nghiên cứu khai thác các gen mã hóa enzyme thủy phân hecmicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối coptotermes gestroi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
--------------------------

NGUYỄN THU PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU KHAI THÁC CÁC GEN MÃ
HÓA ENZYME THỦY PHÂN
HECMICELLULOSE TỪ HỆ VI SINH VẬT
CỘNG SINH TRONG RUỘT MỐI
COPTOTERMES GESTROI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
Người hướng dẫn khoa học
TS. ĐỖ THỊ HUYỀN

Hà Nội, 2013


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới GS.
Trương Nam Hải đã tạo điều kiện cho tôi được tham gia nghiên cứu tại phòng
Kỹ thuật di truyền, TS. Đỗ Thị Huyền đã tạo điều kiện để tôi được tham gia
nghiên cứu theo hướng nghiên cứu của đề tài và đã cho tôi những kiến thức,
kinh nghiệm trong quá trình làm đồ án và hoàn thiện đồ án. Tôi cũng xin chân
thành cảm ơn ThS. Lê Quỳnh Giang, ThS. Nguyễn Thanh Ngọc, ThS. Nguyễn
Thị Thảo, ThS. Dương Thu Hương đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi từng
bước trong suốt quá trình làm thực nghiệm. Đồng thời tôi xin bày tỏ biết ơn
tới toàn thể các cán bộ Phòng Kỹ thuật di truyền - Viện Công nghệ sinh học
đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi rất tận tình trong suốt thời gian thực hiện đồ án tại

đây.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Sinh – KTNN
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã giảng dạy và truyền đạt cho tôi những
nền tảng kiến thức vững chắc để có thể tiếp thu tốt hơn những kiến thức khoa
học mới.
Cuối cùng, bằng tình cảm chân thành tôi xin gửi tới gia đình và bạn bè
lòng biết ơn sâu sắc vì sự quan tâm, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá
trình học tập và hoàn thành đồ án này.
Hà Nội, ngày tháng

năm 2013

Nguyễn Thu Phương

Nguyễn Thu Phương

Lớp K35C – Sinh


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận
này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác. Tôi cũng xin cam
đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận này đã được cảm ơn
và các thông tin trích dẫn trong khóa luận đã được ghi rõ nguồn gốc.
Kí tên

Nguyễn Thu Phương

Nguyễn Thu Phương

Lớp K35C – Sinh


MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT..............................................................................................6
MỞ ĐẦU................................................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài............................................................................................................1
2. Mục tiêu nghiên cứu.......................................................................................................2
Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................................3
1.1. Sơ lược về các loài mối ..............................................................................................3
1.2. Sơ lược về loài mối Coptortermes gestroi...................................................................3
1.4. Tổng quan về Lignocellulose......................................................................................5
1.4.1. Cellulose...............................................................................................................6
1.4.2. Lignin...................................................................................................................7
1.4.3. Hecmicellulose.....................................................................................................8
1.5. Tổng quan về enzyme thủy phân Hecmicellulose.....................................................11
1.5.1. Xylanase.............................................................................................................13
1.5.2. β-Mannanase......................................................................................................14
1.5.3. α-L-Arabinofuranosidase...................................................................................14
1.5.4. α -D-Glucurnonidase..........................................................................................14
Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........................................15
2.1. Vật liệu......................................................................................................................15
2.1.1. Mẫu vật...................................................................................................................15
2.1.2. Hóa chất, enzyme, máy móc, thiết bị.................................................................15
2.1.2.1. Hóa chất ......................................................................................................15
2.1.2.2. Enzyme........................................................................................................15
2.1.2.3. Máy móc và thiết bị.....................................................................................15
2.1.3. Dung dịch và môi trường sử dụng......................................................................15
2.1.3.1. Dung dịch sử dụng trong tách chiết và tinh sạch DNA metagenome.........15
2.1.3.2. Dung dịch được sử dụng trong điện di DNA trên gel agarose....................16

2.2. Các phương pháp nghiên cứu....................................................................................16
2.2.1. Tách chiết AND metagenome của hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối ......16
2.2.2. Điện di DNA trên gel agarose...........................................................................19
2.2.3. Tinh sạch DNA metagenome bằng phương pháp troughing..............................20
Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...........................................................................22
3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA metagenome ..............................................................23
3.1. 1. Thu ruột mối từ mối thợ thuộc chi Coptotermes gestroi.......................................23
3.1.2.Tách chiết DNA metagenome của phức hệ vi sinh vật ruột mối.........................24
3.2 Giải trình tự mẫu DNA metagenome và xử lý các trình tự thu được.........................32
3.3 Đánh gia độ đa dạng của vi sinh vật trong ruột mối...................................................36
3.4. Khai thác các gen mã hóa enzyme hemicellulase....................................................37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..............................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................................43

Nguyễn Thu Phương

Lớp K35C – Sinh


Nguyễn Thu Phương

Lớp K35C – Sinh


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DNA

Acid deoxyribonucleic

Bp

Base pair (cặp nucleotit)

EDTA

Ethylene diamine tetra acid acetic

EtBt

Ethidium bromide

Kb

Kilobase

OD

Optical density ( mật độ tế báo quang học)

PBS

Phosphate buffered saline

RNAse

Ribonuclease

SDS

Sodium dodecyl sulfate

TAE

Tris-acetate-EDTA

TE

Tris-EDTA

CTAB

Cetryl Ammonium Bromide

PE

Buffer PE ( đệm)

VSV

Vi sinh vật

d H2O

Nước đầy ion

PEG 8OOO

Polyethylene Glycol 8000

Nguyễn Thu Phương

Lớp K35C – Sinh


MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Trong bối cảnh nền kinh tế thế giới đang bước vào toàn cầu hóa, mỗi
một biến động trên thế giới đều ảnh hưởng tới các quốc gia, trong đó có Việt
Nam. Trong vài năm trở lại đây thị trường xăng dầu luôn biến động, tăng giá
liên tục, đã ảnh hưởng không nhỏ tới nền kinh tế nước ta.Theo dự đoán của
các nhà khoa học, trữ lượng của các loại nhiên liệu hóa thạch trên thế giới
đang cạn kiệt dần trong vòng vài chục năm tới. Thế giới hiện đang bị lệ thuộc
rất nhiều vào dầu khí, vì vậy nhiều nước trên thế giới đang tìm cách phát triển
các nguồn nhiên liệu thay thế, trong đó phải kể đến nhiên liệu sinh học. Cũng
như nhiều quốc gia khác, việc sử dụng năng lượng gió, năng lượng mặt trời,
năng lượng từ các nguồn sinh khối đang là những giải pháp được áp dụng tại
Việt Nam. Và trong số những nhiên liệu thay thế đó, cồn sinh học (bio ethanol) nổi lên như một ứng cử viên sáng giá nhất, đáp ứng được các tiêu
chuẩn như dễ sản xuất, giá rẻ và “thân thiện” với môi trường.

Cồn sinh học

được sản xuất bằng phương pháp lên men các sản phẩm hữu cơ có chứa hàm
lượng carbonhydrate cao như các loại ngũ cốc chứa tinh bột có thể chuyển
hóa thành đường đơn (ngô, lúa mì, lúa mạch, gạo,... ) hay các loại cây cỏ chứa
lignocellulose ( rơm, rạ, bã mía, gỗ, trấu,...).
Là một nước nông nghiệp, Việt Nam đứng hai trên thế giới về xuất
khẩu gạo và chất thải nông nghiệp như rơm rạ, cỏ, lá,vv... là nguyên liệu tự
nhiên có sẵn trong các cánh đồng hoa màu. Ước tính hàng năm có khoảng 3040 triệu tấn rơm rạ, 3 triệu tấn trấu bị bỏ phí (Tran, 2008), (Nguyen et al.
2010). Gần đây, Thủ Tướng Chính Phủ ra một quyết định số 177/2007/QDTTg phê duyệt một kế hoạch cho phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015
và tầm nhìn đến năm 2025. Trong đó, các nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng

các nhiên liệu sinh học đã được nhấn mạnh. Tuy nhiên, giá thành sản xuất cồn

Nguyễn Thu Phương

1

Lớp K35C – Sinh


sinh học từ phế phụ phẩm nông nghiệp còn rất cao, nguyên nhân được cho là
chưa có nguồn enzyme chuyển hóa nhanh, hiệu quả lignocellulose thành
đường đơn dùng lên men cồn. Vì vậy, mục tiêu trước mắt là phải tìm được
nguồn enzyme có đặc điểm tốt để dùng cho chuyển hóa lignocellulose.
Mối là động vật chân khớp có ở khắp nơi và tiêu hóa lignocellulose
hiệu quả. Ngoài các enzyme phân giải hecmicellulose có từ bản thân mối, các
vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối cũng đóng vai trò đáng kể làm tăng hiệu
quả chuyển hóa lignocellulose. Do đó, ruột mối được xem là nguyên liệu tiềm
năng để khai thác các gen mã hóa enzyme phân giải lignocellulose cho các
định hướng nghiên cứu ứng dụng [9].
Metagenomic là phương pháp nghiên cứu về metagenom – vật liệu di
truyền tồn tại ở mẫu môi trường tự nhiên, bao gồm các genom của nhiều cá
thế sống trong môi trường đó [9]. Metagenomic đã được sử dụng rộng rãi và
thành công trên thế giới gần 40 năm qua [23]. Một số tác giả đã sử dụng kỹ
thuật metagenomic xây dựng thư viện DNA và tách chiết thành công một số
dòng hecmicellulose mới bằng phương pháp metagenomic từ các môi trường
khác nhau như mẫu đất [10], dạ cỏ trâu bò [6] hay phân thỏ [8]. Dựa vào lợi
thế trên của metagenomic, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu khai thác
các gen mã hóa enzyme thủy phân hecmicellulose từ hệ vi sinh vật cộng sinh
trong ruột mối Coptotermes gestroi”.
2. Mục tiêu nghiên cứu

Khai thác thành công gen mã hóa enzyme thủy phân hecmicellulose từ
hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối Coptotermes gestroi.

Nguyễn Thu Phương

2

Lớp K35C – Sinh


Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về các loài mối
Mối thuộc bộ Cánh đều (Isoptera), lớp Côn trùng (Insecta), là loài côn
trùng có đời sống xã hội, mối sống thành tập đoàn, mà khi hình thành có thể
từ hàng trăm cho đến hàng triệu thành viên [14]. Mối có khả năng tiêu hóa
được lignocellulose, trong đó có hecmicellulose làm nguồn năng lượng có ích.
Khả năng này có được là nhờ một phần vào các sinh vật cộng sinh trong ruột
mối, những sinh vật này tiết ra các enzyme cellulase, hecmicellulase thủy phân
hoàn toàn lignocellulose thành đường [12].
Có khoảng hơn 2600 loài mối trên thế giới, chúng thường phân bố ở
các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Theo kết quả nghiên cứu về các loài mối
ở Việt Nam do “Viện phòng trừ Mối và bảo vệ công trình” (2009) có tổng số
141 loài mối thuộc 4 họ, 8 phân họ và 38 giống mối được tìm thấy ở Việt
Nam, 120 loài trong số chúng đã được định danh đầy đủ tên khoa học, 21 loài
chưa được định danh.
1.2. Sơ lược về loài mối Coptortermes gestroi
Coptotermes gestroi (Isoptera: Rhinotermitidae ) là loài đặc hữu của khu
vực Đông Nam Á, phổ biến nhất ở những nơi ấm áp, lượng mưa cao, độ cao
thấp và các khu vực đông dân. Hiện tại khu vực phân bố của chúng đã lan
rộng đến nhiều nơi khác trên thế giới [15].

Giống như các loài mối mọt khác, trong loài Coptotermes gestroi chia
làm 3 cấp chính:mối chúa, mối lính và mối thợ. Mối thợ có trách nhiệm nuôi
dưỡng tổ và chăm sóc các mối khác. Mối lính có trách nhiệm bảo vệ an ninh
cho tổ. Bề ngoài, mối lính của Coptotermes gestroi có một thóp trên trán, có
một cặp lông gần mép của thóp. Mối lính lớn hơn mối thợ, màu trắng đục,
đầu hình trứng, các phân đoạn trước bụng có màu nâu đậm. Cơ thể của mối

Nguyễn Thu Phương

3

Lớp K35C – Sinh


thợ nhỏ hơn, mập hơn và màu trắng đục. Mối chúa có chức năng chính là sinh
sản liên tục do vậy cơ thể lớn hơn rất nhiều so với các mối khác.
Coptotermes gestroi là một loài mối nguy hiểm, gây hại. Chúng tiêu thụ
tất cả các vật liệu có chứa liglocellulose, từ gỗ, giấy và đôi khi là vải. Chúng
khoan lỗ trong các vật liệu như cao su, nhựa và xốp để tìm kiếm thức ăn.
Chúng cũng tấn công cây sống bằng cách tiêu thụ tâm gỗ và làm suy yếu, đổ
cây. Chúng sống dưới lòng đất và xây dựng tổ của mình thông qua các khe,
vết nứt của đất. Chúng ăn gỗ từ bên trong ra bên ngoài, để lại một lớp màng
mỏng trên bề mặt sàn những mảng phồng rộp [25].
Theo một số nghiên cứu, chiết xuất protein thô từ C. gestroi thu được
hiệu quả một lượng enzym trên một khoảng pH rộng ở một loạt các
polysaccharides tự nhiên chứa nhiều liên kết glycosidic. Phương pháp phân
tích protein này đã xác định thành công 55 loại protein khác nhau và đã được
phân loại thành 29 họ CAZy. Dựa trên tổng số peptide xác định, phần lớn các
thành phần được tìm thấy trong C. gestroi digestome là enzyme cellulose ,
enzyme Xylanolytic, men Mannan-thủy phân, pectinaza và enzyme phân hủy

tinh bột. Phân tích proteomic toàn diện, tiết lộ một bộ sưu tập đầy đủ các
enzym thủy phân bao gồm cellulase (GH1, GH3, GH5, GH7, GH9 và CBM
6), hemicellulases (GH2, GH10, GH11, GH16, GH43 và CBM 27) và
pectinaza (GH28 và GH29 ). Dựa trên kết quả này, các nhà nghiên cứu kết
luận rằng cộng đồng vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối Coptotermes gestroi
có vai trò quan trọng trong tiêu hóa thức ăn liglocellulose [25].

Nguyễn Thu Phương

4

Lớp K35C – Sinh


Hình 1.1 : Loài mối Coptotermes gestroi
1.3. Phương pháp Metagenomic
Metagenomic là phương pháp nghiên cứu về metagenom - vật liệu di
truyền tồn tại ở mẫu môi trường tự nhiên, bao gồm các genom của nhiều cá
thế sống trong môi trường đó [9]. Đây là lĩnh vực tương đối mới của nghiên
cứu di truyền cho phép nghiên cứu về vi sinh vật không qua nuôi cấy trong
phòng thí nghiệm cũng như nghiên cứu các đặc tính sinh lí và di truyền của
các vi sinh vật trong môi trường tự nhiên.
1.4. Tổng quan về Lignocellulose
Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và các
thực vật khác như cỏ, lúa, ngô…Trong tự nhiên, chúng ta có thể tìm thấy
lignocellulose ở thực vật hay các chất thải nông nghiệp, lâm nghiệp và các
chất thải rắn trong thành phố. Thành phần chủ yếu của lignocellulose là
cellulose (38-50%), hecmicellulose (23-32%) và lignin (15-25%) [2] [23].

Nguyễn Thu Phương

5

Lớp K35C – Sinh


Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc của thành tế bào thực vật
1.4.1. Cellulose
Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C 6H10O5)n, và là
thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật. Cellulose là glucan không phân
nhánh, cấu tạo bởi các đơn phân β-D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết
β-1,4-glycoside, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose và các phân tử
carbohydrate phức tạp khác [1]. (Hình 1.3).

Hình 1.3: Công thức hóa học của cellulose
Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết
van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình.
Cellulose có cấu tạo tương tự carbohydrate phức tạp như tinh bột và
glycogen. Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thủy phân. Người và động

Nguyễn Thu Phương

6

Lớp K35C – Sinh


vật không có enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa được
cellulose, vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, một số
nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trò điều hòa hoạt động của hệ

thống tiêu hóa. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và
động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose.
Nấm đất cũng có thể phân hủy cellulose. Vì vậy chúng có thể sử dụng
cellulose làm thức ăn.
1.4.2. Lignin
Lignin là một phức hợp chất hóa học phổ biến được tìm thấy trong hệ
mạch thực vật, chủ yếu là giữa các tế bào, trong thành tế bào thực vật. Lignin
là một đại phân tử, có khối lượng phân tử lớn hơn 10.000 đvC, cấu trúc không
gian 3 chiều, phức tạp, vô định hình, có cấu trúc nhiều vòng thơm, có đặc tính
không ưa nước do đó rất khó phân hủy. Vì vậy, các enzyme phân giải lignin
có vai trò quan trọng trong chu trình vận chuyện cacbon trên trái đất [3].
Trong các enzyme oxidase phân hủy lignin, enzyme có hoạt tính rất mạnh là
ligninase và manganese peroxidase [3], [10].
Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở, được cấu thành từ các đơn vị
phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình là: guaiacyl (G), trans-coniferyl
alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-pcourmary alcohol (Hình 1.4).

Hình 1.4: Các đơn vị cơ bản của lignin

Nguyễn Thu Phương

7

Lớp K35C – Sinh


Lignin tạo liên kết hóa học với hemicellulose và ngay cả với cellulose
(nhưng không nhiều). Độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào
bản chất liên kết, cấu trúc hóa học của lignin và các gốc đường tham gia liên
kết. Cấu trúc hóa học của lignin rất dễ bị thay đổi trong điều kiện nhiệt độ cao

và pH thấp như điều kiện trong quá trình tiền xử lý bằng hơi nước. Ở nhiệt độ
phản ứng cao hơn 200oC, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và
tách ra khỏi cellulose [2].
Trong dinh dưỡng động vật, lignin rất đáng quan tâm vì nó không bị
tiêu hóa bởi enzyme của cơ thể vật chủ. Lignin còn liên kết với nhiều
polysaccharide và protein màng tế bào ngăn trở quá trình tiêu hóa các hợp
chất gỗ [25].
1.4.3. Hecmicellulose
Hemicellulose chiếm khoảng 20-32% tổng sinh khối lignocellulose
thực vật. Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng
hợp khoảng 70 đến 200 đơn phân. Hemicellulose chứa cả đường 6 carbon
gồm glucose, mannose và galactose và đường 5 gồm xylose và arabinose.
Thành phần cơ bản của hemicellulose là β – D xylopyranose, liên kết với
nhau bằng liên kết β -(14).

Hình 1.5: Một số thành phần cấu tạo nên hemicellulose

Nguyễn Thu Phương

8

Lớp K35C – Sinh


Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào nguyên
liệu, tuy nhiên có một vài điểm chung gồm:
- Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β -(14).
- Xylose là thành phần quan trọng nhất.
- Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3.
- Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là

disaccharide hoặc trisaccharide. Sự liên kết của hemicellulose với
các polysaccharide khác và với lignin là nhờ các mạch nhánh này.
Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vô định
hình và vì thế dễ bị thủy phân.
Hemicellulose là polysaccharide trong màng tế bào tan trong dung dịch
kiềm và có liên kết chặt chẽ với cellulose, là một trong ba sinh khối tự nhiên
chính. Cùng với cellulose và lignin, hemicellulose tạo nên thành tế bào vững
chắc ở thực vật. Về cấu trúc, hemicellulose có thành phần chính là D-glucose,
D-galactose, D-mannose, D-xylose và L-arabinose liên kết với các thành phần
khác và nằm trong liên kết glycoside [1].. Hemicellulose còn chứa cả axit 4O-methylglucuronic, axit D-galacturonic và axit glucuronic. Trong đó, đường
D-xylose, L-arabinose, D-glucose và D-galactose là phổ biến ở thực vật thân
cỏ và ngũ cốc. Tuy nhiên, khác với hemicellulose thân gỗ, hemicellulose ở
thực vật thân cỏ lại có lượng lớn các dạng liên kết và phân nhánh phụ thuộc
vào các loài và từng loại mô trong cùng một loài cũng như phụ thuộc vào độ
tuổi của mô đó.
Tùy theo trong thành phần của hemicellulose có chứa monosaccharide
nào mà nó sẽ có những tên tương ứng như manan, galactan, glucan và xylan.
Các polysaccharide như manan, galactan, glucan hay xylan đều là các chất
phổ biến trong thực vật, chủ yếu ở các thành phần của màng tế bào của các cơ
quan khác nhau như gỗ, rơm rạ,…

Nguyễn Thu Phương

9

Lớp K35C – Sinh


Trong các loại hemicellulose, xylan là một polymer chính của thành tế
bào thực vật trong đó các gốc D-xylopyranose kết hợp với nhau qua liên kết

β-1,4-D-xylopyranose, là nguồn năng lượng dồi dào thứ hai trên trái đất. Đa
số phân tử xylan chứa nhiều nhóm ở trục chính và chuỗi bên. Các gốc thay
thế chủ yếu trên khung chính của xylan là các gốc acetyl, arabinosyl và
glucuronosyl. Các nhóm này có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị và
không hóa trị với lignin, cellulose và các polymer khác
Cấu tạo, số lượng và vị trí của xylan ở các loài thực vật khác nhau là
khác nhau. Xylan tồn tại ở dạng O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan ở cây
gỗ cứng (Hình 1.6), hay arabino-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ mềm
(Hình 1.7) , hay thành phần cấu tạo xylan là axit D-glucuronic, có hoặc không
có ete 4-O-methyl và arabinose ở các loài ngũ cốc [5].

Hình 1.6: O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ cứng

Nguyễn Thu Phương

10

Lớp K35C – Sinh


Hình 1.7: Arabino-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ mềm
1.5. Tổng quan về enzyme thủy phân Hecmicellulose
Hecmicellulase là enzyme thủy phân, xúc tác phân giải hecmicellulose,
được cấu tạo từ các đường khác nhau, các gốc này được nối với nhau bằng
liên kết β-1,3; β-1,4; β-1,6 glycoside. Hecmicellulase thường tồn tại ở dạng
mạch ngắn, phân nhánh. Khi thủy phân Hecmicellulase sẽ thu được các
monosacchride như manose, galactose, xylose hay arabinose. Hecmicellulase
thường được phân chia thành các nhóm cơ bản sau [21]: Xylanase, βMannanase, α-L-Arabinofuranosidase, α -D-Glucurnonidase.

Nguyễn Thu Phương

11

Lớp K35C – Sinh


Hình 1.8: Các nhóm enzyme thuộc hecmicellulase

Nguyễn Thu Phương

12

Lớp K35C – Sinh


1.5.1. Xylanase
Enzyme Xylanase thủy phân liên kết β-1,4 giữa các phân tử xylan với
nhau, giải phóng các phân tử ngắn xylooligomer.

Hình 1.9: Cấu tạo các phân tư xylan và các vị trí bị các enzyme
hecmicellulase cắt hoặc thủy phân

Nguyễn Thu Phương

13

Lớp K35C – Sinh


1.5.2. β-Mannanase

β-Mannanase tham gia thủy phân galacto-glucomannan và giải phóng
các tiểu phần β-1,4-manno-oligomers, sau đó các tiểu phần này có thể bị thủy
phân thành các đơn phân mannose bởi enzyme β-man-nosidase [17], [18].

α - Galactosidase

Endo-mannanase
Hình 1.10: Sơ đồ cấu trúc của phân tử galacto-glucomannan và các vị trí bị
thủy phân bởi enzyme mannanase
1.5.3. α-L-Arabinofuranosidase
Enzyme α-L-Arabinofuranosidase tham gia thủy phân nhánh bên của
phân tử xylan và giải phóng các phân tử α-1,5-L-Arabinan [20]. Sau đó α-LArabinanase tiếp tục thủy phân α-1,5-L-Arabinan thành các phân tử nhỏ hơn
[7] (hình 1.8).
1.5.4. α -D-Glucurnonidase
α-D-Glucuronidase phân giải liên kết α-1,2- glycosidic của phân tử 4O-metyl-D-glucuronic ở nhánh bên của phân tử xylan (hình 1.8). Tính đặc
hiệu của α-glucuronidase là khác nhau phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme
[4], [16].

Nguyễn Thu Phương

14

Lớp K35C – Sinh


Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Mẫu vật
Mối thuộc loài Coptortermes Gestroi do Viện phòng trừ mối và bảo vệ
công trình cung cấp.

2.1.2. Hóa chất, enzyme, máy móc, thiết bị
2.1.2.1. Hóa chất
Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều được đặt mua từ các công ty
đạt tiêu chuẩn quốc tế như Bio-rad (Mỹ), Fermentas (Mỹ), Sigma (Mỹ),
Merck (Đức) gồm có: SDS, Tris-HCL, EDTA, d-NTPs, TAE, glycogen,
phenol, methanol, isoamylalcohol, ethidum bromine, ethanol, dH 2O, acetic
acid, chloroform, agarose, glass beads, PEG 8000 (polyethylen glycol 8000).
2.1.2.2. Enzyme
Lysozyme, RNAse, protease K
2.1.2.3. Máy móc và thiết bị
Máy ly tâm lạnh bé (Sorvall RC5B, Mỹ), máy ly tâm lạnh lớn (Sorvall
RC5B, Mỹ), máy PCR (MJ Reseacher Mỹ), máy điện di (Bio-Rad, Mỹ), máy
UV (Bio-Rad, Mỹ), máy hút chân không speed vac (Savant, Mỹ), cân phân
tích (Precisa, Thụy Sĩ), cân điện tử (Precisa, Thụy Sĩ), tủ cấy vô trùng (EscoSingapore), tủ hút khí độc.
2.1.3. Dung dịch và môi trường sử dụng
2.1.3.1. Dung dịch sử dụng trong tách chiết và tinh sạch DNA metagenome
- Dung dịch PBS: 1,72 g Na 2HPO4.12H2O, 0,254 g KH2PO4, 8,5 g NaCl
(pha trong 100 ml).
- Dung dịch phenol/chloroform/isomylalcohol với tỷ lệ 25:24:1.
- Dung dịch chloroform/isomylalcohol với tỷ lệ 24:1.

Nguyễn Thu Phương

15

Lớp K35C – Sinh


- Dung dịch TE 0,01M, pH 8,0; 0,1 mM Tris-HCl, pH 8,0; 0,01 mM
EDTA, pH 8,0.

2.1.3.2. Dung dịch được sử dụng trong điện di DNA trên gel agarose
- Dung dịch đệm TAE 1x pha từ dung dịch TAE 50x (100 ml): 24,2 g
Tris-base; 5,71 ml glacial acetic acid; 10ml EDTA 0,5 M, pH 8,0
- Điện tra mẫu (loading dye 6x): 0,25% bromophenol blue; 0,25%
xylen cyanol FF; 30% glycerol.
- Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide (EtBr) 0,5 ɱg/ɱl.
2.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết AND metagenome của hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột
mối
Cơ sở lý thuyết
•

Phá vỡ tế bào:
Dùng phương pháp ly tâm để phá vỡ màng tế bào và phóng thích DNA

trong nhân. Ngoài ra, màng tế bào và màng nhân còn được phá vở bằng hỗn
hợp chất tẩy (SDS – sodium dodecyl sulfate, sarcosyl) và proteinase. Các
DNA sẽ được giải phóng ra môi trường. Các protein liên kết với DNA cũng tự
bị phân hủy.
• Cố định mô:
Dung dịch PbS (137mM Nacl, 2.7mM Kcl, 10mM Na2HPO4, 2Mm
KH2PO4)
•

Hòa tan DNA:
Axít nucleic có thể đựơc hoà tan trong nước cất khử trùng hoặc dung

dịch TE. Axít nucleic sẽ được bảo quản tốt hơn, nếu nó được hoà tan trong
dung dịch TE, vì dung dịch này chứa Tris và EDTA.
•

Loại bỏ các thành phần không phải là DNA:
- Proteinase K: loại bỏ thành phần protein.

Nguyễn Thu Phương

16

Lớp K35C – Sinh


- Phenol có tác dụng kết tủa protein, còn chloroform và isoamyalcohol
có tác dụng phá hủy lipid và các chất béo. Do vậy, phenol được dùng trước để
kết tủa protein, sau khi ly tâm, loại thải phần đã kết tủa, thu nhận phần trong
bên trên có chứa ADN, và tiếp tục dùng chloroform để phá hủy lipit và các
hợp chất béo còn lại.
•

Tủa ADN:
- Sử dụng ethanol 100% ủ ở – 20 0C để tủa DNA trong dung dịch. Mục

đích là thu nhận nucleic acid dưới dạng cô đặc và bảo vệ chúng khỏi sự phân
hủy của các enzyme.
•

Rửa DNA:
- DNA được rửa lại bằng ethanol 70% để loại bỏ các muối.

•

Làm khô:
- DNA sau khi rửa được làm khô bằng cách sấy khô. Mục đích tránh

mẫu DNA còn chứa ethanol sẽ ảnh hưởng đến DNA tổng số.
•

Trữ DNA:
– Trữ ADN ở - 200C giúp ADN không bị biến tính.
Quy trình
- Lấy 300 ruột mối thợ bằng cách dùng kẹp giữ thân mối và đuôi mối,

kéo ruột mối ra nhẹ nhàng và đưa vào eppendorf (E1) chứa 500 ul PBS đã
khử trùng.
- Bổ sung 0,34g glass beads vào E1, spin nhẹ (khoảng 3000 rpm) và hút
dịch ra 1 ống eppendorf (E2) để nghiền mẫu bằng chày 15 – 20 phút.
- Lấy lại dịch ở E2 +500 ul PBS cho vào E1. Vontex và spin down E1
nhẹ (600 – 700 rpm), hút dịch trên cho vào E3. Chú ý không hút kiệt.
- Spin E1 (khoảng 3000 rpm), hút dịch ra E2 để nghiền tiếp mẫu
khoảng 2 phút.

Nguyễn Thu Phương

17

Lớp K35C – Sinh


- Lấy lại dịch ở E2 +500 ul PBS cho vào E1. Vontex và spin E1 nhẹ
(600 – 700 rpm), hút dịch trên ra E3. Chú ý không hút kiệt.
- Spin E1 (khoảng 3000 rpm), hút dịch ra E2 để nghiền tiếp mẫu

khoảng 2 phút.
- Lấy lại dịch ở E2 +500 ul PBS cho vào E1. Vontex và spin E1 nhẹ
(600 – 700 rpm), hút dịch trên ra E3. Chú ý không hút kiệt.
- Ly tâm E3 600 rpm/10 phút ở nhiệt độ phòng. Thu dịch nổi sang
eppendorf mới E4 còn kết tủa cho vào EP E1.
- Ly tâm E4 700 rpm/10 phút ở nhiệt độ phòng. Thu dịch nổi còn kết
tủa cho vào EP E1.
- Nghiền tiếp EP E1, bổ sung 500 ul PBS, ly tâm 600 rpm/10 phút ở
nhiệt độ phòng để thu dịch nổi. Dịch nổi này cho vào dịch nổi vừa thu được ở
trên.
- Ly tâm hỗn hợp dịch nổi trên để thu tế bào VSV 5000 rpm/5 phút.
Loại bỏ dịch nổi bằng cách hút thật nhẹ nhàng, tránh VSV tan ra và đi vào
đầu tip hút mẫu.
- Rửa lại TB nhiều lần bằng PBS cho thật sạch, ly tâm thu tế bào với
tốc độ 2 lần đầu: 2000 rpm/5 phút; lần 3:3000 rpm/3 phút; lần 4: 4000 rpm/3
phút; lần 5: dồn TB các ống lại, ly tâm 4000 rpm/3 phút.
- Hòa TB vào 352,5 ul TE, bổ sung 2,5 ul lysozyme (100 mg/ml), 2 ul
RNase A (1%), ủ 37oC trong 10 phút.
- Bổ sung 3 ul protease K (20 mg/ml), 30 ul SDS 10%, ủ 37 oC trong 30
phút.
- Bổ sung 140 ul TE, 180 ul NaCl 5M, đảo đều, lắc nhẹ và ủ tiếp ở 65oC
trong 10 phút.
- Bổ sung tiếp 500µl phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1). Sau
đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Lúc này mẫu hình thành 3 lớp: lớp

Nguyễn Thu Phương

18

Lớp K35C – Sinh

trên cùng có DNA metagenome, lớp giữa là protein không có khả năng hoà
tan và lớp dưới cùng là phenol/chlorofom có chứa protein tạp.
- Bổ sung tiếp 500µl cholorofom/isoamylalcohol (24:1), ly tâm với tốc
độ 13000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. Lặp lại 2 lần.
- Bổ sung 2 lần thể tích ethanol 100% để tủa plasmid DNA. Ly tâm thu
tủa ở 13000 vòng/phút trong 20 phút.
- Bổ sung 500µl ethanol 70%, ly tâm với tốc độ 1300 vòng/phút trong
10 phút, thu tủa.
- Tủa được làm khô và hoà tan vào 30µl H2O cất khử trùng.
- Điện di kiểm tra DNA trên gel agarose 0,8%.
2.2.2. Điện di DNA trên gel agarose
Cơ sở lý thuyết :
Trong môi trường có pH trung tính, DNA mang điện tích âm. Do đó,
khi được đặt trong một điện trường đều, DNA sẽ di chuyển từ cực âm sang
cực dương. Trong môi trường chứa agarose, các đoạn DNA có kích thước
khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau (đoạn DNA có kích thước lớn
hơn sẽ di chuyển chậm hơn) và sẽ tách biệt trong quá trình chạy.
Quy trình:
 Chuẩn bị gel agarose :
+ Cân bột agarose hoà tan vào đệm TAE 1X sao cho được nồng độ
0,8%.
+ Đun sôi dịch agarose cho đến khi tan hết và để dịch nguội đến
khoảng 50ºC thì đổ vào khuôn có cài sẵn răng lược.
+ Gel sẽ đông và ổn định hoàn toàn trong 30 phút.
+ Rút lược nhẹ nhàng ra khỏi khuôn, đặt gel vào bể điện di, đồ đệm TAE 1X
tới khi ngập mặt gel.

Nguyễn Thu Phương

19

Lớp K35C – Sinh