Nghiên cứu chuyển nạp gen HIV 1 p24 tạo protein kháng nguyên vào lục lạp cây thuốc lá (nicotiana tabacum l ) bằng phương pháp bắn gen

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phan Tường Lộc

NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN HIV-1 p24 TẠO PROTEIN
KHÁNG NGUYÊN VÀO LỤC LẠP CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana
tabacum L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP BẮN GEN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2013


ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phan Tường Lộc

NGHIÊN CỨU CHUYỂN NẠP GEN HIV-1 p24 TẠO PROTEIN
KHÁNG NGUYÊN VÀO LỤC LẠP CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana
tabacum L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP BẮN GEN

Chuyên ngành: Hóa Sinh học
Mã số chuyên ngành: 62 42 30 15

Phản biện 1: PGS.TS. Trần Văn Minh
Phản biện 2: PGS.TS. Bùi Văn Lệ
Phản biện 3: TS. Vương Đình Tuấn
Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Phạm Xuân Hội
Phản biện độc lập 2: PGS.TS. Chu Hoàng Hà

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. TS. Nguyễn Thị Thanh
2. TS. Nguyễn Hữu Hổ

Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2013


TRÂN TRỌNG CẢM ƠN

- TS. Nguyễn Thị Thanh và TS. Nguyễn Hữu Hổ đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
- Chương trình KHCN Trọng điểm cấp Nhà nước, đề tài KC.04.10/06 -10 (do TS.
Nguyễn Thị Thanh làm chủ nhiệm) đã hỗ trợ kinh phí thực hiện.
- Quý Thầy, Cô trong các Hội đồng báo cáo chuyên đề và phản biện đã đóng góp
những ý kiến quý báu giúp tôi hoàn chỉnh luận văn.
- Quý Thầy, Cô Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Ban Lãnh đạo Viện Sinh học
Nhiệt đới, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm, Phòng Công nghệ Gen đã tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
- Các Anh, Chị đồng nghiệp Phòng Công nghệ Gen và các Bộ phận khác đã hỗ trợ
tôi trong các thực nghiệm và thu thập tư liệu.
- Gia đình và các Bạn đã là chỗ dựa giúp tôi vượt qua những khó khăn trong
công việc.


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện, dưới sự
hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Thanh và TS. Nguyễn Hữu Hổ, tại phòng Công nghệ
Gen, Phòng Thí nghiệm Trọng điểm phía Nam về Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện

Sinh học Nhiệt đới. Các kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố bởi
bất kỳ tác giả nào khác.

Phan Tường Lộc


MỤC LỤC
Trang

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU - CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH ẢNH
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU - SƠ ĐỒ
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................. 1
1.1. Mục đích nghiên cứu ....................................................................................... 2
1.2. Nội dung và phạm vi của vấn đề nghiên cứu................................................... 3
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ......................................................................... 3
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN ..................................................................................... 4
2.1. HIV - AIDS và các vấn đề liên quan đến phòng trị bệnh ................................ 5
2.2. Lạp thể (plastid) ở thực vật ............................................................................ 12
2.3. Biến nạp gen lạp thể ...................................................................................... 21
2.4. Cây thuốc lá và những ứng dụng trong biểu hiện gen lục lạp ....................... 34
2.5. Các công trình biểu hiện protein HIV-1 p24 ở cây thuốc lá .......................... 39
2.6. Triển vọng phát triển ra thị trường của các protein tái tổ hợp
dược liệu có nguồn gốc thực vật .................................................................... 46
CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP................................................... 48
3.1. SƠ ĐỒ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM ................................................................. 49
3.2. VẬT LIỆU .................................................................................................... 50
3.2.1. Cây thuốc lá ................................................................................................ 50
3.2.2. Vector chuyển gen ...................................................................................... 50

3.2.3. Môi trường nuôi cấy mô thực vật và vi khuẩn ........................................... 51
3.3. PHƯƠNG PHÁP .......................................................................................... 52
3.3.1. Xây dựng hệ thống tái sinh từ mô lá thuốc lá in vitro ................................ 52
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh chọn lọc streptomycin và
spectinomycin đối với sự tái sinh chồi từ mô lá và sự phát triển


cây trong điều kiện in vitro ........................................................................ 52
3.3.3. Phương pháp chuyển gen vào lục lạp thuốc lá ........................................... 53
3.3.4. Chọn lọc thể chuyển gen ............................................................................ 55
3.3.5. Điện di DNA ............................................................................................... 56
3.3.6. Phân tích Polymerase Chain Reaction (PCR)............................................. 57
3.3.7. Phân tích Southern blot ............................................................................... 58
3.3.8. Phương pháp trồng cây thuốc lá in vitro ra vườn ươm ............................... 62
3.3.9. Phân tích Western blot ................................................................................ 63
3.3.10. Phân tích enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ........................ 67
3.3.11. Thống kê ................................................................................................... 70
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................ 71
4.1. Xây dựng hệ thống tái sinh từ mảnh lá thuốc lá giống V2 ............................ 72
4.2. Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh chọn lọc streptomycin và
spectinomycin lên sự tái sinh của mảnh lá và phát triển cây con
từ đoạn thân của giống thuốc lá V2 ............................................................... 74
4.3. Bắn gen vào mô lá cây thuốc lá V2 và chọn lọc cây chuyển gen .................. 79
4.4. Phân tích di truyền các dòng thuốc lá V2 chuyển gen bằng
phương pháp PCR ......................................................................................... 84
4.5. Phân tích di truyền các dòng thuốc lá V2 chuyển gen bằng
phương pháp Southern blot .......................................................................... 88
4.6. Quy trình chuyển gen..................................................................................... 90
4.7. Đặc điểm hình thái các dòng thuốc lá V2 chuyển gen .................................. 91
4.8. Phân tích biểu hiện protein p24 bằng phương pháp Western blot

ở các dòng thuốc lá V2 chuyển gen .............................................................. 97
4.9. Phân tích hàm lượng protein p24 tích lũy trong các dòng
thuốc lá V2 chuyển gen bằng phương pháp ELISA.................................... 100
4.10. Tóm lược đặc điểm các dòng thuốc lá chuyển gen và nguyên bản. .......... 106
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................ 107
5.1. Kết luận ........................................................................................................ 108


5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 108
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ .................................................. 110
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 111
PHỤ LỤC ............................................................................................................... 126


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU - CHỮ VIẾT TẮT

aadA

Gen mã hóa aminoglycoside-3’-adenylyltransferase.

BADH

Betain aldehyde dehydrogenase.

BAP

Benzylaminopurine.

BSA

Bovine serum albumin.

bp

Base pair.

CaMV 35S Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter.
cp

Chloroplast (lục lạp).

cs

cộng sự.

CTB

Cholera toxin B subunit.

CTL

Cytotoxic T lymphocyte - Tế bào lympho T giết tế bào nhiễm bệnh.

DIG

Dioxygenin.

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay.

Gag

Group-specific antigen.

GOI

Gene of interest - Gen quan tâm.

GFP

Green fluorescent protein

GUS

glucoronidase.

HIV-1 p24

protein p24 của HIV-1.

IR

Inverted repeat - Lặp lại đảo ngược.

LB

Luria Bertani broth.

LD

Lethal dose - Liều gây chết.

NAA

Naphthalene acetic acid.

Nef

Negative Regulatory Factor - Protein điều hòa âm.

nos

gen mã hóa nopaline synthase promoter.

NT

Nghiệm thức.

ORF

Open reading frame - Khung đọc mở.

P

Promoter.

p24-cco

Chloroplast-codon-optimized HIV-1 p24 gene.

PBS

Phosphate buffered saline.

PBST

Phosphate buffered saline + Tween.

PCR

Polymerase Chain Reaction.

PEG

Polyethylene glycol.

PEPCase

phosphoenolpyruvate-carboxylase.

PSI

Pounds per inch.

RBS

Ribosome binding site - vị trí kết hợp ribosome.

rrn

Gen mã hóa rRNA.

rbcL

Gen mã hóa RUBISCO tiểu đơn vị lớn.

Rubisco

Enzyme ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase.

SDS PAGE SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
T

Terminator.

TBE

Tris-borate buffer.

trnfM

Gen mã hóa tRNA-Methionin.

trnG

Gen mã hóa tRNA-Glycin.

T7g10

Gen 10 phage T7 của E.coli.

TSP

Total soluble protein - protein hòa tan tổng số.

UTR

Untranslated region - Vùng không dịch mã.

V2

Giống thuốc lá Virginia TBE2.


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1.1.

Mô hình HIV .....................................................................................6

Hình 2.2.1.

Mô hình cấu trúc của lục lạp ...........................................................14

Hình 2.2.2.

Mô hình sự phát triển của lục lạp ....................................................15

Hình 2.2.3.

Bộ gen lạp thể Nicotiana tabacum. .................................................17

Hình 2.2.4.

Cấu trúc DNA lục lạp và sự sao chép DNA phụ
thuộc tái tổ hợp................................................................................18

Hình 2.2.5.

Khái niệm của sự truyền tín hiệu anterograde và
retrograde. .......................................................................................21

Hình 2.3.1.

Mô hình cấu trúc tổ hợp gen biến nạp vào lạp thể. .........................24

Hình 2.3.2.

Quá trình hòa nhập gen thông qua tái tổ hợp đồng dạng. ...............27

Hình 2.3.3.

Dịch mã đa cistron ở lạp thể .........................................................29

Hình 2.3.4.

Quá trình đồng nhất lạp thể chuyển gen trong tế bào
chuyển gen. .....................................................................................30

Hình 2.4.1.

Cây thuốc lá Nicotiana tabacum .....................................................35

Hình 3.3.1.

Ladder DNA ...................................................................................56

Hình 3.3.2.

Protein marker GE Rainbow ..........................................................66

Hình 4.1.1.

Sự tái sinh chồi của mô lá thuốc lá V2 trên các tổ hợp chất điều
hòa sinh trưởng khác nhau .............................................................73

Hình 4.2.1.

Ảnh hưởng của streptomycin ở các nồng độ khác nhau lên
sự tái sinh chồi từ mảnh lá thuốc lá V2...........................................76

Hình 4.2.2.

Ảnh hưởng của streptomycin ở các nồng độ khác nhau
lên sự phát triển của đoạn thân thuốc lá V2. ...................................76

Hình 4.2.3.

Ảnh hưởng của spectinomycin ở các nồng độ khác nhau

lên sự tái sinh chồi từ mảnh lá thuốc lá V2 .....................................77

Hình 4.2.4.

Ảnh hưởng của spectinomycin ở các nồng độ khác nhau
lên sự phát triển của đoạn thân thuốc lá V2 . ..................................78

Hình 4.3.1.

Chọn lọc chồi và cây con từ mô bắn gen trên môi trường có


spectinomycin ở các nồng độ khác nhau.........................................80
Hình 4.3.2.

Cây chuyển gen giả định có lá loang lổ trắng .................................81

Hình 4.3.3.

Cây chuyển gen được cho tái sinh bốn chu kỳ trên môi
trường chọn lọc. ..............................................................................81

Hình 4.3.4.

Cây chuyển gen phát triển tốt trên môi trường có kháng
sinh spectinomycin và streptomycin ở nồng độ 500 mg/l. .............81

Hình 4.4.1.

Phân tích PCR kiểm tra sự hiện diện của gen aadA

với băng khuếch đại mong muốn 250 bp. .......................................85

Hình 4.4.2.

Phân tích PCR kiểm tra sự hiện diện của gen HIV-1 p24
với băng khuếch đại mong muốn 700 bp. .......................................85

Hình 4.4.3.

Phân tích PCR kiểm tra sự hiện diện của trình tự liên kết từ
gen trnG đến gen HIV-1 p24 với các mồi cpt1 và p24 rev,
với băng khuếch đại mong muốn 2,3 kb. ........................................86

Hình 4.4.4.

Phân tích PCR kiểm tra sự hiện diện của trình tự liên kết
từ gen trnfM đến gen trnG ..............................................................87

Hình 4.5.1.

Phân tích Southern blot các dòng thuốc lá V2 chuyển gen.............89

Bảng 4.7.1 .

Các dòng thuốc lá nguyên bản và chuyển gen in vitro. ..................92

Hình 4.7.2.

Cây con của các dòng thuốc lá V2 nguyên bản và chuyển
gen in vitro được trồng ra vườn ươm ..............................................93

Hình 4.7.3.

Cây trưởng thành của các dòng thuốc lá V2 nguyên bản và
chuyển gen phát triển tốt trong điều kiện vườn ươm ......................93

Hình 4.7.4.

Hoa của các dòng thuốc lá V2 nguyên bản và chuyển gen ............94

Hình 4.7.5.

Quả và hạt của các dòng thuốc lá V2 nguyên bản và chuyển gen ..94

Hình 4.7.6.

Hạt thuốc lá V2 chuyển gen thế hệ T1 nảy mầm trên môi
trường in vitro. ................................................................................95

Hình 4.8.1.

Bản gel SDS PAGE phân tách protein ly trích ..............................98

Hình 4.8.2.

Phân tích Western blot phát hiện các băng protein p24. .................99

Hình 4.9.1.

Tỉ lệ phần trăm protein p24/protein tổng tan ở các dòng

chuyển gen trong điều kiện in vitro. .............................................102


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU - SƠ ĐỒ

Bảng 2.2.1.

Các gen lạp thể đã được xác định. ............................................... 20

Sơ đồ 3.1.

Sơ đồ bố trí thí nghiệm................................................................. 49

Sơ đồ 3.2.1.

Cấu trúc vector plasmid pITB.HIV -1 p24 ................................. 50

Bảng 3.3.1.

Các mồi PCR đặc hiệu ................................................................ 57

Sơ đồ 3.3.1.

Sơ đồ các gen chuyển vào lục lạp và vị trí giới hạn .................... 59

Bảng 3.3.2.

Thành phần gel SDS PAGE ......................................................... 65

Bảng 4.1.1.

Khảo sát sự tái sinh chồi từ mảnh lá giống thuốc lá V2,
ở tuần thứ 5.. ................................................................................ 72

Bảng 4.2.1.

Ảnh hưởng của streptomycin lên sự tái sinh chồi và
hình thành rễ cây thuốc lá V2 in vitro.......................................... 75

Bảng 4.2.2.

Ảnh hưởng của spectinomycin lên sự tái sinh chồi và
hình thành rễ cây thuốc lá V2 in vitro.......................................... 77

Bảng 4.3.1.

Tỉ lệ các dòng thuốc lá kháng với kháng sinh spectinomycin
và streptomycin ở 500 mg/l trên số lượng mẫu bắn gen.. ........... 80

Bảng 4.7.1.

Đặc điểm chiều cao thân và kích thước lá các dòng V2
nguyên bản và chuyển gen trồng trong vườn ươm. .................... 95

Bảng 4.8.1.

Hàm lượng protein tổng tan ở các dòng phân tích. ...................... 97

Bảng 4.9.1.

Hàm lượng protein tổng tan ở các dòng thuốc lá phân tích ....... 101

Bảng 4.9.2.

Hàm lượng protein p24 ở các dòng thuốc lá chuyển gen .......... 101

Bảng 4.9.3.

Hàm lượng protein tổng tan ở các dòng thuốc lá phân tích ....... 102

Bảng 4.9.4.

Hàm lượng protein p24 ở các dòng thuốc lá chuyển gen .......... 103

Bảng 4.10.1. Tóm lược đặc điểm các dòng thuốc lá chuyển gen
và nguyên bản. ........................................................................... 106


CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU

1


Để tài “Nghiên cứu chuyển nạp gen HIV-1 p24 tạo protein kháng nguyên vào
lục lạp cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) bằng phương pháp bắn gen” đã được
thực hiện tại Phòng Công nghệ Gen, Viện Sinh học Nhiệt đới.
1.1. Mục đích nghiên cứu
Tính cấp thiết

HIV là một đại dịch mà cho đến thời điểm này vẫn chưa có một liệu pháp triệt
để nào để phòng ngừa hoặc loại bỏ hoàn toàn virus HIV ra khỏi cơ thể người đã
nhiễm bệnh. Cách điều trị lý tưởng hiện nay là kết hợp nhiều liệu pháp kháng virus
để kéo dài và cải thiện chất lượng cuộc sống người bệnh. Tạo vaccine phòng chống
HIV được xem là hướng nghiên cứu có nhiều tiềm năng và khả thi.
Protein capsid HIV-1 p24 là một marker sớm có thể gây tạo đáp ứng miễn
nhiễm dịch thể và tế bào. Do đó, protein này được xem là một kháng nguyên thích
hợp, để phát triển thành các vaccine HIV đa thành phần và đã bước đầu được thử
nghiệm chữa trị. Ngoài ra protein p24 cũng được ứng dụng trong công nghệ tạo các
kit chẩn đoán HIV trong giai đoạn nhiễm sớm và muộn.
Biểu hiện protein HIV-1 p24 tái tổ hợp, có đặc điểm miễn nhiễm như nguyên
bản, ổn định, bền vững với số lượng lớn, qua con đường thực vật là rất thiết thực và
có ý nghĩa nhằm đáp ứng các nhu cầu nêu trên.
Mục đích của đề tài là nghiên cứu chuyển gen HIV-1 p24 vào lục lạp giống
thuốc lá Virginia có năng suất cao, được thuần hóa và trồng phổ biến ở Việt Nam;
kiểm tra, đánh giá sự sinh trưởng và phát triển của cây chuyển gen, sự biểu hiện của
protein tái tổ hợp HIV-1 p24.
Tính mới của đề tài
- Xây dựng quy trình chuyển gen vào lục lạp bằng phương pháp bắn gen trên
giống thuốc lá Virginia đã được thuần hóa tại Việt Nam.
- Chuyển thành công gen HIV-1 p24 vào lục lạp cây thuốc lá Virgnia.
- Cây thuốc lá Virginia chuyển gen HIV-1 p24 biểu hiện protein p24 ổn định
và có kiểu hình bình thường.

2


1.2. Nội dung và phạm vi của vấn đề nghiên cứu
- Chuẩn bị nguồn plasmid dùng để chuyển gen lục lạp thuốc lá.
- Ứng dụng các phương pháp nuôi cấy mô để tạo nguồn nguyên liệu in vitro

phục vụ chuyển gen, xây dựng hệ thống tái sinh, khảo sát các yếu tố chọn lọc đối
với mô, cây thuốc lá.
- Xây dựng qui trình chuyển gen vào lục lạp cây thuốc lá bằng phương pháp
bắn gen.
- Chọn lọc, tái sinh và thu nhận cây chuyển gen.
- Phân tích sinh học phân tử về di truyển cây thuốc lá chuyển gen lục lạp.
- Phân tích biểu hiện protein HIV-1 p24 tái tổ hợp trong cây thuốc lá chuyển
gen lục lạp.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
- Protein HIV-1 p24 tái tổ hợp có thể được dùng để nghiên cứu trong các
hướng phối hợp tạo vaccine phòng chống bệnh cũng như các kit chẩn đoán HIV.
- Sự thành công của công trình là cơ sở bước đầu để phát triển các chiến lược
biến nạp gen tiên tiến hơn nhằm nâng cao biểu hiện protein HIV-1 p24 tái tổ hợp ở
cây thuốc lá Virginia chuyển gen lục lạp.
- Đối với công tác nghiên cứu khoa học tại cơ sở thực hiện, đề tài đóng góp
xây dựng hoàn thiện các quy trình chuyển gen lục lạp ở thuốc lá nói riêng và ở thực
vật nói chung, kiện toàn các điều kiện phân tích cây chuyển gen như: PCR,
Southern blot, Western blot, ELISA. Bên cạnh đó đề tài cũng bước đầu xây dựng
được các mô hình cơ bản về ly trích, tinh sạch protein từ thuốc lá chuyển gen lục
lạp.

3


CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN

4

2.1. HIV - AIDS và các vấn đề liên quan đến phòng trị bệnh
2.1.1. Giới thiệu.
Hội chứng suy giảm miễn nhiễm mắc phải (Acquired Immunodeficiency
Syndrome - AIDS) được phát hiện trong cộng đồng người vào khoảng giữa năm
1981. Bệnh này do một loại lentivirus làm suy giảm miễn nhiễm người (Human
Immunodeficiciency Virus) gọi tắt là HIV gây ra, truyền nhiễm qua đường máu
[54].
Đặc điểm cấu trúc chung của HIV trưởng thành gồm bao bên ngoài là 2 lớp
lipid có nguồn gốc từ màng của tế bào chủ. Các glycoprotein lồi trên bề mặt
(gp120) được gắn chặc vào virus qua sự tương tác với protein chuyển màng (gp41).
Lớp lipid đôi có chứa một vài protein màng tế bào bắt nguồn từ tế bào ký chủ.
Khung nền virus với khoảng 2000 phiên bản protein nền (matrix, p17) xếp thành
hàng ở mặt trong của màng virus và một hạt lõi capsid hình nón gồm 2000 phiên
bản protein vỏ (capsid, p24) nằm ở trung tâm của virus, ổn định như một phức
ribonucleprotein với khoảng 2000 phiên bản của protein nucleocapsid (p7). Có ba
enzyme được mã hóa bởi virus là: protease (PR), enzyme phiên mã ngược reverse
transcriptase (RT) và hòa nhập gen integrase (IN). Ngoài ra, còn một số protein
khác cùng biểu hiện và hoạt động chức năng khi virus hòa nhập vào trong ký chủ.
Khi xâm nhiễm tế bào ký chủ mới, cơ sở di truyền mã hóa trên RNA của HIV sẽ
được phiên mã thành DNA virus bởi enzyme phiên mã ngược (reverse
transcriptase) [154]. Bộ gen HIV bao gồm 3 gen chính: các gen gag (group specific
antigen - kháng nguyên nhóm đặc hiệu), pol (polymerase) và env (glycoprotein bao)
(Hình 2.1.1) [121, 154].
Trong cơ thể người, HIV xâm nhiễm vào những tế bào quan trọng của hệ
thống miễn nhiễm, gồm tế bào T helper (tên chuyên biệt là tế bào T CD4+), đại thực
bào (macrophage) và tế bào tua (dendritic cell). AIDS là giai đoạn bệnh khi tế bào
CD4+ bị phá hủy mạnh, gây ra tình trạng suy giảm hệ miễn nhiễm, mở đường cho
sự bộc phát của các bệnh nhiễm cơ hội khác và ung thư, cuối cùng dẫn đến người
bệnh bị tử vong [145].

5


Số người bị nhiễm HIV trên thế giới đến cuối năm 2010 vào khoảng 34 triệu
(31,6 - 35,2 triệu), tăng thêm 29,8% so với năm 1999 là 26,2 triệu người. Mặc dù, từ
cuối thập niên 90, số người bị nhiễm mới hàng năm đã giảm đều đặn và ổn định ở
mức 2,7% từ năm 2007, tổng số người nhiễm HIV vẫn tăng cao, do số tử vong từ
AIDS đã bớt đi đáng kể, nhờ các liệu pháp kháng retrovirus được áp dụng có hiệu
quả ở quy mô lớn trong nhiều năm qua. Trong số đó, tỉ lệ nhiễm HIV ở Châu Phi
chiếm 68%, cao đột biến so với toàn cầu, chủ yếu trong vùng tiểu Sahara, Nigeria,
South Africa, Zambia, và Zimbabwe. Số người chết liên quan đến HIV ở khu vực
này trong năm 2009 chiếm 72%. Ở Việt Nam số lượng bị nhiễm HIV, tính đến cuối
năm 2010, là 254.387 người, trong đó chỉ khoảng 58.221 người được chăm sóc y tế
[190].

Hình 2.1.1 Mô hình HIV (HowStuffWorks, Inc)
2.1.2. Những thách thức trong trị liệu và chế tạo vaccine
Hội chứng suy giảm miễn nhiễm mắc phải là một trong những khủng khoảng
nghiêm trọng nhất đang đứng trước sự phát triển của loài người, do từ lúc được phát
6


hiện cho đến nay, nền y học hiện đại của thế giới vẫn chưa tìm ra được loại thuốc
đặc trị nào để tiêu diệt HIV ở người bị nhiễm. Trong bối cảnh đó, vaccine được xem
là một trong những giải pháp hữu hiệu có thể ngăn chặn bệnh dịch này. Tuy nhiên,
việc phát triển được một vaccine đủ hiệu quả và an toàn đã gặp phải nhiều khó khăn
như sau: sự biến đổi về di truyền của virus lớn, sự thiếu kiến thức về mối tương
quan miễn nhiễm và sự bảo vệ, sự thiếu các mô hình động vật có liên quan dùng để
dự đoán và sự phức tạp của việc chuẩn bị và xúc tiến nhiều thử nghiệm với quy mô

rộng lớn, đặc biệt là ở những nước đang phát triển [54, 110, 123]. Do đó, con đường
này vẫn còn cần nhiều nỗ lực để có thể đạt được mục tiêu.
HIV biến đổi về di truyền cao, được phân chia thành hai type là HIV-1 và
HIV-2. HIV-2 ít độc, ít lây nhiễm và khu trú địa lý ở vùng Tây Phi. HIV-1 lại được
tiếp tục phân chia thành 3 nhóm: M (chủ yếu - major) O (outlier) và N (không thuộc
M và O - non M/non O). Phần chủ yếu của các dòng (strain) HIV-1 gây bệnh AIDS
trên toàn cầu, kể cả Việt Nam, thuộc nhóm M [54].
Nhiễm HIV trong tự nhiên đã không thể dẫn tới được việc loại bỏ virus thông
qua hệ thống miễn nhiễm ở ký chủ cũng như phát triển sự miễn nhiễm tự nhiên cho
các lần tái nhiễm sau đó. Mặc dù vẫn gây đáp ứng miễn nhiễm mạnh và kéo dài bởi
cả sự phòng vệ dịch thể và thông qua tế bào của cơ thể ký chủ, HIV lại có khả năng
kháng lại sự thải loại và tiếp tục làm suy giảm tế bào T CD4+, cuối cùng dẫn đến
tiến triển lâm sàng AIDS. Thậm chí, có bằng chứng cho thấy, sự bội nhiễm với một
dòng HIV thứ hai có thể xảy ra dễ dàng với những người đã nhiễm HIV trước đó,
dẫn đến sự xuất hiện của các biến thể virus tái tổ hợp và làm tăng sự đa dạng virus
[9, 54, 109, 167].
HIV hòa nhập như một DNA tiền virus tiềm tàng vào trong bộ gen của các tế
bào T CD4+ nhớ lâu dài, cung cấp một nguồn virus dai dẳng có khả năng tránh khỏi
sự kiểm soát miễn nhiễm của cơ thể. Ước tính là phải mất 60 năm để xóa một nguồn
khoảng 105 các tế bào bị nhiễm tiềm ẩn. Cửa sổ cơ hội cho một vaccine HIV do đó
giới hạn rất hẹp vào giai đoạn mới bị nhiễm, trước khi virus có thể lan truyền vào
các cơ quan bạch huyết trong các mô niêm mạc [17, 50, 54, 132].

7


HIV có sự tương tác với thể chủ bị nhiễm khá phức tạp, có thể phát triển nhiều
cơ chế để phá vỡ các đáp ứng miễn nhiễm từ thể chủ gồm cả khả năng điều chỉnh
giảm các phân tử nhóm I phức tương thích mô chính (MHCI) và bằng cách đó đã
làm giảm sự nhận dạng bởi tế bào lympho T gây độc tế bào (cytotoxic T

lymphocytes - CTL); cũng như là tốc độ tiến hóa di truyền cao của chúng, cho phép
chúng tránh khỏi các đáp ứng miễn nhiễm qua sự xuất hiện của các biến thể có thể
tránh được CTL của virus và kháng thể trung hòa [47, 48, 54, 59, 122, 135, 157].
Cơ sở di truyền của một quần thể cũng có thể là một yếu tố quan trọng trong
việc xác định tính hiệu quả của vaccine, đặc biệt là các allele lớp I phức tương thích
mô chính liên quan đến miễn nhiễm qua trung gian tế bào. Các allele trình diện
kháng nguyên lạ đến các tế bào miễn nhiễm rất quan trọng trong đáp ứng miễn
nhiễm của chủ thể đối với sự nhiễm virus. Trong khi một số HLA allele liên kết với
sự nhạy cảm và/ hoặc sự tiến triển của AIDS, một số khác cho thấy có một tác động
bảo vệ đối với sự tiến triển đến AIDS [118].
Một khó khăn khác tồn tại khi phát triển vaccine HIV có hiệu quả là các
glycoprotein ở bao virus giấu các vị trí kết hợp đồng thụ thể và thụ thể bảo tồn của
nó trong những hốc lõm được bao bởi các vòng phân tử siêu biến đổi và các chuỗi
glycan [89, 170, 176]. Kháng thể trung hòa được tạo ra từ đáp ứng với gp 120 ban
đầu được nhắm đến các vòng siêu biến đổi của phân tử này và hiếm khi nhận dạng
được các vị trí kết hợp thụ thể, gây khó tạo ra các kháng thể trung hòa phản ứng trên
phổ rộng kháng những dòng virus ban đầu ở người bệnh [22, 23, 52, 58, 130, 177].
Việc những đáp ứng dịch thể được tạo ra bởi các vaccine monomeric gp120 hoàn
toàn thiếu hiệu quả trong việc bảo vệ chống lại sự nhiễm virus đã được chứng minh
một cách không còn nghi ngờ gì nữa trong hai thử nghiệm lâm sàng vaccine AIDS
đầu tiên [30, 54].
Những kháng thể trung hòa đưa thụ động vào linh trưởng được ghi nhận là có
thể tạo ra sự bảo vệ chống lại sự nhiễm SHIV khi thử nghiệm, trong khi kết quả về
vai trò bảo vệ của chúng ở người bị nhiễm vẫn mang tính ngẫu nhiên. Điều rõ ràng
nhất về vai trò kháng thể trung hòa HIV-1 trong tự nhiên là sự chọn lọc ổn định và

8


nhanh các biến thể tránh được kháng thể trung hòa trong thời gian nhiễm. Tuy

nhiên, trái ngược với những dòng virus đã thích ứng trong phòng thí nghiệm dùng
CXCR-4 như một đồng thụ thể (các strain X4) và đề kháng với sự bảo vệ trong
chimpanzee, có thể trung hòa dễ dàng bởi kháng thể được cảm ứng nhắm đến vòng
V3 siêu biến đổi, thì những dòng virus được phân lập, dùng CCR-5 như đồng thụ
thể (các dòng R5) rất khó để trung hòa, đã làm nghi ngờ về khả năng của một
vaccine nhằm tạo ra sự bảo vệ kháng nhiễm chỉ đơn độc bởi sự cảm ứng kháng thể
trung hòa. Nhìn chung, hướng tiếp cận vaccine gần đây đã được tập trung trên sự
cảm ứng đáp ứng miễn nhiễm tế bào [54].
Các nghiên cứu cho thấy là những CTL nhận dạng các epitopes bảo tồn cao
trong kháng nguyên đặc hiệu nhóm có khả năng kiểm soát sự sao chép HIV ở
những người không tiến triển bệnh trong nhiều năm. Điều quan trọng cho các khái
niệm vaccine mới là việc trình diện được một nguồn lớn các vị trí kháng nguyên
cũng như kích thích được những tác động. Theo đó, những type khác nhau của
những thể giống virus HIV tái tổ hợp (Virus like particle - VLP) đã được cấu trúc,
mà chúng có thể kích thích sự cảm ứng kháng thể trung hòa và đáp ứng CTL đặc
hiệu trong những nghiên cứu trước lâm sàng. Liên quan đến các thử nghiệm vaccine
trong tương lai, việc tạo vaccine HIV có thể cần được điều chế cho phù hợp đối với
những chủng virus địa phương đang lưu hành trong một vùng địa lý [164].
Bằng chứng về vai trò của các tế bào T CD8+ trong việc kiểm soát nhân lên
của virus phải nói đến mối tương quan tạm thời giữa sự xuất hiện của các tế bào T
CD8+ đặc hiệu HIV và mức suy giảm của virus trong máu ban đầu, với thực tế là
một số allele HLA lớp I (HLA-B57, HLA B-27, HLA-B63) liên quan đến sự tiến
triển bệnh chậm, sự chọn lọc sớm của thể virus đột biến tránh được CTL của lần
nhiễm đầu tiên và sự tăng nhanh số lượng virus ở khỉ bị nhiễm SIV sau khi phá hủy
các tế bào T CD8+ trong thí nghiệm. Sự cảm ứng gây đáp ứng miễn nhiễm tế bào
chống HIV, đặc biệt là đáp ứng của CTL CD8+, mặc dù không thể cung cấp sự
miễn nhiễm loại bỏ tuyệt đối và bảo vệ không bị nhiễm, hy vọng có thể làm cho các
đối tượng tiêm vaccine được kiểm soát sự nhân lên của virus sau khi nhiễm, giảm

9

tải lượng virus, làm chậm tiến trình dẫn đến bệnh của chúng và giảm khả năng lây
nhiễm lần thứ hai của virus [54].
2.1.3. Protein HIV-1 p24 trong nghiên cứu vaccine và kit chẩn đoán
Một trong những câu hỏi đáng quan tâm mà những nhà nghiên cứu đang phải
đối diện đầu tiên là liệu có thể có một vaccine chung, độc lập, kháng lại tất cả các
dòng HIV, hay các vaccine phải được biến đổi theo những type phụ hoặc những
dòng phổ biến nhất trong từng vùng cụ thể. Hệ thống hiện tại phân loại sự đa dạng
của HIV dựa trên những trình tự di truyền, không theo các thuộc tính miễn nhiễm
và cũng không phân các type phụ dựa trên sự khác biệt miễn nhiễm mà chúng có
thể thích hợp hơn trong trường hợp thiết kế vaccine. Do đó, cần phải có sự hiểu biết
cụ thể hơn nữa về đa dạng di truyền của HIV-1 với những thuộc tính về miễn nhiễm
[118].
Có nhiều hướng tạo vaccine hiện nay đang được tiếp tục xúc tiến trên toàn
cầu, và tạo ra một toàn cảnh khá phức tạp do sự phụ thuộc vào các biến thể theo địa
lý của virus. Một số trong các báo cáo ủng hộ mạnh mẽ việc đưa các thành phần cấu
trúc virus vào trong vaccine để cũng cố tính hiệu quả của vaccine [110, 118]. Do
kháng nguyên HIV-1 Gag là một trong những protein virus bảo tồn nhất và được
biết là có thể cảm ứng đáp ứng tế bào T cả trong thú và người, nó được xem xét như
một kháng nguyên thích hợp để tạo vaccine phòng chống HIV. Thực vậy, những
nghiên cứu trước cho thấy là, đáp ứng tế bào T đặc hiệu Gag tham gia loại trừ sự
nhiễm trong máu ban đầu và kiểm soát sự nhân bản virus sau đó, nhờ vậy làm chậm
tiến trình bệnh [25].
Gen gag mã hóa tiền phân tử polyprotein, Pr55Gag (Gag), sẽ được cắt bởi
protease virus thành những protein Gag trưởng thành: nền (p17), vỏ (p24),
nucleocapsid (p7) và p6 trong hoặc ngay sau khi virus sinh sản từ tế bào [121].
Protein HIV-1 p24 có tính bảo tồn cao, được đề nghị là một mục tiêu đặc hiệu
cho các chiến lược kháng virus. Protein này có chứa nhiều các epitop đối với CTL
có khả năng gây đáp ứng miễn nhiễm tế bào T trong cả những đối tượng mới nhiễn

hoặc nhiễm mạn tính. Kháng nguyên p24 (Gag) được chọn trong nhiều nghiên cứu

10


ngày nay như một phần không thể thiếu trong các ứng viên vaccine HIV-1 đa thành
phần [110, 121, 180].
Protein p24 gồm 231 amino acid, có trọng lượng phân tử 24 kDa, không có
các gốc đường kết hợp, tạo thành lõi hình nón của các thể virus, hiện diện sớm ở
người nhiễm HIV và là đối tượng gây đáp ứng miễn nhiễm cả trong trường hợp mới
nhiễm hoặc nhiễm mạn tính [108].
Bên cạnh đó protein p24 là một trong những mục tiêu phát hiện của hầu hết
các kit chẩn đoán. Sự phát hiện kháng nguyên p24 cũng rất có ích trong chẩn đoán
sớm sự nhiễm HIV. Các xét nghiêm kiểm tra nhiễm virus thế hệ thứ 4 được thành
lập dựa trên cơ sở phát hiện kháng nguyên p24 và có thể tìm thấy sự nhiễm HIV ở
một giai đoạn sớm, dẫn đến rút ngắn cửa sổ điều trị [160, 180].
Với số lượng nhiễm lan rộng, chủ yếu ở các nước nghèo, bất cứ các biện pháp
chẩn đoán chữa trị HIV đều cần phải được thực hiện ở quy mô lớn và giá thành thấp
[110]. Việc sản xuất protein p24 phục vụ chương trình phát triển vaccine và kit chẩn
đoán cũng được thực hiện trên hướng tiếp cận đó. Protein p24 tái tổ hợp phù hợp
với hoạt động kháng nguyên như protein p24 tự nhiên sẽ hữu ích cho nhiều nghiên
cứu [180].
Việc sản xuất protein p24 đã được thực hiện trong nhiều hệ thống khác nhau,
bao gồm vi khuẩn Escherichia coli, nấm men Pichia pastoris, tế bào côn trùng
baculovirus [180]. Một trong những giải pháp khả thi, nhiều tiềm năng và có chi phí
thấp để sản xuất các protein kháng nguyên như p24 là nhờ thực vật. Những đối
tượng được sử dụng bao gồm nhiều loại cây trồng như Nicotiana tabacum (thuốc lá
vàng), các loài Nicotiana khác, cỏ linh lăng, lúa, lúa mạch, khoai tây và đậu nành.
Sản xuất protein trong thực vật có thể thực hiện qua các hệ thống biểu hiện
tạm thời bởi các vector virus, hay các hệ thống biểu hiện bền vững từ biến đổi gen

nhân hoặc lục lạp [110].
Trong nghiên cứu của luận văn này, gen HIV-1 p24 được biến nạp vào giống
thuốc lá Virginia TBE2 (gọi tắt là V2) và bước đầu khảo sát khả năng biểu hiện
protein trong cây. Đây là giống thuốc lá vàng thương mại đã được nội địa hóa, có

11


năng suất cao và đã được trồng trên nhiều vùng nguyên liệu của Việt Nam.
2.2. Lạp thể (plastid) ở thực vật
2.2.1. Giới thiệu về nguồn gốc và các loại lạp thể trong thực vật xanh
Lạp thể là nhóm bào quan eukaryote đa dạng, liên quan đến sự phát sinh loài,
phát triển cá thể và sinh lý, đóng vai trò trung tâm trong biến dưỡng thực vật thông
qua quá trình quang hợp, tổng hợp lipid và amino acid, đồng hóa nitrogen và sulfur.
Lạp thể có hàng chục dạng tiêu biểu khác nhau và rất ít các trường hợp ngoài lệ, tồn
tại trong tế bào tảo, rêu, dương xỉ, cây hạt trần và cây hạt kín.
Lạp thể phát sinh và hình thành từ mối quan hệ cộng sinh bên trong tế bào của
tổ tiên vi khuẩn cyanobacteria. Theo như các nghiên cứu, mối quan hệ cộng sinh
này gồm nhiều sự kiện, khởi đầu từ 1 tế bào protoeukaryote bắt lấy và giữ lại một vi
khuẩn quang hợp. Sự kiện đa nguồn gốc này xảy ra nhiều lần trong khoảng thời
gian cách nay 1,5 - 1,6 tỉ năm tạo thành sự đa dạng được nhìn thấy trong ba nhánh
tiến hóa ngày nay của lạp thể là: glaucophyte, nhánh tiến hóa đỏ và nhánh tiến hóa
xanh lá cây. Nhánh tiến hóa xanh lá cây tồn tại như các lạp thể trong tảo xanh và
các thành viên của Kingdom Plantae. Tuy nhiên, tổ tiên của lạp thể vẫn chưa được
biết chính xác ra sao hoặc 3 nhánh tiến hóa của lạp thể được rẽ ra như thế nào từ
những thể eukaryote quang hợp ban đầu. Học thuyết cho là đã xảy ra những lần
cộng sinh thứ hai và thứ ba được ủng hộ mạnh mẽ hơn bởi các nghiên cứu so sánh
về bộ gen. Kết quả so sánh cung cấp nhiều dấu hiệu nhận dạng những khác biệt giữa
các nhánh tiến hóa của lạp thể và cyanobacterium. Hệ thống quang hợp bảo tồn cao
giữa các lạp thể khác nhau và cyanobacterium, nhưng về một số chức năng khác,

các lạp thể được đa dạng hóa trong quá trình tiến hóa.
Các gen chứa bên trong lạp thể mã hóa cho khoảng 100 trên 2500 protein tìm
thấy trong một lục lạp điển hình; 95% còn lại được mã hóa bởi gen nhân. Các
protein mã hóa trong nhân phải được chuyển vị trí vào trong lạp thể. Nhiều dữ liệu
cho thấy là các gen mã hóa cho protein lạp thể (ở lạp thể hoặc là các gen nhân) có
nhiều nguồn gốc mà nó bao gồm cả các nhánh tiến hóa đỏ và xanh. Sự chuyển gen,
sao chép gen, mất gen theo hàng ngang và có thể ngay cả sự nhận gen từ ti thể và

12


các sản phẩm gen đều tham gia vào sinh học lạp thể hiện nay. Bằng chứng về nguồn
gốc prokaryote của lạp thể có thể được quan sát từ bộ gen và cơ chế phân tử được
dùng trong phiên mã và dịch mã của chúng. Sự liên lạc chặc chẽ tồn tại giữa các
gen lạp thể và gen nhân và, do nguồn gốc từ prokaryote, lục lạp phân chia theo kiểu
phân đôi [31, 173].
Trong thực vật xanh, lạp thể có thể tồn tại ở các dạng biệt hóa khác nhau tùy
thuộc vào vai trò thể hiện trong các tế bào cụ thể, bao gồm: lục lạp (chloroplast), sắc
lạp (chromoplast), vô sắc lạp (leucoplast), gerontoplast, etioplast. Vô sắc lạp lại có
các dạng đặc biệt như amyloplast, elaioplast aleuroplast. Tất cả các dạng lạp thể
được phát triển từ tiền lạp thể (proplastid) hoặc do chuyển hóa giữa các dạng [31,
45, 60, 62, 66, 72, 75, 92, 106, 116, 129, 173, 178, 179].
2.2.2. Lục lạp (Chloroplast)
Lục lạp là bào quan thực hiện quang hợp, tổng hợp phụ thuộc ánh sáng các
phức có carbon bị khử với trọng lượng phân tử thấp từ carbon dioxide trong không
khí [115]. Ngoài ra lục lạp còn là nơi oxy hóa carbon qua sự quang hô hấp [126],
tổng hợp chlorophyll, carotenoid, α-tocopherol (vitamin E), tổng hợp plastoquinone
và phylloquinone (vitamin K), tổng hợp acid béo và lipid, đồng hóa nitrogen và
tổng hợp amino acid, biến dưỡng sulfur, biến dưỡng oxygen và một loạt phản ứng
oxy hóa được gọi là chlororespiration. Rõ ràng, quá trình tiến hóa đã tận dụng lợi

thế của sức mạnh sinh tổng hợp và tính linh hoạt của lạp thể, và chọn chúng làm
nhà máy đồng hóa đa chức năng của tế bào thực vật [31, 173].
Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) là enzyme
carboxyl hóa chính trong cây C3 và dạng bền vững đầu tiên của carbon cố định là
phosphoglycerate acid 3 carbon (do đó có tên là C3). Rubisco được tìm thấy trong
lục lạp C3 và có thể là protein phong phú nhất trên hành tinh [31, 173].
Khi quan sát, lục lạp có dạng đĩa phẳng, lồi khoảng 5 - 10 m đường kính.
Bên trong lục lạp là thể dịch lỏng, bán gel, giàu protein được gọi là stroma và là nơi
các enzyme của chu trình Calvin-Benson được tìm thấy; trong đó các màng
thylakoid màu xanh lá cây nằm lơ lững. Thylakoid được phân chia thành hai loại,

13