Báo cáo thực tập công nghệ sinh học dược

1

Bài 1: CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT
1.1 Khái quát.

Muốn có sản phẩm tốt, ngoài quy trình công nghệ thì khâu giống là quan trọng
nhất, nó quyết định chất lượng sản phẩm và giá trị kinh tế của quy trình công
nghệ sản xuất. Trong công nghệ lên men, người ta sử dụng rộng rãi nhiều loại vi
sinh vật thuộc nhóm Prokaryote (vi khuẩn, xạ khuẩn, vi khuẩn lam) và nhóm
Eukaryote (nấm men, nấm mốc,
tảo).
Quá trình chọn lọc giống vi sinh vật bao gồm:
-

Phân lập từ tự nhiên,
Gây đột biến,
Phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn,
Bảo quản giống.

Việc phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn dựa vào:
-

Chất chuyển hóa tạo ra: ví dụ như kháng sinh, sắc tố, …
Enzym ngoại bào tác động lên cơ chất trong môi trường
Sự thay đổi đặc tính sinh trưởng của vi sinh vật
Sự thay đổi hình thái

Một chủng giống vi sinh vật được dùng cho công nghiệp hiện nay cần phải đáp
ừng những nhu cầu sau:
- Chủng vi sinh vật phải thuần, không chứa vi sinh vật gây nhiễm khác.
- Phải đảm bảo khả năng tạo thành sản phẩm với năng suất cao, chất lượng tốt,

không tạo ra sản phẩm phụ không mong muốn.
- Khả năng sử dụng nguyên liệu dễ kiếm và rẻ tiền. Trên những cơ chất này vi
sinh vật phải mọc nhanh và sản sinh lượng lớn sinh khối ổn định. Khả năng tách
dễ dàng các tế bào hay các sản phẩm tạo ra trong qua trình lên men.
- Phải thể hiện tính không mẫn cảm với vi sinh vật tạp nhiễm và thực khuẩn
thể .
- Cùng với thời gian chủng sản xuất phải bảo toàn được đặc tính hoá sinh ban
đầu.
- Chủng vi sinh vật có khả năng thay đổi đặc tính bằng các kỹ thuật đột biến,
kỹ thuật
gen đểkhông ngừng nâng cao năng suất


2
1.2 Một số phương pháp bảo quản giống:

Có nhiều phương pháp bảo quản giống vi sinh vật, nhưng không có cách nào
hoàn hảo cả. Việc lựa chọn cách bảo quản đối với mỗi vi sinh vật thường mang
tính kinh nghiệm.
a. Giữ giống trên thạch

Cấy chuyền định kỳ vi sinh vật sang môi trường mới.
Phương pháp này hay được áp dụng mặc dù tốn nhiều công sức và có thể dẫn
đến thoái hóa chủng. Khi sử dụng phương pháp này cần chú ý thành phần môi
trường để tránh thoái hóa chủng.
Giống có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc ở 4 – 5 0C
Thời gian cấy chuyền thường từ 1 tuần đến 1 tháng, tùy theo chủng
b. Giữ giống dưới lớp dầu khoáng:

Khi giữ giống ở 4 – 5 0C, môi trường thường có hiện tượng bị khô làm giống bị

chết hoặc giảm hoạt tính. Để khắc phục người ta cho lên bề mặt môi trường một
lớp dầu trơ (dầu khoáng, parafin, vaselin, …)
Thực hiện như sau: giống sau khi chọn lọc được nuôi cấy trên môi trường đặc
hoặc lỏng trong điều kiện tối ưu đến giai đoạn logarit hoặc đến khi bào tử chín.
Sau đó phủ một lớp dầu khoảng 10 mm trên bề mặt môi trường, và gắn kín nút
bông bằng parafin. Giữ ở nhiệt độ phòng hoặc ở 4 – 7 0C.
Dưới lớp dầu khoáng, vi sinh vật vẫn duy trì sự sống và các chủng hiếu khí vẫn
sinh trưởng với tốc độ chậm. Và trong quá trình bảo quản có thể lấy chủng ra bằng
cách chọc que cấy qua lớp dầu mà không làm hỏng tình trạng chủng.
Cách này giữ chủng được lâu, có thể lên đến nhiều năm, do vậy phải nghiên
cứu điều kiện môi trường để đảm bảo dự trữ dinh dưỡng và chống các sản phẩm
chuyển hóa hay acid tạo ra trong quá trình sinh trưởng. Thường chọn môi trường
giàu protein và có lượng đường tối thiểu.
c. Giữ giống trong cát:

Phương pháp này thường chỉ áp dụng cho việc bảo quản bào tử. Do đặc tính
của chủng có khả năng chịu đựng các điều kiện khắc nghiệt và nếu gặp điều kiện
thuận lợi sẽ nảy mầm thành dạng dinh dưỡng.


3

Thực hiện bằng cách: cát sông được rửa nước cho sạch bụi, có thể rửa bằng
cách đun với HCl và rửa lại bằng nước. Rây để lấy các hạt mịn. Sấy khô cát 120 0C
trong 3 – 4 giờ. Phân thành từng liều nhỏ trong ống nghiệm và tiệt trùng bằng tủ
sấy 160 – 180 0C trong 2 – 3 giờ hoặc 120 0C hai lần cách ngày, mỗi lần 1 giờ.
Kiểm tra độ vô trùng của cát.
Chủng được nuôi cấy đến khi bào tử chín, đổ cát đã thanh trùng vào và cho bào
tử bám vào cát. Đổ cát có dính bào tử vào ống nghiệm khô vô trùng, hút kiệt ẩm và
nút kín. Bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc 4 – 5 0C

d. Đông lạnh:

Là làm lạnh ống môi trường chứa vi sinh vật đã phát triển từ từ đến độ lạnh sâu
-20 đến -30 0C, tốt nhất là -80 0C. Khi làm lạnh cần chú ý tốc độ làm lạnh thích
hợp và phải thêm các tác nhân bảo vệ chống đông thích hợp như glycerin (10 –
15%), sữa (~5%), lòng trắng trứng, …
Tùy độ lạnh mà thời gian bảo quản khác nhau, nếu ở -20 0C, khoảng 6 tháng,
còn ở -80 0C khoảng 10 năm. Khi cần sử dụng thì làm tan băng bằng cách lấy
chủng ra và đặt vào bếp cách thủy 37 0C. Không làm tan băng nhiều lần. Hoặc có
thể dùng que cấy cứng cạo lấy một ít vi sinh vật đang đông đá rồi cấy lên môi
trường thích hợp, phần còn lại trả nhanh về tủ đông.
e. Đông khô:

Là quá trình làm khô ở áp suất (>1 mbar) và nhiệt độ thấp (dưới nhiệt độ đông
đặc của mẫu).
Ở nhiệt độ này và áp suất đủ thấp, nước đá trong mẫu sẽ thăng hoa. Do nước
được lấy đi từ dạng rắn thành dạng hơi nên nồng độ chất tan trong mẫu sẽ không
tăng dần lên như các lúc bay hơi từ dạng lỏng, nên ít ảnh hưởng đến chất lượng
sinh học của mẫu, đồng thời khi mẫu khô sẽ có cấu trúc xốp, dễ dàng lấy lại trạng
thái ban đầu khi thêm nước vào.
Mẫu sau khi đông khô có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài.
Phương pháp rất đắt tiền nhưng cho phép bảo quản giống rất tốt, cho khả năng
phục hồi cao mà ít ảnh hưởng đến hoạt tính.
NỘI DUNG THỰC TẬP


4
1.3 Chuẩn bị mẫu

Tiến hành: lấy mẫu đất pha loãng với NaCl 0.85% từ huyền dịch ban đầu thành

các cấp độ pha loãng tương ứng 10 -1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6. Lấy các eppendorf
có các độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6 đi trải đĩa.
1.3.1. Phân lập các chủng có amylase ngoại bào

Lấy 100 µldịch từ các độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6 trải trên các đĩa thạch có chứa
tinh bột, đánh số tương ứng cho các đĩa thạch (A4, A5 và A6); Đem ủ 37oC/ 24h.
1.3.2. Phân lập các chủng có prolase ngoại bào

Lấy 100 µl dịch từ các độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6 trải trên các đĩa thạch có chứa
gelatin, đánh số tương ứng cho các đĩa thạch (P4, P5 và P6); Đem ủ 37 oC/ 24h.
1.3.3. Xác định khả năng kháng khuẩn của vi sinh vật:

Các chủng thử nghiệm E.coli, S.aureus.
a. Phương pháp khếch tán (kỹ thuật đục lỗ):

Trải đều vi khuẩn E.coli / S.aureuslên mặt thạch
Đục lỗ 5 lỗ trong bản thạch
Nhỏ vào 5 lỗ lần lượt các dịch chứa:
chủng vi khuẩn B1, B2, B3, B4 và lỗ chứng chỉ chứa môi trường
Để yên để chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch.
Ủ 37oC trong 16 – 18 giờ
Đọc kết quả
b. Phương pháp khếch tán (kỹ thuật đường kẽ vuông góc):
- Bước 1: Kẻ các đường vuông góc vối chủng cần kiểm tra (cách tồi thiểu 0.2
mm, các chủng thử nghiệm cách nhau tối thiểu 1 cm.
- Bước 2: Dùng que bông cấy chủng thử nghiệm lên đĩa thạch bộ môn đã cấy
đã cấy sẵn chủng kiễm tra.
- Bước 3: Ủ 37oC trong 16 – 18 giờ
1.4 Phát hiện vi sinh vật có đặc tính mong muốn.
a. Phát hiện Amylase ngoại bào

Vi sinh vật từ mẫu đất sau khi được cấy trên thạch tinh bột, đem ủ thì sẽ phát
triển. Khi đem tráng bề mặt môi trường với một ít dung dịch Lugol (iod) thì nền


5

môi trường sẽ có màu tím than do màu của iod với tinh bột. Chủng vi sinh vật có
sinh amylase ngoại bào thì xung quanh chỗ vi sinh vật sẽ có vòng trong suốt quanh
khóm khuẩn lạc; do amylase sinh ra đã thủy phân tinh bột.
b. Phát hiện Protase ngoại bào

Vi sinh vật từ mẫu đất sau khi được cấy trên thạch gelatin, đem ủ thì sẽ phát
triển. Khi đem tráng bề mặt môi trường với một ít dung dịch TCA 50% thì nền môi
trường sẽ đục vì gelatin bị tủa. Chủng vi sinh vật có sinh protease ngoại bào thì
xung quanh khóm khuẩn lạc sẽ có vòng trong suốt; do gelatin đã bị protese sinh ra
thuỷ phân.
1.5 KẾT QUẢ THỰC TẬP

a. Các chủng amylase ngoại bà: có 3 loại khóm trên đĩa
Bảng 1.1:Mô tả khóm vi khuẩn và khả sinh Amylase ngoại bào
T
T

Khả năng sinh
amylasengoại bào

Mô tả khóm

Khuẩn lạc tròn, lồi – không bằng phẳng,
1 màu vàng nhạt,đường kính 8 – 10 cm, bìa

răng cưa
Khuẩn lạc trong, màu trắng, tròn, lồi,
2
đường kính 8 – 10 mm, bìa tròn
Khóm màu vàng nhạt bằng phẳng, bìa
3
răng cưa, đường kính khoảng 5 mm
b. Protease ngoại bào: có 3 loại khóm trên đĩa

không
Không
Có

Bảng 1.2:Mô tả khóm vi khuẩn và khả sinh Protease ngoại bào
T
T

Khả năng sinh Protease

Mô tả khóm

ngoại bào

Khóm màu vàng nhạt, hơi lồi, khô, bìa xẻ
thuỳ sâu, đường kính khoảng 5 – 7 mm
Khóm màu vàng nhạt, tròn lồi, bìa không
2
răng cưa, đường kính khoảng 8 - 10 mm
Khóm màu vàng nhạt bằng phẳng, bìa
3

răng cưa, đường kính khoảng 5 mm
c. Xác định khả năng kháng khuẩn của vi sinh vật
1

Không
Có
Không

Bảng 1.3:Khả năng kháng khuẩn của E.coli và S.aureus – pp đục lỗ
Chủng
E.coli

B1
Có

Vòng kháng khuẩn xung quanh
B2
B3
không
không

B4
Có


6

S.aureus
Kết luận:

Không

Không

Có

Không

•

E.coli có khả năng sinh kháng sinh kháng lại chủng vi khuẩn B1, B4

•

S.aureus có khả năng sinh kháng sinh kháng lại chủng vi khuẩn B3

Bảng 1.4: Khả năng kháng khuẩn của E.coli và S.aureus – pp đường kẻ vuông
góc
Chủng
E.coli
S.aureus
Kết luận:

Chủng kiểm tra (Bộ môn cấy trước)
Mọc bình thường
Khoảng trong suốt cách chủng kiểm tra khoảng 1 cm

•

E.coliKhông nhạy cảm

•

S.aureusCó nhạy cảm

1.6 TRẢ LỜI CÂU HỎI

Kể tên và nêu nguyên tắc của một số phương pháp phát hiện các đặc tính
mong muốn trong thực nghiệm.
Để chọn được giống vi sinh vật thuần chủng, bước đầu tiên là phân lập chúng
từ các nguồn tự nhiên như: nước, không khí, đất, các mô động thực vật, các vật
liệu hữu cơ vô cơđã bị phân huỷ ít nhiều.
Theo kỹ thuật vi sinh vật cổ điển, việc phân lập các chủng thuần khiết mất
nhiều công sức và chậm. Ngày nay người ta dùng phương pháp “sàng lọc” vừa
nhanh vừa có hiệu quả.
Nguyên lý của phương pháp này là:
Trước hết người ta kiểm tra sơ bộ hỗn hợp các giống vi sinh vật từ mẫu tự
nhiên nhưđất hoặc nước, cỏ cây chẳng hạn…làm các huyền phù pha loãng 1/10
đến 1/100 từ đất, rồi gieo trên mặt hộp petri đựng môi trường thạch dinh dưỡng và
đã cấy một chủng vi sinh vật kiểm định có tác dụng đối kháng.
Chỉ có những chất nào trong đất sinh chất đối kháng với chủng kiểm định,
nghĩa là có tính chất kháng sinh thì sau khi nuôi sẽ tạo ra vùng ức chế đặc hiệu
trên đĩa thạch. Ta tách khuẩn lạc của chủng ấy và đem nuôi cấy, thử chất sinh ra và
xác định tiếp theo.
Cũng có thể đơn giản là đặt các mẫu đất lên các điểm khác nhau trên mặt thạch
dinh duỡng (nếu muốn tìm vi khuẩn) hoặc của thạch khoai tây (nếu muốn tìm
nấm) đã có chủng kiểm định được nuôi cấy từ trước. Giữ đĩa thạch ở 28-37 oC
trong khoảng 2 ngày, quan sát vùng bị ức chế và quyết định công việc phân lập các
chủng vi sinh vật có tác dụng tiếp theo.

7

Phương pháp “sàng lọc” cho phép nhanh chống xác định được tính kháng
khuẩn kháng nấm hoặc virus hoặc kháng ung thư của một chủng được phân lập.
Phương pháp này thường dùng hai kiểu kỹ thuật:
- Lấy một mẫu thử để khảo sát tác dụng với nhiều chủng kiểm định.
- Lấy nhiều mẫu thử để khảo sát tác dụng với một chủng kiểm định .
Cấy những chủng đã được phân lập bằng những đường vạch trên mặt thạch
dinh dưỡng trong hộp petri. Sau đó cấy chủng kiểm định theo đường song song
hoặc vuông góc 30với đường vạch của chủng nghiên cứu. Đặt hộp petri vào tủ ấm
với nhiệt độ thích hợp với chủng kiểm định. Tác dụng kháng sinh của mẫu thử sẽ
được xác định ở vùng mặt thạch không bị mờ tại các giao điểm đường cấy của
chủng bị ức chế.
Phương pháp này chủ yếu được sử dụng trong việc tìm chủng sản xuất các
chất kháng sinh. Từ nguyên lý cơ bản phương pháp đã được cải tiến và ngày một
phong phú hơn. Để chọn các chủng sản xuất các acid amin người ta đã sử dụng
kiểu chọn lọc theo kỹ thuật penicilin. Trong phương pháp này các điều kiện được
lựa chọn sao cho các tế bào hoang dại có thể phát triển trong môi trường dinh
dưỡng thiếu một acid amin nào đó và bị giết chết bằng pennixilin. Chúng ta đã
biết, penicilin chỉ có tác dụng lên các tế bào đang sinh trưởng. Các tế bào cần acid
amin không sinh trưởng được nên sống sót. Đối với những vi khuẩn mẫn cảm với
penicilin thì dùng chất kháng sinh khác. Để phân lập những chủng có tính chất đặc
biệt (như chuyển hoá steroit), người ta dùng hỗn hợp của nhiều chủng vi sinh vật
đem nuôi cấy trong cùng một môi trường có chất mà ta muốn thực hiện sự biến
đổi. Sau khi nuôi ta chiết xuất và các sản phẩm, phân tích theo các phương pháp
sắc ký.


8

BÀI 3: ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CÓ LỢI CỦA VI
KHUẨN PROBIOTIC
3.1. Khái quát
Bên cạnh các tiêu chuẩn về tính an toàn, tính đề kháng kháng sinh và chứa năng, vi
sinh vật (VSV) được lựa chọn làm probiotic phải đáp ứng được yêu cầu về d9a8c4
điểm sinh học như: (i) khả năng sống sót qua ống tiêu hoá của vật chủ, (ii) đặc
điểm công nghệ như sự ảnh hưởng của các yếu tố lý hoá tác đọng đến probiotic
trong suốt quá trình lên men cũng như bào chế.
Khi sử dụng bằng đường uống, hai yếu tố tác động trực tiếp đến dân số probiotic là
pH, acid của dịch vị và thành phần muối mật của dịch vị.
NỘI DUNG THỰC TẬP
-

Chủng thử nghiệm trong bài thực tập là tế bào sinh dưỡng và bào tử của Bacillus
SubtilisPY79
Đánh giá tỷ lệ sống sót của VSV probiotic trong dịch vị nhân tạo ở các pH khác nhau.
Đánh giá tỷ lệ sống sót của VSV probiotic trong dịch mật nhân tạo ở các nồng độ muối
mật khác nhau.

KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM
Đánh giá khả năng chịu dịch vị nhân tạo
a. Tế bào sinh dưỡng:

Thời
gian
(phút)

Nồng độ
VSV

0

pH
Đối chứng

MT pH 2

MT pH 3

103

5

2

4

60

10

1

13

90

104

10

8

b. Bào tử

Thời
gian
(phút)

Nồng độ
VSV

0

---

60

103

90

4

10

pH
Đối chứng

MT pH 2

MT pH 3

---

---

Nhiễm

8

6

Nhiễm

30

62

Nhận xét: ?????
Đánh giá khả năng chịu muối mật


9
a. Tế bào sinh dưỡng

Thời
gian
(phút)

Nồng độ
VSV

0

104

Nồng độ muối mật
Đối chứng

0.3%

0.5%

72

---

---

4

60

10

13

18

120

103

Nhiễm

Nhiễm

b. Bào tử

Thời
gian
(phút)

Nồng độ
VSV

0
60
120

Nồng độ muối mật
Đối chứng

0.3%

0.5%

104

96

---

---

104

Nhiễm

111

109

4

Nhiễm

134

112

10

|Nhận xét: Khả năng sống sót của VSV ở dạng bào tử cao hơn rất nhiều so với tế bào sinh dưỡng
ở các nồng độ muối mật đã khảo sát: Nồng độ muối mật 0,5% B. subtilis dạng bào tử sống sót
tương đối với nồng độ 0,5%
Theo thời gian khảo sát B. subtilis dạng bào tử khả năng sống chịu vẫn cao.
Ngược lại dạng tế bào sinh dưỡng của B. subtilis xét về khả năng chống chịu muối mật không cao.

Nếu để tế bào trong muối mật càng lâu thì số lượng tế bào klho6ng còn khả năng sống sót (xét ở
độ pha loãng 104).
BÀN LUẬN KẾT QUẢ
Mật độ dân số VSV lý thuyết là 108 CFU/ml. Qua thực nghiệm trải đếm sốngở độ pha loãng
104 nhận thấy:
-

Cứ 100l có 96 khóm khuẩn lạc  trong 1 ml sẽ có 960 con VSV;
Trong mẫu ban đầu ước lượng tương đối khoảng 0.96.107 con VSV.
B. subtilis dạng bào tử sống sót tốt trong muối mật khảo sát.


10
-

Khả năng chịu đựng pH và acid mật (trong thí nghiệm thực hành) số lượng giảm đi 2/3 so
với mẫu chứng ban đầu.Bài

4: TINH CHẾ ENZYM AMYLASE

BẰNG ALGINAT
4.1. Khái quát
Enzym amylase có ứng dụng quan trọng trong công nghiệp, thực phẩm, y dược ...
Trong những năm gần đây amylase được sử dụng nhiều và rộng rãi trong y học để sản
xuất gluose. làm dịch tiêm truyền, chuyển hóa tinh bột thành dextrin, tinh bột tan làm tá
dược trong bào chế để sản xuất một số thuốc.
Enzym amylase có thể thu nhận từ động vât, vi sinh vật và thực vật, tuy nhiên enzym
để có thể ứng dụng trong y dược cần trải qua các bước tinh chế từ enzym thô. Có nhiều
phương pháp được sử dụng để tinh chế enzyme như kết tinh, sắc ký và điện di.
Enzym amylase được tinh chế bằng dung dịch sodium alginate 2% (trong đệm

CH3COONa 0,2M pH = 4,8) với tỉ lệ 1:5. Enzym bám trên bề mặt sodium alginate 2% sẽ
bị kết tủa bởi ion hóa trị II, giải amylase vào dung dịch bằng dung dịch glucose 2%.
Để đánh giá hiệu quả của quá trình tinh chế, người ta dựa vào 2 tiêu chuẩn: xác định
hàm lượng protein (cơ chất của enzyme) bằng cách đo độ hấp thu OD 280 và xác định hoạt
tính của enzyme thông qua xác định hoạt độ của enzyme_tức là lượng enzyme có khả
năng phân giải 1 mg tinh bột sau 15 phút ở 300C.

NỘI DUNG THỰC TẬP
+ Thu enzym amylase từ nguyên vật liệu là khoai lang
+ Tinh chế amylase
+ Xác định hoạt lực của enzym thu được

4.2. Qui trình tiến hành.
a.

Chuẩn bị enzyme thô ( Bộ môn chuẩn bị sẵn)

Tế bào được phá vỡ bằng phương pháp cơ học (xay),
chiết amylase bằng đệm phosphat.
Loại tạp thô (các mảnh tế bào) bằng rây
Loại tinh bột (để lắng rồi gạn lọc lấy phần dịch)
Lọc phần dịch 2 lần qua giấy để loại hoàn toàn tinh bột


11

Dịch enzyme thô
b.

Tinh chế enzym amylase bằng alginat

Tạo liên kết giữa amylase với sodium alginat 2%
(15 ml dịch chiết thu được cho vào 75 ml dung dịch sodium alginate 2%.
Khuấy, ủ 1 giờ)
Tạo cấu trúc mạng lưới bắt giữ amylase (dùng 15 ml dung dịch CaCl2 0.7M)
Lọc lấy phần gel có amylase
Tách amylase từ mạng lưới gel alginat (dùng 75 ml dung dịch glucose 2%,
để ở 40C trong 12 giờ.)
Bỏ phần gel thu được phần dịch tinh chế có amylase.
c. Xác định hàm lượng protein trong dịch enzym thô và enzym tinh chế bằng
OD280
Ly tâm 10.000 vòng/phút.
Pha loãng mẫu enzym thô 30 lần, mẫu enzym tinh chế 5 lần.
Lấy 1 ml mẫu đo độ hấp thu ở bước sóng 280 nm

Xác định hoạt độ của amylase bằng phương pháp của Heinkel

4.2.1. Định lượng hoạt tính amylase
Nguyên tắc
Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường độ
màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch Iode.
Một đơn vị hoạt độ tương ứng với khả năng phân giải 1 mg tinh bột sau 30 phút ở
300C.
Thực hiện pha chế như bảng sau:
TT
Tinh bột 1% (ml)
Acid sulfosalicylic 20%
Đệm phosphate (ml)
Enzym (ml)

Ống Thử

0.1
0
0.3
0.1
Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút
Acid sulfosalicylic 20%
0.5
Hút 0.1 ml từ các ống sang eppendorf mới
Thuốc thử iode
0.9
Đo OD 560 nm

Ống Chứng
0.1
0.5
0.3
0.1
0
0.9


12
Hệ số pha loãng thực nghiệm
-

Enzym thô pha loãng 50 lần
Enzym tinh chế pha loãng 5 lần

3.2.Kết quả thực tập
3.3.1.Xác định hàm lượng protein trong dịch enzym thô và enzym tinh chế
bằng OD280
Bảng 3.6: Hàm lượng protein trong dịch enzym thô và enzym tinh
TT
Dịch enzym thô
Dịch enzym tinh chế

Hệ số pha

Tổng thể tích dịch

OD280

loãng

enzym

0,530
0,629

N
30
1

V (ml)
10
35

Tổng lượng protein trong mẫu

Protein (A280nm) = n x OD280 x V
159
22,015

3.3.2.Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính amylase
Bảng 3.7: Dữ liệu xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính amylase
Ống

1

2

3

4

5

Tinh bột (mg)

0,2

0,4

0,6

0,8

1

OD

0,1141

0,1878

0,3205

0,3686

0,4949

U/ml

2

4

6

8

10

Hình 3.4: Đường chuẩn xác định hoạt tính amylase

3.3.3. xác định hoạt độ của amylase
Bảng 3.8: Kết quả xác định hoạt độ của amylase
Hệ số pha loãng

TT

n

ODC

ODT

∆OD

Hoạt tính amylase

(ODC - ODT)

U/ml
(suy từ đường chuẩn)
497,93
26,89

Dịch enzym thô

50

0,4776

0,1146

0,363

Dịch enzym sau tinh chế

5

0,2950

0,4958

0,2008

Bảng 3.9:Thông số quy trình tinh chế

TT

Hệ số

Tổng thể

pha

tích dịch

loãng

enzym

n

V (ml)

Tổng

protein
(A280)

Tổng hoạt tính
(U)

Hiệu suất

Hiệu suất

Hoạt tính

Tổng

tổng hoạt

chuyên biệt

protein

tính

(U/A2 80)

A280

protein

(%)

(%)

Mức
tinh
chế
(lần)


13
Dịch enzym
thô
Dịch enzym
sau tinh chế

1000

10

159497.930

10

35

22,015

3073,64
13.85%
26.890

5.4%

0,39

1211,44

3.3.Nhận xét
Enzym sau tinh chế có tổng hoạt tính, hoạt tính chuyên biệt giảm so với ban đầu, hiệu
suất tinh chế đạt được là 5,4% với mức tinh chế là 0,39 lần.
Một quá trình tinh chế enzym amylase lý tưởng thì chỉ giúp loại bỏ các tạp protein
khác enzym amylase chứ không làm mất đi một lượng enzym amylase nào, đồng thời
cũng không được làm giảm đi hoạt tính của amylase. Tuy nhiên, trong thực tế quá trình
tinh chế thì rất khó đạt được kết quả lý tưởng mà thường có thể làm mất đi một lượng
enzym amylase nhỏ hay cũng có thể làm giảm đi một phần nhỏ hoạt tính của amylase.
Qua kết quả thực tập nhận thấy quá trình tinh chế amylase của nhóm làm vẫn chưa đạt
kết quả tốt vì trong quá trình tinh chế amylase đã làm mất đi một lượng enzym amylase,
làm giảm đi một phần hoạt tính của amylase. Nguyên nhân có thể là do:
Thao tác tinh chế enzym chưa chính xác:


-

Tỉ lệ các chất cần cho quá trình tinh chế cho vào chưa thật chuẩn,

-

Thời gian ủ, nhiệt độ ủ chưa tuân thủ chặt chẽ,

-

Quá trình lọc bỏ tủa thu dịch chứa enzym không cẩn thận nên có thể làm mất đi một
lượng enzym amylase,

-

Xác định tổng thể tích dịch lọc chứa enzym thô, dịch lọc chứa enzym sau tinh chế
còn sai số.



Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính Amylase chưa thật đúng



Thao tác đo quang chưa chính xác gây sai số

Bài 5: CỐ ĐỊNH CGTASE LÊN ALGINAT
5.1. KHÁI QUÁT
Cyclodextrin glucanotranferase (CGTase, EC 2.4.1.19) là enzym duy nhất có
khả năng chuyển hóa tinh bột và các chất tự thành hỗn hợp cyclodextrin ở các mức
độ polymer hóa từ 6, 7 và 8 đơn vị glucose (ứng với α-CD, β-CD và γ-CD). Việc
cố định sẽ tận dụng được khả năng tái sử dụng của các CGTase đắt tiền, và tăng
cường tính ổn định cũng như hoạt tính enzym.
Tinh bột

→ CGTase chuyển hóa tinh bột →

β-Cyclodextrin

14

Dựa vào bản chất các liên kết giữa chất mang và enzym, người ta phân loại các
phương pháp cố định enzym sau:
-

Phương pháp vật lý: hấp phụ, liên kết ion…
Phương pháp liên kết cộng hóa trị: dựa vào ái lực giữa enzym và chất mang

-

để tạo phức giữa enzym-chất mang bằng liên kết cộng hóa trị.
Phương pháp bắt giữ enzym vào khuôn gel: dựa trên nguyên tắc sự bắt giữ
của enzym vào một mạng lưới mà cơ chất và sản phẩm đi qua được nhưng

-

không cho enzym khuếch tán vào môi trường.
Phương pháp tạo vi nang: enzym được giữ trong các bao vi thể có màng bán
thẩm dày 200 Å (cellulose, polysaccarid).

•
a.
b.
c.

Nội dung thực tập
Cố định CGTase lên chất mang bằng phương pháp bắt giữ và hấp phụ.
Xác định hàm lượng protein cố định theo phương pháp Bradford.
Xác định hoạt tính CGTase cố định theo phương pháp Kaneko.

5.2. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
5.2.1. Kết quả

xác định hàm lượng protein cố định theo phương pháp

Bradford.
Bảng 5.1: Dữ liệu xây dựng đường chuẩn theo nồng độ protein chuẩn
Ống nghiệm
Nồng độ BSA (μg/ml)
∆OD595 nm

0
0
0

1
10
0.098

2
20
0.159

3
30
0.223

4
40

0.260

5
50
0.338

Hình 5.1: Đường chuẩn định lượng protein theo phương pháp Bradford
5.2.2. Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase và protein cố định
a. Xác định hàm lượng protein của ezyem tự do
Bảng 5.2: Hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase


15

Hệ số pha loãng n
100
∆OD 595 nm
0.204
Nồng độ protein (µg/ml)
(0.204-0.0197)/0,0064
Hàm lượng protein trong 2
100*28.80* 10-3*2

ml

=

28.80

=

5.76

chế phẩm CGTase (mg/ml)

b. Xác định hàn lượng protein theo phương pháp bắt giữ và hấp phụ
•

Công thức tính hàm lượng protein có trong 1ml enzym:
mg protein/ml enzym= n*x*10^-3

Trong đó:
N: Hệ số pha loãng
X: Nồng độ protein có trong mẫu thử (ug/ml). Suy từ đồ thị.
Hàm lượng protein cố định tính theo công thức:
mpr cố định = mpr ban đầu - mpr không cố định
• Hiệu suất cố định protein tính theo công thức:
H% = x 100 (%)
•

Bảng 5.3: Hàm lượng protein cố định theo phương pháp bắt giữ và hấp phụ
Phương pháp bắt giữ
Dịch lọc
Dịch rửa
2
0
0.250
0.127

Hệ số pha loãng n

∆OD595
Nồng độ protein 35.984
(μg/ml)
Thể tích V (ml)
32
Hàm lượng protein
2.304
trong V ml (mg/ml)
Hàm lượng protein
không

cố

cố định (mg)
Hiệu suất cố định
protein (%)

16.766

38.170

14.734

18

22

19

0.306

1.672

0.285

định 2.304+0.306 = 2.610

(mg/ml)
Hàm lượng protein

Phương pháp hấp phụ
Dịch lọc
Dịch rửa
2
0
0.264
0.114

1.672 + 0.285 = 1.957

3.150

3.803

54.69

66.02


16

Nhận xét: bố sung
5.2.3. Xác định hoạt tính enzyme trong chế phẩm và enzyme cố định
a. Xây dựng đường chuẩn cyclodextrin
Bảng 5.4: Dữ liệu xây dựng đường chuẩn cyclodextrin
Số thứ tự
Nồng độ β-CD (mg/ml)
OD550
∆OD550
Hệ số góc (a)

0
0
0
0
0.0187

1
2
0.043
0.037

2
4
0.098
0.075

3
6
0.138

0.112

4
8
0.159
0.150

5
10
0.184
0.187

Hình 5.2: Đường chuẩn Cyclodextrin
b. Xác định hoạt tính enzyme ban đầu
•
•

∆OD = OD chứng – OD thử
Hoạt tính của CGTase trong mỗi ml dung dịch CGTase (U/ml)
A=
Trong đó:
- n: Hệ số pha loãng
- a: Hệ số góc cảu đường chuẩn nồng độ CD theo mật độ quang
- t: Thời gian phản ứng
- M: Khối lượng riêng của CD (M = 1135)
- 10: Tỷ lệ ezym phản ứng: 1ml/0.1 ml = 10 (0.1 ml enzym tham gia

phản ứng)
Hoạt tính riêng của enzyme là hoạt tính của enzym trong 1mg protein
• Hoạt tính riêng của enzyme tự do

HTR enzyme tự do (U/mg protein)
• Hoạt tính riêng của enzyme cố định
HTR enzyme CĐ (U/mg protein CĐ)
• Tỉ lệ hoạt tính enzyme cố định so với enzyme tự do:
TLHT (%)
Bảng 5.5: Hoạt tính của CGTase
Hệ số pha loãng n

40


17

OD chứng
OD thử
∆OD
Khối lượng riêng của CD
Thời gian phản ứng t (phút)
Nồng độ CD (mg/ml)
Hoạt tính của CGTase trong mỗi ml

0.406
0.192
0.214
1135
15
10.90

dung dịch CGTase (U/ml)
Hoạt tính của CGTase (U/mg protein)

0.256
0.044

c. Xác định hoạt tính enzyme cố định
Nồng độ CD: suy ra từ phương trình hồi quy
Hoạt tính chung : A =
Bảng 5.6: Hoạt tính chung của enzyme cố định phương pháp bắt giữ và hấp
thụ

Nội dung

Phương pháp bắt giữ

Phương pháp hấp phụ

Enzyme

10 hạt

10 hạt

OD chứng

0.355

0.367

OD thử

0.188

0.317

∆OD

0.167

0.05

Nồng độ CD

8.385

2.128

4.9 x 10^-3

1.25 x 10^-3

Hoạt tính chung của enzyme cố định
d. Xác định hoạt tính riêng

Bảng 5.7: Hoạt tính riêng enzyme theo phương pháp bắt giữ và hấp phụ

Enzyme tự do
Hoạt tính chung
Hàm lượng protein cố
định (mg/ml)
Hoạt tính riêng cố

0.044

Enzyme cố định
Phương pháp bắt giữ
Phương pháp hấp phụ
^-3
4.9 x 10
1.25 x 10^-3

5.76

3.150

3.803

7.64 x 10^-3

1.56 x 10^-3

3.29 x 10^-4


18

định
Tỉ lệ hoạt tính

0.2

0.04

5.3. TỔNG KẾT
Bảng 5.7: So sánh hoạt tính enzyme cố định enzym phương pháp bắt giữ và
hấp thụ
Phương pháp
Thời gian
Hiệu suất cố định protein
Tỉ lệ hoạt tính (6 hạt)

Bắt giữ
Nhanh
54.69
0.2

Hấp phụ
Chậm
66.02
0.04

5.4. TRẢ LỜI CÂU HỎI
5.4.1. Nguyên tắc của phương pháp xác định hoạt tính của CGTase
- Xác định hoạt tính CGTase bằng phương pháp Kaneco
- Nguyên tắc: Hoạt tính của CGTase được đánh giá thông qua lượng cyclodextrin
do CGTase tạo ra từ malatosedextrin trong điều kiện xác định. Dựa vào khả năng
hấp phụ và mất màu phenolphtalein của cyclodextrin, ta có thể xác định được
cyclodextrin tạo thành.
5.4.2. Vẽ sơ đồ quy trình cố định CGTase
Cố định enzym bằng phương pháp bắt
giữ

2 ml enzyme + 15 ml alginate 2%

Nhỏ từ từ hỗn hợp enzym và alginat vào 30 ml dung dịch CaCl2 0,2 M.
Lọc thu hạt gel Ca-alginate-enzym. Thu dịch lọc xác định thể tích.

Rửa gel Calci alginat – enzym với 2 lần bằng đệm Tris-HCl, mỗi lần 10 ml


19

Thu hạt gel Thu dịch rửa, xác định thể tích
Xác định hàm lượng và hiệu suất protein cố định
Xây dựng đường chuẩn Cprotein(µg/ml) = f(OD595)

Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase
Xác định hàm lượng protein trong dịch rửa

Tính toán được hàm lượng protein cố định
Xác định hoạt tính CGTase cố định
Xây dựng đường chuẩn ∆OD550 = f(Cβ-CD(µg/ml))

Xác định hoạt tính của CGTase ban đầu
Xác định hoạt tính của CGTase cố định
Nhận xét về Tỉ lệ hoạt tính enzym trước – sau cố định bằng phương pháp bắt
giữ
Cố định enzym bằng phương
pháp hấp phụ
Dùng ống nhỏ giọt nhỏ từ từ 15 ml alginate 2% vào 30 ml
CaCl2-0.2 M

20

Thu hạt gel Ca-alginat

Cho hạt gel vào 20 ml đệm Tris-HCl pH8,
thêm 2 ml enzym CGTase vào dung dịch.

Cố định enzyme gel 45 phút

Lọc dung dịch sau khi cố định, thu dịch lọc
xác định thể tích

Rửa hạt gel Ca-alginate-enzyme 2 lần với
đệm Tris-HCl với pH 8 (mỗi lần 10 ml)

Thu hạt gel Thu dịch rửa, xác định thể tích
Xác định hàm lượng và hiệu suất
protein cố định
Xây dựng đường chuẩn Cprotein(µg/ml) = f(OD595)
Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase
Xác định hàm lượng protein trong dịch rửa
Tính toán được hàm lượng protein cố định
Xây dựng đường chuẩn ∆OD550 = f(Cβ-CD(µg/ml))Xác định hoạt tính CGTase cố
định


21

Xác định hoạt tính của CGTase ban đầu

Xác định hoạt tính của CGTase cố định
Nhận xét về Tỉ lệ hoạt tính enzym trước – sau cố định bằng phương pháp bắt
giữ


22

BÀI 9: TINH CHẾ PROTEIN BẰNG SẮC KÝ ÁI LỰC
9.1. KHÁI QUÁT
Sắc ký ái lực
Nguyên tắc:
Dựa vào sự gắn thuận nghịch của 1 nhóm chức năng trên protein với 1
nhóm chức năng của pha tĩnh sắc ký. Như vậy, chỉ có protein đích mang nhóm
chức năng đặc hiệu mới gắn vào pha tĩnh, còn các protein khác thì đi ra khỏi cột,
protein đích sau đó được thôi ra bằng 1 chất cạnh tranh với nó.
Đây là kỹ thuật sắc ký đơn giản và hiệu quả nhất để tinh chế protein. Tuy
nhiên, nó có nhược điểm là đòi hỏi protein đích, phải có 1 nhóm chức năng nào đó
mà không phải lúc nào cũng có được.
Ngày nay với kỹ thuật tái tổ hợp, người ta có thể them vào đoạn gen đích 1 đoạn
acid nucleic mã hoá cho đoạn peptid mang chức năng này để sau đó có thể tách
chiết protein đích, đoạn peptid sau đó có thể loại bỏ bằng 1 peptase
-

Một số ví dụ:
IMAC: nhựa sắc ký được gắn các ion kim loại (hoá trị II như Cu, Ni…). Ion
này có ái lực với đoạn peptid có nhiều histidin, đặc biệt 6 – 10 histidin.
Chất dung để thôi protein là imidazole nồng độ > 100 mM.
GST: Nhựa có ái lực với enzyme Glutathion-S-tranferase. Protein đích được
thu bằng glutathione dạng khử có nồng độ > 20 mM

9.2. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
•

Mô tả các hiện tượng xảy ra khi thực hiện phá huỷ tế bào:

•

Mẫu thử protein

Mẫu

A

B

C

D

D

D

D

Lượng protein
Thể tích
Lượng
Hiệu suất

HS = (Mẫu gộp)/Mẫu A (%)
•

Nhận xét về hiệu suất tinh chế - giải thích:

D

Mẫu
gộp D1Dn


23

9.3. VẼ SƠ ĐỒ QUÁ TRÌNH TINH CHẾ
a. Chuẩn bị cột
Rửa cột bằng nước cất vô trùng
Phân tán nhựa sắc ký cho thật đều bằng cách úp ngửa

Cho 2 ml Ni-Sepharose vào cột
Để yên khoảng 1h
Mở cột cho chạy hết dung dịch bảo quản cột
Rửa cột lần lượt với các đệm
3 thể tích nước cất vô trùng
3 thể tích Đệm ion 1 X
3 thể tích Đệm chảy 1X
b. Phá vỡ tế bào:
Ly tâm 15 ml môi trường nuôi cấy E.coli, bỏ phần nước
Phân tán tế bào trong 2 ml Đệm chạy H 1X
Trán siêu âm mẫu đến khi thu được dịch đồng nhất
Chuyển dịch vào eppendorf 1.5 ml

24

Ly tâm 9600rpm/10min, thu phần nổi, được dịch A
c. Tinh chế His-tag protein
Nạp 1 ml Dịch A. Mở cho cột chạy, hứng dịch chảy ra = Dịch B
Rửa cột với 5 thể tích Đệm chạy H 1X, thu được dịch B1
Rửa cột với 3 thể tích Đệm rửa H 1X, hứng dịch chảy ra = Dịch C
Thôi protein ghi nhãn D1-Dn, kiểm tra các phân đoạn thôi để đảm bảo
protein được thu hết.
Tái cân bằng cột bằng 5 thể tích Đệm chạy H.


25



Bài 10: TINH CHẾ LYSOZYM BẰNG SẮC KÝ TRAO ĐỔI
ION
5.1. Khái quát.
Khi nào dùng phương pháp sắc ký trao đổi ion để tinh chế protein ?
 Khi biết được điểm đẳng điện pI của protein.
 Dung dịch phải có lực ion thấp.
 Có pI khác nhau giữa protein tinh và protein tạp.

Nguyên tắc của Sắc ký trao đổi ion:
Nhựa sắc ký trao đổi ion gồm một chất nền rắn không tan được gắn các nhóm mang
điện tích bằng liên kết cộng hóa trị, các nhóm mang điện tích này sẽ liên kết với các đối
ion có điện tích trái dấu một cách thuận nghịch nhờ tương tác tĩnh điện (Hình 5.7).

Hình 5.7: Sự thay đổi điện tích của protein theo pH dung dịch
Sắc ký trao đổi ion dựa vào sự trao đổi thuận nghịch của các điện tích trên protein với
các điện tích trái dấu của pha tĩnh sắc ký, tùy theo cân bằng ion và pH trong dung dịch mà
protein sẽ được gắn vào nhựa hay bị đẩy ra khỏi nhựa.
Các loại nhựa trao đổi ion:
Theo loại điện tích được trao đổi nhựa được chia làm 2 loại cation và anion.
Theo độ mạnh của nhóm mang điện tích trên nhựa thì có 2 loại mạnh và yếu. Khái
niệm mạnh hay yếu là do mức độ biến động của sự ion hóa theo pH chứ không phải độ