Nghiên cứu ứng dụng quy trình xử lý tế bào gốc máu cuống rốn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

HUỲNH NGHĨA

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG
QUY TRÌNH XỬ LÝ
TẾ BÀO GỐC MÁU CUỐNG RỐN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH - Năm 2007


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

HUỲNH NGHĨA

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG
QUY TRÌNH XỬ LÝ
TẾ BÀO GỐC MÁU CUỐNG RỐN
CHUYÊN NGÀNH : BỆNH HỌC NỘI KHOA
Mã số: 3 01 31

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1.PGS. TRẦN VĂN BÉ
2.PGS. TS. TRẦN THỊ LIÊN MINH

TP. HỒ CHÍ MINH - Năm 2007


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả được trình bày trong luận án là trung thực và
chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào
khác.

Tác giả luận án

Huỳnh Nghóa


MỤC LỤC
TRANG PHỤ BÌA
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................
MỤC LỤC ...............................................................................................................
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................
DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ.................................................................................
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ......................................................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 5
1.1 Lược sử phát triển ngân hàng và ghép tế bào gốc MCR ............................. 5
1.2 Tế bào gốc tạo máu - sự hình thành và phát triển ...................................... 6
1.3 Máu cuống rốn............................................................................................ 10

1.4 Thu thập, xử lý và lưu trữ MCR ................................................................. 16
1.5 Kỹ thuật xử lý mẫu MCR ........................................................................... 22
1.6 Kỹ thuật tồn trữ lạnh mẫu MCR ................................................................ 27
1.7 Xét nghiệm đánh giá và kiểm tra chất lượng các sản phẩm MCR ............ 31
1.8 Ứng dụng lâm sàng ghép tế bào gốc từ MCR ............................................ 40
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 48
2.1 Thiết kế nghiên cứu.................................................................................... 48
2.2 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 48
2.3 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 50
2.4 Phân tích và xử lý số liệu thu thập ...................................................................... 70
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................................... 71
3.1 Kết quả tư vấn và sàng lọc trước thu thập MCR ........................................ 71
3.2 Kết quả thu thập MCR ............................................................................... 72
3.3 Kết quả xử lý MCR ................................................................................... 84
3.4 Kết quả nuôi cấy tế bào tạo khúm sau xử lý MCR .................................... 86
3.5 Kết quả sàng lọc tế bào MCR thu thập ...................................................... 98
3.6 Kết quả MCR dự trữ đông lạnh (- 1960c) sau xử lý .................................. 99
3.7 Kết quả thực nghiệm ghép tế bào MCR .................................................. 101
CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN .................................................................................. 104
4.1 Về sàng lọc người cho trước khi thu thập MCR ....................................... 104
4.2 Về quy trình thu thập mẫu MCR .............................................................. 106
4.3 Quy trình kỹ thuật xử lý MCR .................................................................. 121


4.4 Kết quả nuôi cấy tế bào sau xử lý mẫu MCR .......................................... 128
4.5 Quy trình dự trữ đông lạnh MCR sau xử lý ở -1960c ................................ 132
4.6 Về kết quả lây nhiễm do virus ................................................................. 136
4.7 Các xét nghiệm đánh giá chất lượng tế bào gốc từ MCR ........................ 137
4.8 Kết quả thực nghiệm ghép tế bào gốc MCR............................................ 140
KẾT LUẬN ....................................................................................................... 144

KIẾN NGHỊ ...................................................................................................... 146
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU .............................................
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................
PHỤ LỤC ...............................................................................................................
Phụ lục 1 ..............................................................................................................
Phụ lục 2 ..............................................................................................................
Phụ lục 3 ..............................................................................................................
Phụ lục 4 ..............................................................................................................
Phụ lục 5 ..............................................................................................................
Phụ lục 6.. .............................................................................................................
Phụ lục 7…………………………………………………………………………………………………………………………………………


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ALL

: Bệnh bạch cầu cấp dòng lymphô

AML

: Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy

anti HCV

: Kháng thể viêm gan virút C

BC

: Bạch cầu

BCHTT

: Bạch cầu hạt trung tính

BFU-E

: Tế bào tạo khúm dòng hồng cầu

CFC = CFU

: Tế bào tạo khúm = Đơn vò tạo khúm

CFU – E

: Đơn vò tạo khúm dòng hồng cầu

CFU – G

: Đơn vò tạo khúm dòng hạt

CFU – GEMM

: Đơn vò tạo khúm đa tiềm năng

CFU – GM

: Đơn vò tạo khúm dòng bạch cầu hạt, đại thực bào

CFU – L

: Đơn vò tạo khúm dòng lymphô

CFU – M

: Đơn vò tạo khúm dòng tủy

CFU – Meg

: Đơn vò tạo khúm dòng mẫu tiểu cầu

CFU-Total

: Đơn vò tạo khúm toàn bộ

CLL

: Bệnh bạch cầu mãn dòng lymphô

CLP

: Tế bào tiền thân chung dòng lymphô

CML

: Bệnh bạch cầu mãn dòng tủy

CMP

: Tế bào tiền thân chung dòng tủy

CMV

: Cytomegalo virus

CR1

: Lui bệnh hoàn toàn lần thứ nhất

DMSO

: Dimethylsulfoxide (chất bảo quản đông lạnh )

FLT3 – Ligand

: Một trong các yếu tố phát triển ( danh từ riêng)

GMP

: Tế bào tiền thân dòng đại thực bào-bạch cầu hạt


GVHD

: Bệnh mảnh ghép chống ký chủ

GVL

: phản ứng mảnh ghép chống ung thư

HbA

: Hemoglobin A

HbA2

: Hemoglobin A2

HbF

: Hemoglobin F (hemoglobin bào thai)

HbH.

: Hemoglobin H

HC

: Hồng cầu

HES

: Hydroxyethyl starch (chất làm kết tủa hồng cầu)

HLA

: Kháng nguyên hoà hợp tổ chức

HPCs

: Các tế bào gốc đa tiềm năng đầu tạo máu

HSXLMCR

: Hồ sơ xử lý máu cuống rốn

ICBTR

: Tổ chức đăng ký ghép máu cuống rốn quốc tế

KN

: Kháng nguyên

LT – HSC

: Tế bào gốc tạo máu dài hạn

LT-CIC

: Tế bào đầu tiên nuôi cấy lâu dài

MCR

: Máu cuống rốn

MEP

: Tế bào tiền thân dòng hồng cầu-Mẫu tiểu cầu

MMP

: Tế bào tiền thân đa tiềm năng

Pro-B

: Tiền tế bào Lympho B

Pro-DC

: Tiền tế bào nhánh

Pro-NK

: Tiền tế bào giết tự nhiên

Pro-T

: Tiền tế bào T

RLCH

: Rối loạn chuyển hóa

SL HC

: Số lượng hồng cầu

SLBC

: Số lượng bạch cầu

SLTB CD34+

: Số lượng tế bào CD34 dương tính


SLTBNTB

: Số lượng tế bào nhân toàn bộ

SLTC

: Số lượng tiểu cầu

ST – HSC

: Tế bào gốc tạo máu ngắn hạn

TBGMNV

: Tế bào gốc máu ngoại vi

TBGTM

: Tế bào gốc tạo máu

TBN

: Tế bào nhân

TBĐN

: Tế bào đơn nhân

TC

: Tiểu cầu

TLN

: Trọng lượng nhau

TMTƯ

: Tónh mạch trung ương

TPMCR

: Thành phần máu cuống rốn

TX

: Tủy xương

YTSK

: Yếu tố sản khoa


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần TBG tạo máu trong MCR và tủy xương .......................... 12
Bảng 1.2: Các kháng nguyên bộc lộ trên tế bào CD34+ .................................... 14
Bảng 1.3: So sánh kết quả loại bỏ hồng cầu và sự thu hồi tế bào nhân, ............. 24
Bảng 1.4: Kết quả so sánh tỉ lệ % thu hồi giữa Sepax và HES .......................... 25
Bảng 1.5: Tỉ lệ nhiễm trùng của các sản phẩm tế bào gốc của MCR ................ 33
Bảng 1.6 : Thống kê các đơn vò MCR đã được lưu trữ , sử dụng ở Châu Á ....... 40
Bảng 1.7 : Thống kê các đơn vò MCR đã được lưu trữ, sử dụng trên thế giới .... 41
Bảng 1.8: Kết quả ghép MCR ở trẻ em ............................................................... 44
Bảng 1.9: Kết quả sau ghép MCR của bệnh nhân người lớn .............................. 46
Bảng 1.10: So sánh ghép MCR với ghép tế bào gốc khác .................................. 47
Bảng 2.11: Trang thiết bò, dụng cụ lưu trữ MCR ................................................. 68
Bảng 3.12: Các lý do loại bỏ trước khi thu thập MCR ........................................ 72
Bảng 3.13: Các lý do loại bỏ sau khi thu thập MCR ........................................... 73
Bảng 3.14: Đặc điểm sản khoa của người cho MCR .......................................... 74
Bảng 3.15: Đặc điểm mẫu MCR thu thập ........................................................... 74
Bảng 3.16: Tương quan giữa các YTSK và thể tích MCR thu thập .................... 75
Bảng 3.17: Tương quan giữa YTSK và với số lượng TBNTB ............................. 76
Bảng 3.18: nh hưởng của các YTSK với phân nhóm TBN ............................... 77
Bảng 3.19: Kết quả thể tích,TBN mẫu MCR thu thập với phân nhóm TBN ...... 79
Bảng 3.20: Tương quan YTSK, thành phần MCR với SLTB CD34 + ................. 80
Bảng 3.21: Kết quả SLTB CD34+ theo phân nhóm TBN .................................. 83
Bảng 3.22: Đặc điểm mẫu MCR sau xử lý ........................................................ 84
Bảng 3.23: Kết quả giảm thể tích và loại bỏ hồng cầu sau xử lý ........................ 84
Bảng 3.24: Khả năng tăng số lượng TBN và tế bào CD34 + sau xử lý ............... 85


Bảng 3.25: Kết quả SLTBN, TBĐN của MCR trước và sau xử lý ..................... 85
Bảng 3.26: Kết quả tế bào CD34+ toàn bộ trước và sau xử lý ........................... 85
Bảng 3.27: Kết quả đếm tế bào sống trước và sau xử lý MCR ........................... 86
Bảng 3.28: Nguyên nhân mẫu MCR nuôi cấy khúm tế bào không thu hoạch .... 87

Bảng 3.29: Kết quả chung của nuôi cấy khúm tế bào của MCR sau xử lý ......... 88
Bảng 3.30: Kết quả YTSK, TPMCR liên quan đến khúm BFU – E................... 89
Bảng 3.31: Kết quả YTSK và TPMCR sau xử lý liên quan ................................ 91
Bảng 3.32: Kết quả YTSK , thành phần MCR liên quan nuôi cấy khúm tế bào..93
Bảng 3.33: Kết quả yếu tố sản khoa, thành phần MCR thu thập sau xử lý......... 95
Bảng 3.34: Tương quan giữa SLTB CD34+ và nuôi cấy khúm tế bào sau xử lý 97
Bảng 3.35: Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn, nhiễm vi nấm trước và sau xử lý MCR .......... 98
Bảng 3.36: Kết quả sàng lọc bệnh lây lan qua mẫu MCR .................................. 98
Bảng 3.37: Kết quả sàng lọc bệnh hemoglobin (trước khi xử lý) ........................ 99
Bảng 3.38: Kết quả loại bỏ MCR dự trữ đông lạnh (- 1960C) ............................ 99
Bảng 3.39: Kết quả đếm tế bào sống theo thời gian lưu trữ .............................. 100
Bảng 3.40: Kết quả so sánh thành phần MCR trước và sau lưu trữ ................... 100
Bảng 4.41: So sánh thể tích trung bình MCR thu thập ....................................... 108
Bảng 4.42: Sự tương quan giữa thể tích MCR thu thập và các yếu tố sản khoa 111
Bảng 4.43: So sánh số lượng TBNTB của MCR thu thập ................................. 112
Bảng 4.44: So sánh yếu tố sản khoa của tác giả Solves P ................................ 114
Bảng 4.45: So sánh kết quả số lượng tế bào CD34+ túi MCR .......................... 115
Bảng 4.46: So sánh yếu tố sản khoa với tế bào CD34+ của các nghiên cứu .... 116
Bảng 4.47: So sánh tỉ lệ nhiễm trùng, nhiễm nấm sau khi thu thập MCR ........ 118
Bảng 4.48: So sánh kết quả xử lý tế bào bằng kỹ thuật HES ........................... 123
Bảng 4.49: So sánh các thành phần MCR sau xử lý với các chất khác nhau .... 124
Bảng 4.50: So sánh nuôi cấy khúm tế bào sau xử lý MCR .............................. 129


Bảng 4.51: So sánh nuôi cấy tế bào với ngưỡng TBN 80x 107 .......................... 131
Bảng 4.52: Tỉ lệ % phục hồi phục hồi tế bào MCR sau lưu trữ 10 và 15 năm . 135
Bảng 4.53: So sánh các nguyên nhân loại bỏ MCR sau dự trữ đông lạnh......... 135
Bảng 4.54: So sánh do lây nhiễm virus .............................................................. 136
Bảng 4.55: Các xét nghiệm được khảo sát theo các quy trình........................... 138
Bảng 4.56: Các thành phần tế bào nhân, tế bào CD34+ và CFU của MCR ..... 140

Bảng 4.57: So sánh các thành phần MCR, HLA và tuổi bệnh nhân.................. 141
Bảng 4.58: Kết quả ghép tế bào gốc của MCR Tokyo cung cấp ..................... 141
Bảng 4.59: So sánh kết quả thời gian mọc mảnh ghép của 2 nguồn: ................ 142
Bảng 4.60: Thời gian sống toàn bộ sau ghép của MCR Tokyo ......................... 143


DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1: Kết quả khảo sát tư vấn và sàng lọc trước khi thu thập ................. 71
Biểu đồ 3.2: Kết quả số lượng mẫu MCR thu thập.............................................. 72
Biểu đồ 3.3: Các lý do loại bỏ sau khi thu thập MCR ........................................ 73
Biểu đồ 3.4: Sự tương quan giữa trọng lượng nhau và thể tích MCR ................. 75
Biểu đồ 3.5: Sự tương quan giữa TLN và SLTBNTB trước xử lý........................ 76
Biểu đồ 3.6: Sự tương quan giữa thể tích MCR và số lượng TBNTB trước xử lý 77
Biểu đồ 3.7: Biểu đồ hình hộp TLN và số lượng TBNTB theo phân nhóm ....... 78
Biểu đồ 3.8: Biểu đồ trọng lượng thai nhi và lượng TBNTB theo phân nhóm.... 78
Biểu đồ 3.9: Biểu đồ hình hộp phân chia TBNTB theo nhóm ............................. 79
Biểu đồ 3.10: Biểu đồ hình hộp thể tích trung bình MCR thu thập ..................... 80
Biểu đồ 3.11: Sự tương quan giữa tuổi sản phụ và số lượng TBCD34+ .............. 81
Biểu đồ 3.12: Sự tương quan giữa thể tích MCR và SLTB CD34+ ..................... 82
Biểu đồ 3.13: Sự tương quan giữa số lượng TBN trước xử lý ............................. 82
Biểu đồ 3.14: Biểu đồ hình hộp SLTB CD34+ trung bình của MCR thu thập .... 83
Biểu đồ 3.15: Biểu đồ kết quả nuôi cấy khúm tế bào sau xử lý ......................... 87
Biểu đồ 3.16: Sự tương quan của BFU-E với số lượng TBNTB sau xử lý ........... 90
Biểu đồ 3.17: Sự tương quan của BFU-E với trọng lượng em bé ........................ 90
Biểu đồ 3.18: Sự tương quan của CFU với trọng lượng thai nhi .......................... 92
Biểu đồ 3.19: Sự tương quan của CFU-GM với TBNTB sau xử lý...................... 92
Biểu đồ 3.20: Sự tương quan của CFU-GEMM với trọng lượng thai nhi............. 94
Biểu đồ 3.21: Sự tương quan của CFU-GEMM Mvới số lượng TBN sau xử lý .. 94
Biểu đồ 3.22: Sự tương quan của CFU-total với trọng lượng thai nhi.................. 96
Biểu đồ 3.23: Sự tương quan của CFU-total với số lượng TBNTB sau xử lý ...... 96

Biểu đồ 3.24: Sự tương quan của CFU-total với số lượng TBN sau xử lý ........... 97


Biểu đồ 3.25: Biểu đồ Kaplan Meier về thời gian sống toàn bộ sau ghép MCR102
Biểu đồ 4.26: Sự tương quan tế bào CD34+ và số lượng TBNTB (≥ 80 x 107 ) 117
Biểu đồ 4.27: Kết quả so sánh hiệu quả xử lý của các phương pháp .............. 126
Biểu đồ 4.28: Kaplan Meier so sánh thời gian sống toàn bộ sau ghép của ....... 143


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1: Sơ đồ sự tạo máu của tế bào gốc .......................................................... 8
Sơ đồ 2.2: Sơ đồ tuyển chọn và sàng lọc người cho MCR khi thu thập ............... 53
Sơ đồ 2.3: Tóm tắt quy trình xử lý chiết tách tế bào gốc từ MCR ....................... 57
Sơ đồ 2.4: Quy trình bảo quản đông lạnh – giải đông MCR................................ 59
Sơ đồ 2.5: Sơ đồ dò ghép tế bào máu gốc từ MCR ............................................... 65
Sơ đồ 4.6: Đảm bảo chất lượng mẫu MCR trước xử lý và tránh lãng phí ......... 120


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 : Máy tự động Sepax.............................................................................. 25
Hình 1.2: Phương pháp có bộ lọc ......................................................................... 26
Hình 1.3: Hệ thống xử lý tự động......................................................................... 26
Hình 2.4: Giai đoạn cắt dây máu cuống rốn ........................................................ 55
Hình 2.5: Thu thập MCR sau khi lấy bánh nhau ra ngoài tử cung ....................... 55
Hình 2.6: Phòng xử lý MCR sau khi thu thập...................................................... 67
Hình 2.7: Máy ly tâm lạnh ................................................................................... 67
Hình 2.8:Máy trộn, máy bơm tự động .................................................................. 67
Hình 2.9: Dụng cụ xử lý và lưu trữ lạnh MCR, hệ thống lưu trữ đông lạnh ........ 68
Hình 2.10: Máy đếm tế bào tự động và hệ thống máy Flow Cytometry ............ 69

Hình 3.11: Mẫu MCR sau xử lý ........................................................................... 86
Hình 3.12: Lập hồ sơ MCR sau xử lý ................................................................... 86
Hình 3.13: Khúm BFU-E lớn................................................................................ 88
Hình 3.14: Bốn khúm CFU-GM ........................................................................... 81
Hình 3.15: (A) Tế bào CD34 + nhuộm giem sa, (B) GFU- GEMM khổng lồ..... 88
Hình 3.16: Mẫu MCR được lưu trữ sau khi xử lý ............................................... 101
Hình 3.17: Mẫu MCR được lấy từ túi vận chuyển ............................................. 103
Hình 3.18: Mẫu MCR được rã đông ở 370C ....................................................... 103
Hình 3.19: Mẫu MCR được rút ra bằng ống chích 20cc....................................... 96
Hình 3.20: TBG MCR được truyền qua ống thông TMTƯ ................................ 103
Hình 3.21: MCR : đếm SLTBN; CD34; nuôi cấy khúm TB; đếm TB sống....... 103
Hình 3.22: Mẫu MCR được hoàn tất sau ghép ................................................... 103


1

MỞ ĐẦU
Hơn 30 năm qua, phương pháp ghép tuỷ xương khác gien đã được sử dụng
điều trò hàng ngàn bệnh nhân mắc bệnh ác tính và di truyền bẩm sinh của hệ tạo
máu. Hai yếu tố chính góp phần thành công trong ghép tuỷ xương khác gien là
sự lựa chọn người cho phù hợp kháng nguyên hoà hợp tổ chức (Human
Leucocyte Antigen : HLA ) và sự kiểm soát được bệnh mảnh ghép chống ký chủ
(Graft vesus host disease: GVHD) [41]. Người cho tủy là anh em ruột phù hợp
HLA thường không đủ, do đó phải tìm nguồn cho tuỷ từ trong cộng đồng có HLA
phù hợp. Tuy nhiên vẫn có một số bất lợi [41], [42]:
- Mất thời gian dài để tìm người cho phù hợp HLA: 1- 6 tháng (trung bình
3.5 tháng);
- Số người cho bò giới hạn ở những cộng đồng dân thiểu số và các chủng
tộc khác nhau;
- Người cho không có sẵn ở thời điểm cần ghép;

- Nguy cơ cao sự thải ghép, bệnh mảnh ghép chống ký chủ nặng, và
nhiễm trùng cơ hội sau ghép nhiều;
Trong những năm gần đây, các nhà nghiên cứu đã và đang đánh giá
những nguồn tế bào gốc tạo máu mới để ghép , bao gồm tế bào gốc máu ngoại
vi (Pheripheral Blood Stem Cells : PBSCs) và tế bào gốc MCR (máu cuống
rốn). Cho đến nay nhiều nghiên cứu đã chứng minh MCR có thể thay thế cho tủy
xương dùng để ghép, do có những ưu điểm sau:
- Dễ tiến hành thu thập;
- Tỉ lệ nhiễm virus lúc sanh thấp, đặt biệt là CMV (Cytomegalo virus);


2

- Có nhiều người cho, thời gian tìm người cho phù hợp HLA rút ngắn có
khả năng ghép trên nhóm dân thiểu số;
- Không có nguy cơ cho mẹ và trẻ sơ sinh trong lúc thu thập tế bào gốc;
- Dung nạp miễn dòch tốt: khả năng mọc mô ghép tốt trong những trường
hợp không phù hợp HLA (1 - 3 kháng nguyên);
- Tần xuất GVHD thấp và nhẹ, dễ dàng điều trò sau khi ghép;
- Được lưu trữ để ghép lại cho chính đứa trẻ hoặc cho người mẹ nếu bò
bệnh sau này.
Từ các lợi điểm trên mà hầu hết các nước tiên tiến trên thế giới cũng như
trong khu vực đã tiến hành tổ chức thu thập, xử lý và lưu trữ tối đa các mẫu
MCR bằng các công nghệ tiên tiến để sẵn sàng điều trò cho bệnh nhân.
Từ năm 1988, Gluckman và cs đã sử dụng MCR ghép cho một bé trai
mắc bệnh thiếu máu Fanconi có kết quả thành công rất tốt[58]. Trong thập niên
90 các nước tiên tiến trên thế giới đều có các ngân hàng MCR, lưu trữ MCR lâu
dài để cung cấp sản phẩm tế bào gốc cho ghép. Ở châu Âu đã có 80 trung tâm
với 20 quốc gia sử dụng MCR để ghép[42]. Tại Hoa kỳ, Úc, mỗi nước đã lưu trữ
được vài chục ngàn mẫu MCR và Châu Á đã và đang hình thành hệ thống MCR

các khu vực nhằm trao đổi thông tin và các sản phẩm MCR .
Tại Việt Nam, việc tìm hiểu các yếu tố trong MCR ở các sản phụ người
Việt Nam đã được Trung tâm Truyền máu Huyết học TP. Hồ Chí Minh thực hiện
và kết quả cho thấy MCR của các sản phụ người Việt Nam đủ tiêu chuẩn của
một sản phẩm sử dụng trong ghép để thay thế cho các nguồn tế bào gốc từ tủy
xương hoặc máu ngoại biên.
Mặc khác tổng kết 10 năm điều trò bệnh về máu tại Bệnh viện Truyền
máu Huyết học TP. Hồ Chí Minh cho kết quả [2],[6], [10]:


3

- Các bệnh lý ác tính chiếm: 50,24% trong tổng số bệnh nhân. Trong số
này có chỉ đònh điều trò bằng ghép: khoảng 20% (700 bệnh nhân). Nhưng vì
không tìm được người cho phù hợp, do đó chỉ có dò ghép tuỷ xương cho 3 bệnh
nhân và 18 bệnh nhân tự ghép tế bào gốc máu ngoại vi , kết quả này mới chỉ
bằng 3% số bệnh nhân có chỉ đònh điều trò bằng ghép.
- Các bệnh Hemoglobin và bệnh Thalassemia chiếm 12% tổng số bệnh
nhân [2],[6]. Trong loại bệnh này chỉ có dò ghép mà không có tự ghép và tất cả
các bệnh nhân thể nặng của bệnh Thalassemia đều có chỉ đònh ghép, nhưng chỉ
mới dò ghép được 2 bệnh nhân. Các loại bệnh này là gánh nặng cho xã hội vì
phải thường xuyên truyền máu và “sống nhờ máu người khác”.
Với khuynh hướng phát triển chung trên thế giới, đặc biệt trong lónh vực
công nghệ sinh học áp dụng cho việc điều chế vật liệu sinh học mới để áp dụng
cho điều trò, bên cạnh đó nhu cầu thiết thực của xã hội trong điều trò bệnh lý ác
tính và bệnh lý di truyền bẩm sinh , cần thiết phải có một sản phẩm tế bào gốc
đạt tiêu chuẩn để ghép, việc chọn lựa MCR để xử lý thành sản phẩm TBG được
xem là giải pháp tối ưu hiện nay. Do vậy, để tiến tới xây dựng một ngân hàng
MCR tại TP. Hồ Chí Minh đáp ứng các tiêu chuẩn quốc tế và thật sự mang lại
lợi ích cho cộng đồng, điều cần thiết phải có những nghiên cứu thử, các nghiên

cứu triển khai kỹ thuật, các quy trình kỹ thuật, tổ chức ghép thực nghiệm trong
điều kiện cụ thể của nước ta, nhằm tìm ra các giải pháp tốt nhất trong việc điều
chế sản phẩm tế bào gốc từ MCR và áp dụng ghép lâm sàng.
Xuất phát từ những điều trình bày trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu
ứng dụng quy trình xử lý tế bào gốc máu cuống rốn . Thực hiện nghiên cứu này,
chúng tôi mong muốn đạt được các mục tiêu sau đây :


4

1. Xây dựng và hoàn thiện quy trình tuyển mộ, sàng lọc người cho trước thu
thập MCR
2. Chuẩn hóa và hoàn thiện quy trình kỹ thuật thu thập MCR sau giai đoạn
xổ nhau.
3. Chuẩn hóa và hoàn thiện quy trình xử lý MCR bằng kỹ thuật có chất kết
tủa HES (Hydroxy Ethyl-Starch).
4. Chuẩn hóa và hoàn thiện quy trình lưu trữ sản phẩm tế bào máu gốc MCR
ở nhiệt độ –1960C.
5. Chuẩn hóa và hoàn thiện các xét nghiệm sinh học: đếm số lượng tế bào
nhân , số lượng tế bào CD34 (+), nuôi cấy khúm tế bào , đếm tế bào sống
và các xét nghiệm sàng lọc vi khuẩn, virus theo các giai đoạn để đánh giá
chất lượng sản phẩm tế bào gốc đạt tiêu chuẩn.
6. Đánh giá hiệu quả ứng dụng sản phẩm tế bào gốc MCR được xử lý trong
thực hành ghép tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP. Hồ Chí Minh.


5

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 LƯC SỬ PHÁT TRIỂN NGÂN HÀNG VÀ GHÉP TẾ BÀO GỐC MCR
[ 59],[60]
- Năm 1974, có sự hiện diện tế bào gốc đa tiềm năng trong MCR ở người
đã được xác đònh bởi Knudtzon. Gần 10 năm sau, Ogawa và cs đã có bằng chứng
về sự hiện diện của tế bào gốc tiền thân trong MCR. Khả năng sử dụng tế bào
MCR của người như là nguồn tế bào gốc để ghép được đề nghò lần đầu tiên vào
cuối năm 1982 bởi tác giả Edward A Boyse trong một cuộc thảo luận riêng với
Hal Broxmeyer và Judith Bard.
- Từ năm 1984 – 1985, những giả thuyết cho rằng MCR có chứa nhiều tế
bào có khả năng hồi phục sự tạo máu lần đầu tiên đã được chứng minh bởi
Bosey và cs trong một mô hình trên chuột. Tuy nhiên, vấn đề này không có tiến
triển hơn cho mãi đến năm 1989, những thực nghiệm và nghiên cứu lâm sàng đã
được chỉ đònh rộng rãi cho MCR có thể sử dụng trong trò liệu lâm sàng.
Broxmeyer và cs đã cho thấy những bằng chứng thực nghiệm chứng minh MCR
là nguồn tế bào gốc tạo máu giàu có [42]ù. Vài năm sau đó, năm 1989 Gluckman
và cs đã báo cáo trường hợp ghép tế bào gốc tạo máu đầu tiên bằng MCR thay
vì dùng bằng tủy xương. Chúng có khả năng phục hồi hệ thống tạo máu của trẻ
em bò bệnh thiếu máu Fanconie bằng MCR phù hợp HLA của người anh em
[58].
- Năm 1991, ghép MCR thành công đầu tiên trên trẻ em bệnh máu ác
tính: bệnh bạch cầu mãn dòng tủy (CML).
- Năm 1992, mẫu MCR của gia đình được thu thập đầu tiên tại ngân hàng
MCR của trường Đại học Arizona.


6

- Năm 1993, ghép MCR không liên hệ huyết thống được thực hiện tại Đại
học Duke.
- Năm 1994 - 1995, chương trình đăng ký MCR được thành lập trên thế

giới.
- Năm 1996, Cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc (Foods and Drugs
Adminitration : FDA) điều tra nghiên cứu đầu tiên về MCR. Viện Tim - Phổi Máu Quốc gia Hoa Kỳ tài trợ cho chương trình nghiên cứu ghép tế bào gốc
MCR. Cùng năm này, tổ chức đăng ký MCR bắt đầu thiết kế chương trình ghép
để cung cấp mẫu MCR miễn phí cho các gia đình có yêu cầu ghép.
- Năm 1997, ghép MCR được thực hiện thành công trên người lớn 46 tuổi
với bệnh bạch cầu mãn dòng tủy,giai đoạn mãn, đây là thử nghiệm lâm sàng sử
dụng MCR đã được tăng sinh ngoài cơ thể.
- Năm 1998, Tổ chức đăng ký MCR trở thành ngân hàng MCR gia đình
đầu tiên đã được công nhận bởi Ngân hàng hàng máu của hiệp hội Hoa Kỳ.
- Từ năm 1998 - 2006 [41],[42],[114], người ta dùng MCR như là một
nguồn thay thế cho tế bào gốc( TBG) và đã được áp dụng rộng rãi để ghép cho
trẻ em cũng như người lớn. Cho đến nay, hơn 4000 các trường hợp ghép đã được
thực hiện trên toàn thế giới, trên 80 loại bệnh di truyền và bệnh máu ác tính với
kết quả rất khả quan.
1.2 TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU - SỰ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN
[1],[5],[63]
Các tế bào gốc tạo máu của người và chuột thì tương tự nhau, vì vậy
chúng ta có thể nghiên cứu hệ thống tạo máu trên chuột để hiểu rõ hơn hệ thống
tạo máu trên người [63]. Sự hình thành tế bào máu bắt nguồn từ trung bì phôi
thai. Nơi tạo máu sơ khai ngoài phôi là túi noãn hoàng, còn vò trí tạo máu đầu
tiên trong phôi là ở động mạch chủ tuyến sinh dục – trung thận (Aorta-gonad-


7

mesonephros: AGM) [5],[63}. Những tế bào non sơ khai của dòng hồng cầu và
những tế bào tạo máu mang CD34+ được tìm thấy đầu tiên ở túi noãn hoàng
người sau 18.5 ngày hình thành và phát triển phôi. Những tế bào tiềm năng của
hai dòng lymphô và dòng tủy thì được tìm thấy ở vùng AGM vào khoảng ngày

24 đến ngày 34 của sự hình thành và phát triển phôi. Màng nội mạc có khả
năng tạo máu thì nằm ở mặt lưng của động mạch chủ và có nguồn gốc từ vùng
AGM. Có mối liên quan chặt chẽ giữa hệ thống tạo máu và hệ thống tạo mạch,
vì chúng đều xuất phát từ tế bào mầm có khả năng tạo máu và tạo mạch
(haemangioblast). Những tế bào gốc di chuyển khắp cơ thể bằng cách chảy xuôi
dòng theo dòng máu và nhờ thế những tế bào tạo máu từ túi noãn hoàng hay từ
vùng AGM đến gan. Vào tuần thứ 7 của thời kỳ thai nghén, gan là cơ quan chính
của sự tạo máu. Nhiệm kỳ của hệ thống tạo máu sơ khai kéo dài trong bao lâu
thì chưa rõ, có lẽ nó tùy thuộc vào từng loại động vật. Số lượng tế bào non bình
thường tạo dòng hồng cầu chiếm hơn 90% so với quần thể hồng cầu trưởng
thành trong tuần hoàn vào tuần thứ 10 của thời kỳ thai nghén. Từ tháng thứ 3
của thời kỳ thai nghén đã có sự tạo máu ở lách, tuyến ức và hạch lymphô. Sự tạo
máu bắt nguồn từ tủy xương vào tháng thứ 4 hay tháng thứ 5 của thời kỳ thai
nghén. Kể từ tháng thứ 6 của thai kỳ, tủy xương sẽ nắm vai trò chủ lực trong sự
tạo máu, mặc dù sự tạo máu vẫn còn hiện hữu ở các vò trí khác như gan lách cho
đến hết tuần đầu sau sanh. Về hình thái học, những tế bào gốc tạo máu là
những tế bào đơn nhân, kích thước trung bình, nhân chiếm nhiều hơn tế bào chất,
tế bào chất ưa kiềm và không hạt, còn hạt nhân thì rất nổi bật. Tuy nhiên, chúng
ta không thể phân loại hình thái học của chúng bằng kính hiển vi quang học.
 ĐẶC TÍNH TẠO HÌNH CÁC DÒNG CỦA CÁC TBGTM [63], [88]
Trong các mô hình cổ điển của tế bào gốc tạo máu (TBGTM) , các tế bào
đa năng dần dần tự thay thế để chuyển sang giai đoạn biệt hóa cao hơn và đồng


8

thời mất dần tính đa năng của chúng. Gần đây, những mô hình tạo máu tân tiến
được giới thiệu, như mô hình thống nhất về sự phát triển tế bào gốc và mô hình
khoảng cách các giai đoạn phát triển tế bào gốc. Những mô hình này cho thấy sự
biệt hóa tế bào gốc tạo máu theo thứ bậc nhất đònh trong những tình huống cụ

thể, thậm chí vượt qua ranh giới chuyên biệt dòng có nguồn gốc phôi thai.

Sơ đồ 1.1: Sơ đồ sự tạo máu của tế bào gốc
“ Nguồn : Broxmeyer HE, 1998” [41]
Ghi chú : MMP : Multipotent progenitor , CMP: Common myeloid progenitor,
MEP: Mega-Erythroid progenitor, GMP: Granulo-Macrophage progenitor, CLP :
Common lymphoid progenitor, Pro-DC : Pro-Dendritic Cell, Pro-T : Pro- Lympho
T, Pro-NK : Pro-Natural Killer, Pro-B : Pro-Lympho B


9

Đặc tính tạo hình các dòng của các TBGTM còn liên quan đến các cơ chế
hóa học, bao gồm các yếu tố hóa học của mạng lưới hệ thống cytokine và các
yếu tố tăng trưởng trong môi trường vi mô, trong các hốc của tuỷ những tế bào
gốc cũng như do sự điều chỉnh của các sợi chromatin và những thay đổi của biểu
hiện gien trong chu trình của tế bào. Tuy nhiên cho đến nay, tính tạo hình và sự
biệt hóa tế bào vẫn còn đang nghiên cứu và tranh cãi. Những tế bào gốc từ trung
mô đa năng có thể biệt hóa thành các loại tế bào khác nhau từ ba lớp tế bào
mầm, và chúng cũng được tìm thấy ở MCR. Hơn nữa, người ta còn đang nghiên
cứu khả năng biệt hóa của các tế bào trung mô của cuống rốn thành tế bào thần
kinh hay cơ, tế bào mạch vành,tế bào tuyến tụy...[97]
Qua các nghiên cứu cơ bản nuôi cấy tế bào, người ta thấy có 2 loại tế bào
gốc tạo máu, nhưng thực chất chính là 2 giai đoạn biệt hóa khác nhau của tế bào
gốc tạo máu [1],[5], [97].
Các tế bào gốc tạo máu dài hạn (Long term- Hematopoietic Stem Cell:
LT-HSC) đây là các tế bào máu non, số lượng ít, chưa biệt hóa, có khả năng tự
tái tạo và có tính đa năng cao, chúng có hoạt động men Tolomerase ở mức độ
cao (hoạt động men Tolomerase là đặc tính của tế bào đang phân chia nhưng
không biệt hóa và các tế bào ung thư). Các tế bào đã biệt hóa – trưởng thành thì

không có hoạt động của men này. Trong thực nghiệm tiền lâm sàng các tế bào
này có thể khôi phục lại hoàn toàn chức năng tạo máu của chuột bò chiếu xạ ở
liều chết sau vài tháng. Tế bào gốc tạo máu dài hạn là các tế bào gốc tạo máu
mang CD34 Thy Lin, các tế bào này có thể biệt hoá thành tất cả các loại tế
bào máu khác nhau. Trong điều kiện bình thường, các tế bào gốc dài hạn có khả
năng tự tái tạo trong suốt đời cá thể.
Các tế bào gốc tạo máu ngắn hạn (Short term – Hematopoietic: ST-HSC)
so với tế bào gốc dài hạn thì chúng tương đối trưởng thành hơn, được sinh ra từ


10

tế bào gốc dài hạn mà vẫn duy trì được bản chất tự tái tạo khoảng 8 tuần và chỉ
tăng sinh­biệt hóa một thời gian thường là vài tháng. Các tế bào gốc ngắn hạn
sinh ra các tiền thân đònh hướng chung dòng tủy (CFU–GEMM) và các tiền thân
đònh hướng chung dòng lymphô (CFU–L). Các tiền thân đònh hướng dòng
lymphô tạo ra các tế bào đầu dòng và biệt hoá thành tế bào lymphô B hoặc tế
bào lymphô T, tế bào giết tự nhiên. Các tiền thân dòng tủy sinh ra các tế bào
đònh hướng dòng hồng cầu (BFU–E), tế bào đònh hướng dòng hạt và đại thực bào
(CFU–GM)â, tế bào đònh hướng dòng mẫu tiểu cầu (CFU–Meg)… và biệt hóa
thành các tế bào bạch cầu đơn nhân, đại thực bào, bạch cầu hạt đa nhân trung
tính, bạch cầu ưa axít, ưa kiềm, tiểu cầu và hồng cầu. Các tế bào gốc tạo máu
ngắn hạn cũng có khả năng tăng sinh–biệt hóa thành các tế bào máu nhưng so
với các tế bào gốc tạo máu dài hạn, tính đa năng của chúng bò giới hạn. Thí dụ
tế bào tiền thân hồng cầu chỉ có thể tạo thành tế bào hồng cầu (sơ đồ 1.1).
1.3 MÁU CUỐNG RỐN
MCR ( máu cuống rốn) [5],[97]hay còn gọi là máu dây rốn hay máu bánh
nhau chảy trong tuần hoàn máu thai nhi và cung cấp chất dinh dưỡng cho bào
thai đang phát triển trong tử cung người mẹ. Phần máu còn lại trong dây rốn và
bánh nhau khi sản phụ sinh em bé và dây rốn là chất thải sinh học trong các

bệnh viện phụ sản. Ngày nay, nhờ sự tiến bộ trong khoa học, người ta đã sử
dụng chất thải sinh học này như một trong những nguồn cung cấp dồi dào tế bào
gốc cho ghép tế bào để điều trò một số bệnh lý ác tính và di truyền bẩm sinh của
hệ tạo máu.
1.3.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ MIỄN DỊCH HỌC TẾ BÀO MCR
1.3.1.1 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MCR


Tần suất của tế bào gốc của MCR