáng. Tuy nhiên, m t lúc nào đó cây

18


Lu n án ti n s : Sinh h c

1.3.2. L c l p
Ph n l n ti n l p th trong các mô th c v t trên c n chuy n hóa thành l c l p
mang s c t chlorophyll màu xanh. L c l p hi n di n đ c tr ng

trong t bào lá, tuy

nhiên, l c l p c ng hi n di n trong các mô nh : thân cây, cu ng lá, qu , cánh hoa non,
lá đài, tua cu n và nhi u b ph n khác c a th c v t.
1.3.2.1 C u t o, hình thái
Trong h u h t các loài th c v t, m i t bào th t lá ch a kho ng t 50 đ n 200
l c l p, ph thu c vào kích th

c t bào lá và t bào l c l p. Vì t bào th t lá ch a

không bào l n nên các t bào l c l p ch x p thành m t l p và b đ y sát vách t bào.
L c l p không nh ng khác nhau v kích th
th c v t khác nhau mà còn khác v kích th
l p trong t bào bi u bì lá có kích th
th t lá nh ng v n đ

c khi

c khi hi n di n trong nh ng loài
trong các mô khác nhau. Ví d l c

c nh và kém phát tri n h n l c l p trong t bào

c coi là m t l c l p đúng ngh a.

M c dù kích th

c l c l p khác nhau gi a các loài và các mô nh ng nhìn chung,

l c l p dài kho ng t 5 đ n 10μm và r ng t 2 đ n 5μm, nên có th

c tính di n tích

l c l p kho ng 50μm2. Nhìn chung, c u t o l c l p g m l p màng kép, h th ng màng
thylakoid, d ch l ng (stroma) bên trong l p màng l c l p bao quanh các màng
thylakoid là n i ch a nhi u enzyme và ph c h p protein, ph c h p c a phân t DNA
v i màng trong l c l p, ribosome l c l p, các h t tinh b t và các th lipid g i là
plastoglobuli [140].

19


Lu n án ti n s : Sinh h c

1. Màng ngoài; 2. Kho ng gi a hai màng; 3. Màng trong; 4. Stroma (d ch l ng);
5. Thylakoid lumen; 6. Màng thylakoid; 7. Granum; 8. Thylakoid (lamella);
9. Tinh b t; 10. Ribosome; 11. DNA; 12 Plastoglobule (các gi t ch t béo).

Hình 1.4: C u t o l c l p

1.3.2.2. Ch c n ng l c l p
C u trúc c a l c l p g m h th ng màng thylakoid bên trong đã làm gia t ng
hi u qu quang h p. Trên màng thylakoid có ch a nh ng ph c h p protein mang
nh ng phân t chlorophyll có vai trò thu nh n ánh sáng và chuy n hóa n ng l

ng.

Ngoài ra, l c l p còn đóng vai trò trong các chuy n hóa khác c a th c v t [108,140,145].
Màng đôi thylakoid s p x p thành m t c u trúc ch ng lên nhau g i là grana.
Vùng màng thylakoid không ch ng lên nh ng là k t n i các grana v i nhau g i là
lamallae. Bên trong l p màng đôi là thylakoid lumen. Chính lumen này có vai trò quan

tr ng trong quang t ng h p, đ c bi t là giúp cho s trao đ i proton qua màng thylakoid
đ t o thành ATP.

20


Lu n án ti n s : Sinh h c

c tính l c l p ch a kho ng 105 ribosome đ giúp d ch mã các phân t mRNA
đ

c phiên mã t DNA l c l p. Trong nhi u loài th c v t, các h t tinh b t, s n ph m

c a quang t ng h p, đ

c gi l i trong l c l p cho đ n cu i ngày. Su t th i gian ban

đêm, các h t tinh b t đ

c phá v và chuy n ra t bào ch t. Ng

c l i, m t s th c v t

không tích t tinh b t trong l c l p mà chuy n carbon t ng h p đ

c ngay trong pha

sang.
Ngoài vai trò quan tr ng trong con đ

đ nh CO2 và bi n d

ng

đ nh nitrogen và t ng h p amino

carbon[12,124,173], l c l p còn là n i c
acid[12,25,95,173,180], c đ nh và bi n d

ng c

ng sulphur [17,18,128,150,151].

1.3.3. S phiên mã và d ch mã trong l p th
1.3.3.1. Nucleoid l p th
DNA trong l p th t n t i

d ng ph c h p protein-DNA đ

l p th hay nhân l p th (plastid nucleus). S l
ph thu c t ng loài nh ng th
mì tr

c g i là nucleoid

ng genome trong m i nucleoid l p th

ng ch a nhi u h n 10 genome. Ví d trong l c l p lúa

ng thành có 10-30 nucleoid và 70-80 genome trên m i nucleoid. T bào l c l p

thu c lá có 8-40 nucleoid và m i nucleoid có 10 genome. S l

ng nucleoid khác nhau

trong t ng lo i t bào l p th và trong t ng giai đo n phát tri n c a l p th . Có m t
đi u khác bi t là trong ti n l p th luôn ch có 1 nucleoid và l p th th
nucleoid liên k t v i màng trong c a l p th

ng có m t vài

[140]

.

Ti n l p th ch a kho ng 20 genome nh ng t bào l c l p tr
ho c h n 100 genome và trong th i k l p th phân chia, s l

ng thành có 100

ng này t ng lên g p 10

l n. Nh v y, trong t bào th t lá có ch a 100 l c l p đ ng ngh a v i vi c có 10.000
genome l c l p trong t bào th t lá. S l
trong l c l p vì nhi u protein đ

ng genome trong các l p th khác ít h n

c mã hóa trong gen l c l p là nh ng protein tham gia

vào quang t ng h p.

21


Lu n án ti n s : Sinh h c

1.3.3.2. C u trúc genome l p th
N m 1986, l p th đ u tiên đ
T đó, l p th c a nhi u loài đã đ

c gi i trình t là DNA l p th c a thu c lá

.

c gi i trình t . Hi n nay đã gi i trình t l p th c a

kho ng 122 loài. Trình t b gen l p th c a nh ng th c v t trên c n t
tính b o t n, nh ng

[157]

ng t nhau, có

t o l i cho th y s khác bi t l n trong s s p x p b gen và kh

n ng mã hóa. M t vài đ c tính c a b gen l p th

th c v t b c cao đã đ

c hi u rõ.

T l adenine và thymidine (A và T) cao h n so v i cytidine và guanidine (C và
G). Kho ng 60%-70% base trong b gen là A và T, và trong nh ng vùng không mã
hóa t l có th đ t t i 80% [67]. Trong vùng mã hóa, có khuynh h
T t i v trí th ba s đ

ng b ba có A ho c

c dùng khi mà có nhi u b ba khác nhau nh ng cùng mã hóa

m t lo i amino acid [72].
DNA l p th g m vùng l n (Lager Single Copy), vùng nh (Small Single Copy)
và hai đo n trình t l p l i nh ng ng

c chi u nhau (Inverted Repeat sequence). Hai

đo n này phân đ nh ra vùng trình t l n và nh (hình 1.5).
Do đó, nh ng gen n m trên trình t l p l i có s l
gen khác ch là m t. Kích th

c c a đo n l p l i

ng g p đôi trong khi nh ng

nh ng loài khác nhau thì khác nhau.

Trong m t vài loài th c v t b c cao nh các cây thu c h đ u và m t vài loài t o
không có đo n trình t l p l i [178].
S l

ng gen trong b gen l p th kho ng 100-200 gen [55,177]. Trong b gen l p

th c a nh ng loài nh t o, th c v t b c th p ch a m t s gen mà trong th c v t b c
cao, chúng hi n di n trong nhân t bào. Do v y, b gen l p th c a nh ng th c v t b c
cao ch đáp ng m t ph n nh protein trong l p th , còn l i 95% protein trong l p th
đ

c mã hóa b i gen nhân r i chuy n vào l p th .

22


Lu n án ti n s : Sinh h c

Hình 1.5: S đ DNA l p th

Gen trong b gen l p th chia thành ba nhóm chính: gen mã hóa protein tham
gia quá trình quang t ng h p, gen mã hóa protein h th ng di truy n bên trong l p th
và nhóm th ba không đ ng nh t g m nhi u lo i gen khác nhau, m t s còn ch a rõ
ch c n ng. Kho ng 46 gen mã hóa protein quang t ng h p. Tuy nhiên, đây ch là m t
ph n các protein tham gia trong quang h p, ph n còn l i đ

c mã hóa trong nhân.

1.3.3.3. Phiên mã
Trong l p th có ba lo i RNA polymerase [8,22,62,125].
M t RNA polymerase tham gia phiên mã b gen l p th đ

c mã hóa chính b i

b gen l p th nên có tên g i là PEP (plastid-encoded polymerase). RNA polymerase
này đ

c hình thành t 4 c u t mã hóa b i 4 gen trong l p th là RpoA, PpoB, RpoC1

23


Lu n án ti n s : Sinh h c

PEP b t đ u phiên mã b ng vi c nh n bi t trình t b o t n -35 và -10. Nh ng
nhân t c n thi t cho s nh n bi t này l i là ti u đ n v sigma. Ti u đ n v này đ
mã hóa trong nhân

c

[109,113,174,192]

. Nhân t sigma làm t ng thêm tính ph c t p và ki m

soát ho t tính c a PEP. Do v y, có th nói, nhân đóng vai trò đi u khi n ho t tính c a
PEP trong l p th . M t đ c tính quan tr ng là s bi u hi n gen c a nhân t sigma đ

c

đi u hòa b i ánh sáng. Tóm l i, c ch ki m soát ho t đ ng c a PEP trong l p th là
tác đ ng c a ánh sáng lên s bi u hi n gen nhân t sigma.
Quá trình phiên mã b gen l p th v n di n ra khi ribosome l p th thi u h t hay
khi PEP b b t ho t đã cho th y có m t lo i RNA polymerase th hai ho t đ ng trong

l p th

. RNA polymerase này là m t phân t đ n c u t , t

ng đ ng v i

[8,15,162]

polymerase c a bacteriophage và ti th n m men.

ây là RNA polymerase đ

c mã

hóa trong nhân có tên g i là NEP (nuclear-encoded polymerase). Có đ n 3 gen nhân
mã hóa cho NEP. M t NEP chuyên bi t cho l p th , m t NEP chuyên bi t cho ti th và
cái còn l i phù h p v i c hai bào quan. Vì v y, l p th ch a 2 lo i NEP.
Ho t đ ng c a PEP và NEP trong quá trình phát tri n t ti n l p th thành l c
l p có s phân c p theo th t rõ ràng.

u tiên NEP đ

c bi u hi n trong nhân và

chuy n vào trong ti n l p th . T i đây, nó phiên mã nh ng gen h th ng trong b gen
l p th , bao g m 4 gen mã hóa cho ph c h p PEP. M t PEP protein đã đ
thành trong l p th và tác nhân sigma đ

c đ a vào l p th . PEP đ

c hình

c kích ho t và

phiên mã nh ng gen thu c nhóm quang t ng h p trên b gen l c l p. Ngoài ra, NEP
v n có ho t tính trong l c l p tr

ng thành và m t vài gen đ

c phiên mã nh c hai

enzyme NEP và PEP. Trong l p th không có màu xanh, nh l p th c a r , NEP có
ch c n ng chính vì PEP c n ph i có tác nhân sigma m i ho t đ ng đ

24

c.


Lu n án ti n s : Sinh h c

M t khi PEP đ

c kích ho t và phiên mã b gen l p th , s t o ra s n ph m là

glutamyl-tRNA. Chính ch t này g n v i NEP có trong l p th đ làm gi m ho t tính
c a NEP. Nh v y, PEP tr thành polymerase chính y u trong l p th c a nh ng th c
v t s ng trong đi u ki n chi u sáng. V i quan đi m này, PEP ngày càng hi n di n
nhi u trong l c l p cây tr

ng thành.

1.3.3.4. Ribosome l p th và s d ch mã
Ribosome l p th có r t nhi u trong stroma l p th , đ c bi t trong l c l p đang
giai đo n phát tri n c a t bào th t lá.
M c dù ph n l n ribosome

c tính m i l c l p ch a kho ng 105 ribosome.

trong stroma, v n có m t s ribosome liên k t v i b m t

màng thylakoid.
Khác v i ribosome c a nhân là 80S, ribosome l p th có nh ng tính ch t và kích
th

ct

ng t v i ribosome c a vi khu n. Ribosome 70S c a l p th là s k t h p c a

hai ti u đ n v l n 50S và nh 30S. Ti u đ n v 50S có 33 protein, trong đó 8 protein
đ

c mã hóa trong l p th , s còn l i mã hóa trong nhân. Ti u đ n v 30S có 25

protein, 12 protein đ

[39,65,190]

. M t vài protein trong c hai ti u

c mã hóa trong l p th

đ n v chuyên bi t cho l p th vì không gi ng nh protein trong ribosome c a vi
khu n. Nh ng protein này đ

c mã hóa trong nhân và có tên g i là PSRP (plastid-

specific ribosomal protein). Trong 30S ribosome có 4 phân t PSRP và 50S ribosome
có 2 phân t PSRP [115].
C u trúc ribosome g m b n phân t RNA đ
n m trên vùng IR. Vì th chúng t ng g p đôi s l

c mã hóa trong b gen l p th ,

ng trong t bào l p th . Trong b n

phân t này, ba phân t là thành ph n c a 50S và m t phân t là thành ph n c a 30S.
M t mRNA cho quá trình d ch mã có nh ng y u t chuyên bi t (hình 1.6):
-

Vùng 5’ không d ch mã (5’UTR) v i c u trúc vòng l p.

-

M t trình t kh i đ u d ch mã, th

ng là AUG.

25