Thử Nghiệm Tạo Chế Phẩm Probiotic Dạng Thức Uống Lên Men Từ Gạo Lức

CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC
1.1.1 Định nghĩa probiotic.
Probiotic bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “sự sống”. Khái niệm
probiotic đầu tiên xuất phát từ nhà khoa học Eli Metchnikoff, trong cuốn sách
“Kéo dài sự sống” của ông đưa ra 1908. Ông cho rằng những người nông dân
Bulgary sống lâu là nhờ họ tiêu thụ những sản phẩm lên men từ sữa.
Thuật ngữ “probiotic” đã được sử dụng đầu tiên bởi Lily và Stillwell [57]
năm 1965 để mô tả “những cơ chất” được tiết ra bởi một vi sinh vật kích thích
sự phát triển của các vi sinh vật khác. Năm 1974, Parker đã phát triển định
nghĩa này, ông cho rằng probiotic là “những vi sinh vật và những cơ chất mà
giúp cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột”[69]. Sau đó vào năm 1989, Fuller đã
thay đổi định nghĩa này, ông cho rằng probiotic là “thực phẩm bổ sung một vi
sinh vật sống mà ảnh hưởng có ích lên vật chủ bằng cách cân bằng hệ vi sinh
vật đường ruột của nó” . Định nghĩa này nhấn mạnh vai trò khả năng sống của
vi sinh vật [32]. Năm 1998 Salminen đã định nghĩa probiotic là “những thực
phẩm chứa vi khuẩn sống ảnh hưởng có lợi cho sức khoẻ”[77]. Trái lại, năm
2002 Marteau đã định nghĩa probiotic hoàn chỉnh hơn “probiotic là những chế
phẩm chứa tế bào vi sinh vật hay những thành phần của tế bào vi sinh vật mà
ảnh hưởng có lợi cho sức khoẻ”.
Một vài định nghĩa hiện nay mô tả chính xác hơn về hoạt động của
probiotic trong phòng và trị bệnh dựa trên khả năng chữa một số bệnh đường
ruột của probiotic, vì thế nó được xem như là một nhân tố trị bệnh [92].
1.1.2. Các chế phẩm probiotic thông dụng.
Vi sinh vật probiotic thường được đề cập và nghiên cứu chủ yếu là vi
khuẩn lactic (LAB). Tuy nhiên, một trong những chế phẩm probiotic được
sử dụng sớm là Bacillus subtilis. B.subtilis được sử dụng qua đường uống
để phòng và chữa các rối loạn tiêu hoá sau khi dùng kháng sinh, mà nhiều
trường hợp dẫn đến tiêu chảy. B.subtilis có tác dụng hồi phục hệ vi sinh vật
1

tự nhiên trong ống tiêu hoá của người sau khi dùng kháng sinh kéo dài hoặc
bị bệnh. Các chế phẩm B.subtilis được bán ở hấu hết các nước Châu Âu,
mặc dù người ta còn biết ít về cơ chế tác dụng của chúng. Bào tử của
B.subtilis có thể qua được rào chắn đường tiêu hoá, một phần bào tử nảy
mầm trong ruột non và sinh sôi trong đường ruột. Một số tác dụng lâm sàng
của B.subtilis đã được biết như làm tác nhân kích thích miễn dịch trong một
số bệnh.
Ngoài ra, một số chế phẩm khác dùng nấm men (Saccharomyces
boulardii) như Biolactine ,.[3]., chủng Echerichia coli Nissle 1917 đến nay
vẫn được sử dụng trong các trường hợp nhiễm khuẩn đường ruột là những
ví dụ của probiotic không phải LAB [27].
Các sản phẩm probiotic hiện nay có thể phối hợp nhiều chủng vi khuẩn
lactic (thường là: L.acidophilus, L.sprorogenes, L.kefir, Streptococcus
faecalis..) hoặc chỉ sử dụng một chủng vi khuẩn (như L.acidophilus hay
L.sprorogenes…) là liệu pháp rất tốt cho các trường hợp rối loạn đường tiêu
hoá, giúp duy trì hệ vi sinh vật có lợi cho tiêu hoá, ngăn ngừa tiêu chảy hữu
hiệu và nhiều trường hợp bệnh khác nhờ những tác dụng trong cơ thể người
[8, 40].
Bảng 1 : Các vi sinh vật được AAFCO chấp nhận sử dụng trong các chế
phẩm thức ăn cho động vật ở Mỹ.[80]
Aspergillus niger

Lactobacillus curvatus

Aspergillus oryzae

Lactobacillus delbruekii

Bacillus coagulans

Lactobacillus farciminis

Bacillus lentus

Lactobacillus fermentum

Bacillus lichenformis

Lactobacillus helveticus

Bacillus pumilus

Lactobacillus lactis

Bacillus subtilis

Lactobacillus plantarum

Acteroides amylophilus

Lactobacillus reuteri

Bacteroides capillosus

Leuconostoc mesenteroides

Bacteroides ruminocola

Pediococus acidilactici

Bacteroides suis

Pediococcus cerevisiae
2


Bifidobacterium adolescentis

Pediococcus pentosaceus

Bifidobacterium animalis

Propionibacterium

Bifidobacterium bifidum

Freudenreichii

Bifidobacterium infantis

Propionibacterium shermanii

Bifidobacterium longum

Saccharomyces cerevisiae

Bifidobacterium thermophilum

Enterococcus cremoris*

Lactobacillus acidophilus

Enterococcus diacetylactics*

Lactobacillus brevis

Enterococcus faecium*

Lactobacillus buchneri

Enterococcus intermedius*

Lactobacillus bulgaricus

Enterococcus lactis*

Lactobacillus casei

Enterococcus therniophilus*

Lactobacillus cellobiosus
* : Trước đây được gọi là Streptococcus.
Những chủng vi khuẩn này có thể được tiêu thụ đều đặn với số lượng
lớn trong các chế phẩm probiotic : sữa bột trẻ em, thực phẩm lên men, và
dược phẩm.
1.1.3. Một số ứng dụng khác.
Sản phẩm probiotic lactic được ghi nhận đầu tiên là sữa lên men dùng
cho người. Metchnikoff đã phát hiện ra và sử dụng chủng Lactobacillus

bulgaricus để len men các sản phẩm từ sữa, nhằm kéo dài thời gian sử dụng
chúng. Sau đó, các sản phẩm probiotic trở nên phổ biến trong khẩu phần
của động vật. Vai trò của sữa lên men trong khẩu phần dinh dưỡng của
người đã được biết từ rất lâu. Nhưng các nhà khoa học quan tâm nhiều đến
lĩnh vực này sau khi quyển sách "The Prolongation of Life " của Ellie
Metchinkoff xuất bản vào năm 1908. Trong đó, ông đề nghị mọi người nên
dùng nhiều sữa lên men chứa Lactobacilli để kéo dài tuổi thọ. Tuổi thọ rút
ngắn là do sự nhiễm độc trong cơ thể, do hệ vi sinh vật đường ruột tiết ra
các chất độc. Các nông dân Bungary là đối tượng của các nghiên cứu cho
thấy tuổi thọ được kéo dài nhờ dùng môt lượng lớn sữa chua hằng ngày, và
thói quen dùng sữa chua giúp loại bỏ các phản ứng bệnh lí, tình trạng sức
khoẻ được cải thiện nhờ vi khuẩn lactic có trong sữa chua. Từ đó, các nhà

3


nghiên cứu đã bắt đầu tìm hiểu vai trò của vi khuẩn lactic đối với sức khoẻ
con người và động vật [8, 40, 41].
Vấn đề này được tiếp tục quan tâm cho đến nay, khi những tiến bộ về kỹ
thuật cho phép phân lập và nuôi cấy vi sinh vật giúp cho việc xác định
những đặc tính trị liệu của chúng. Những vi sinh vật này không những đem
lại giá trị dinh dưỡng căn bản mà còn đem đến nhiều lợi ích khác.
Năm 1994, Tổ chức Y Tế Thế giới (WHO) cho rằng probiotic sẽ trở
thành một hệ thống phòng vệ miễn dịch quan trọng nhất, tiếp theo các loại
kháng sinh được cho phép phổ biến hiện nay (khi các loại thuốc này không
còn hữu dụng, do hiện tượng kháng thuốc) [55].
Các sản phẩm probiotic hiện nay là liệu pháp rất tốt cho các trường hợp
rối loạn đường tiêu hoá, duy trì hệ vi sinh vật có lợi cho hệ tiêu hoá, ngăn
ngừa tiêu chảy hữu hiệu và nhiều trường hợp bệnh khác nhờ những tác
dụng trong cơ thể người như : ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh,

sản xuất kháng sinh như bacteriocin, tăng cường tiêu hoá thức ăn, kích thích
hoạt động của hệ miễn dịch.
Ngoài ra, probiotic được sử dụng như chất hoạt hoá tăng trưởng nhờ có
khả năng đồng hoá lactose, kháng khối u, kháng khuẩn và làm giảm
cholesterol. Probiotic đã được nghiên cứu nhiều ở các điều kiện in vitro và
in vivo [41].
Bên cạnh đó, hiệu quả tiêu hoá thức ăn của động vật phụ thuộc vào các
vi sinh vật sống tự nhiên trong hệ tiêu hoá. Do bộ máy tiêu hoá của người
bình thường chứa 1014 tế bào vi sinh vật, gấp 10 lần tổng số tế bào của các
mô cơ thể cộng lại, điều này cho thấy hiếu quả điều hoá của vi sinh vật lên
hoạt động của cơ thể [54].
Trước đây người ta từng sử dụng các kháng sinh trong thức ăn của động
vật để cải thiện sức khoẻ và phòng bệnh cho động vật trong chăn nuôi công
nghiệp. Tuy nhiên, việc sử dụng những chất này làm mất cân bằng hệ vi
khuẩn đường ruột có lợi và làm gia tăng vi khuẩn kháng kháng sinh dẫn đến
gây bệnh cho con người và động vật.

4


Những năm gần đây, việc sử dụng sinh vật probiotic và các acid hữu cơ
như chất thay thế kháng sinh trong thực phẩm đang rất được quan tâm. Sự
thích nghi tự nhiên của nhiều vi khuẩn lactic (LAB) đối với môi trường ruột
và những chất kháng khuẩn được chúng tạo ra (acid hữu cơ và bacteriocin)
đã cho LAB một thuận lợi cạnh tranh so với những vi sinh vật khác khi
được dùng làm probiotic.
Tiêu chuẩn lựa chọn vi khuẩn lactic là probiotic bao gồm : có trong cơ
thể người, độ an toàn, khả năng sống sót/ độ acid trong phương tiện vận
chuyển, tính chịu acid và mật, bám vào biểu mô ruột, khả năng nhân rộng
trong đường ruột, sản xuất L-lactic acid, sản xuất những cơ chất kháng vi

trùng, khả năng kích thích hệ thống miễn dịch của vật chủ và khả năng ảnh
hưởng đến hoạt tính biến dưỡng như là sản xuất vitamin, đồng hoá
cholesterol và lactose [8, 40]
1.1.4. Cơ chế hoạt động của probiotics.

5


Kiểm soát triệu
chứng kích thích
ruột

Kiểm soát bệnh
nhiễm trùng
đường ruột

Ngăn chặn vi
khuẩn gây bệnh
nội sinh

Chống lại sự hình
thành tập đoà

Cân bằng
miễn dịch
Cân bằng thành
phần vi sinh vật
đường ruột

Thay đổi hệ thống miễn

dịch

Ngăn chặn vi
khuẩn
n gây bệnh
ngoại sinh

Tăng cường
miễn dịch

Giảm cholesterol

Probiotics

Cung cấp chuỗi
acid béo ngắn và
vitamin cho biểu
mô ruột

Làm giảm dị
ứng thực phẩm
ở trẻ em

Sự tiết muối mật
Ảnh hưởng cơ
chế chuyển hoá

Giảm mức độc tố/phản ứng đột biến
trong đường ruột

Thuỷ phân lactose

Giảm những tác
nhân gây ung
thư

Cải thiện sự dung nạp
lactose

Hình 01: Kiểu tác động của probiotic [74].
Theo Salminen và Ouwehand khả năng của các chủng probiotics ảnh hưởng
tới sức khoẻ có thể bao gồm những cơ chế sau [94]:
-

Bám chặt vào màng nhầy ruột và vi sinh vật.

-

Sản sinh những cơ chất kháng sinh vi sinh vật.
6


-

Chống lại những nhân tố gây bệnh và chất gây ung thư.

-

Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn gây bệnh.

-

Tương tác với tổ chức lympho đường tiêu hoá (thay đổi khả năng miễn

dịch).
-

Những thành phần có hại trong đường ruột (liên kết với những độc tố và

quy định hoạt động chuyển hoá của vi sinh vật đường ruột) [90, 71].
1.1.5. Hoạt tính probiotic.
Các hoạt tính thường được quan tâm khảo sát trước khi nghiên cứu thêm
về các tính năng hữu ích khác của probiotic bao gồm:
1.1.5.1. Chịu pH thấp.
Trước khi sử dụng các chủng probiotic, cần phải đáng giá khả năng chịu
đựng của chúng đối với các áp lực trong đường ruột đặc biệt là dưới các
điều kiện acid. Các nhà khoa học đã chứng minh: các probiotic phải trải qua
các quá trình tiêu hoá khắc nghiệt hơn 90 phút trước khi được giải phóng từ
bao tử vào ruột.
Ngoài ra, vi khuẩn probiotic phải chống lại được các enzyme đường
miệng như lysozyme, các acid tiêu hoá, tính độc của mật cũng như các điều
kiện áp lực trong ruột kết. Thời gian cho cuộc hành trình từ dạ dày được
báo cáo là khoảng 90 phút. Tuy nhiên, các quá trình tiêu hoá có thời gian
xảy ra lâu hơn nên vi khuẩn probiotic phải chống lại được các điều kiện áp
lực của dạ dày với pH thấp đến khoảng 1,5. Do đó các chủng được chọn lọc
để sử dụng như vi khuẩn probiotic cần phải chịu được môi trường pH thấp
ít nhất 90 phút, gắn vào biểu mô và phát triển được trong đường ruột trước
khi chúng có thể bắt đầu cung cấp các lợi ích cho sức khoẻ.
Khả năng chịu acid là một trong những tính chất đầu tiên để sàng lọc khi
muốn tuyển chọn các dòng probiotic [28].

Các stress đến vi sinh vật ở bao tử, với pH khoảng 1,5 đến 3. Sống sót ở
pH 3,0 trong 2 giờ và nồng độ 1000mg/l được xem như là khả năng chống
đỡ đối acid tối ưu đối với các chủng probiotic [30].

7


Một số thí nghiệm xác định khả năng chịu được acid của một số dòng
Lactobacillus và Bifidobacteria được tách chiết từ hồi tràng của người. Các
kết quả này sau đó được so sánh trực tiếp với khả năng chịu acid của các
dòng Lactobacillus thu từ các nhóm nghiên cứu độc lập.
Bảng 2: Khả năng sống sót của các dòng Lactobacillus trong ruột người ở
các gái trị pH khác nhau. [80]
Chủng

Nguồn trích

pH
0

dẫn
L.casei 161
L.acidophilus 1748
L.paracasei 212.3
L.salivarius

Thời gian (phút)
5
30
Log10 CFU/L

ND
ND

60

UCC

1,2

ND

ND

Arla

2,5
1,2

9250
ND

9290
ND

8550
ND

8510
ND

AUA

2,5
1,2

8350
9030

8170
3370

7090
0

6290
ND

Các nghiên

2,5
1,2

8600
9000

8610
8930

8520
4240

8600
ND

UCC118
cứu mới đây
2,5
9570
9580
9620
9550
ND: Không xác định, UCC: Đại học Cork, Cork, Ireland, AUS: Arla,
Stockholm, Thụy Điển, Arla: Đại học Nông nghiệp của Athens, Athens, Hy
lạp.
Sự sống sót của các dòng vi khuẩn được ước định ban đầu bằng cách bổ
sung khoảng 109 – 1011 CFU Lactobacilli vào môi trường MRS pH lần lượt
từ 2,0 đến 3,4 [16].
1.1.5.2. Chịu mật.
Sau khi đi qua dạ dày, vi khuẩn đến vùng ruột, muối mật đi vào khu vực
tá tràng thì số lượng vi khuẩn sẽ giảm. Khả năng chịu đựng muối mật là
một trong những tính cần thiết của vi khuẩn có hoạt tính probiotic [45].
Vi khuẩn Gram dương nhạy cảm với muối mật và acid mật hơn vi khuẩn
Gram âm. Ngoài ra, sự nhảy cảm đối với mật còn phụ thuộc vào nguồn gốc
của mật. Hấu hết Lactobacillus phân lập từ người có khả năng chịu được
các nồng độ sinh lý của mật người [28].
Khi các acid mật trên liên kết amid với các amino acid glycine hay
taurine (một loại amino acid trung gian được tạo thành trong quá trình

8

chuyển hoá protein) sẽ tạo nên các acid-muối mật tương ứng: acid
glycocholic-muối

mật

glycocholate,

acid

taurocholic-muối

mật

taurocholate, acid glycodeoxycholic-muối mật glycodeoxycholate… hay
còn được gọi là các muối mật kết hợp.

Hình 02: Tuỳ vào nhóm R1 kết hợp sẽ tạo muối mật kết hợp tương ứng
[80].
Ở hầu hết các sinh vật (bao gồm người), quá trình tổng hợp acid mật chủ
yếu thông qua sự tiêu thụ cholesterol. Cơ thể tổng hợp khoảng 8mg
cholesterol một ngày và dùng 4mg cholesterol để tổng hợp caid mật. Tổng
cộng có khoảng 20-30g acid mật tiết vào ruột mỗi ngày, trong đó khoảng
90% mật tiết ra được tái hấp thu và sử dụng lại. [57]
* Chức năng của muối mật.
Muối mật có hai chức năng quan trọng là tác dụng nhũ tương hoá và hoà
tan mỡ trong nước [4].
Các nghiên cứu sơ bộ đã xác định mức độ chịu mật của một số dòng
Lactobacillus được tách chiết từ hồi tràng. Thí nghiệm thực hiện bằng cách
môi trường rắn bổ sung mật bò, mật heo và mật người để đạt nồng độ cuối

cùng từ 0,3% - 7,5%. Môi trường trải vi sinh vật được ủ trong điều kiện kỵ
khí ở 370C và ghi nhận khả năng phát triển sau 24-48 giờ.

9


Bảng 3: Khả năng kháng của một số dòng Lactobacillus đối với mật bò và
heo [80].
Chủng
L.casei 161
L.acidophilus 1748
L.casei F19
L.fermentum KLD
L.paracasei 212.3
L.acidophilus 242
L.salivarius UCC118

Nồng độ phần trăm tối đa
Mật bò
Mật heo
%
5,0
0,0
0,5
0,3
ND
0,0
ND
0,0
7,5

0,0
0,0
0,0
5,0
1,0

Thông thường mật bò được sử dụng trong môi trường chọn lọc vi khuẩn
đường ruột ở người vì hiệu lực của nó tương tự như muối mật của người và
nồng độ trung bình là 0,3% (w/v) [16].
1.1.5.3. Khả năng hấp thu cholesterol khỏi môi trường nuôi cấy của
probiotic.
1.1.5.3.1. Tổng quan về cholesterol.
* Cấu tạo:
Cholesterol là một chất béo steroid, có ở màng tế bào của tất cả các mô
trong cơ thể, đặc biệt nhiều ở trong các mô thần kinh, sỏi mật, thể vàng của
buồng trứng và được vận chuển trong huyết tương của mọi động vật. Hầu
hết cholesterol không có nguồn gốc từ thức ăn mà nó được tổng hợp bên
trong cơ thể. Cholesterol được đào thải qua đường ruột, dưới tác dụng của
vi khuẩn tạo ra coprosterol [57].

10


Hình 3: Cholesterol trong mạch máu [80].
* Chức năng:
Cholesterol là thành phần quan trọng của màng tế bào, nó giúp tính lỏng
của màng ổn định trong khoảng dao động nhiệt độ rộng lớn. Nó là tiền chất
chính để tổng hợp vitamin D, nhiều loại hormon steroid, bao gồm cortisol,
cortisone và aldosterone ở tuyến thượng thận, các hormone sinh dục
progesterone, estrogen và testosterone.

Tuy nhiên, tăng mức cholesterol là nguyên nhân chính của chứng xơ vữa
làm nghẽn mạch vành tim gây ra chứng đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim,
chết bất ngờ và suy tim [59].
* Bài tiết:
Cholesterol được bài tiết từ gan vào mật và được tái hấp thu ở ruột.
Trong một số trường hợp, khi bị cô đặc như ở túi mật, nó kết tinh và là
thành phần cấu tạo chính của hầu hết sỏi mật [59].
Nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn lactic có tác dụng làm giảm
cholesterol trong máu. Vi khuẩn lactic phân lập từ phân lợn có khả năng
phân huỷ cholesterol trong môi trường nuôi cấy.
Có nhiều giả thuyết về khả năng loại cholesterol của vi khuẩn lactic,
trong đó quan trọng nhất là mối quan hệ có ý nghĩa giữa khả năng đồng hoá
cholesterol và mức độ “giải kết hợp” mật (các muối mật “kết hợp” bị vi
khuẩn phân giải các nhóm amino acid tạo thành acid mật tự do và amino
acid) [28].
1.1.5.3.2. Loại cholesterol nhờ sự “giải kết hợp” các muối
mật.

11


Khả năng “giải kết hợp” muối mật bởi vi sinh vật đường ruột có vai trò
quan trọng trong việc làm giảm cholesterol dịch.
Enzyme phân giải muối mật (BSH) chịu trách nhiệm “giải kết hợp”
muối mật có ở vài loài vi khuẩn của hệ tiêu hoá [16].
Con đường thải loại cholestrol ở người và động vật là qua phân. Các
muối mật “kết hợp” được tiết vào trong ruột non giúp hấp thu chất béo,
cholesterol, các vitamin kỵ nước và các chất hoà tan khác của khẩu phần
thức ăn. Các muối mật này được hấp thu từ ruột non (97%) và trở về gan.
Một phần nhỏ các muối mật (250-400mg) không được hấp thu sẽ thất thoát

ra cơ thể người như là các muối mật tự do trong phân. Các muối mật tự do
ít tan và ít được hấp thu ở ruột so với các muối mật “kết hợp”.
Do đó ở trạng thái ổn định, sự “giải kết hợp” của các acid mật tạo các
acid mật mới làm giảm sự hấp thụ cholesterol và các chất béo qua lumen
ruột.
Bên cạnh đó, khi các muối mật được vi sinh vật “giải kết hợp” tạo thành
các acid mật tự do nhiều, sẽ dẫn đến cholesterol ở gan tham gia sản xuất tạo
acid mật để bù đắp cho lượng acid mật bị thất thoát qua phân. Cơ chế này
cũng góp phần làm giảm lượng cholesterol.
Ngoài ra, việc “giải kết hợp” muối mật tạo ra acid mật tự do còn làm
phá vỡ các hạt cholesterol ổn định. Nguyên nhân do cholesterol đồng kết
tủa với các acid mật tự do này ở các giá trị pH nhỏ hơn 5,5 tạo thành các
chuỗi acid béo ngắn và được loại ra khỏi cơ thể qua phân [28].

12


OH
(A)

Hình 04: (A) Cấu trúc hoá học của muối mật kết hợp (acid mật kết hợp
với glycine hay taurine). (B) Enzyme BSH xúc tác phản ứng phân giải
muối mật thành acid mật giải kết hợp và nhóm amino acid, kết quả là
acid mật bị tủa ở pH thấp. (C) Phát hiệt hoạt tính của BSH: khuẩn lạc
trên môi trường MRS và các kết tủa trắng xung quanh khuẩn lạc trên môi
trường MRS có bổ sung muối mật [80].
1.1.5.3.3. Hấp thu cholesterol vào trong màng tế bào.
Một cơ chế hoá học khác được đề nghị cho quá trình làm giảm
cholesterol là L.acidophilus hấp thu một số cholesterol khỏi môi trường
nuôi vào trong màng tế bào trong suốt quá trình phát triển.

Kết quả thí nghiệm cho thấy các thành phần màng tế bào được tách chiết
từ các tế bào vi khuẩn phát triển trong môi trường bổ sung cholesterol có
20% cholesterol bị loại khỏi môi trường nuôi cấy và được thu hồi từ màng
tế bào. Các tế bào phát triển trong môi trường bổ sung cholesterol có khả
năng chống lại sự tự phân do sóng siêu âm khoảng 85%, trong khi không có
cholesterol tỉ lệ này là 90%. Điều này cho tấhy sự khác biệt trong màng tế
bào chủng L.acidophilus ATTC 43121 phát triển trong môi trường bổ sung
cholesterol có khả năng chịu đựng cáo đối với sự tự phân bởi sóng siêu âm
hơn là trong môi trường đối chứng. Sự sát nhập cholesterol vào trong các tế
bào L.acidophilus có thể đã làm thay đổi màng hay vách tế bào lactobacilli
và làm tăng sức căng của màng [28].

13


Ngoài ra cơ chế hoá học về khả năng hấp thu cholesterol được nghiên
cứu ở một khía cạnh khác khi người ta phát hiện các tế bào Lactococci
không phát triển vẫn có khả năng loại cholesterol in-vitro.
Các tác giả nhận thấy cả tế bào bị giết bởi nhiệt độ và tế bào nghỉ đều
hấp thu cholesterol mặc dù nồng độ cholesterol bị hấp thu khỏi môi trường
thấp hơn so với các tế bào phát triển. Điều này dẫn đến một giả thuyết là
cholesterol không chỉ bị loại khỏi môi trường bởi các tế bào sống trong suốt
quá trình phát triển mà cholesterol còn gắn kết vào các tế bào chết.
Hoạt tính kết hợp hoặc gắn cholesterol vào tế bào của vi khuẩn được
xem như tương đương với hoạt tính hấp thu cholesterol ra khỏi môi trường
nuôi.
Khả năng làm giảm mức cholesterol in vitro trong môi trường phòng thí
nghiệm đã cho thấy ở nhiều chủng vi khuẩn lactic, ví dụ như L.acidophilus,
L.delbrueckii sp.bulgaricus, L.casei, L.gasseri, L.amylovorus. Gần đây, các
loài vi khuẩn khác có hoạt tính tương tự đã được phát hiện là :

Streptococcus

(Str.salivarius

sp.thermophilus)

và

Enterococcus

(E.faecium), cũng như Lactococcus (Lc.lactis sp.lactic, Lc.lactis sp.lactis),
Leuconostoc mesenteroides [29].
1.1.5.4. Hoạt tính kháng khuẩn.
LAB có hoạt tính kháng khuẩn trên diện rộng. Trong số các hoạt tính
này, khả năng sản xuất lactic acid và acetic acid được xem là quan trọng
nhất. Tuy nhiên gần đây người ta biết thêm là LAB còn sản xuất ethanol,
acid formic, acid béo, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterin, và
reutericyclin. Nhiều chủng còn sản xuất bacteriocin và các phân tử có hoạt
tính kháng khuẩn giống bacteriocin, một số LAB có khả năng tổng hợp các
peptide kháng khuẩn khác cũng có thể góp phần bảo quản thực phẩm [38].
Trong một số thí nghiệm, các nhà khoa học đã phát hiện Lactobacilli
được phân lập từ hồi tràng của người có khả năng kháng với một chuỗi vi
sinh vật chỉ thị như : Listeria, Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus,
Clostridium,

Pseudomonas,

E.coli,

Lactobacillus,

Streptococcus,

Bifidobacterium, và Lactococcus,.. [16].
14


1.1.5.4.1. Sản sinh nhiều acid hữu cơ nồng độ cao.
Vi khuẩn lactic ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh bằng
cách sinh ra lactic acid, acid béo, peroxide và các kháng sinh. Trong các thí
nghiệm in vitro, các vi khuẩn lactic ngăn cản sự phát triển của
Staphylococcus, Shigella, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella và
các chủng E.coli gây bệnh [20].
1.1.5.4.2. Sản sinh bacteriocin.
Bacteriocin là các hợp chất protein kháng khuẩn có khả năng ức chế các
chủng nhạy cảm và được tạo ra bởi vi khuẩn Gram dương và Gram âm.
Tác đông kháng khuẩn của vi khuẩn lactic đã được con người dự đoán
cách đây hơn 10.000 năm và có khả năng bảo quản thực phẩm nhờ quá
trình lên men.
Vi khuẩn lactic tiết ra các chất có hoạt tính đối kháng mạnh chống lại
nhiều vi sinh vật, bao gồm sinh vật gây ôi thiu thức ăn và vi sinh vật gây
bệnh [29].

Hình 5: Vòng kháng khuẩn trên đĩa môi trường [80].
1.1.5.5. Sản xuất acid L-lactic.
Tác nhân probiotic tốt, ngoài yếu tố không gây bệnh, không độc hại,
chịu được môi trường pH thấp ở dạ dày, chịu được các acid mật, sản xuất
15

các chất kháng khuẩn, đồng hoá cholesterol, lên man lactose và tạo vitamin
…[41], giúp củng cố và khôi phục sự cân bằng hệ vi khuẩn ở ruột, còn phải
có khả năng sinh ra L(+) lactic acid. Acid này dễ dàng được hấp thu hoàn
toàn và có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch.
Ở tế bào người và động vật tồn ạti dạng L(+) lactic acid, nên chỉ tìm
thấy enzyme L-lactatdehydrogenase tương ứng. Do đó, cấu hình của lactic
acid có vai trò rất quan trọng về mặt dinh dưỡng, Sự hấp thu một lượng lớn
D(-) lactic acid hay DL-lactic có thể gây nên sự tích luỹ D(-) lactic trong
máu, làm dư acid trong nước tiểu. Phát hiện này đã buộc WHO phải giới
hạn sự tiêu thụ D(-) lactic acid ở mức 100mg/kg/ngày.
Vài trường hợp nhiễm độc acid D-lactic acid đã được miêu tả ở bệnh
nhân có trải qua phẫu thuật đường ruột. Một số triệu chứng biểu hiện liên
quan đến hệ thần kinh như đau đầu, suy nhược, loạn thị, choáng váng và
mất điều hoà. Các triệu chứng này có thể kéo dài vài giờ đến vài ngày. Sự
nhiễm độc D-lactic acid gây độc cho não và đã được chứng minh là do sự
phát triển vượt bậc của L.acidophilus ở ruột non.
bảng:
Ngộ độc D-lactic acid là biến chứng không phổ biến của “hội chứng ruột
ngắn”, được miêu tả như là bệnh của người vào năm 1979, mặc dù trước đó
nó đã được xem như là bệnh của động vật nhai lại hàng thế kỉ trước [16].
Từ những vấn đề trên, hiện nay việc chọn lọc các chủng vi khuẩn lactic
chỉ sản xuất L-lactic acid để ứng dụng vào các sản phẩm probiotic có ý
nghĩa vô cùng to lớn.
1.1.5.6. Lên men lactose.
Sự không dung hoà lactose là tình trạng sinh lí xảy ra ở những người
thiếu khả năng sản xuất enzyme lactase hay β-galactosidase. Lactase cần
thiết đề đồng hoá lactose trong sữa, cắt chúng thành các phân tử đường
glucose và galactose đơn giản. Các cá thể thiếu lactase sẽ không tiêu hoá
được sữa và thường gây ra những khó khăn cho trẻ sơ sinh. Người không
dung hoà lactose thường bị khó chịu ở bụng, tiêu chảy, bị vọp bẻ, đầy hơi,

nôn và buồn nôn,.. khi dùng sữa. Một vần đề khác có liên quan đến việc
16


không dung hoà lactose là tình trạng thiếu calcium vì người không dung hoà
lactose thường được khuyên không nên dùng sữa. Ngoài ra, vi khuẩn khu
trú trong ruột kết không lên men tiêu hoá được lactose sẽ sản xuất acid và
khí, gây ra các triệu chứng như đau bụng, sưng phù và tiêu chảy [16].
Các dòng probiotic đã được chứng minh là cũng có thể giải quyết vấn đề
không dung hoà được lactose.
Việc sử dụng probiotic cho kết quả làm giảm tình trạng không dung hoà
lactose nhờ các chủng LAB có khả năng sản xuất lactase và tăng nồng độ βgalactosidase ở ruột non.
Do vậy, nếu các bệnh nhân không dung hoà lactose được cho dùng
probiotic, các dòng probiotic sẽ thuỷ phân lactose trong sữa và lactose sẽ
được đồng hoá cũng như calcium cũng được hấp thu [41].
1.1.6. Vai trò của probiotics.
1.1.6.1 Sự không dung nạp lactose.
Hầu hết dân số trên thế giới không dung nạp lactose sau khi cai sữa là do sự
giảm khoảng 90 – 95% lượng enzyme lactase sinh ra. Lactase là enzyme thuỷ
phân lactose thành glucose và galactose. Sự hiện diện của lactose làm thay đổi
sự cân bằng thẩm thấu trong khoang ruột kết. Vì vậy xuất hiện những triệu
chứng như trương bụng trương phồng lên, co thắt, đầy hơi và kéo theo là tiêu
chảy. Để giảm sự không dung nạp lactose người ta chứng minh được rằng nên
tiêu thụ sản phẩm probiotic. Và trên những kiểm nghiệm lâm sàng gần đây
người ta khuyên nên dùng LAB [17, 48, 73, 82, 84, 94].
1.1.6.2. Giảm tác nhân gây ung thư.
Những tác nhân gây ung thư có thể được đưa vào hay được tạo thành bởi
hoạt động chuyển hoá của vi sinh vật cư trú trong đường ruột. Những cơ chế
hoạt động của probiotic chống lại khối u có thể tóm tắt như sau [66]:
-

Khử độc những chất gây ung thư được đưa vào.

-

Thay đổi môi trường của ruột và hoạt động chuyển hoá của vi khuẩn có

thể tạo thành những chất gây ung thư.

17


-

Tạo thành những sản phẩm chuyển hoá (butyrate) mà những sản phẩm

này thay đổi khả năng của tế bào chết khi nó chết.
-

Sản sinh ra những chất ức chế sự phát triển của những ết bào tạo khối u.

-

Kích thích hệ thống miễn dịch.
1.1.6.3. Chữa trị bệnh tiêu chảy.

Có nhiều nguyên nhân gây ra bệnh tiêu chảy vì vậy rất khó khăn cho việc
đánh giá ảnh hưởng của probiotic trên bệnh tiêu chảy. Trên toàn thế giới, bệnh
tiêu chảy đã giết chết phần lớn trẻ em và rotavirus là nguyên nhân chính. Sự
phát triển của bifidobacteria trong đường ruột tạo nên pH thấp trong ruột già

bằng cách sản sinh ra acid lactic và acid acetic, vì vậy chúng ức chế sự phát
triển của vi khuẩn gram âm kỵ khí tuỳ ý gây ra bệnh tiêu chảy.
Khu hệ sinh thái đường ruột ổn định, nó hoạt động như một hàng rào vật lý
và sinh lý chống lại vi khuẩn gây bệnh và những kháng nguyên từ khoang ruột.
Những nghiên cứu cho thấy rằng, những trẻ em bị tiêu chảy do rotavirus thì
phục hồi nhanh hay giảm những triệu chứng tiêu chảy khi sử dụng probiotic.
Nghiên cứu ở những đứa trẻ (1 – 36 tháng tuổi) sử dụng Lactobacillus casei
GG liều lượng 1x 1011 CFU trong 5 ngày bệnh tiêu chảy rút ngắn từ 3.8 ngày
còn 2.7 ngày [27].
1.1.6.4. Kích thích hệ thống miễn dịch.
Khả năng vi khuẩn probiotic chống đỡ hệ thống miễn dịch có vai trò quan
trọng đối với người già và những người hệ thống miễn dịch bị tổn thương.
Sanders cho rằng “đường ruột có số lượng tế bào miễn nhiễm cao nhất trong cơ
trẻ”. Nhiều nghiên cứu cho rằng sự cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột có lợi cho
hệ thống miễn dịch. Những nghiên cứu gần đây cho rằng những người tiêu thụ
probiotic làm tăng khả năng kháng thể khi chúng được cung cấp một vaccine.
Sự tác động của probiotic trên chức năng miễn dịch thì phức tạp. Sanders
cho rằng probiotic có thể kích thích những thành phần của hệ thống miễn dịch
để chống lại vi khuẩn gây bệnh.
1.1.6.5. Giảm cholesterol.
Có hai cơ chế khi tiêu thụ LAB làm giảm cholesterol. Cơ chế thứ nhất cho
rằng, cholesterol được sử dụng trong sản xuất những acid mật, tăng sự dị hoá
18


và bài tiết của những acid mật có thể làm giảm cholesterol. Những acid mật chủ
yếu được tạo thành bởi gan là acid chenodeoxycholic. Những acid này thường
kết hợp với glycine hay taurine tạo thành acid glycocholic và acid taurocholic,
nhưng có thể được tách ra bởi enzyme vi sinh vật là BSH (bile salt hydrolase).
Sự tách những muối mật này ngăn sự gia tăng cholesterol. Điều này chứng tỏ

rằng vi sinh vật trực tiếp hấp thụ cholesterol [26].
1.1.6.6. Điều trị dị ứng một số loại thực phẩm.
Nhiều nghiên cứu cho rằng các chế phẩm probiotic có chứa L.rhamnosus
GG giúp hạn chế hội chứng dị ứng thực phẩm. Những đứa trẻ bị dị ứng với
protein thịt bò và bị nổi vết chàm khi được cho ăn váng sữa đã thuỷ phân có bổ
sung L.rhamnosus GG cho thấy sự cải thiện đáng kể những vết chàm dị ứng
trên da, đồng thời giảm tiết α1- kháng trypsin và interferon – α, so với những
đứa trẻ chỉ được cho ăn sữa đã thuỷ phân.
Trong một cuộc thử nghiệm tại bệnh viện công nương Magarett (Úc), việc
cho trẻ dùng các chế phẩm probiotic có chứa Lactobacillus trong chế độ ăn
uống vời liều dùng 2 lần/ngày trong sáu tháng đầu đời cho thấy khả năng tăng
cường sự miễn nhiễm, làm giảm một nửa số trẻ mắc bệnh viêm da [3, 44].
1.1.6.7. Ngăn chặn và xử lý nhiễm khuẩn Helicobacter pylori.
H.pylori là một trong số một vài vi khuẩn có khả năng sống được trong
niêm mạc dạ dày. Trong một số trường hợp chúng gây viêm loét hoặc ung thư
dạ dày. Sử dụng probiotic là hiệu pháp thường được kết hợp với liệu pháp
kháng sinh truyền thống trong điều tri nhiễm khuẩn H. pylori.
Các thử nghiệm in vitro và in vivo cho thấy các chủng L.acidophilus LB tiết
ra các chất kháng H.pylori. Chúng cũng làm giảm sự kết bám, và số lượng của
H.felis trong chuột và của H.pylori trên dòng tế bào ruột người HT29-MTX
(Coconier và ctv.,1995).
Khi nghiên cứu trên những người tình nguyện nhiễm H.pylori được ăn loại
sữa lên man LC1 chứa L.jonhsonii La1, thấy rằng có sự giảm mật độ H.pylori
và giảm các triệu chứng viêm loét dạ dày (Felley và ctv.,2001) [52].

19


1.1.7. Những tiêu chí khi chọn các chủng probiotic.
1.1.7.1 Những tiêu chí chọn giống.

Các tiêu chí chọn giống vi sinh vật làm chế phẩm probiotic có thể bao gồm
những khía cạnh về sự an toàn, chức năng và kỹ thuật.
 Những khía cạnh về sự an toàn.
-

Có nguồn gốc từ người.

-

Chúng được phân lập từ đường ruột người.

-

Không gây bệnh và không có độc tố.

 Những khía cạnh về chức năng.
-

Có khả năng sống sót khi vận chuyển qua đường ruột của vật chủ (kháng

với muối mật, pH thấp, proteases).
-

Bám dính tốt trên tế bào biểu mô ruột để làm giảm hay bảo vệ sự hình

thành tập đoàn vi khuẩn gây hại.
-

Thích nghi với khu hệ vi sinh vật đường ruột.

-

Vi khuẩn probiotic cạnh tranh chất dinh dưỡng, gia tăng hệ thống miễn

dịch trong vật chủ.
-

Sản sinh cơ chất kháng sinh, vitamin và giải phòng các enzyme có lợi

giúp cho việc tiêu hoá được dễ dàng.
 Những khía cạnh về kỹ thuật.
-

Có chất lượng cảm quan tốt.

-

Chống chịu với các chất kháng khuẩn.

-

Khả năng sống sót trong suốt quá trình bảo quản.

-

Ổn định trong suốt quá trình sản xuất và bảo quản [49,72].
1.1.7.2 Những phương pháp nghiên cứu chọn các chủng probiotics.

* Chọn giống.
Sản phẩm probiotic đáng tin cậy yêu cầu ghi tên những chủng sử dụng và số

lượng tế bào sống lên thông tin trên nhãn. Những chủng được định danh sử
dụng những phương pháp sinh học phân tử hiện đại như trình tự 16S rDNA, lai
DNA/DNA, sự phân loại theo danh pháp hiện đại [85].

20


* Những đặc điểm sinh lý.
Có nhiều phương pháp được dùng để nghiên cứu những đặc điểm sinh lý
của những chủng probiotics. Phương pháp lên men carbonhydrat và hoạt
động enzyme được sử dụng rộng rãi. Quan trọng là chọn những cơ chất
chuyên biệt hay những hoạt động enzyme liên quan đến những ảnh hưởng
chức năng mong đợi của chúng. Những phương pháp kiểm tra như thuỷ
phân muối mật hay sản sinh các cơ chất kháng kháng sinh có liên quan đến
mục đích sử dụng chủng đó [21, 37, 56].
* Chống chịu được những điều kiện đường ruột.
Khả năng sống sót của những chủng probiotic được xem như là quan trọng
để đảm bảo chức năng tốt nhất. Sau khi tiêu hoá, những vi khuẩn vượt qua
được hàng rào sinh học chính, môi trường acid dạ dày và sự tiết dịch mật trong
tá tràng . Để đảm bảo khả năng sống sót trong suốt quá trình di chuyển trong
đường ruột các chủng probiotic phải chống chịu được với pH acid và dịch mật.
Những vi khuẩn khác nhau thì khả năng chống chịu với đường ruột khác nhau.
Có nhiều phương pháp khác nhau phục vụ cho mục đích này nhưng nhìn chung
khả năng chống chịu với những điều kiện đường ruột thì thấp [29, 43, 53, 87].
* Sự bám dính.
Sự bám dính với màng nhầy ruột là một trong những tiêu chí quan trọng để
chọn chủng probiotics. Nó làm cho thời gian cư trú của probiotics trong đường
ruột kéo dài. Có nhiều phương pháp hiện đại khác nhau để đánh giá sự bám
dính của probiotics như sự bám dính với màng nhầy ruột và sự bám dính với tế
bào biểu mô. Sự ảnh hưởng của các điều kiện đường ruột (pH, dịch mật,

enzyme tiêu hoá ) và sự kháng acid và dịch mật.
Những chủng có khả năng bám dính cao như Bifidobacterium lactic Bb12
và L.rhamnosus GG thì ảnh hưởng trên sự bảo vệ và điều trị bệnh tiêu chảy cấp
tính ở trẻ em [30, 38, 39, 89].
1.1.7.3 Những khía cạnh an toàn của probiotic.
Có nhiều phương pháp để đánh giá sự an toàn của probiotics:
-

Nghiên cứu những thành phần bên trong của chủng probiotics.

-

Nghiên cứu trên được di truyền học của chủng probiotics.
21


-

Nghiên cứu trên sự tương tác giữa chủng probiotics và vật chủ.

Theo những nghiên cứu thì probiotics nên chứa đủ số lượng vi khuẩn sống
trong đường ruột tối thiểu 106/g hay 106 /ml của sản phẩm tại thời điểm tiêu thụ
để ảnh hưởng tốt trên người tiêu thụ. Hầu hết probiotics thì ổn định trong một
thời gian ngắn nhất định khi được bảo quản dưới điều kiện lạnh đông hay sấy
khô. Khả năng sống của vi khuẩn thì phụ thuộc vào hình thức sản xuất (dạng
bột, dạng viên hay dạng nang) cũng như việc đóng gói (dạng chai hay túi
nhôm…). Khi những vi khuẩn này bị đặt trong những điều kiện có O 2, độ ẩm
nhiệt độ sẻ ảnh hưởng lên tế bào vi sinh vật. Probiotics dạng lỏng thì không ổn
định bằng dạng bột.
Vì vậy, việc quan trọng là cần kiểm tra khả năng sống sót và sức chịu đựng

của probiotics trong suốt quà trình sản xuất và bảo quản. Kiểm tra việc tạp
nhiễm các vi sinh vật không mong muốn vào sản phẩm probiotics. Việc kiểm
tra phải đảm bảo đặc tính ổn định và đặc tính kỹ thuật của probiotics:
• Giữ được chất lượng cảm quan tốt.
• Giữ được khả năng bám dính trong thành ruột sau quá trình sản xuất
và bảo quản.
• Loại trừ vi sinh vật tạp nhiễm không mong muốn.
• Có khả năng ổn định trong suốt quá trình sản xuất và bảo quản.
• Duy trì được tính acid nhẹ trong suốt quá trình bảo quản.
1.1.8. Các phương pháp bảo quản chế phẩm probiotic.
1.1.8.1. Lịch sử của kỹ thuật giữ và bảo quản giống vi sinh vật.
Trong những năm gần đây kỹ thuật giữ và bảo quản giống vi sinh vật có vai
trò rất quan trọng. Sự phát triển của những kỹ thuật này nhằm giúp cho việc
nghiên cứu và sản xuất được thuận lợi. Từ thập niên 1930, các nhà khoa học đã
bắt đầu quan tâm về kỹ thụât giữ và bảo quản giống thuần khiết, nhưng chú
thực sự đã bắt đầu cách đây hàng trăm năm.
Vào khoảng cuối thế kỷ XVII, Leewenhoek, người Hà Lan, đã quan sát
nước tự nhiên ( nước mưa và nước biển), cũng như bia lên men. Bằng việc sử
dụng kính hiển vi thô tự chế, ông đã tìm thấy vô số “vi động vật” đang chuyển
22


động trong những chất lỏng trên và vì vậy đã thừa nhận đây là phát kiến đầu
tiên về thế giới vi sinh vật. Tuy nhiên, đã không có sự phát triển nào xa hơn
trong lĩnh vực này vào thế kỷ XVIII. Bắt đầu vào thế kỷ XIX, các nhà hoá học
vẫn cho rằng cồn là do sự tích luỹ của các phản ứng hoá học hơn là quá trình
sống của vi sinh vật. Trong những năm 1830, Cagniard, người Pháp đã khám
phá ra quá trình sản sinh ra cồn là do cơ chế nội bào của vi sinh vật. Hai mươi
năm sau, các luận điểm của các nhà hoá học đã bị bác bỏ bởi Pasteur (1860).
Bằng một loạt các thí nghiệm của mình nhằm loại bỏ những ảnh hưởng của vi

sinh vật từ không khí bằng gia nhiệt. Và, Pasteur đã chứng minh được sự hiện
diện của vi sinh vật trong không khí. Tuy nhiên, việc giữ giống trên môi trường
đặc đã không có ý nghĩa vào thời đó và ông cũng không có khả năng phân lập
được vi sinh vật thuần khiết.
Các nhà vi khuẩn học đã cố gắng giữ những khuẩn lạc phát triển từ canh
trường nuôi cấy bằng môi trường đặc nhưng không thu được kết quả. Đến thập
niên 1870 nhà thực vật học O.Brefeld, lần đầu tiên sử dụng gelatin để làm đông
đặc môi trường nuôi cấy. Robert Koch đã làm đặc canh trường dinh dưỡng với
gelatin. Phát hiện của ông đã giúp ích rất nhiều cho kỹ thuật phân lập vi khuẩn
thuần khiết.
Các nhà khoa học đã cố gắng tìm ra phương pháp bảo quản vi sinh vật bằng
cách làm giảm tối thiểu sự phát triển của vi sinh vật và cản trở quá trình trao
đổi chất của chúng. Đầu tiên Will (1907) đã trộn lẫn những nấm men với dung
dịch Sucrose 10% đã thanh trùng và bảo quản được 10 năm. Tuy nhiên những
tính chất sinh lý của chúng giảm đáng kể và không phục hồi lại được khi cấy
lại trong môi trường mới.
Các nhà vi khuẩn học đã cố gắng giữ những khuẩn lạc phát triển từ canh
trường nuôi cấy bằng mơi trường đặc nhưng khơng thu được kết quả. Đến thập
niên 1870 nhà thực vật học O.Brefeld, lần đầu tiên sử dụng gelatin để làm đông
đặc môi trường nuôi cấy. Robert Koch đã làm đặc canh trường dinh dưỡng với
gelatin. Phát hiện của ông đã giúp ích rất nhiều cho kỹ thuật phân lập vi khuẩn
thuần khiết.

23


Các nhà khoa học đã cố gắng tìm ra phương pháp bảo quản vi sinh vật
bằng cách làm giảm tối thiểu sự phát triển của vi sinh vật và cản trở quá trình
trao đổi chất của chúng. Đầu tiên Will (1907) được trộn lẫn những nấm men
với dung dịch Sucrose 10% đã thanh trùng và bảo quản được 10 năm. Tuy

nhiên những tính chất sinh lý của chúng giảm đáng kể và không phục hồi lại
được khi cấy lại trong môi trường mới
1.1.8.2. Những nhân tố giúp nâng cao tỉ lệ sống trong quá trình bảo
quản
Sự bảo vệ vi sinh vật bằng phương pháp đông khô và say khô đã được sử
dụng phổ biến trong những thập niên qua. Những phương pháp này thích hợp
cho việc vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn vi sinh vật. Chúng có thể
ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm và áp dụng cho nhiều
loài vi sinh vật khác nhau. Trong đó, LAB đặc biệt là những giống
Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus và Pediococcus đóng
vai trò trung tâm vì nó có nhiều ứng dụng trong đời sống có lợi cho sức khoẻ
con người.
Trong công nghiệp, LAB co thể được bảo quản và phân phối ở dạng lỏng,
lạnh đông, đông khô, sấy phun. Tuy nhiên những phương pháp này phải đảm
bảo sao cho tỉ lệ sống cao và ổn định trong thời gian dài mà vẫn đảm bảo chức
năng hoạt động tốt [23]. Sự giảm khả năng sống sót khi sử dụng những phương
pháp sấy khô là do hậu quả của tế bào bị tổn thương tại nhiều vị trí mục tiêu,
đặc biệt là thành tế bào, màng tế bào và DNA cũng như do màng tế bào bị oxi
hoá [86].
Sự sống tối đa của LAB trong suốt quá trình sấy khô và bảo quản có ý nghĩa
quan trọng cả về mặt kinh tế và kỹ thuật. Sự sống sót của vi sinh vật trong quá
trình sấy khô và bảo quản phụ thuộcvào nhiều yếu tố như :
- Pha phát triển và nồng độ ban đầu.
- Môi trường phát triển.
- Môi trường sấy khô.
- Phương pháp sấy khô.
- Quá trình đóng gói và bảo quản.
24

1.1.8.2.1 Pha phát triển và mật độ tế bào
Sự phát triển của vi sinh vật gồm 4 pha : pha thích nghi, pha phát triển, pha
ổn định và pha suy tàn. Pha ổn định gồm nhiều trạng thái sinh lý khác nhau
trong tế bào, thông thường sự thiếu nguồn cacbon và sự cạn kiệt những nguồn
dinh dưỡng gây nên trở ngại cho sự sống sót của quần thể tế bào. Sự sống sót
trong pha ổn định có thể bảo vệ tế bào trong những điều kiện không thuận lợi
khác như quá trình sấy khô và nhiệt độ không thuận lợi. Theo báo cáo của
Corcoran năm 2004 khi thu sinh khối Lactobacillus rhamnosus ở pha ổn định
thì thu được tỉ lệ sống cao nhất 31 – 50%, thu ở pha phát triển 14% sống sót và
chỉ có 2% sống sót khi thu tế bào ở pha thích nghi.
Mật độ tế bào khi đem sấy khô nên lớn hơn 1 x 10 8 tế bào/ml. Tuy nhiên
theo Costa (2000) đã cho rằng nồng độ tế bào ban đầu tối ưu phụ thuộc vào môi
trường bảo vệ sử dụng. Khi sử dụng sucrose thì mật độ tế bào 10 10 CFU/ml là
tối ưu cho sự phục hồi cao nhất. Mặt khác, nếu sữa gầy là môi trường bảo vệ
thì mật độ tế bào ban đầu là 108 CFU/ml [67].
1.1.8.2.2. Môi trường phát triển
Cho tới nay, chưa có quan niệm rõ ràng cho rằng môi trường phát triển ảnh
hưởng lên sự sống sót của vi sinh vật. Những nghiên cứu tập trung vào cơ chất
được bổ sung vào. Nghiên cứu của Streeter và cộng sự (2003) cho rằng khi
thêm trehalose vào môi trường phát triển cho phép tế bào gia tăng khối lượng
của trehalose trong tế bào chất làm chắc chắn màng tế bào chất trong suốt quá
trình sấy khô [67].
1.1.8.2.3. Môi trường sấy khô
Môi trường sấy khô là yếu tố quan trọng nhất. Sự lựa chọn môi trường sấy
khô thích hợp cho LAB là rất quan trọng. Nó có thể gia tăng tỉ lệ sống sót trong
suốt quá trình làm khô và bảo quản. Những chất bảo quản có thể phụ thuộc vào
vi sinh vật. Tuy nhiên có những chất bảo quản thích hợp cho nhiều loại vi sinh
vật như : sữa gầy, huyết thanh, trehalose, glycerol, betaine, adonitol, sucrose,
glucose, lactose và những polymer như dextran và polyethyleneglycol [46].
Cách đây hơn 20 năm những cơ chất đường như trehalose và sucrose được

báo cáo là làm tăng sự chống chịu với đông khô của đa số vi sinh vật do nó ổn
25