Nghiên cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối bacillus spp làm nguyên liệu probiotic cung cấp carotenoid

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN H U T M

Nghiên cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất
sinh khối Bacillus spp. làm nguyên liệu
probiotic cung cấp carotenoid

U N ÁN TIẾN S DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – năm 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRẦN H U T M

Nghiên cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất
sinh khối Bacillus spp. làm nguyên liệu
probiotic cung cấp carotenoid
CHUY N NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM
M

SỐ: 62 73 01 01

Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. TRẦN CÁT ĐÔNG
GS.TS. NGUY N V N TH NH

Thành phố Hồ Chí Minh – năm 2014


i

ời cam oan
Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trình bày
trong Luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.
Người viết cam đoan

Trần Hữu Tâm


ii

Mục lục
Lời cam đoan
anh m c các chữ viết t t
Danh m c các bảng
Danh m c các hình
anh m c các s đ
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chư ng 1. T NG QU N T I LI U

1.1. Vi khuẩn Bacillus
1.2. Carotenoid
1.3. Các vi sinh vật sinh carotenoid
1.4. Nghiên cứu về vi khuẩn sinh carotenoid trên thế gi i và t i Việt Nam
1.5. Thực phẩm chức n ng
1.6. Probiotic
1.7. Thực phẩm chức n ng và probiotic đối v i sức khỏe
1.8. Lên men sản xuất sinh khối
Chư ng 2. Đ I T NG, V T LI U, THI T
V PH NG PH P
NGHI N CỨU
2.1. Đối tượng
2.2. Vật liệu
2.3. Trang thiết b
2.4. Phư ng pháp nghiên cứu
Chư ng 3. K T QUẢ NGHI N CỨU
3.1. Phân lập, sàng l c s b và đ nh danh vi khuẩn
3.2. Khảo sát các đặc điểm probiotic
3.3. Khảo sát điều kiện nuôi cấy và đường cong t ng trưởng
3.4. Khảo sát đặc điểm sinh carotenoid
3.5. Khảo sát môi trường thay thế
3.6. Khảo sát thông số lên men thu bào tử trong môi trường lỏng
3.7. Lên men thu bào tử
3.8. S b xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu sinh khối
3.9. Thử nghiệm đ c tính
3.10. Khả n ng hấp thu, tích lũy carotenoid từ T14 và
1.1 ở gan chu t
3.11. Khả n ng tr tiêu chảy do kháng sinh của DD1.1, AT14
3.12. Khả n ng ứng d ng của T14 và
1.1 trên m t số d ng chế phẩm

i
iv
vi
ix
x
1
3
3
6
16
19
21
22
23
25
28
28
28
29
30
49
49
55
63
65
70
81
86
99

105
111
111
115


iii

Chư ng 4.
N LU N
4.1. Vi khuẩn sinh carotenoid
4.2. Môi trường thay thế
4.3. Lên men thu bào tử và tiêu chuẩn nguyên liệu sinh khối
4.4. Đ c tính của hai chủng T14 và DD1.1
4.5. Hấp thu, tích lũy carotenoid từ T14 và
1.1 ở gan chu t
4.6. Khả n ng điều tr tiêu chảy liên quan đến kháng sinh
4.7. Khả n ng ứng d ng bào tử T14 và
1.1 sinh carotenoid trên m t số
d ng chế phẩm
K T LU N
KI N NGH
NH M C C C C NG TR NH Đ C NG
T I LI U TH M KHẢO
PH L C

120
120
124
127

129
130
131
132
134
136

PL-1


iv

Danh mục các ch vi t t t
2SG

2xSchaeffer's sporulation agar

ADN

Acid Deoxyribonucleic

BHT

Butylated Hydroxyl Toluene

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

CDSM

Chemically Defined Sporulation Medium

CFU

Colony Forming Unit

CLSI

Clinical and Laboratory Standards Institute

CMC

Carboxymethyl cellulose

DNS

3,5-dinitrosalicylic acid

DPPH

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

DSM

Difco Sporulation Medium

EDTA

Ethylendiamin Tetraacetic Acid

EtOH

Ethanol

FAO

Food and Agriculture Organization

Hb

Hemoglobin

HCT

Hematocrit

HDL

High Density Lipoprotein

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

I

Intermediate

IBS

Irritable Bowel Syndrome

IL

Interleukin

LDL

Low Density Lipoprotein

MHA

Muller Hilton Agar

MIC

Minimal Inhibitory Concentration

NA

Nutrient Agar

Na CMC

Sodium Carboxy Methyl Cellulose

NAFLD

Nonalcoholic Fatty Liver Disease

NB

Nutrient Both


v

NCBI

National Center for Biotechnology Information

NK

Natural Killer

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

OD

Optical Density

PCI

Phenol Chloroform Isoamin Alcohol

PCR

Polymerase Chain Reaction

PCV

Packed cell volume

PDA

Photodiode Array Detector

PVP

Polyvinylpyrrolidone

R

Resistant

rADN

Ribosom Acid Desoxynucleic

RBC

Red Blood Cell

RSM

Response Surface Methodology

S

Susceptible

SD

Standard Deviation

SDS

Sodium Dodecyl Sulphat

SGOT

Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase

SGPT

Serum Glutamic Pyruvic Transaminase

TCA

Tricloacetic acid

TSA

Trypticase Soy Agar

TSB

Trypticase Soy Broth

UV-Vis

Ultra violet – Visible

WBC

White Blood Cell


vi

Danh mục các bảng
ảng 1.1. Chế phẩm chứa carotenoid đang lưu hành t i VN ............................................ 14
ảng 1.2. Các vi sinh vật sinh carotenoid và các carotenoid đặc trưng ............................. 17
ảng 2.1. C chất cảm ứng và cách đ c kết quả thử nghiệm khả n ng sinh enzym .......... 34
ảng 2.2. Pha dung môi khảo sát tính tuyến tính ............................................................. 37
ảng 2.3. Môi trường từ d ch chiết tự nhiên .................................................................... 38
ảng 2.4. Tỉ lệ nguyên liệu trong d ch chiết ..................................................................... 39
ảng 2.5. Đ n v mã hóa theo CC ................................................................................. 40
ảng 2.6. ấu hiệu sức khỏe của chu t ........................................................................... 43
ảng 2.7. Lô chu t thử nghiệm........................................................................................ 46
ảng 2.8. ố trí thí nghiệm.............................................................................................. 46
ảng 3.1. Kết quả phân lập vi sinh vật từ các n i lấy mẫu ............................................... 49
ảng 3.2. Các chủng có khả n ng t o bào tử và màu s c trên môi trường SM ............... 50
ảng 3.3. Ho t tính chống oxy hóa của các mẫu đối chứng ............................................. 51
ảng 3.4. Ho t tính b t giữ gốc tự do PPH của các mẫu................................................ 52
ảng 3.5. Đỉnh hấp thu của m t số carotenoid đối chứng trong cloroform ....................... 53
ảng 3.6. Đỉnh hấp thu của các mẫu thử .......................................................................... 53

ảng 3.7. Kết quả đ nh danh ............................................................................................ 54
ảng 3.8. Khả n ng sinh enzym của các chủng vi khuẩn phân lập ................................... 55
ảng 3.9. Số lượng và phần tr m bào tử vi khuẩn sống sót trong môi trường acid............ 57
ảng 3.10. Số lượng và phần tr m bào tử vi khuẩn sống sót trong muối mật .................... 59
ảng 3.11. MIC chủng chuẩn v i kháng sinh .................................................................. 61
ảng 3.12. Thống kê số lo i kháng sinh b đề kháng bởi các chủng khảo sát.................... 62
ảng 3.13. Điều kiện phát triển thích hợp của 5 chủng .................................................... 64
ảng 3.14. Thời gian thế hệ và các đặc tính phát triển của 5 chủng .................................. 64
ảng 3.15. Kết quả khảo sát tính tuyến tính ..................................................................... 65
ảng 3.16. Kết quả đ lặp l i của phư ng pháp ............................................................... 66
ảng 3.17. Đỉnh chính trên s c k đ d ch chiết carotenoid của các chủng Bacillus ......... 68
ảng 3.18. Thời gian carotenoid đ t cao nhất của 5 chủng khảo sát ................................. 70
ảng 3.19. Hàm lượng carotenoid trên môi trường thay thế của các chủng Bacillus......... 70
ảng 3.20. Ảnh hưởng của hàm lượng nguyên liệu trong d ch chiết................................. 74


vii

ảng 3.21. Kết quả khảo sát khả n ng t o bào tử trên các lo i môi trường lỏng .............. 75
ảng 3.22. Kết quả khảo sát khả n ng t o bào tử trên các lo i môi trường r n ................ 76
ảng 3.23. Ảnh hưởng khoáng đến sinh khối, hàm lượng carotenoid ............................... 77
ảng 3.24. Hệ số tư ng quan R2 của mô hình trên môi trường lỏng và r n ...................... 79
ảng 3.25. Giá tr p của mô hình trên môi trường lỏng và r n .......................................... 79
ảng 3.26. Phư ng trình đáp ứng mô hình trên môi trường lỏng và r n ........................... 79
ảng 3.27. N ng đ khoáng cho lượng bào tử tối ưu và carotenoid theo dự đoán ............ 80
ảng 3.28. Kết quả khảo sát tỷ lệ truyền chủng trên T14............................................... 81
ảng 3.29. Kết quả khảo sát tốc đ khuấy trên T14....................................................... 82
ảng 3.30. Kết quả khảo sát lưu lượng oxy của T14 ..................................................... 83
ảng 3.31. Kết quả khảo sát lượng chủng đầu vào của
ảng 3.32. ảng kết quả khảo sát tốc đ khuấy của

ảng 3.33. Kết quả khảo sát pO2 của

1.1 ......................................... 84
1.1.............................................. 84

1.1 .................................................................... 85

ảng 3.34. Ứng d ng quy trình lên men thu bào tử T14 trên ĐK15K mẻ 7 L ............. 95
ảng 3.35. Ứng d ng quy trình lên men thu bào tử

1.1 trên Đ5K mẻ 7 L ................ 95

ảng 3.36. Giá thành của môi trường thay thế r n so v i th ch SM .............................. 97
ảng 3.37. Ứng d ng quy trình lên men thu bào tử T14 trong môi trường lỏng ............. 97
ảng 3.38. Ứng d ng quy trình lên men thu bào tử

1.1 trong môi trường lỏng ........... 97

ảng 3.39. Giá thành của môi trường thay thế lỏng so v i môi trường SM.................... 98
ảng 3.40. Chi phí cho 1 mẻ và giá của 109 bào tử/liều vi khuẩn sinh carotenoid............. 98
ảng 3.41. Tiêu chuẩn nguyên liệu sinh khối bào tử T14 .............................................. 99
ảng 3.42. Tiêu chuẩn nguyên liệu sinh khối bào tử DD1.1........................................... 100
ảng 3.43. Kiểm tra đ lặp l i của phư ng pháp đếm .................................................... 103
ảng 3.44. Khảo sát đ ổn đ nh của nguyên liệu chứa bào tử T14 hoặc

1.1 ........... 104

ảng 3.45. Cân nặng c thể chu t của liều thử nghiệm cao nhất .................................... 105
ảng 3.46. Thể tr ng chu t dùng theo thời gian thử nghiệm .......................................... 107
ảng 3.47. Cân nặng các c quan giữa các lô sau 60 ngày thử nghiệm .......................... 108

ảng 3.48. Các thông số huyết h c của chu t sau 60 ngày thử nghiệm .......................... 109
ảng 3.49. Thông số b ch cầu của chu t sau 60 ngày thử nghiệm ................................. 109
ảng 3.50. Thông số tiểu cầu của chu t sau 60 ngày thử nghiệm ................................... 109
ảng 3.51. Các chỉ số sinh hóa của máu chu t sau 60 ngày thử nghiệm ......................... 110
ảng 3.52. Hàm lượng carotenoid trong gan chu t sau 2 tháng thử nghiệm. .................. 111


viii

ảng 3.53. Tỷ lệ chu t chết sau bốn ngày thử nghiệm ................................................... 112
ảng 3.54. Tỷ lệ chu t khỏi tiêu chảy sau bốn ngày thử nghiệm .................................... 112
ảng 3.55. T ng cân trung bình của các lô chu t sử d ng liều từ 10 6 bào tử trở lên........ 114
ảng 3.56. T ng cân trung bình của các lô chu t sử d ng liều 2x10 5 bào tử................... 114
ảng 3.57. Đánh giá cảm quan của sữa chua bổ sung bào tử B. marisflavi DD1.1......... 116
ảng 3.58. Đánh giá cảm quan của sữa chua bổ sung bào tử B. infantis AT14 .............. 116
ảng 3.59. Đ ổn đ nh của bào tử vi khuẩn sinh carotenoid trong sữa chua ................... 117
ảng 3.60. Đ ổn đ nh của chế phẩm cốm ..................................................................... 118
ảng 3.61. Kết quả theo dõi mật đ bào tử trong 12 tháng đối v i hỗn d ch ................... 119


ix

Danh mục các hình
Hình 1.1. Các cấu tr c chính của bào tử Bacillus subtilis ................................................... 4
Hình 1.2. Chu trình hình thành bào tử và nảy mầm trở l i của Bacillus .............................. 5
Hình 1.3. Mô hình cấu tr c c bản của các carotenoid ....................................................... 7
Hình 1.4. Các d ng cấu tr c của carotenoid ....................................................................... 7
Hình 1.5. M t số carotenoid thường gặp ............................................................................ 8
Hình 1.6. V trí carotenoid trong màng tế bào .................................................................. 10
Hình 1.7. Sự t o thành vitamin

từ β-caroten ................................................................. 11

Hình 3.1. Khuẩn l c của m t số chủng vi khuẩn phân lập ................................................ 49
Hình 3.2. M t số chủng Bacillus phân lập được trên môi trường SM ............................ 51
Hình 3.3. S c k đ của các carotenoid chuẩn ................................................................. 65
Hình 3.4. Đường tuyến tính của canthaxanthin ................................................................ 66
Hình 3.5. S c k đ HPLC của d ch chiết carotenoid từ các chủng Bacillus ..................... 67
Hình 3.6. Lượng carotenoid t o ra theo thời gian của 6 chủng khảo sát ............................ 69
Hình 3.7. S c k đ carotenoid của môi trường đối chứng ............................................... 71
Hình 3.8. S c k đ carotenoid của chủng

1.1 trên các môi trường ............................. 73

Hình 3.9. Tư ng tác K+-Ca2+, K+-Fe2+ v i bào tử

1.1 trên môi trường r n .................. 80

Hình 3.10. Tư ng tác K+-Ca2+, K+-Fe2+ v i carotenoid

1.1 trên môi trường r n .......... 80

Hình 3.11. Thu bào tử T14 trên h p và bào tử T14 trư c, sau tinh chế ....................... 96
Hình 3.12. Thu bào tử

1.1 trên h p và bào tử

Hình 3.13. Sinh khối bào tử của T14 và

1.1 trư c, sau tinh chế ..................... 96

1.1 sau đông khô ....................................... 98

Hình 3.14. Vi phẫu thận, lách và ru t ............................................................................ 107
Hình 3.15. Vi phẫu gan .................................................................................................. 108


x

Danh mục các s

ồ

S đ 2.1. Sàng l c vi khuẩn dựa trên ho t tính chống oxy hóa và phổ UV-Vis ............... 31
S đ 2.2. Thu d ch chiết từ sinh khối vi khuẩn ............................................................... 31
S đ 2.3. Quy trình chiết carotenoid từ gan chu t .......................................................... 45
S đ 3.1. Quy trình nuôi cấy thu bào tử T14 trên môi trường r n ................................. 87
S đ 3.2. Quy trình nuôi cấy thu bào tử

1.1 trên môi trường r n ............................... 89

S đ 3.3. Quy trình nuôi cấy thu bào tử T14 trong môi trường lỏng............................. 91
S đ 3.4. Quy trình nuôi cấy thu bào tử

1.1 trong môi trường lỏng ........................... 93


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các gốc tự do và các d ng oxy ho t đ ng được hình thành từ quá trình chuyển hóa của c
thể hoặc tác đ ng từ bên ngoài, sau khi hình thành, những tác nhân này sẽ tấn công các đ i
phân tử như protein, lipid, polysaccharid, đặc biệt là acid nucleic t o nên các tổn thư ng, là
m t trong những nguyên nhân của bệnh tật và sự lão hóa [40].
Để bổ sung cho c thể chống l i các gốc tự do và các d ng oxy ho t đ ng, các chất chống
oxy hóa trong tự nhiên như flavonoid, polyphenol, carotenoid, … được cho là an toàn h n
vì ít t o ra các d ng đ ng phân cấu tr c có khả n ng ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con
người so v i từ con đường tổng hợp hóa h c nên được quan tâm và nghiên cứu rất nhiều.
Trong đó, carotenoid được quan tâm nhiều nhất, vì bên c nh chức n ng chống oxy hóa,
carotenoid còn đóng vai trò là tiền tố của vitamin

, làm giảm tỷ lệ m c các bệnh m n tính

như ung thư, tim m ch [43],[53],[83].
Đ ng vật bậc cao không thể tự tổng hợp được carotenoid mà phải sử d ng carotenoid từ
thực vật, tảo, nấm hoặc vi khuẩn thông qua chế đ

n. Trên th trường, có rất nhiều chế

phẩm chứa carotenoid, hầu hết các carotenoid sử d ng trong các chế phẩm này được chiết
xuất từ thực vật hoặc bằng tổng hợp hóa h c. Trong những n m gần đây, việc dùng ngu n
vi khuẩn để sản xuất m t số carotenoid quan tr ng đã được quan tâm nghiên cứu. Việc sử
d ng vi khuẩn sinh carotenoid làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức n ng có nhiều ưu
điểm như dễ nuôi cấy ở qui mô l n, t ng trưởng nhanh, sử d ng c chất rẻ tiền, ngoài ra
còn có những giá tr c ng thêm như có thể bổ sung thêm các men trợ tiêu hóa, ổn đ nh
trong bảo quản. Trong số các vi khuẩn sinh carotenoid, Bacillus có nhiều ưu điểm vì ch ng
có khả n ng t o bào tử bền v i nhiệt nên dễ bảo quản và sản xuất [25],[96].
Hiện nay, trên thế gi i cũng chưa có nhiều nghiên cứu sâu và toàn diện về vi khuẩn
Bacillus sinh carotenoid để cung cấp carotenoid, riêng t i Việt Nam, từ n m 2008 trở l i
đây, nhóm nghiên cứu của Trần Cát Đông đã tham gia vào dự án Colorspore sàng l c các

chủng vi khuẩn có khả n ng sinh carotenoid từ vùng biển và h ở Việt Nam, từ đó đến nay
đã có khoảng 7 công bố dư i d ng bài báo khoa h c, dự án đã sàng l c được m t số chủng
vi khuẩn Bacillus có khả n ng sinh carotenoid như: Bacillus indicus, Bacillus firmus,
Bacillus alcalophilus, Bacillus catenulatus, Bacllus aquimaris,… có khả n ng t o bào tử
ứng d ng làm thực phẩm chức n ng, mở ra nhiều triển v ng cho việc nghiên cứu vi khuẩn


2

Bacillus để cung cấp carotenoid. Tuy nhiên, các nghiên cứu này mặc dù đã thu được m t
số kết quả có giá tr và

nghĩa, nhưng vẫn chưa đầy đủ, vì vậy vẫn đang tiếp t c triển khai.

o đó đề tài Nghiên cứu xây dựng quy trình pilot sản xuất sinh khối Bacillus spp.
làm nguyên liệu probiotic cung cấp carotenoid”, là m t hư ng tiếp cận m i, không
những có

nghĩa khoa h c mà còn có

nghĩa thực tiễn, làm c sở để đưa ra những chế

phẩm sử d ng vi khuẩn Bacillus làm ngu n cung cấp carotenoid. Đề tài được triển khai v i
các m c tiêu sau:
1. Phân lập vi khuẩn Bacillus sinh carotenoid và khảo sát đặc điểm probiotic.
2. Khảo sát khả n ng sinh carotenoid từ các chủng vi khuẩn phân lập được.
3. Khảo sát môi trường thay thế và điều kiện nuôi cấy để xây dựng quy trình lên men.
4. Xây dựng quy trình lên men ở quy mô pilot để sản xuất sinh khối Bacillus làm
nguyên liệu probiotic cung cấp carotenoid.
5. Xây dựng tiêu chuẩn c sở của nguyên liệu.

6. Nghiên cứu khả n ng ứng d ng sinh khối thu được.


3

Chư ng 1. TỔNG QU N TÀI IỆU
1.1. Vi khuẩn Bacillus
1.1.1. Đặc iểm chung
Theo Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Bacillus thu c gi i Bacteria, ngành
Firmicutes, l p Bacilli, b Bacillales, h Bacillaceae, chi Bacillus, Geobacillus [73].
Vi khuẩn Bacillus được Ehrenberg mô tả s m nhất là Vibrio subtilis” vào n m 1835.
N m 1872, Cohn đặt l i tên là Bacillus subtilis. Đó là thành viên của m t chi l n và đa
d ng, được Cohn nghiên cứu đầu tiên, là m t phần của h Bacillaceae. Đặc điểm phân
biệt của h này là sự t o bào tử, bào tử d ng tròn, oval, hoặc tr trong tế bào, do đó được
g i là n i bào tử. ào tử ch u nhiệt, được Cohn mô tả đầu tiên ở B. subtilis và sau đó Kock
mô tả sự xâm nhiễm ở B. anthracis [73].
Vi khuẩn Bacillus được phân lập từ nhiều n i như đất, nư c, thức n, ru t, phân, cỏ khô,
cống rãnh…Tế bào hình que, thẳng hoặc gần thẳng, kích thư c 0,3 - 2,2 x 1,2 - 7 µm.
Thường di đ ng, roi điển hình nằm ở hai bên thân. ào tử có khả n ng ch u nhiệt, chỉ có
m t bào tử trong m t tế bào. Phản ứng Gram của Bacillus có thể thay đổi trong chu trình
sống, tế bào trẻ ch c ch n Gram dư ng [73].
H Bacillaceae được Fischer trình bày có hệ thống n m 1895 thì n i bào tử được dùng
trong khóa phân lo i vi khuẩn. Đặc điểm của chi Bacillus là tất cả có n i bào tử, hiếu khí,
có thể b t bu c hay tùy , hình que và t o catalase. Tuy nhiên, cũng có m t số loài thu c
chi Bacillus không t o bào tử như B. thermoamylovorans, B. halodenitrificans [73].
Phần l n các chi Bacillus phát triển tốt trên các môi trường dinh dưỡng thư ng m i
g m các thành phần c bản như: pepton, cao th t, glucose, lactose, chất khoáng; mặc dù
trong m t số trường hợp đặc biệt, các môi trường này cần được điều chỉnh pH hoặc
n ng đ

muối (pH từ 2 - 11, và n ng đ

muối từ dư i 2 - 25%). Trong phòng thí

nghiệm, v i điều kiện tối ưu, thời gian thế hệ của Bacillus khoảng 25 ph t [52],[73].


4

1.1.2. Bào tử
Cấu trúc của bào tử vi khuẩn Bacillus
Quan sát bào tử khi không nhu m, thấy có l p màu đen ở mép rất sáng và chiết quang, cấu
tr c bào tử g m nhiều l p:
- Vỏ bào tử (spore coat):

ao quanh l p màng ngoài, g m những protein di đ ng, phức

t p, g m ba l p khác nhau. Có chức n ng bảo vệ l p peptidoglycan của bào tử khỏi b
các tác nhân bên ngoài tấn công như enzym, UV, chất oxy hóa,…
- Cortex: L p peptidoglycan dày đặc biệt, bao quanh màng trong. Cortex là thành phần
quan tr ng gi p bào tử không b khử nư c, do đó t o sự bền vững và d ng sống tiềm
sinh. L p cortex tích điện âm, trong quá trình nảy mầm, l p này sẽ nhanh chóng b thủy
giải do enzym có sẵn trong bào tử.
- Lõi bào tử (core): Đây là thành phần quan tr ng nhất của bào tử, bao g m đầy đủ các
thành phần gần giống như tế bào sinh dưỡng như protein bào tư ng, ribosom, thể nhân
chứa

N. Tuy nhiên, thành phần bào tư ng của bào tử chứa khoảng 30 – 50% nư c,

trong khi tế bào sinh dưỡng là 70 – 88% nư c.

Vỏ ngoài
Vỏ trong
Cortex
Lõi
Nucleoid

Hình 1.1. Các cấu trúc chính của bào tử Bacillus subtilis
Ngu n: T. C. eaman và c ng sự, 1982” [22]
Quá trình hình thành bào tử và nảy mầm của bào tử vi khuẩn Bacillus
Khi gặp điều kiện bất lợi, vi khuẩn Bacillus có khả n ng hình thành n i bào tử. Quá trình
bào tử hóa b t đầu từ cuối thời kỳ sinh trưởng, khi gặp điều kiện thức n c n kiệt hoặc có
tích lũy sản phẩm trao đổi chất có h i.


5

ào tử vi khuẩn Bacillus là có khả n ng ch u nhiệt, ch u chất đ c và enzym phân giải.
Trong thời kỳ m i b t đầu hình thành n i bào tử, vi khuẩn Bacillus tiết ra chất kháng
khuẩn tiêu diệt các vi khuẩn xung quanh.
Ở các loài thu c chi Bacillus được nghiên cứu, quá trình hình thành bào tử tư ng tự nhau.
Toàn b quá trình diễn ra trong khoảng từ 8 -10 giờ, b t đầu bằng việc phân chia

N,

tách m t nhiễm s c thể bao quanh bởi màng sinh chất t o thể nguyên sinh là d ng bào tử
s khởi, và kết th c bằng việc hình thành vỏ bào tử, r t hết nư c t o thành bào tử trưởng
thành và phóng thích ra khỏi tế bào mẹ.
Sự nảy mầm bào tử là quá trình chuyển bào tử từ tr ng thái ngủ sang tế bào sinh dưỡng của
vi khuẩn. Quá trình này g m ba giai đo n: ho t hóa, nảy mầm và sinh trưởng. Có thể ho t
hóa bào tử bằng cách nâng nhiệt trong thời gian ng n, h thấp pH, xử l hóa chất. Ví d

bào tử B. subtilis có thể được ho t hóa bằng cách đun 65 oC trong 5 ph t.

Tăng trưởng

Giai đoạn VI,VII
Trưởng thành, ly
giải tế bào mẹ

Nảy mầm

Giai đoạn V
Tạo vỏ
Cortex

Chu kỳ
sinh dưỡng

Thành tế bào

Tạo bào tử

Màng tế bào

Sinh sản
nhân đôi

Phân bào bất đối xứng

Giai đoạn IV
tạo cortex

Tiền bào tử
Vách ngăn
Tế bào mẹ
Giai đoạn II

Giai đoạn III

Hình 1.2. Chu trình hình thành bào tử và nảy mầm trở lại của Bacillus
Ngu n: J. Errington, 2003” [44]
Môi trường kích thích tạo bào tử vi khuẩn Bacillus
Hầu hết vi khuẩn Bacillus cần m t môi trường đặc biệt để có thể cảm ứng t o bào tử. Sự
t o bào tử được cảm ứng sau pha t ng trưởng do n ng đ dinh dưỡng b c n kiệt, đặc biệt
là việc thiếu ngu n carbon, nit , hoặc phospho. Có thể sử d ng các môi trường nhân t o để


6

cảm ứng t o bào tử như

SM ( ifico Sporulation Agar), 2SG (2xSchaeffer's sporulation

agar).

1.1.3. Ứng dụng
Vi khuẩn Bacillus được ứng d ng nhiều trong sản xuất enzym công nghiệp vì nó có khả
n ng sinh các lo i enzym như amylase, alkaline phosphatase, cellulase, cyclodextran
glucanotransferase, galactosidase, chitinase, glucose isomerase, glucanase, lipase, serin
protease, urease,… Ngoài ra, Bacillus còn có khả n ng sinh các chất chuyển hóa s cấp
như nucleotid xanthanylic acid, inosinic acid, guanilic acid,…. Trong điều kiện sống thiếu

dinh dưỡng, vi khuẩn Bacillus còn có khả n ng sinh các lo i kháng sinh peptid như
surfactin hay subtilin có ho t tính kháng khuẩn và kháng khối u [9],[109].
o khả n ng t o bào tử ch u nhiệt, sinh các lo i enzym ngo i bào và khả n ng đối kháng
v i các vi sinh gây bệnh như Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, Candida
albicans, E. coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Shigella, Vibrio spp.,…nên Bacillus
spp. được sử d ng làm probiotic trong ch n nuôi và thủy sản [8],[9].
Vi khuẩn Bacillus được ứng d ng nhiều làm probiotic để điều tr cũng như phòng bệnh ở
người, trên th trường Việt Nam hiện cũng đang phát triển nhiều sản phẩm probiotic có tác
d ng phòng tr bệnh như Enterogermina của công ty Sanofi-Synthelabo, là sản phẩm có
thành phần là bào tử Bacillus clausii, có tác d ng cân bằng hệ vi khuẩn ru t, gi p phòng
tr bệnh tiêu chảy cấp, tiêu chảy kéo dài.
M t số vi khuẩn Bacillus cũng t o ra m t số lo i carotenoid như β-caroten, carotenoid C50
đang được nghiên cứu và ứng d ng làm probiotic vì đây là loài có khả n ng sinh bào tử t n
t i trong những điều kiện nhiệt đ cao và môi trường acid của d ch v d dày [69].

1.2. Carotenoid
1.2.1. Cấu trúc và phân loại
Cấu trúc c bản
Các carotenoid là các hợp chất được t o thành từ tám đ n v isopren (ip) có cấu tr c s p
xếp b đảo ngược ở trung tâm của phân tử t o nên b khung carbon (C40).

khung này

có thể được thay đổi bằng cách: (1) t o vòng ở m t đầu hoặc cả hai đầu của phân tử để t o


7

thành bảy nhóm cấu tr c khác nhau, (2) thay đổi mức hydro hóa và (3) thêm các nhóm
chức chứa oxy [29], [37].

Isopren - ip
ip

ip

ip

ip

ip

ip

ip

ip

Hình 1.3. Mô hình cấu trúc c bản của các carotenoid

Hình 1.4. Các dạng cấu trúc của carotenoid
( ) Cấu tr c c bản của m t carotenoid không có vòng (lycopene) và m t carotenoid có hai vòng
(ß-caroten). ( ) ảy cấu tr c khác nhau tìm thấy trong các carotenoid tự nhiên
Ngu n: G. Britton, 1995” [29]

Phân loại
Các carotenoid có thể được phân lo i dựa trên cấu tr c hóa h c thành hai lo i như sau: (1)
Caroten được t o thành từ carbon và hydro; (2) Oxycarotenoid hoặc còn g i là các
xanthophyl được t o thành từ carbon, hydro và oxy. Nói m t cách khác, các carotenoid có
chứa m t hoặc nhiều nhóm chức chứa oxy được g i là các oxycarotenoid hoặc

xanthophyl, còn các carotenoid chỉ chứa hydrocarbon được g i là các caroten [37]


8

Ngoài ra, các carotenoid còn được phân lo i thành carotenoid s cấp hoặc carotenoid thứ
cấp dựa trên đặc điểm sinh tổng hợp của ch ng. Các carotenoid s cấp là nhóm các hợp
chất cần cho thực vật trong quá trình quang tổng hợp (ß-caroten, violaxanthin, và
neoxanthin), trong khi các carotenoid thứ cấp là các carotenoid có trong hoa, quả thực vật,
có chức n ng t o màu (α-caroten, ß-cryptoxanthin, zeaxanthin, antheraxanthin, capsanthin,
capsorubin) [37].

Hình 1.5. Một số carotenoid thường gặp
Ngu n: F. Delgado-Vargas và c ng sự, 2000” [37]

1.2.2. Đặc iểm h a l
Phản ứng oxy h a
Đối v i các carotenoid, phần quan tr ng nhất của phân tử là chuỗi polyen. Đây là m t hệ
giàu electron, có tính phản ứng cao, dễ b tấn công bởi các chất có ái lực điện tử, là đặc
tính quan tr ng có liên quan đến phản ứng oxy hóa và hóa h c các gốc tự do [29].


9

Các carotenoid tinh khiết, ngay cả ở d ng kết tinh, rất dễ b ảnh hưởng bởi phản ứng oxy
hóa sau khi phân lập và có thể b phá hủy nhanh chóng nếu bảo quản mẫu trong điều kiện
có oxy, thậm chí có rất ít oxy. Ngoài ra, trong in vivo, các carotenoid cũng rất dễ b hư
hỏng nếu tiếp x c v i các nhân tố oxy hóa.

ấu hiệu của carotenoid b phá hủy là sự tẩy

màu, ví d , hiện tượng mất màu do phá vỡ chromophor [29].
Phản ứng oxy hóa đã được sử d ng từ rất lâu để xác đ nh s b carotenoid. Có thể sử d ng
các phản ứng hóa h c có kiểm soát để phá vỡ các nối đôi carbon - carbon khác nhau trong
chuỗi polyen, t o thành các apocarotenal và apocarotenon cũng như các mảnh nhỏ từ sự
phá vỡ carotenoid [29].
Hấp thu ánh sáng
Sự hấp thu n ng lượng ánh sáng của m t phân tử hữu c là quá trình t o ra tr ng thái kích
thích của phân tử đó khi b chiếu sáng. Carotenoid có tr ng thái n ng lượng kích thích
tư ng đối thấp khi hấp th ánh sáng bởi vì có sự di chuyển của các điện tử d c theo chuỗi
liên kết đôi liên hợp của phân tử. Sự chuyển tiếp từ tr ng thái c bản đến m t tr ng thái
kích thích cao h n cho phép carotenoid có thể hấp thu ánh sáng trong vùng khả kiến và có
màu vàng cam, đỏ. Đỉnh hấp thu cực đ i và hình d ng của quang phổ hấp thu là công c sử
d ng để xác đ nh các đặc tính cấu tr c của carotenoid [39].

1.2.3. Tác dụng sinh học và ứng dụng carotenoid trong y học
1.2.3.1. Sự hấp thu, phân bố trong c thể
Tuy t n t i trong tự nhiên v i m t số lượng l n nhưng qua nghiên cứu chỉ có khoảng 20
lo i carotenoid được hấp thu và dự trữ trong c thể người. Carotenoid là những phân tử k
nư c nên thường ở trong l p màng kép của tế bào và giữ vai trò điều hòa tr ng thái lỏng
của màng. Tính k nư c của ch ng sẽ giảm khi có sự gia t ng các nhóm thế phân cực (chủ
yếu là các nhóm hydroxyl tự do hoặc được ester hóa v i các glycosid). Điều này cũng ảnh
hưởng đến v trí của carotenoid trong màng tế bào (Hình 1.4).
Ví d , các dẫn chất dihydroxy carotenoid như lutein và zeaxanthin nằm vuông góc v i bề
mặt màng để đưa các nhóm hydroxy về vùng phân cực. Ngược l i, các caroten như βcaroten và lycopen có v trí song song v i bề mặt màng để được giữ l i trong phần thân
dầu. Vì thế, các phân tử carotenoid có ảnh hưởng quan tr ng trong đ dày, đ bền và tính


10

lỏng của màng. Để di chuyển vào vùng thân nư c, các carotenoid có thể t o thành d ng
phức v i protein. Khi chức n ng sinh h c của màng tế bào b suy giảm, xu hư ng chung
của tế bào là t ng lượng carotenoid phân cực và giảm lượng carotenoid không phân cực vì
các carotenoid phân cực có vai trò làm giảm tính lỏng của màng do đó sẽ gi p bảo vệ màng
tế bào chống l i các yếu tố tác đ ng [29],[31],[32].

Carotenoid
không phân
cực

Carotenoid
phân cực

Hình 1.6. Vị trí carotenoid trong màng t bào
Ngu n: Milan Certik và c ng sự, 2009” [33]
Carotenoid là thành phần thường gặp trong máu và mô của người và đ ng vật. Ở người
khỏe m nh, carotenoid hiện diện ở mô mỡ (80-85%), gan (8-12%) và c (2-3%) và m t
lượng nhỏ trong các mô khác. Hầu hết carotenoid được hấp thu ở ru t non. Tuy nhiên, m t
số carotenoid và các tiền tố vitamin

được hấp thu ở võng m c và các c quan khác [23].

Hàm lượng carotenoid được hấp th tuỳ thu c vào từng người, sự hấp thu và chuyển hoá
carotenoid cũng đặc hiệu ở mỗi c thể. Huyết thanh người chứa β-caroten, cryptoxanthin,
lycopen, lutein, m t lượng nhỏ zeaxanthin, các xanthophyl khác và các polyen như
phytofluen, phytoen [23].

1.2.3.2. Tác dụng sinh học và vai tr của carotenoid ối với y học
Ti n tố của vitamin

ngăn ng a các bệnh v thị giác

Khoảng 800 lo i carotenoid từ tự nhiên đã được xác đ nh, trong đó khoảng 10% là tiền tố
của vitamin

, trong đó β-caroten có giá tr cao nhất, chiếm 15-30% toàn b carotenoid

trong huyết thanh. Khi vào đến thành ru t non m t phân tử β-caroten sẽ phân hủy t o thành
hai phân tử vitamin

nhờ x c tác của caroten dioxigenase (Hình 1.5) [43].

β-caroten cũng có các tác d ng tư ng tự vitamin

như chống khô giác m c của m t, t ng

đ nh y của m t, chống bệnh quáng gà. Vitamin

là m t vitamin tan trong dầu, nên khi

quá liều sẽ được dự trữ và gây đ c cho c thể. Ngược l i, nếu dùng nhiều β-caroten thì chỉ


11

có m t lượng nhất đ nh caroten được chuyển hóa t o thành vitamin

, số còn l i sẽ được

dự trữ ở mô mỡ [85],[105].

H 3C
CH 3

CH 3

CH 3

H 3C

CH 3

CH 3

CH 3

β -caroten
CH 3

CH3

caroten dioxigenase
H 3C

CH3

CH3

CH3
OH

Vitamin A (dạng retinol)

CH 3

Hình 1.7. Sự tạo thành vitamin

t β-caroten

Ngu n: A. El-Agamey và c ng sự, 2004” [43]
Lutein và zeaxanthin là hai carotenoid được tìm thấy ở điểm vàng võng m c và có tác d ng
chống l i sự oxy hóa, bảo vệ sự toàn vẹn của điểm vàng. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh
sự liên hệ giữa việc sử d ng lutein và zeaxanthin v i sự giảm nguy c m c bệnh thoái hóa
điểm vàng và đ c thủy tinh thể [39].
B t gi gốc tự do
Carotenoid b t giữ các gốc tự do trong các phản ứng dây chuyền của quá trình oxy hóa v i
vai trò của m t chất ng t m ch để ng n chặn sự sản sinh các sản phẩm đ c h i đối v i c
thể.

o đó, carotenoid được bào chế ở d ng dược phẩm bổ sung hay thực phẩm chức n ng

đem l i lợi ích sức khỏe cho con người [78].
Cơ chế của carotenoid trong bắt giữ gốc tự do không có oxy [78]

car (H) + R·
R· + car

RH + car·
R- + car·+

Cơ chế của carotenoid trong bắt giữ gốc tự do có oxy [29]

R· + O2
car + ROO·
[ROO_car· ] + ROO·

ROO·
[ROO_car· ]
ROO-car-OOR


12

Các sản phẩm [car.], [ROO_car.] tiếp t c được trùng hợp và làm b t giữ gốc tự do. Như
vậy carotenoid có tác d ng ng n cản các gốc ROO. tham gia vào các phản ứng gốc tự do
tiếp theo nên quá trình oxy hóa trong c thể b dừng l i.
Ngăn ng a ung thư
V i khả n ng chống l i các gốc tự do tấn công vào các

N làm sai lệch vi trí các cặp

base dẫn đến đ t biến gây ung thư, carotenoid đã và đang được nghiên cứu trên lâm sàng
để chứng minh khả n ng giảm nguy c hay ng n ngừa ung thư như ung thư phổi, ung thư
da, ung thư v , tuyến tiền liệt, thực quản…[83],[100].
ên c nh đó, carotenoid có khả n ng làm gia t ng chức n ng hệ miễn d ch như tác đ ng
lên các tế bào b ch cầu vốn có vai trò rất l n trong việc nhận diện và tiêu diệt các tế bào
ung thư. M t số nghiên cứu đã phát hiện β-caroten có khả n ng làm t ng ho t đ ng của các
tế bào NK (Natural Killer) có vai trò tiêu diệt không chỉ các tế bào ung thư mà cả các tế
bào b nhiễm virus. β-caroten còn được chứng minh làm gia t ng đáng kể các tế bào miễn
d ch khác như interleukin IL-2 và C 4 trên các bệnh nhân ung thư và polyp đ i tràng
[83],[94]. Trong m t nghiên cứu khác, β-caroten đã được chứng minh làm giảm hàm lượng

cytochrome P450 ở gan chu t, và làm t ng ho t đ ng của aryl hydrocarbon hydroxylase ở
ru t chu t, có vai trò quan trong trong quá trình chuyển hóa và giải đ c của m t số tác
nhân gây ung thư tiềm n ng [71].
Ph ng ng a bệnh tim mạch
Nguyên nhân chủ yếu của các tai biến về tim m ch có liên quan đến x vữa đ ng m ch.
Nhiều nghiên cứu cho rằng trong vành đ ng m ch b đóng bởi các lipoprotein xấu g i là
L L (low density lipoprotein), lipoprotein này thẩm thấu vào thành m ch và t o ra những
tế bào mỡ xốp, những dải mỡ và màng mỡ. Sự bám chặt của L L vào thành m ch diễn ra
rất chậm. Tuy nhiên, khi các L L b các gốc tự do có oxy tấn công sẽ t o ra các sản phẩm
peroxy hóa, nhanh chóng làm tổn thư ng thành đ ng m ch, làm hư hao các c , và tiến sâu
vào thành đ ng m ch v i tốc đ nhanh h n 20 - 30 lần tác đ ng của L L.

o vậy, m t

trong những bư c quan tr ng trong việc ng n ngừa các bệnh l tim m ch là phòng chống
sự oxy hóa L L thông qua các chất chống oxy hóa như carotenoid [23],[39].
Chống l o h a
Carotenoid được xem là các chất chống oxy hóa do có thể tác d ng được v i d ng oxy đ n
b i (1O2), d ng oxy ho t đ ng m nh gây phá hủy mô. o đó, carotenoid có tác d ng bảo vệ


13

c thể chống l i sự hủy ho i mô do gốc tự do, đ ng thời ng n chặn tác đ ng của các gốc tự
do lên cấu tr c colagen ở da. Vì vậy, carotenoid được bổ sung vào trong các mỹ phẩm gi p
chống l i sự lão hóa da và ng n ngừa ung thư da [23],[78].

1.2.4. Phư ng pháp ịnh tính và ịnh lượng carotenoid
Phổ UV-vis
Carotenoid có đỉnh hấp thu cực đ i trong vùng 450 – 500 nm, do đó phổ UV-vis rất có

nghĩa trong đ nh tính, sàng l c carotenoid. Trong phư ng pháp này, đ hấp thu cực đ i,
hình d ng, và cấu tr c của quang phổ là đặc tính của các chromophor trong carotenoid
[37].
Phư ng pháp s c k lỏng hiệu năng cao (HP C)
Nghiên cứu đầu tiên sử d ng s c k lỏng hiệu n ng cao (HPLC) để phân tích đ nh lượng
carotenoid được công bố bởi Stewart và c ng sự vào n m 1971. Kể từ nghiên cứu này,
HPLC trong phân tích đ nh lượng carotenoid phát triển rất nhanh, và cho đến ngày nay,
hầu như tất cả các nghiên cứu được công bố về carotenoid đều sử d ng kết quả đ nh lượng
bằng HPLC [50],[89].
M t c t mốc quan tr ng trong phư ng pháp phân tích đ nh lượng carotenoid bằng HPLC là
kỹ thuật kết hợp v i đầu dò chuỗi diod quang (photodiod array detector-P

). Hiện nay,

HPLC được đánh giá là tiêu chuẩn vàng” để đ nh lượng carotenoid [27],[50],[89].
Đối v i m t số carotenoid có tính không ổn đ nh, HPLC kết hợp v i đầu dò khối phổ
(LC/MS) là phư ng pháp được lưu

sử d ng [37],[56].

Các phư ng pháp ịnh lượng carotenoid khác
Ngoài phư ng pháp HPLC là tiêu chuẩn vàng” và là phư ng pháp sử d ng nhiều nhất để
phân tích đ nh lượng các carotenoid, còn có m t số phư ng pháp khác được sử d ng. Điển
hình là các phư ng pháp s c k kết hợp v i đo quang, phư ng pháp s c k c t kết hợp
h ng ngo i FTIR (Fourier transform infrared spectroscopy) và NIR (Near infrared
spectroscopy), phư ng pháp Raman c ng hưởng, phư ng pháp s c k mao dẫn (CEC),...
Các phư ng pháp này tuy không có đ chính xác bằng phư ng pháp HPLC nhưng vẫn có
khả n ng ứng d ng cao, và có thể sử d ng thay thế cho phư ng pháp HPLC trong m t số
trường hợp [13],[27],[49],[81],[88].