Nghiên cứu tạo dòng biến dị IN VITRO ở cây lan Hài Hồng (PAPHIOPEDILUM CALLOSUM) bằng phương pháp chiếu xạ.

1
MỞ ĐẦU


Đã từ lâu, hoa lan được cả thế giới ca ngợi là “Nữ hoàng của các loài hoa”.
Hoa lan đã chinh phục con người bởi cấu trúc kỳ diệu của đóa hoa cũng như bởi sự
đa dạng về màu sắc, hình dạng và hương thơm quyến rũ của nó. Nhu cầu trồng và
thưởng thức hoa lan của con người ngày càng tăng bởi vẻ đẹp và độ bền của hoa.
Lan Hài Vệ nữ (Paphiopedilum sp.) với hình dạng độc đáo như ch
iếc hài của
phụ nữ và vẻ đẹp quý phái được coi là nhóm đặc sắc nhất trong họ lan. Đây là một
trong những loài thực vật kiểng được ưu thích và có giá trị thương mại cao nhất trên
thế giới. Không chỉ quý vì vẻ đẹp, lan Hài còn là một trong những loài thực vật
hiếm nhất trên thế giới hiện nay.
Là một nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, Việt Nam đư
ợc các nhà
khoa học xác định là một trong những cái nôi của loài lan Hài Vệ nữ với khoảng 20
loài, trong đó có nhiều loài có tính đặc hữu hẹp. Tuy nhiên, do sự khai thác ồ ạt
thiếu kiểm soát và nạn phá rừng tràn lan, các loài lan Hài quý hiếm của Việt Nam
đang có nguy cơ tuyệt chủng ngoài tự nhiên. Để bảo vệ nguồn gen quý này, Công
ước quốc tế về buôn bán các loài động, thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng
(CITES) đã cấm xuất khẩu các loài lan Hài của Việt Nam dưới mọi hình thức.
Là loài lan Hài có tính đặc hữu rất hẹp, lan Hài Hồng (Paphi
opedilum
delenatii) là một trong các loài lan quý hiếm nhất của Việt Nam cũng như của thế
giới. Được người Pháp phát hiện từ đầu thế kỷ 20, lan Hài Hồng đã nhanh chóng
được ưa thích trên toàn thế giới bởi vẻ đẹp quý phái nhưng thanh nhã của nó. Do có
giá trị thương mại cao và tính đặc hữu rất hẹp, độ mẫn cảm với môi trường cao mà
lan Hài Hồng ngoài tự nhiê
n đang trong tình trạng có nguy cơ tuyệt chủng trầm

2
trọng.
Khác với lan Hài Hồng, Vân Hài (Paphiopedilum callosum) là một trong các
loài lan Hài có khu vực phân bố rộng. Tuy vậy, do giá trị thương mại cao lại dễ khai
thác do khu vực sống của loài lan này ở độ cao thấp, gần suối nên hiện nay Vân Hài
ngoài tự nhiên cũng đang có nguy cơ tuyệt chủng.
Với mong muốn góp phần bảo tồn đồng thời tạo nguồn biến dị in vitro làm
nguyên liệu cho công tác tạo giống hai loài lan Hài quý hiếm này, chúng tôi thực
hiện đề t
ài “Nghiên cứu tạo dòng biến dị in vitro ở cây lan Hài Hồng
(Paphiopedilum delenatii) và Vân Hài (Paphiopedilum callosum) bằng phương
pháp chiếu xạ”.













3
MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Mục tiêu của đề tài “Nghiên cứu tạo dòng biến dị in vitro ở cây lan Hài Hồng
(Paphiopedilum delenatii) và Vân Hài (Paphiopedilum callosum) bằng phương

pháp chiếu xạ” là xác định quy trình nhân giống in vitro phục vụ bảo tồn và thương
mại hai loài lan quý hiếm của Việt Nam và tạo ra các dòng biến dị in vitro bằng
bức xạ ion hóa.

ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN VĂN
Quy trình nhân giống in vitro lan Hài Hồng (Paphi
opedilum delenatii) và
Vân Hài (Paphiopedilum callosum) có ý nghĩa quan trọng đối với công tác bảo tồn
hai loài lan Hài quý hiếm của Việt Nam bên cạnh ý nghĩa thương mại của nó.
Nghiên cứu tác động của bức xạ ion hóa đối với các loài lan này là cơ sở cho
các nghiên cứu về chọn tạo giống lan Hài, góp phần phát triển đa dạng các giống
lan Hài đặc hữu quý hiếm của Việt Nam.

TÓM TẮT KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC
- Xây dựng hoàn chỉnh quy trình nhân giống in vitro hai loài lan Hài Hồng
(Paphiopedilum delenatii) và Vân Hài (Paphiopedilum callosum).
- Khảo sát tác động của bức xạ ion hóa lên sự sinh trưởng và phá
t triển của
mẫu in vitro ở hai loài lan Hài nói trên.
- Đã gây tạo và chọn lọc được các dòng biến dị in vitro ở cây lan Hài Hồng
(12 dòng) và Vân Hài (12 dòng); trong đó đã tiến hành khảo sát sự biến đổi di
truyền ở mức phân tử của 5 dòng Vân Hài và 2 dòng Hài Hồng.
MỤC LỤC

Mục lục
Danh mục từ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình
Mở đầu…………….… ……………………………………………………… 1
Mục tiêu của đề tài……………………………………………………………… 3

Điểm mới của luận văn………………………………………………………… 3
Tóm tắt kết quả đạt được…………………………………………………………3
Chương I: Tổng quan tài liệu
1.1 Tổng quan về cây lan Hài…………………………………………………….4
1.1.1 Phân loại………………………………………………………………… 4
1.1.2 Hình thái………………………………………………………………… 5
1.1.3 Sinh thái………………………………………………………………… 8
1.1.4 Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam………………………………………….9
1.1.5 Sơ lược về lan Hài Hồng và Vâ
n Hài…………………………………….12
1.1.5.1 Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii)……… ………………………….12
1.1.5.2 Vân Hài (Paphiopedilum callosum)…………………………………… 13
1.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật………………………………………………15
1.2.1 Môi trường nuôi cấy mô thực vật……………………………………… 16
1.2.1.1 Các loại muối khoáng………………………………………………… 16
1.2.1.2 Vitamin………………………………………………………………….17
1.2.1.3 Chất điều hòa sinh trưởng……………………………………………….17
1.2.1.4 Các chất bổ sung……………………………………………………… 18
1.2.2 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô trong nghiên cứu và sản xuất………….19
1.3 Tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chiếu xạ………………………20
1.3.1 Đột biến và phân loại đột biến………………………………………… 20
1.3.2 Các tác nhân gây đột biến……………………………………………… 21
1.3.2.1 Tác nhân vật lý………………………………………………………… 22
1.3.2.2 Tác nhân hóa học……………………………………………………… 23
1.3.3 Tác dụng của bức xạ ion hóa lên cơ thể sống……………………………24
1.3.
4 Gây đột biến bằng bức xạ ion hóa và ứng dụng
trong tạo giống cây trồng………………………….…………………… 25
1.4 Chọn lọc dòng biến dị……………………………………………………….29
1.4.1 Chọn lọc dựa trên karyotype của thực vật……………………………….30

1.4.2 Kỹ thuật PCR…………………………………………………………….31
1.4.2.1 Nguyên tắc kỹ thuật PCR……………………………………………… 31
1.4.2.2 Quy trình kỹ thuật PCR………………………………………………….32
1.4.2.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR…………………………………………….32
1.4.2.4 Các hạn chế của kỹ thuật PCR………………………………………… 34
1.4.
2.5 Kỹ thuật phân tích tính đa hình của DNA được nhân bản
ngẫu nhiên (RAPD)……………………………….…………………… 34
Chương II: Vật liệu và phương pháp
2.1 Vật liệu………………………………………………………………………37
2.2 Các phương pháp nghiên cứu……………………………………………… 38
2.2.1 Nghiên cứu điều kiện khử trùng mẫu…………………………………… 38
2.2.2 Nghiên cứu quy trình nuôi cấy in vitro lan Hài………………………… 39
2.2.2.1 Khảo sát môi trường hình thành callus của lan Hài…………………… 39
2.2.2.2 Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB………………………………… 41
2.2.2.3 Khảo sát môi trường nhân nhanh chồi………………………………… 43
2.2.2.4 Khảo sát môi trường tái sinh cây lan Hài in vitro………………………….45
2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của bức xạ ion hóa lên mẫu lan Hài in vitro………….46
2.2.3.1 Chiếu xạ mẫu……………………………………………………………47
2.2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng mẫu sau chiếu xạ………………………………… 47
2.2.3.3 Tạo và xác định các dòng biến dị.………………………………………48
2.2.4 Chọn lọc sau chiếu xạ…………………………………………………… 48
2.2.
4.1 Chọn lọc cây có biểu hiện khác biệt về kiểu hình
trong nuôi cấy in vitro……….……………………………………………… 48
2.2.4.2 Kiểm tra sự biến đổi di truyền………………………………………… 49
2.2.5 Xử lý thống kê số liệu…………………………………………………… 51
Chương III: Kết quả và thảo luận
3.1 Khảo sát điều kiện khử trùng và nuôi cấy mô lan Hài………………………52
3.1.1 Điều kiện khử trùng mẫu………………………………………………….52

3.1.2 Khảo sát môi trường tạo callus……………………………………………53
3.1.3 Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB…………………………………….56
3.1.4 Khảo sát môi trường nhân nhanh chồi
…………………………………….58
3.1.5 Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh……………………………… 60
3.2 Chiếu xạ tạo các dòng biến dị lan Hài trong điều kiện in vitro……………….61
3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng chiếu xạ tia gamma và chùm ion
lên mẫu lan Hài in vitro 61
3.2.1.1 Khảo sát tác động bức xạ gamma đối với mẫu lan Hài 62
3.2.1.1 Khảo sát tác động bức xạ chùm ion lên mẫu lan Hài in vitro 65
3.2.2 Tạo dòng biến dị… 66
3.3 Chọn lọc các dòng biến dị in vitro 69
3.3.1 Chọn lọc kiểu hình 69
3.3.2 Chọn lọc dựa trên chất liệu di truyền 72
3.3.
2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 75
3.3.2.2 Kết quả phân tích bằng kỹ thuật RAPD 77
Chương IV: Kết luận và đề nghị
4.1 Kết luận… 83
4.2 Đề nghị 84
Tài liệu tham khảo 86
Phụ lục







DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ hạng bảo tồn của Tổ chức
Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN)……… …………………… 10
Bảng 2.1 Nghiệm thức ảnh hưởng của các chất ĐHST đến khả năng tạo callus 40
Bảng 2.2 Nghiệm thức ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân PLB……42
Bảng 2.3 Nghiệm thức ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số
nhân chồi… ………………………………………………… … 44
Bảng 2.4 Khảo sát môi trường tái sinh cây lan Hài in vitro………… … 45
Bảng 2.
5 Tên và trình tự các đoạn mồi………………………….………………50
Bảng 3.1 Tình trạng mẫu đỉnh sinh trưởng lan Hài sau khử trùng 6 tuần……….52
Bảng 3.2 Tình trạng hạt lan Hài sau khử trùng và gieo hạt 10 tuần……….…….53
Bảng 3.3 Khả năng tạo callus từ PLB………………………………………… 55
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân PLB……………….…57
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân chồi của lan Hài…… 58
Bảng 3.6 Khả năng tái sinh hoàn chỉnh của câ
y lan Hài……………………… 60
Bảng 3.7 Giá trị LD
50
của các mẫu lan Hài Hồng và Vân Hài……………… 65
Bảng 3.8 Khả năng biến dị của cây lan Hài sau khi chiếu xạ tia gamma.………67
Bảng 3.9 Các dạng biến dị in vitro của cây lan Hài sau khi chiếu xạ chùm ion 68
Bảng 3.10 Đặc điểm của các dòng biến dị từ lan Hài Hồng chiếu xạ chùm ion
(mẫu phân tích DNA)……………………………… 73
Bảng 3.11 Đặc điểm của các dòng biến dị từ lan Vân Hài chiếu xạ chùm ion (mẫu
phân tích DNA)……………………………………….…………….74
Bảng 3.12 Kết quả tách chiết DNA của các dòng lan Hài biến dị
và mẫu đối chứng dùng trong kỹ thuật RAPD … ………………76
Bảng 3.13 Tổng số phân đoạn DNA xuất hiện khi điện di sản phẩm RAPD
lan Hài Hồng 78

Bảng 3.14 Hệ số tương đồng di truyền của các dòng Hài Hồng…………… 78
Bảng 3.15 Tổng số phân đoạn DNA xuất hiện khi điện di sản phẩm RAPD
lan Vân Hài …………………… 80
Bảng 3.16 Hệ số tương đồng di truyền của cá
c dòng Vân Hài …………….… 81
Bảng 3.17 Tỉ lệ sống của mẫu PLB và chồi lan Hài sau chiếu xạ
2 tháng và 4 tháng………………………… … phụ lục
Bảng 3.18 Tỉ lệ sống của mẫu cây lan Hài sau chiếu xạ 4 tháng………… phụ lục








DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Một số loài lan Hài của Việt Nam………………………………………7
Hình 1.2 Lan Hài Hồng……………………………………………………….…12
Hình 1.3 Lan Vân Hài………………………………………………………… 14
Hình 1.4 Sơ đồ kỹ thuật RAPD………………………………………………….35
Hình 2. Quy trình thực hiện thí nghiệm…………………………………………46
Hình 3.1 Mẫu lan Hài in vitro ở các giai đoạn khác nhau………………………59
Hình 3.2 Mẫu PLB và chồi lan Hài chết sau chiếu xạ………………………… 62
Hình 3.3 Ảnh hưởng của bức xạ gamma Co-60 lên sự sống sót
của mẫu lan Hài Hồng in vitro… 63
Hình 3.4 Ảnh hưởng của bức xạ gamma Co-60 lên sự sống sót
của mẫu lan Vân Hài in vitro… 64
Hình 3.
5 Các dạng biến dị ở cây Hài Hồng bởi chùm ion…………………… 70

Hình 3.6 Các dạng biến dị ở cây Vân Hài bởi chùm ion…………………… …71
Hình 3.7 Các dòng biến dị lan Hài Hồng thế hệ M
1
V
2
(mẫu phân tích DNA) 72
Hình 3.8 Các dòng biến dị lan Vân Hài thế hệ M
1
V
2
(mẫu phân tích DNA) 72
Hình 3.9 Kết quả điện di mẫu DNA lan Hài 75
Hình 3.10 So sánh ba dòng lan Hài Hồng ở mức độ phân tử 79
Hình 3.11 Kết quả điện di sản phẩm RAPD
với các primer OPD5 và OPD6 của 6 dòng lan Vân Hài…… …… 79
Hình 3.12 So sánh năm dòng lan Vân Hài ở mức độ phân tử……………… …81
Hình 3.13 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của Hài Hồng……………… phụ lục
Hình 3.14 Kết quả điện di sản phẩm RAPD của Vân Hài…………………phụ lục
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
2,4D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid
BA Benzynladenine
CITES Convention in International Trade in Endagered Spicies of Wild
Fauna and Flora
DES Diethylsulfate
DMS Dimethylsulfate
DNA Deoxyribonucleic acid
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EL Ethylenime
EMS Ethylmetansulphonate
FAO Food Argiculture Organization

IAEA The International Union for Conservation of Nature
LD
50
Lethal Dose 50%
MS Murashige and Skoog
NAA α-naphthaleneacetic acid
NMU Nitrozomethylurea
OD Optical Density
P. Paphiopedilum
PLB Protocorm like body
PCR Polymerse Chain Reaction
RAPD Random Amplified Polymorphic DNAs
RFLP Retriction Fragment Length Polymorphisms
TBE Tris-Boric acid-EDTA
TDZ Thidiazuron
UV Ultraviolet


4
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY LAN HÀI (Paphiopedilum)

1.1.1 Phân loại

Lan Hài (Paphiopedilum) là một nhánh của họ Lan (Orchidaceae) thuộc bộ
Lan (Orchidales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp Một lá mầm (Monocotyledoneae),
ngành Hạt kín (Angiospermatophyta) [14]. Bộ Lan có liên hệ chặt chẽ với bộ Hành,
có một số ý kiến cho rằng có lẽ bộ Lan đã tiến hóa từ bộ Hành do hoa của bộ Hành
có khuynh hướng phát triển dẫn đến bộ Lan. Bộ Lan chỉ gồm một họ duy nhất là họ

Lan. Họ Lan có cơ quan sinh dưỡng khá đa dạng, thường có rễ khí sinh khá phát
triển. Mạch p
hần lớn là kiểu nguyên thủy, không có ở rễ và thân. Lá mọc cách,
nguyên, phiến lá đôi khi rất dày. Cuống lá hoặc gióng thân đôi khi phình lên gọi là
hành giả. Hoa lưỡng tính, đối xứng hai bên, thường tập hợp thành dạng cụm hoa
chùm hay bông. Bao hoa dạnh cánh, gồm 6 mảnh rời nhau, xếp trên hai vòng, mỗi
vòng 3 mảnh. Vòng trong có một cánh lớn, có màu sắc và hình dạng khác biệt gọi là
cánh m
ôi. Cấu trúc hoa phức tạp, giao phấn bắt buộc, thích nghi cao với sự giao
phấn nhờ sâu bọ. Quả khô, hạt nhỏ, nhiều, nhẹ do thường không có nội nhũ, dễ
dàng phát tán nhờ gió. Hạt muốn nảy mầm cần có nấm cộng sinh để phôi phát triển
được. Lan sinh trưởng chậm, từ khi nảy mầm đến khi ra hoa có thể mất 10–15 năm
[14].
Lan Hài là một nhóm rất khác biệt trong họ Lan. Chúng dễ dàng được nhận
ra bởi cấu trúc hoa khá
c thường với một cánh hoa giữa hình túi sâu trông giống một
chiếc hài, mà trong chuyên môn thường được gọi là môi hay cánh môi, nằm ở vị trí

5
thấp nhất của hoa, tạo nên một vẻ bề ngoài rất đặc sắc. Và do vậy nó trở thành tên
chung của nhóm này. Chiếc môi đặc sắc và hình dạng khác thường của hoa làm cho
lan Hài dễ dàng phân biệt với các loài lan khác [1].
Lan Hài có 5 chi gồm:
- Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là Hài Vệ nữ, chủ
yếu phân bố ở vùng núi và vùng ôn đới của bắc bán cầu.
- Chi Mexipedium, Phragmipedium và Selenipedium có khoảng 25 loài phân
bố ở vùng nhiệt đới châu Mĩ.
- Chi Paphiopedilum gồm k
hoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á
từ nam Ấn Độ và đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo

Solomon.
Các loài lan Hài ở Việt Nam đều thuộc chi Paphiopedium. Tuy lan Hài là
nhóm rất hiếm, tính đa dạng của lan Hài tại Việt Nam cao hơn bất cứ nơi nào trên
thế giới. Nhiều loài của Việt Nam không chỉ rất hiếm mà còn là loài đặc hữu hẹp, có
tầm quan trọng quốc tế [1].

1.1.2 Hình thái

Các loài lan Hài có hình dạng bê
n ngoài rất đa dạng. Hầu hết các loài đều có
thân cỏ lùn nhỏ, cá biệt có một số loài có thân dạng trúc cao 1-3m [1]. Trong phạm
vi của đề tài, chúng tôi chỉ mô tả hình thái chung của các loài thuộc chi
Paphiopedium.
- Cây: thân cỏ, kích thước trung bình, thân bị thu rất ngắn mang nhiều lá mọc
thành hai hàng xếp thành hình quạt. Tất cả các loài đều có thân rễ nhưng đa số rất

6
ngắn.
- Lá: thường có dạng lá dài, hình trứng ngược hay bầu dục thuôn và mở rộng.
Mỗi lá có đốt ở gốc, dưới là bẹ lá hình chữ V xếp lớp xít lên nhau trên thân. Độ dài
của lá ở các loài có thể rất khác nhau, từ 3–50cm. Mặt trên của lá có thể màu xanh
lá cây cùng màu, hoặc khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu
xanh lá nổi rõ. Mặt dưới lá của một số loài có các đốm tím dày đặc, ở các loài khác
chỉ thấy vết tím xỉn ở gần gốc lá. Rất ít loài có mặt dưới thuần m
àu xanh lá. Mật độ
và đặc điểm của vết khảm màu trên lá là một trong các đặc điểm phân loại ở các
loài. Lá ở một số loài có thể dày, mọng nước, cứng hoặc có lông.
- Hoa: cụm hoa thường thẳng đứng hay cong. Một số loài có cuống hoa nằm
ngang hay chúc xuống, nhưng hầu hết có cuống hoa dựng đứng. Phần lớn các loài
chỉ có một hoa riêng lẻ nhưng một vài loài có hơn một thể có nhiều hoa trong một

cụm
hoa. Hoa gồm lá đài lưng và lá đài hợp ở vòng ngoài và ba cánh hoa ở vòng
trong. Hoa có lông mềm dài ở gần mép gốc, có hình thìa, bầu dục, trứng rộng hay
tròn. Cánh hoa hình mũi giáo hẹp hoặc xoắn ốc hẹp dần từ gốc lên đến đỉnh. Cánh
hoa giữa thứ ba biến dạng rõ rệt thành một môi giống như cái bao hoặc hình chiếc
hài. Môi có ba thùy với thùy giữa lõm sâu và hai thùy bên vòng quanh. Mép thùy
giữa có thể cuộn và
o trong hình thành ống ở gốc môi hay không cuộn. Nhị bất thụ
của vòng ngoài và nhụy cái hợp thành cột nhị - nhụy. Hai nhị đực hữu thụ của vòng
trong có chỉ nhị ngắn dính liền ở phía sau núm nhụy và hai bên cuốn cột. Bầu dưới,
một ô, đính noãn bên là điểm đặc trưng của chi này. Hầu hết bầu có lông tơ, hình
trụ, màu xanh lá cây hay đỏ tía xỉn.
- Quả: dạng quả na
ng, khô, dài, mở ở gần đỉnh bằng 6 rãnh nứt. Quả chin
trong điều kiện tự nhiên sau khi thụ phấn từ 6 đến 10 tháng.



7

Lan Hài Đài cuộn lan Hài Đốm lan Hài Hồng
(P. appletonianum) (P. concolor) (P. delenatii)


Lan Hài Lông lan Hài Lục lan Hài Hằng
(P. hirsutissimum) (P. gratrixianum) (P. hangianum)


Lan Hài Tía lan Hài Vàng lan Vân Hài
(P. purpuratum) (P. villosum) (P. callosum)

Hình 1. 1 Một số loài lan Hài của Việt Nam

8
1.1.3 Sinh thái

Chi Paphiopedilum chắc chắn có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á,
trong đó có Việt Nam. Các loài nguyên thủy nhất của chi này được tìm thấy ở Đông
Nam Á, chủ yếu ở nam Trung Quốc và bắc Việt Nam, mỗi loài đều có khu phân bố
rất hạn chế [1]. Sự di cư liên tục của các loài tổ tiên và sự phân ly tỏa tròn thành
nhiều loài đặc hữu địa phương thường có khu phân bố xa nhau đã mở rộng khu
phân bố xuống phía na
m và phía đông.
Tính đặc hữu hẹp có lẽ là đặc điểm nổi bật của các loài thuộc chi này. Có đến
72% số loài đã biết là loài đặc hữu rất hẹp, một số có khu phân bố ít hơn 100km
2
.
Rất nhiều loài mới được phát hiện ở một hoặc một vài địa điểm. Hầu hết các loài
đều có đặc tính phân bố hẹp và rải rác, không tập trung vào một vùng riêng biệt. Chỉ
có chưa đến 12% các loài của chi này là có khu phân bố tương đối rộng [1].
Các loài lan Hài là một cấu phần không thể thiếu của rừng nguyên sinh và
chúng có thể bị tuyệt chủng một cách nhanh chóng và không thể phục hồi khi các
quần xã tự nhiên bị con người phá hủy [1]. Trong rừng núi của Việt Nam, nơi còn
sót lại những mảnh rừng nguyê
n sinh đa dạng nhất, các loài lan Hài rất phong phú.
Về mặt sinh thái, các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm.
Một nhóm sống ở vùng núi đá vôi phía bắc Việt Nam và nhóm còn lại sống ở khu
vực có đá mẹ là silicat, đá phiến và cát kết. Trong rừng, lan Hài có thể mọc trên đất,
đá và phụ sinh. Mỗi loài thường có loại môi trường sống ưa thích mặc dù sự thay
đổi cũng đã đư
ợc ghi nhận nhưng rất ít. Khoảng 22% là địa lan (mọc trên đất), 8%

mọc trên đá, còn lại là phụ sinh [1].
Tại Việt Nam, lan Hài thường phân bố ở vùng có lượng mưa lớn, độ ẩm cao.
Tuy nhiên do đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên thường chúng phải
trải qua một thời kỳ khô hạn và nhanh chóng phục hồi khi mùa mưa trở lại. Độ ẩm

9
xung quanh rễ, kiểu đất và độ pH, sự có mặt của các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và
cường độ ánh sáng là các nhân tố quan trọng trong sự hình thành và phát triển của
các quần thể lan Hài.
Trong rừng nguyên sinh, lan Hài phân bố đều nhau ở các hướng của sườn
núi. Nhưng trong các vùng rừng đã bị xuống cấp, lan Hài có khuynh hướng phát
triển ở các sườn núi phía bắc, đông bắc và tây bắc của núi. Ngày nay, thường chỉ
tìm thấy lan Hài mọc thành từng đám nhỏ. Nhưng những đám lớn với hàng ngà
n
chồi hoa trước đây chắc chắn không phải là hiếm. Các nơi sống tự nhiên bị phá hủy
bởi con người, sự thay đổi các điều kiện môi trường và việc thu hái lan để bán là
những nguyên nhân chính gây ra sự tuyệt chủng nhanh chóng của lan Hài trên khắp
các vùng của Việt Nam [1].

1.1.4 Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam

Với sự hiện hữu của hơn 20 loài thuộc chi Paphiopedi
lum, Việt Nam là một
trong các quốc gia có nguồn lan Hài tự nhiên phong phú nhất. Không những phong
phú về chủng loại, Việt Nam còn có nhiều loài lan Hài đặc hữu có giá trị thẩm mĩ
cao, được thế giới ưa chuộng. Điều này đã tạo nên tình trạng thu thập và xuất khẩu
lan Hài một cách ồ ạt, không kiểm soát, dẫn đến việc lan Hài ngày càng hiếm trong
tự nhiên. Được coi là một trong các thực vật chỉ thị tình trạng môi trường, lan Hài
rất nhạy cảm với các thay đổi của môi trường sống. Với tình trạng môi trường tự
nhiê

n bị khai thác cạn kiệt như hiện nay, lan Hài đang biến mất nhanh chóng.
Lan Hài và các loài thuộc bộ Lan là những loài thực vật bị đe dọa biến mất
trước tiên khi môi trường sống tự nhiên bị suy thoái. Nền kinh tế phát triển nhanh
chóng dẫn đến ô nhiễm môi trường cùng với diện tích rừng nguyên sinh bị suy giảm
nhanh chóng do hoạt động khai t
hác làm giảm đi nơi sống tự nhiên của lan Hài gây

10
ra nguy cơ tuyệt chủng nhiều loài lan Hài ở Việt Nam hiện nay.
Bảng 1: Các nhóm lan Hài Việt Nam theo thứ tự hạng bảo tồn của Tổ chức
Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN).
Tình trạng Loài
Đã bị tuyệt chủng P. malipoense var. hiepii
Đã tuyệt chủng ngoài thiên nhiên
P. vietnamense
Đang có nguy cơ tuyệt chủng trầm trọng
P. delenatii
Đang có nguy cơ tuyệt chủng
P
. aspersum, P. barbigerum var.Lokianum,
P
. callosum, P. dianthum, P. emersonii,
P
. gratrixianum, P. hangiannum, P. helenae,
P
. hanryanum, P. herrmannii, P. malipoense
v
ar.Jackii, P. malipoense var.malipoense,
P
. micranthum, P. purpuratum,

P
. tralienianum
Sắp tuyệt chủng
P
. appletoniaum, P. concolor,
P. hirsutissimum var Chiwuawnum,
P
. hirsutissimum var. Esquirolai, P. villosun
v
ar Annamense
Thiếu dẫn liệu
P
. affine, P. datalanse,
P
. villosum var. boxalli

Nguyên nhân thứ hai dẫn đến sự biến mất của chủng lan quý này là việc thu
hái trên quy mô lớn của người dân địa phương để xuất khẩu bất hợp pháp ra thị
trường nước ngoài, chủ yếu là thị trường Hồng Kông, Đài Loan, Nhật Bản, Hoa Kỳ

11
và Châu Âu. Một lượng lớn lan Hài Việt Nam, trong đó có nhiều loài đặc hữu đang
có nguy cơ tuyệt chủng đã được nhiều nước nhập khẩu. Từ khoảng thập niên 1990
việc thu hái diễn ra ồ ạt đã làm trữ lượng lan Hài giảm sút một cách nhanh chóng
dẫn đến nguy cơ tuyệt chủng của nhiều loài lan Hài vốn trước đây khá phổ biến [1].
Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên trong khi việc nhân giống
in vitro dòng lan này vẫn được ch
o là rất khó, nhiều chương trình quốc gia về bảo
tồn loài hoa quý này đã được triển khai, chủ yếu là thu thập, phân loại, nghiên cứu
về các loài lan Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên của chúng. Một công trình

hợp tác quốc tế về lĩnh vực này là mô tả các giống lan Hài của Việt Nam của nhóm
tác giả Leonid Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp (2004).
Cho đến nay, việc nhân giống loài lan quý này hầu như vẫn đư
ợc tiến hành
bằng cách gieo hạt hoặc tách các mầm cây từ cây mẹ. Phương pháp này vừa không
hiệu quả vừa cho hệ số nhân rất thấp, không đủ đáp ứng nhu cầu thị trường. Là
nhóm hoa kiểng được nhiều người yêu thích, các loài lan Hài được nhiều nhà khoa
học trong và ngoài nước nghiên cứu nhằm mục đích nhân giống vô tính như: Nuôi
cấy chồi và chóp lá (Allenberge, 1976); Kích thích tạo chồi bên và cây con
(Nieman, 1980; Sampolinski, 1983; Stewart & Button, 1977); Phân lập tế bào trần
của các loài lan Hài (Price & Earl, 1984); Nuôi cấy mô sẹo (Lin, 2000); Tạo dòng
lan Hài in vitro (Huang, 2001); Tái sinh cây lan Hài từ nuôi cấy lá (Cheng et al,
2004); Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật gây tạo vết thương, sử dụng phương phá
p
nuôi cấy lỏng và kéo dài đốt thân (Dương Tấn Nhựt, 2007); Nhân giống in vitro và
tạo đột biến (Lê Quang Luân, 2007); Nhân giống lan Hài Hằng (Paphiopedilum
hangianum) và Hài Tam Đảo (Paphiopedium gratrixianum) (Viện Ứng dụng Công
nghệ, 2009); Lai tạo giống lan Hài (Trần Phạm Anh Tuấn, 2009).



12
1.1.5 Sơ lược về lan Hài Hồng và Vân Hài

1.1.5.1 Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii)

Lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii Guillaum) là
một trong những loài đặc hữu hẹp nhất của Việt Nam [1].
Với vẻ đẹp đặc sắc của hoa và cả lá cây, lan Hài Hồng hiện
nay là một trong các loài hoa được ưa chuộng và có giá trị

kinh tế cao trên thị trường cây cảnh thế giới.
Hình 1.2. Hài Hồng
Lan Hài Hồng được phát hiện lần đầu từ khoảng năm 1922 do một nhà điều
tra người Pháp tên là Poilane ở gần thành phố Nha Trang [1]. Những cây này s
au đó
được các nhà làm vườn Pháp trồng thành công ở Pháp. Sau một thời gian lai giống,
các thế hệ con cháu của chúng hiện nay đã thích nghi với điều kiện sinh trưởng ở
Pháp và trở nên dễ trồng.
Hình thái học: Cây thân cỏ mọc trên đá hoặc đất với 5-7 lá mọc thành 2 hàng. Lá
từ hình bầu dục tới bầu dục thuôn, tù và có 3 răng nhỏ ở chóp, dài tới 11cm, rộng 3-
3,9cm, mép có lông rìa ở gần gốc, các đốm khảm xanh lá cây nhạt và thẫm ở mặt
trên, chấm
dày màu tía ở dưới. Cụm hoa 1-2 hoa, rất hiếm khi 3; cuống hoa dài tới
22cm, xanh, đốm tía, phủ lông trắng cứng; lá hoa hình bầu dục tới hình trứng, dài
1,2-1,5cm, rộng 1cm, xanh đốm tía, có lông ngắn; cuống hoa và bầu dài tới 5,5cm,
màu xanh, có đốm tía, phủ lông. Hoa có đường kính 7,5-8cm, màu hồng nhạt với
môi hồng hoặc hồng-tía, có đốm đỏ và vàng trên nhị lép, có lông ở cả mặt trong và
ngoài. Lá đài lưng hình trứng, chóp tù tới gần nhọn, dài 1,7-3,5cm, rộng 1,8-2,5cm.
Lá đài hợp tương tự, dài 1,
9-3cm. Môi hình bầu dục tới hình gần cầu, dài 2,5-
3,8cm. rộng 2,5-3cm, mép cuốn vào trong, có lông tơ nhỏ. Nhị lép hơi lồi, hình

13
trứng, chóp tù, dài 14-17mm, rộng 13-16mm, có lông ria. Bộ nhiễm sắc thể 2n=26
[1].
Đặc điểm sinh thái: Khu phân bố của lan Hài Hồng trong tự nhiên chắc chắn ít hơn
100km
2
, chủ yếu ở các tỉnh Đắc Lắc và Khánh Hòa thuộc khu vực Nam Trung Bộ
[1]. Không giống như các loài lan có quan hệ thân thuộc thường mọc trên núi đá

vôi, lan Hài Hồng mọc trên đất có đá mẹ là đá granit và gơnai. Chúng mọc phổ biến
dưới bóng râm ở những khe hở có rêu trên những vách đá dốc hoặc trong lổ hổng,
chỗ lõm của mặt thềm các vách đá granit trong rừng cây lá rộng thường xanh ở độ
cao từ 750-1300m. Thời gian ra hoa là khoảng tháng 12 đến sau Tết âm lịch.
Ph
ân loại: lan Hài Hồng có tên khoa học là Paphiophedilum delenatii Guillaum.
hay Cypripedium delenatii Guillaumin. hoặc Paphiopedilum delenatii f. albinum
Braem. thuộc tổ Parvisepalum Aver. &Cribb, dưới chi Parvisepalum Karas.&
Saito, chi Paphiopedilum Pfitzer, họ Lan Orchidaceae, bộ Lan Orchidales, phân lớp
Hành Liliidae, lớp Một lá mầm Monocotyledoneae, ngành Hạt kín
Angiospermatophyta [1],[14]. Lan Hài Hồng được xếp trong nhóm lan Hài nguyên
thủy, rất tách biệt và có các đặc điểm ít nhiều thể hiện sự trung gian giữa các chi
[1].
Tình trạng hiện na
y ngoài tự nhiên: đang có nguy cơ tuyệt chủng trầm trọng.

1.1.5.2 Vân Hài (Paphiopedilum callosum)

Được mô tả từ cuối thế kỷ 19, Vân Hài hiện được trồng rất phổ biến trong
khi ngoài thiên nhiên hầu như không còn tìm được do bị khai thác quá mức. Bên
cạnh vẻ đẹp quyến rũ của lá và hoa, dễ trồng và dễ khai thác cũng là một trong các
nguyên nhân khiến loài hoa quyến rũ này nhanh chóng bị cạn kiệt ngoài tự nhiên

14
[1]. Hầu hết các mô tả về Vân Hài là dựa trên các cây được trồng. Theo các nghiên
cứu của nhóm tác giả Leonid (2004) thì hiện nay ở Việt Nam khó có thể tìm thấy
Vân Hài trong môi trường hoang dại, hầu hết Vân Hài được bày bán trên thị trường
trong nước đều có nguồn gốc từ Lào và Camphuchia.
Hình thái học: Cây thân cỏ mọc trên đất hoặc đôi khi trên đá với 3-5 lá. Lá hình
bầu dục hẹp, bầu dục thuôn hoặc hình trứng ngược, thường có 3 răng ở đỉnh nhọn,

dài 10-20cm, rộng 3,2-4,8cm, phủ lông rìa ở gốc, đốm khảm tối và sáng ở mặt trên,
đôi khi đốm tía ở mặt dưới gần gốc. Cụm 1 hoa, hiếm khi 2 hoa, cao 20-40cm;
cuống hoa tía, phủ lông tía, dài 15-20cm, lá hoa hình trứng tới hình bầu dục, nhọn
hoặc gần nhọn, dài 1,5-2,8cm, rộng 1,4-2cm, màu xanh, đôi khi có đốm tía, có lông
rìa. Hoa to, rộng 8-11cm, cánh hoa trắng, xanh hoặc vàng với một phần ba đỉnh
màu tía, có đốm nâu thẫm ở mép trên và đôi khi ở nửa dưới, đôi khi cong lại, ít
nhiều hì
nh chữ S, dạng lưỡi, tù hoặc tròn ở đỉnh, có lông rìa nâu hạt dẻ; môi nâu tía
nhạt, vàng tươi ở gốc, có các mụn lồi tía nâu ở các thùy bên
cong, thường có gân xanh ô liu. Lá đài trắng có điểm vài đốm
tía ở nửa dưới, gân tía và xanh; lá đài lưng có các mụn lồi nhỏ
màu bạc ở gần gốc, hình trứng ngược tới gần tròn, chóp nhọn
đột ngột; lá đài hợp hình lòng chảo, bầu dục tới hình mũi giáo
rộng, nhọn. Nhị lép hình bán nguyệt, màu trắng hoặc vàng
tươi với gâ
n xanh thẫm, có các thùy bên cong hình lưỡi liềm
hẹp; cuống và bầu dài 3 – 6,5cm, màu xanh có đốm tía, phủ
lông tía. Bộ nhiễm sắc thể 2n = 32 [1]. Hình 1.3: Vân Hài
Đặc điểm sinh thái: Vân Hài là
một trong các loài lan Hài có khu phân bố rộng
nhất. Vân Hài là loài tự nhiên, đặc hữu của vùng Đông Nam Á [1]. Chúng được tìm
thấy rải rác cách xa nhau ở Thái Lan, Camphuchia, Lào và Việt Nam (khu vực Nam
Trung Bộ và Tây Nguyên). Vân Hài thường được tìm thấy trong tự nhiên mọc thành
từng đám lớn ở khu vực rừng nguyê
n sinh rậm, cây lá rộng thường xanh, mưa theo
mùa và không có thời kỳ thật sự lạnh. Thường mọc ở độ cao từ 800-1100m vùng

15
núi đá granit hoặc đá silic dọc theo các sườn suối, trên mùn lá hoặc đá phủ rêu ở nơi

có ánh sáng khá nhiều và khí hậu tương đối khô. Ra hoa vào khoảng từ tháng 4 đến
tháng 6 hàng năm [1].
Phân loại: Vân Hài có tên khoa học là Paphiopedilum callosum thuộc tổ Barbata
(Kraenzl.), dưới chi Paphiopedilum, chi Paphiopedilum Pfitzer, họ Lan
Orchidaceae, bộ Lan Orchidales, phân lớp Hành Liliidae, lớp Một lá mầm
Monocotyledoneae, ngành Hạt kín Angiospermatophyta [1].
Tình trạng hiện nay ngoài tự nhiên: đang bị tuyệt chủng.

1.2 KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Haberlandt
(1902) là người đầu tiên đã đưa ra quan niệm mỗi tế bào bất kỳ
của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá
thể hoàn chỉnh [2]. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã
phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể
sinh vật đó.
Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể tái biệt hóa và phát
triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào [18]. Cho đến
nay con người đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn
chỉnh từ một tế bào riêng lẻ. Tính toàn năng của tế bào chính là cơ sở lý luận của
phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật.
Nuôi cấy m
ô thực vật là một thuật ngữ được dùng rộng rãi để mô tả việc nuôi
cấy tất cả các phần của thực vật (tế bào, mô, cơ quan) trong điều kiện vô trùng trên
môi trường dinh dưỡng thích hợp [2]. Tế bào nuôi cấy thường phải là các tế bào có
nhân hoàn chỉnh mang toàn bộ thông tin di truyền của loài đó, trong điều kiện thích
hợp có thể phân hóa và phát triển thành cây hoàn chỉnh. Các hệ thống nuôi cấy m
ô

16

thực vật thường được dùng để nghiên cứu các vấn đề liên quan đến thực vật như
sinh lý học, sinh hóa, di truyền học và cấu trúc thực vật. Kỹ thuật này hiện nay cũng
được sử dụng nhiều trong nhân giống thực vật, sản xuất giống sạch bệnh…, nhất là
đối với các loài thực vật quý, có giá trị cao [2],[16],[18].
1.2.1 Môi trường nuôi cấy mô thực vật

Mô thực vật nuôi cấy trong môi trường nhân tạo cũng cần đư
ợc cung cấp
các chất dinh dưỡng giống như cây được cung cấp từ đất. Các chất cơ bản trong
môi trường nuôi cấy bao gồm: các chất vô cơ, nguồn cacbon và các chất hữu cơ và
nước [2],[18].
Tùy theo từng loài thực vật và giai đoạn phát triển của mô mà thành phần
môi trường có thể thay đổi để phù hợp. Ngoài ra thành phần môi trường còn phụ
thuộc vào mục đích nuôi cấy là nhân giống, lưu trữ giống hoặc theo mục tiêu
nghiên cứu [6],[16].

1.2.
1.1 Các loại muối khoáng

Các chất vô cơ bao gồm các thành phần đa lượng (hàm lượng trên 0,5mM)
và vi lượng (hàm lượng dưới 0,05mM) trong môi trường nuôi cấy được thực vật sử
dụng như là thành phần cơ bản để tổng hợp chất hữu cơ [2],[18]. Các dạng ion của
muối đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển xuyên màng, điều hòa áp
suất thẩm thấu và điện thế m
àng [23].
Các loại muối khoáng được bổ sung vào môi trường với nồng độ trên
0,5mM được xếp vào nhóm đa lượng. Các muối khoáng được xếp vào nhóm đa

17
lượng chứa các nguyên tố như: Nitrogen (N), Phosphorus (P), Sulfur (S), Potassium

(K), Calcium (Ca) và Magnesium (Mg) thường được bổ sung vào môi trường ở
dạng muối mà thực vật dễ hấp thu.
Các loại muối khoáng vi lượng vẫn thường được bổ sung vào trong môi
trường nuôi cấy để bảo đảm cho sự phát triển của mô như: Boron (B), Chlorine
(Cl), Copper (Cu), Manganese (Mn)… với nồng độ dưới 0,05mM.

1.2.1.2 Vitamin

Vitamin thường giữ vai trò co-enzyme trong các phản ứng sinh hóa. Vitamin
được bổ sung vào môi trường nuôi cấy dưới nhiều dạng và nhiều nồng độ kh
ác
nhau, nhưng tất cả các môi trường đều có Thiamin (Vitamin B
1
). Các Vitamin
thường dùng là: Myo-inositol, nicotinic acid (Vitamin PP), Pyridoxine HCl
(Vitamin B
6
)…

1.2.1.3 Chất điều hòa sinh trưởng

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật còn được gọi là Phytohormone, là các
chất hữu cơ có bản chất hóa học khác nhau nhưng đều có vai trò điều hòa các hoạt
động sinh lý, các quá trình sinh trưởng, sinh sản và phát triển của thực vật, được
tổng hợp với một lượng rất nhỏ trong các cơ quan khác nhau của thực vật [23]. Chất
điều hòa sinh trưởng có vai trò trong quá trình phân chia tế bào, phân hóa m
ô, phát
sinh phôi, ảnh hưởng đến những hoạt động sống chủ yếu của thực vật như quang
hợp, hô hấp…[18]. Chính vì vậy, chúng có tác dụng điều hòa sinh trưởng và phát