Nghiên cứu sự biểu hiện gen mã hóa keratinase trong tế bào escherichiacoli và bacillus subtilis

Luận văn Thạc sĩ khoa học
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HOÀNG THỊ THU HIỀN
NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
KERATINASE TRONG TẾ BÀO
ESCHERICHIA COLI VÀ BACILLUS
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội – Năm 2014
1
Luận văn Thạc sĩ khoa học
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HOÀNG THỊ THU HIỀN
NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN GEN MÃ
HÓA KERATINASE TRONG TẾ BÀO
ESCHERICHIA COLI VÀ BACILLUS
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60420122
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn chính: TS. Nguyễn Huy Hoàng
Người hướng dẫn phụ: PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân
Hà Nội – Năm 2014
2
Luận văn Thạc sĩ khoa học
MỤC LỤC
3
Luận văn Thạc sĩ khoa học
LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tri ân và sâu sắc tới TS. Nguyễn Huy Hoàng – Phó
viện trưởng, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện KH&CN Việt Nam, là người
thầy_người anh đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ
và chia sẻ những khó khăn cùng em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành
luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn tới PGS. TS Nguyễn Thị Hồng Vân – cô giáo đã
tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn.
Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, em đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo
tận tình của các cán bộ Phòng Hệ gen học chức năng, viện Nghiên cứu hệ gen. Đặc
biệt là Th.S. Nguyễn Thu Hiền đã giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và tiến
hành thí nghiệm.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo nghiên cứu giảng dạy tại
Khoa Sinh, Khoa đào tạo sau đại học – Trường Đại học KHTN đã truyền đạt cho
em những kiến thức bổ ích trong suốt 2 năm qua.
Cuối cùng, em xin gửi tới bố, mẹ và những người thân trong gia đình lòng biết
ơn sâu sắc, cảm ơn những người bạn đã chia sẻ khó khăn thử thách trong cuộc sống
và công việc để em có được kết quả này.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 08 năm 2014
4
Luận văn Thạc sĩ khoa học
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
B.subtilis Bacillus subtilis
bp Base pair (c
DNA Deoxyribonucleic axcid
E.coli Escherichia coli
EtBr Dung d Ethidium Bromide
IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Ker Keratinase
LB Luria-Bertani

µl Microlit
PCR Polymerase Chain Reaction (Phvà B.sem nhis 168M chia
Primer-F MPolymer
Primer-R MMPolymer
rARN Ribosomal ribonucleic acid
VK Vi khul
5
Luận văn Thạc sĩ khoa học
DANH MỤC CÁC BẢNG
Số hiệu Tên bảng Trang
Bảng 1 Trình tư các cặp mồi 21
Bảng 2 Thành phần một phản ứng PCR 23
Bảng 3
Thành phần gel cô 5% và gel tách 10% polyacrymide
25
Bảng 4 Thành phần phản ứng cắt với enzyme XhoI và BamHI 26
Bảng 5 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR
1a
29
Bảng 6. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR
2
30
Bảng 7 Hoạt tính của keratinase từ các chủng nghiên cứu 48
6
Luận văn Thạc sĩ khoa học
DANH MỤC CÁC HÌNH
Số hiệu Tên hình Trang
Hình 1
Một số sản phẩm chứa keratin
3

Hình 2 Cấu trúc xoắn α và gấp nếp β của keratin 4
Hình 3 Cấu tạo phân tử của keratinase
6
Hình 4 Vi khuẩn E.coli 9
Hình 5 Vi khuẩn B. subtilis 10
Hình 6 Vector biểu hiện 19
Hình 7 Sơ đồ nghiên cứu biểu hiện gen Ker trong E.coli và
B.subtilis
22
Hình 8 Sơ đồ tái tổ hợp gen Ker và promoter của gen α-amylase
của chủng B. subtilis 168M bằng phương pháp
Megarprimer
28
Hình 9 Ảnh điện di DNA tổng số 33
Hình 10 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen Keratinase 34
Hình 11 Điện di sản phẩm cắt bằng 2 enzyme giới hạn XhoI và
BamHI
36
Hình 12 Trình tự được đọc bằng mồi vector (T7 promoter và T7
terminator)
37
Hình 13 Cắt kiểm tra sản phẩm tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới
hạn
39
Hình 14 Điện di protein trên gel polyacrylamide –SDS ở nồng độ
12,5%
40
Hình 15 Điện di đồ sản phẩm PCR 42
Hình 16 Điện di đồ sản phẩm cắt kiểm tra vector tách dòng bằng
enzyme giới hạn

43
7
Luận văn Thạc sĩ khoa học
Hình 17 Plasmid pHT43 mang tổ hợp [Bspr.Ker] được cắt kiểm
tra bằng SmaI và KpnI
45
Hinh 18 Kết quả kiểm tra hoạt tính các tế bào B. subtilis 168M tái
tổ hợp mang vector tái tổ hợp pHT43[Bspr.Ker]
46
Hình 19 Điện di dịch enzyme thô trên gel SDS-PGE 47
8
Luận văn Thạc sĩ khoa học
MỞ ĐẦU
Ngày nay, ngành công nghệ sinh học chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh
tế nước ta. Trong đó, công nghệ DNA tái tổ hợp đang được chú trọng đầu tư và là
công nghệ then chốt của lĩnh vực công nghệ sinh học. Công nghệ DNA tái tổ hợp ra
đời dựa trên cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử. Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA
cho phép phân lập và khuếch đại một gen từ genome của một sinh vật để có thể
nghiên cứu, biến đổi và chuyển nó vào trong một cơ thể sinh vật khác. Việc nâng
cao hoạt tính và khả năng tổng hợp enzyme bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA hiện đang
được ứng dụng rộng rãi. Trong đó có tạo dòng và sản xuất keratinase.
Keratinase là enzyme có khả năng thủy phân các protein cứng, các cấu trúc
phức tạp trong lông, tóc, móng, sừng Nhiều nghiên cứu ghi nhận rằng keratinase là
thành viên của nhóm protease serine.
Hiện nay, keratinase được thu từ nhiều nguồn khác nhau như nấm, xạ khuẩn,
vi khuẩn. Trong nhóm vi khuẩn có khả năng sinh keratinase, hoạt tính keratinase
cao đã được ghi nhận rộng rãi đối với các chủng từ Bacillus và Streptomyces. Nhiều
nghiên cứu ghi nhận rằng keratinase được phân lập từ chủng B. licheniformis và B.
subtilis là thành viên của nhóm protease serine [5]. Đây là nhóm enzyme thương
mại, có nhiều ứng dụng quan trọng trong các ngành công nghiệp, trong các quá

trình công nghệ sinh học liên quan đến chất thải có chứa keratin, các từ ngành công
nghiệp gia cầm và công nghệ da
Với sự bùng nổ của ngành công nghiệp gia cầm, hàng năm tồn đọng hàng tấn
lông gà trong tự nhiên, điều này gây nên tình trạng ô nhiễm môi trường. Trong khi
đó, lông gà chiếm khoảng 90% là keratin [9], việc thủy phân keratin đem lại được
những ứng dụng to lớn, có thể làm phân bón, keo, tạo ra các axit amin hiếm như
serine, cystein và proline, đặc biệt là tạo ra thức ăn chăn nuôi [50]. Tuy nhiên, nếu
xử lý lông vũ bằng các loại hóa chất như những phương pháp trước đây sẽ làm mất
hàm lượng axit amin của thức ăn và rất tốn kém. Trong khi đó, nếu sử dụng
9
Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20
Luận văn Thạc sĩ khoa học
keratinase trong quá trình thủy phân lông vũ để sản xuất thức ăn chăn nuôi sẽ không
làm mất hàm lượng dinh dưỡng của nó mà giá thành rẻ [38] và làm giảm ô nhiễm
môi trường.
Hiện nay, keratinase được thu từ nhiều nguồn khác nhau như nấm, xạ khuẩn,
vi khuẩn. Trong đó, nhóm vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao, hoạt tính
keratinase đã được ghi nhận rộng rãi đối với các chủng từ chi Bacillus và
StreptomycesNhận thấy tầm quan trọng của keratinase trong các ngành công nghiệp
nên keratinase đã được biết đế. Tuy nhiên, khả năng sinh tổng hợp keratinase từ các
chủng hoang dại còn hạn chế, hoạt tính của enzyme thấp và thường lẫn tạp chất. Do
đó Nhưng để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của keratinase trong ứng dụng công
nghiệp thì trọng tâm là nâng cao trình độ sản xuất keratinase tái tổ hợp thông qua
tách dòng. Mặt khác gen và biểu hiện gen. Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu
tách dòng và hiện gen keratinase từ vi khuẩn Gram dương, xạ khuẩn hay nấm men
trong hệ biểu hiện E.coli, B.subtilis hoặc P.pastoris để khám phá một hệ thống
biểu hiện tốt hơn để sản xuất keratinase , gen từ vi khuẩn Bacillus licheniformis
được thể hiện trong Escherichia coli , Bacillus subtilis , và Pichia pastoriỞ Việt
Nam hiện nay việc nghiên cứu keratinase còn hạn chế, chưa có cơ sở nào sản xuất
keraitnase ở quy mô công nghiệp. Vì vậy Do đó với mục đích tìm ra được chủng vi

khuẩn tái tổ hợp có khả năng sinh karatinase cao để có thể đưa vào sản xuất với qui
mô lớn, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự biểu hiện gen mã
hóa keratinase trong tế bào Escherichia coli và Bacillus”.
• Mục tiêu đề tài
Nghiên cứu Tạo tạo chủng tái vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng sinh
keratinase cao, nhanh và sạch nhằm ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp
• Nội dung nghiên cứu
10
Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20
Luận văn Thạc sĩ khoa học
- Chọn dòng gen biểu hiện keratinase từ chủng vi khuẩn hoang dại
- Thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện trong E.coli và B.subtilis.
- Biểu hiện gen mã hóa keratinase trong E.coli và B.subtilis.
- Đánh giá mức độ biểu hiện của chủng tái tổ hợp so với chủng hoang dại.Thử hoạt
tính của keratinase tái tổ hợp
11
Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20
Luận văn Thạc sĩ khoa học
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Keratin
Keratin là một hợp chất sừng, thành phần chính trong da, tóc, lông, móng
tay, móng guốc, sừng, răng và len (Hình 1). Đây là protein có cấu trúc bền vững,
khó hòa tan, chứa một lượng lớn sulfua, các axit amin, đặc biệt là cystein (chiếm
24%), ngoài ra có các axit amin khác như: glycin, alanin, serin và valin. Ngoài các
liên kết hydro nội phân tử và liên phân tử, keratin còn có hàm lượng lớn lưu huỳnh
trong cystein. Chính các cystein có thể tạo thành cầu disulfide. Những cầu nối này
được tạo từ các nguyên tử lưu huỳnh liên kết với nhau, do đó nó không dễ dàng hòa
tan, không dễ dàng bị phân hủy bởi các enzyme thông thường như: trypsin, pepsin,
và papain… Tùy thuộc số lượng liên kết cysteine disulfide chứa trong keratin, có
thể chia thành 2 loại: keratin cứng được tìm thấy trong móng guốc và keratin mềm

tìm thấy trong mô linh hoạt như tóc và da (Hình 1).
Hình 1. Một số sản phẩm chứa keratin
Keratin chiếm khoảng 30% phần biểu bì của các tế bào sống và 85% protein
của các tế bào chết (lớp vảy hoặc sừng đã chết ở bên ngoài da). Trong tóc, keratin
chiếm 65-95% và ở lông vũ chiếm gần 90% theo trọng lượng. Mỗi phân tử keratin
là rất nhỏ khoảng 10 nm, chúng liên kết với nhau qua cầu disulfide, hydrogen với
các muối cũng như các liên kết khác. Từ các sợi keratin có chứa hàm lượng lưu
huỳnh lớn đã được ép thành các bó keratin lớn hơn.
12
Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20
Luận văn Thạc sĩ khoa học
Keratin có 2 dạng cấu trúc xoắn α và gấp nếp β [50], α-keratin chủ yếu được
tìm thấy trong động vật có vú còn β-keratin tạo thành các chuỗi polypeptide dạng
mảnh có chủ yếu trong da các loài bò sát và các loài chim. Cấu trúc của α và β-
keratin trong tóc và lông có thể thấy khi chiếu xạ tia bằng tia X.
Anpha- keratin (α-keratin): có Trong trong tóc (kể cả lông cừu), sừng, móng tay,
móng chân, và móng guốc của động vật có vú. Cấu tạo là các sợi đơn protein liên
kết với nhau bằng liên kết hydro.
.BBeta keratin (β-keratin): Có Trong trong móng tay và móng vuốt của loài bò sát,
họ vỏ chelonians (ba ba, rùa, …), và trong lông, mỏ, móng vuốt của chim và nhím,
được hình thành chủ yếu trong các tấm β. Cấu trúc β cứng, chắc hơn cấu trúc α do
các tấm β được nối với nhau bằng các cầu nối disulfide (Hình 2).
Hình 2. Cấu trúc xoắn α và gấp nếp β của keratin.
Dựa vào số lượng sulfur, keratin có thể được chia thành 2 dạng keratin
“mềm” và keratin “cứng” .[45]. Keratin mềm có thể tìm thấy trong da, có ít cầu nối
disulfur và mềm dẻo hơn và có thể dễ dàng phá vỡ còn keratin cứng tìm thấy ở lông
vũ, tóc, móng guốc, có nhiều cầu nối disulfur và không thể kéo dài ra, keratin cứng
không hòa tan trong nước, và khó phân hủy hơn. Trong tóc chủ yếu được cấu tạo
bởi keratin cứng. Keratin tồn tại phổ biến nhất hiện nay trong da động vật, sừng,
tóc, lông với thành phần là các amino acidaxit amin như: glutamic, lysine, cysteine,

alanine và tyrosin e đây hầu hết là những amino acidaxit amin cần thiết mà cơ thể
13
Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20
Luận văn Thạc sĩ khoa học
không tự tổng hợp được, đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì và phát triển cơ
thể. Mặc dù rất khó phân hủy bởi những enzyme thông thường nhưng các chất thải
keratin có thể bị phân hủy bởi vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm do chúng tạo ra các
protease – keratinase.
Thủy phân keratin từ vi sinh vật đã được nghiên cứu từ năm 1959 [28], tuy
nhiên cơ chế thủy phân từ vi khuẩn vẫn chưa được nghiên cứu nhiều. Việc giảm cầu
nối disulfur có thể có ảnh hưởng đáng kể đến sự phân hủy keratin [9],[40] [10, 47]
Keratinase là enzymee, có khả năng phân hủy cấu trúc protein keratin khó tan. Các
keratinase tham gia thủy phân các chất thải keratin từ lông vũ trong công nghiệp
chăn nuôi gia cầm đã tạo ra các sản phẩm có giá trị như thức ăn chăn nuôi, phân
bón, các polymer và các amino acidaxit amin hiếm như serine, cysteine và proline.
1.2. Keratinase
Keratinase thuộc nhóm các protease kiềm có khả năng hoạt động mạnh trên
keratin không hòa tan. Enzyme này đóng vai trò quan trọng trong việc thủy phân
cấu trúc phức tạp của keratin có trong lông vũ, tóc, lông cừu, collagen và casein,
trong việc loại bỏ các rác tắc nghẽn trong các hệ thống xử lý nước thải. Keratinase ở
vi sinh vật chủ yếu enzyme ngoại bào khi sinh trưởng trên môi trường có chứa cơ
chất keratin và đôi khi cũng có keratinase nội bào, chúng giúp cho enzyme thủy
phân cầu disulfitde, sulfite hoặc thiosulfate có trong các cơ chất. Keratinase ngoại
bào thủy phân cấu trúc keratin trong sừng, lông, móng bằng cách giảm các cầu
disulfide của keratin, quá trình này có sự hiện diện của các chất khử như natri
sulfite, DTT (dithiothreitol), mercaptoethanol, glutathione, cysteine và
thioglycolate.
Keratinase được tạo ra từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau vi khuẩn, xạ
khuẩn và nấm. Các enzyme này được tạo ra trong quá trình phân hủy các cơ chất
như keratin trong tóc, lông, sừng, … Các đặc tính về hóa sinh và lý sinh của

keratinase là rất đa dạng. Phần lớn keratinase hoạt động ở điều kiện tối ưu là pH
14
Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20
Luận văn Thạc sĩ khoa học
trung tính tới kiềm và nhiệt độ từ 30
0
C đến 60
0
C. Hơn nữa kerainase có tiềm năng
ứng dụng lớn trong nông nghiệp, dược học và các lĩnh vực y sinh học, được ứng
dụng trong các hệ thống nước thải, thực phẩm, dệt may, dược phẩm, mỹ phẩm,
keratinase cũng được sử dụng trong ngành công nghiệp thuộc da trong quá trình tẩy
lông của da động vật thay vì xử lý chúng với sodium sulfide. Ngoài ra, sử dụng
keratinase trong sinh khối sinh học có thể giải quyết một phần nào đó về chuyển đổi
năng lượng và tái sử dụng các nhiên liệu.
Keratinase là enzyme thương mại do hình dạng cấu tạo có tới 97% giống với
protease kiềm (Hình 3) và nó cũng bị ức chế bởi các thuốc ức chế giống như ức chế
protease serine [5]. Khối lượng phân tử tùy theo từng loại sinh vật có thể dao động
từ 18 đến 35 kDa đối với protease serine có khối lượng phân tử nhỏ hoặc lớn hơn
90 kDa đối với protease serine có khối lượng lớn.
Hình 3: Cấu tạo phân tử của enzyme Keratinase
Ðến nay, keratinase được nghiên cứu chủ yếu có nguồn gốc từ vi khuẩn,
trong đó Bacillus được nghiên cứu nhiều nhất. Nhiều chủng B. licheniformis và B.
subtilis được mô tả có khả năng thủy phân keratin, những loài khác như B. pumilus
và B. cereus cũng có khả năng tổng hợp keratinase. Sinh tổng hợp keratinase cũng
được nghiên cứu ở xạ khuẩn, chủ yếu là từ các chi Streptomyces. Nhóm vi khuẩn
này được phân lập từ các vùng đất khác nhau, có khả năng thủy phân một loạt các
chất chứa keratin như tóc, len và lông.
15
Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20

Luận văn Thạc sĩ khoa học
Tính chất:
Keratinase thuỷ phân thành các axit amin:
Với tính chất thuỷ phân của keratinase, nó phá vỡ cầu nối disunfua của
keratin làm đứt liên kết của vòng xoắn. Như vậy, sau khi thuỷ phân hợp chất keratin
trong lông vũ đã được phân huỷ và chia nhỏ thành các axit amin và peptit ngắn. Khi
đó protein keratin mang đầy đủ các tính chất của protein tan như là: Tính hoà tan,
kết tủa, điện ly lưỡng tính, thuỷ phân và phản ứng màu đặc trưng. Keratinase chủ
yếu tấn công vào các liên kết disulfide (S-S), làm suy giảm các protein dạng sợi
fibrin, elastin, collagen và sợi protein khác.
pH và nhiệt độ:
Keratinase hoạt động được ở nhiệt độ từ 30
o
C - 80
o
C nhưng nhiệt độ tối ưu là:
50
o
C và enzyme này được ổn định khi bảo quản ở -20
o
C [60]. Keratinase bền vững
trong khoảng pH từ 6,0 - 9,0 nhưng pH tối ưu là 7,5 [51].;
Chất kìm hãm:
Khi bổ sung đường sucrose và lactose làm ức chế sự tổng hợp keratinase [51].
Chất nền có nồng độ và lượng cơ chất quá cao cũng sẽ làm ức chế sự tổng hợp
keratinase.[51]. Khi bổ sung các chất có chứa các ion kim loại nặng hoá trị hai như:
Cu
2+
, Ag
2+

, Hg
2+
và Pb
2+
thì cũng làm ức chế sự hoạt động của keratinase. Một số
hoá chất khác cũng ức chế phản ứng enzyme keratinase như: EDTA,…[30].
Chất hoạt hoá:
Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới thì khi bổ sung các chất có chứa các ion
kim loại hoá trị hai như: Ca
2+
, Mg
2+
, Mn
2+
thì kích thích sự hoạt động của keratinase.
[30].
Đặc tính hóa sinh của keratinase
16
Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20
Luận văn Thạc sĩ khoa học
Các đặc tính của enzyme được tạo ra từ vi khuẩn là rất đa dạng, tùy thuộc vào
loại vi sinh vật sản xuất ra keratinase. Các enzyme này chủ yếu là enzyme ngoại
bào được tiết ra từ vi sinh vật. Phần lớn các keratinase được tiết ra từ vi khuẩn có
pH là kiềm hoặc trung tính, pH tối ưu từ 7,5-9,0. Tuy nhiên, một số keratinase khác
được tối ưu hoạt động ngoài phạm vi này, pH hoạt động ở kiềm hóa [10] hoặc pH là
axít [21],[41][50, 51]. Một số keratinase ổn định trên một khoảng pH rộng., Ví dụ
như keratinase của chủng Nocardiopsis TOA-1, được ổn định trong khoảng pH từ
1,5-12, trong 24h ở 30°C .[37].
Trọng lượng phân tử keratinase đã được xác định. Mặc dù trọng
lượng phân tử các enzyme từ 18 kDa [43] đến 240 kDa [13] , [11]

nhưng đa số keratinase có trọng lượng phân tử thấp hơn 50 kDa.
Phần lớn các keratinase là các đơn enzyme, tuy nhiên phân lớp đa
enzyme cũng đã được ghi nhận [18], [52]. Keratinase có trọng
lượng phân tử cao thường kết hợp với các keratinase có đặc tính
của metalloprotease hoặc chúng có nguồn gốc từ chịu nhiệt.
Ảnh hưởng của các ion kim loại và các bất hoạt hoạt tính keratinase đã và đang
được nghiên cứu. Gần đây các nghiên cứu của Gupta và Ramnani [24] cho thấy các
ion kim loại hóa trị 2 như Ca
2+
, Mg
2+
và Mn
2+
có xu hướng kích thích hoạt tính
enzyme keratinase. Ảnh hưởng này có thể liên quan tới việc duy trì hoạt tính của
enzyme và tạo ra sự ổn định phức hợp giữa cơ chất và enzyme. Ngoài ra các ion
kim loại có thể bảo vệ cho enzyme chống lại biến tính về nhiệt độ [6],[40][7, 48].
Ngược lại, sự chuyển trạng thái và các kim loại nặng khác như Cu
2+
, Ag
+
, Hg
2+
và
Pb
2+
là nguyên nhân của sự bất hoạt các enzyme keratinase. Các keratinase thường
ổn định trong sự hiện diện của dung môi hữu cơ như DMSO, Triton X-100.
1.3.Một số chủng biểu hiện
1.3.1. Chủng chủ E. coli

E. coli là vi khuẩn Gram âm, có thể hiếu khí hoặc kị khí, không sinh bào tử.
Chúng có bộ máy di truyền tương đối đơn giản, thành phần di truyền sơ cấp chỉ là
17
Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20
Luận văn Thạc sĩ khoa học
một nhiễm sắc thể đơn với khoảng 5 triệu cặp bazơ. Tế bào E. coli có khả năng sinh
sản với tốc độ nhanh trên môi trường nuôi cấy đơn giản, trung bình 20 phút chúng
lại phân chia một lần. Đặc biệt, E. coli có khả năng thu nhận rất nhiều yếu tố di
truyền từ môi trường ngoài như plasmid, phage với khả năng sao chép DNA rất
lớn. Chính vì vậy, chúng đã được cải biến để sử dụng như một vật chủ hữu hiệu
trong kỹ thuật tách dòng cùng như biểu hiện gen, có rất nhiều chủng được sử dụng
như: E. coli BL21(DE3), E. coli DH5α
Hình 4. Vi khuẩn E.coli
Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn lựa chủng E. coli BL21 (DE3) làm
chủng chủ để biểu hiện. Chủng biểu hiện E. coli BL21 (DE3) là chủng đột biến,
chứa đột biến Ion protease (một protease nội bào) và ompT protease (một protease
ngoại bào) nên hạn chế khả năng thủy phân protein. Ngoài ra trong hệ gen của
chủng E. coli BL21 (DE3) có chứa gen mã hóa T7 RNA polymerase, [18] đây là
gen có nguồn gốc từ bacteriophage T7 được đưa vào hệ gen của E. coli BL21 (DE3)
đặt dưới sự điều khiển promoter lac cảm ứng với IPTG. T7 RNA polymerase rất
đặc hiệu với promoter của phage T7 nên có khả năng phiên mã bất kỳ trình tự DNA
nào nằm dưới sự điều khiển promoter T7. Đây còn là enzyme hoạt động mạnh, có
tốc độ kéo dài chuỗi nhanh gấp 5 lần so với các RNA polymerase khác có nguồn
gốc từ E. coli. Do đó, sự có mặt T7 RNA polymerase giúp tổng hợp một lượng lớn
protein ngoại lai dưới sự điều khiển của promoter T7. Khi biểu hiện trong E. coli là
các protein sinh ra có xu hướng tạo thành thể vùi không hòa tan, do nguyên nhân là
18
Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20
Luận văn Thạc sĩ khoa học
E. coli không có khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã (ví dụ như glycosyl

hóa) nên ảnh hưởng đến sự cuộn gấp, tính bền hoặc hoạt tính sinh học.
Ngoài ra, việc biểu hiện trong E.coli tồn tại một bất lợi, đó là sản phẩm thường
lẫn độc tố, và để loại bỏ hoàn toàn những độc tố này cần phải qua nhiều bước tinh
chế rất khó khăn và tốn kém. Do đó cần có những hệ thống biểu hiện khác không
tạo ra độc tố để biểu hiện và thu nhận được protein dễ dàng hơn với chi phí thấp. Vi
khuẩn B.subtilis là một trong những đối tượng cho tiềm năng trên.
1.3.2. Chủng chủ Bacillus subtilis
Bacillus subtilis là vi khuẩn Gram dương, hình que thuộc chi Bacillus, có
khả năng tạo bào tử và có khả năng chịu đựng trong các điều kiện môi trường khắc
nghiệt (Hình 5). Toàn bộ bộ gen của B. subtilis đã được giải trình tự vào năm 1997.
Tế bào vi khuẩn B. subtilis chỉ có một phân tử DNA nằm trong một nhiễm sắc thể
tròn. Kích thước tổng thể của DNA là 4.214.814 cặp bp. Khoảng 87% bộ gen (bao
gồm 4.100 gen) mã hóa cho protein. Trong 4.100 gen thì có 192 gen được cho là
không thể thiếu và 79 gen được cho là cần thiết cho các quá trình sống của B.
subtilis. Hầu hết các gen cần thiết tham gia vào quá trình trao đổi chất.
Hình 5. Vi khuẩn B. subtilis
Trong các điều kiện môi trường không thuận lợi, vi khuẩn B. subtilis hình
thành nội bào tử. Nội bào tử ở trung tâm có kích thước 0,5-0,8 X 0,4 µm. Sự hình
19
Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20
Luận văn Thạc sĩ khoa học
thành bào tử xảy ra trong nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất. Đầu tiên,
nucleotid kéo dài trở thành một sợi trục. Sau đó, tế bào hình thành một vách ngăn
và bắt đầu phân chia thành hai phần. Phần nhỏ hơn của tế bào được gọi là các tiền
bào tử (forespore) và phần lớn hơn được gọi là tế bào mẹ. Tế bào mẹ nuôi dưỡng
tiền bào tử. Khi hình thành vách ngăn, 30% số nhiễm sắc thể đã nằm bên trong tế
bào mẹ, 70% nhiễm sắc thể còn lại chuyển vào tiền bào tử thông qua một loại
protein vận chuyển được gọi là SpoIIIE. Trước giai đoạn hình thành bào tử các tế
bào vi khuẩn có thể tự tạo ra chất đề kháng (kháng sinh) hoặc giết chết đồng loại để
tìm kiếm chất dinh dưỡng

Thành tế bào của vi khuẩn là một cấu trúc cứng nhắc bên ngoài tế bào. Nó
bao gồm peptidoglycan, là một polymer của đường và amino axit. Các
peptidoglycan được tìm thấy trong vi khuẩn được gọi là murein. Các thành phần
khác kéo dài từ murein là axit teichoic, axit lipoteichoic, và protein. Thành tế bào
tạo thành rào cản giữa môi trường và tế bào vi khuẩn. Do đó B.subtilis có tính ổn
định cao trong điều kiện môi trường khắc nghiệt. Ngoài ra, vật chủ này mang một
số đặc điểm nổi bật khác như là: hoạt tính protease thấp, các plasmid tương đối bền
về cả cấu trúc lẫn phân ly trong phân bào, khả năng sinh trưởng trên nhiều loại cơ
chất khác nhau. Đặc biệt B.subtilis là sinh vật không gây bệnh và có khả năng tiết ra
các protein ngoại bào với chức năng trực tiếp vào môi trường nuôi cấy. Chính
những điều này làm cho B.subtilis là ứng viên sángđược sử dụng nhiều giá để
nghiên cứu biểu hiện protein ngoại lai.
1.4. Ứng dụng của keratinase
Keratinase từ vi sinh vật đã được đặc biệt chú ý trong thập niên gần đây do
nhiều ứng dụng của enzyme này trong các ngành công nghiệp như trong thực phẩm,
nông nghiệp, chất tẩy rửa, thuộc da và các ngành công nghiệp dược phẩm. Hiện
nay, ứng dụng hứa hẹn nhất của keratinase từ vi sinh vật là sản xuất các chất dinh
dưỡng với chi phí thấp hơn mà mang lại hiệu quả tốt với môi trường giàu lông vũ
cho gia cầm.
20
Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20
Luận văn Thạc sĩ khoa học
1.4.1. Ứng dụng trong nông nghiệp
* Sản xuất thức ăn chăn nuôi
Trong lông vũ có hơn 90% là protein, thành phần chính là β-keratin không
hòa tan do chứa nhiều liên kết hydro, cầu disulfide và kỵ nước. Do tính chất không
hòa tan này, lông vũ kháng lại được sự thủy phân của protease thông thường như
trypsin, pepsin và papain. Tuy nhiên, lông vũ đã được xử lý ở nhiệt độ và áp suất
cao để tạo thành các sản phẩm giàu dinh dưỡng, sử dụng bổ sung thức ăn chăn nuôi
trong dưới hình thức chế phẩm dạng bột. Việc xử lý bằng nhiệt gây tốn kém về chi

phí và còn phá hủy một số axit amin thiết yếu là methionin, lysin và tryptophan, dẫn
đến sản phẩm bị giảm về hiệu năng và chất lượng chất dinh dưỡng. Khắc phục
những nhược điểm đó thì sử dụng keratinase để tạo thành thành thức ăn chăn nuôi
giàu dinh dưỡng. Thức ăn từ lông vũ là tương đối rẻ tiền và còn tốt hơn bột đậu
tương bởi tổng số axit amin chứa trong đó như cystein, valin và threonin cao và
chúng có thể thay thế thức ăn đậu tương ở mức 7% [4]. Dịch thủy phân từ lông vũ
giàu protein cũng có thể được sử dụng cho nông nghiệp như là phân hữu cơ giàu
nitơ. Việc sử dụng phân bón giàu nitơ hữu cơ phục vụ hai mục đích cải thiện tăng
trưởng thực vật và tăng cường hoạt động của vi sinh vật trong đất. Trong khi đó
thức ăn từ lông vũ giàu đạm sẽ là nguồn thay thế tiềm năng cho phân bón hóa học.
* Tăng hàm lượng chất dinh dưỡng trong thức ăn gia súc
Khi bổ sung các vi khuẩn đã được phân lập và tuyển chọn vào các loại thức
ăn thì làm cho thức ăn của gia súc bảo quản được lâu hơn, khi gia súc ăn sẽ dễ tiêu
hoá hơn [3] [21][3, 24]. Trong công nghiệp, phế liệu lông được biến đổi thành bột
lông bằng cách sử dụng nhiệt độ và áp suất cao. Tuy nhiên sử dụng bột lông đã thuỷ
phân để thay thế protein có một số giới hạn. Khi thêm 6% bột lông đã thuỷ phân
vào bữa ăn của gà con làm giảm trọng lượng cơ thể của chúng. Nhưng nếu sử dụng
thuỷ phân bột lông bằng vi khuẩn có thể tạo ra sản phẩm thay thế đến 15% protein
trong thức ăn gia cầm [2].
21
Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20
Luận văn Thạc sĩ khoa học
Thí nghiệm trên gà, người ta nhận thấy rằng feather lysate, được cân bằng
với một số axit amin, có thể thay thế đậu nành như là một nguồn protein tới 7%
trong khẩu phần. Trong các nghiên cứu khác, bột lông thương mại được ủ qua đêm
với Keratinase keratinase để tạo ra một phần bột lông thuỷ phân. Khả năng tiêu hoá
amino acid axit amin của bột lông thủy phân với Kkeratinase ở gà trưởng thành là
82% cao hơn so với bột lông thủy phân thương mại, là 60%. Vậy có thể kết luận
rằngDo vậy, keratinase có khả năng thuỷ phân và biến đổi bột lông vũ thành nguồn
protein có thể tiêu hoá ở mức tối đa là 7% protein khẩu phần trong thức ăn [4].

1.4.2. Ứng dụng trong công nghiệp
Công nghệ thuộc da và chất tẩy rửa
Enzyme thủy phân protein đã có mặt ở thành phần chất tẩy rửa từ thời cổ đại.
Trong thực tế, khoảng 89% chất tẩy rửa là các protease kiềm. Tuy nhiên luôn cần
nghiên cứu để đưa ra các enzyme mới để mở rộng phạm vi chất tẩy rửa có sử dụng
enzyme. Keratinase có khả năng liên kết và thủy phân các hợp chất rắn cấu tạo
giống như lông vũ. Đây là một đặc tính quan trọng của enzyme làm cho chúng hấp
phụ các chất phụ gia có trong các chất tẩy rửa bề mặt cứng, có thể loại bỏ các loại
vết bẩn thường gặp trong giặt ủi, chẳng hạn như vòng cổ áo, cổ tay của áo sơ mi.
1.4.3. Đối với môi trường sinh thái
Hiện nay, với sự phát triển của ngành chế biến gia cầm, đã kéo theo một lượng
lớn rác thải lông vũ từ các khu giết mổ và trang trại chăn nuôi. Nếu không được xử
lý thì lượng rác thải này sẽ gây ra những mùi hôi thối từ khí H
2
S làm ảnh hưởng đến
cuộc sống của con người và môi trường sống. Chúng ta có thể bổ sung các chủng vi
khuẩn đã được phân lập tuyển chọn vào các đống rác ủ để các chủng vi khuẩn này
phân huỷ các hợp chất khó tiêu huỷ như lông vũ. Đây là ý nghĩa rất quan trọng giúp
môi trường được trong sạch và giảm thiểu sự ô nhiễm một cách cần thiết.
22
Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20
Luận văn Thạc sĩ khoa học
1.4.4.Ứng dụng trong y, dược học
Prion là các hạt proteinaceous thường là nguyên nhân gây tử vong cho bệnh
nhân mắc thoái hóa thần kinh được gọi là xốp truyền nhiễm encephalopathies (TSE)
mà bao gồm bệnh bò điên và bệnh Creutzfeld-Jakob. Shih và cộng sự đã chỉ ra rằng
keratinase có khả năng làm giảm prion từ mô não của loài bò xốp não (BSE) do bị
nhiễm từ động vật. [35].
Các peptide có hoạt tính sinh học từ keratin có chứa trong các vật liệu như len,
da, tóc và lông là một trong những thành phần của thực phẩm chức năng có giá rẻ

và phong phú từ các nguồn tự nhiên. Các chuỗi axit amin giàu prolin có hoạt tính
sinh học được dùng để phòng chống các bệnh cho con người bao gồm: ngăn chặn
sự hình thành khối u, kiểm soát tăng huyết áp và bệnh Alzheimer [21].
1.5. Tình hình nghiên cứu
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Keratinase đã được nghiên cứu từ những năm 90, là một dạng protease rất
phổ biến trong thế giới vi sinh vật. Vi sinh vật tổng hợp keratinase đã được phân lập
từ nhiều vị trí khác nhau, từ đất Nam Cực đến suối nước nóng, ở điều kiện môi
trường hiếu khí và kỵ khí. Vì vậy, vi khuẩn tổng hợp keratinase có sự đa dạng rất
lớn về đặc tính hóa sinh và lý sinh .[53].
Đến nay, các keratinase được nghiên cứu chủ yếu có nguồn gốc từ vi khuẩn,
trong đó Bacillus spp. được nghiên cứu nhiều nhất. Nhiều chủng B. licheniformis và
B. subtilis được mô tả có khả năng thủy phân keratin [10],[13],[45],[41], [11], [15],
[70], những loài khác như B. pumilus và B. cereus cũng có khả năng tổng hợp
keratinase [29], [20]. [33], [66], [34], [24]. Sinh tổng hợp keratinase cũng được
nghiên cứu ở Actinomycetes, chủ yếu là từ chi Streptomyces. Nhóm vi khuẩn này
được phân lập từ các vùng đất khác nhau, có khả năng thủy phân một loạt các chất
chứa keratin như tóc, len và lông. Gushterova và cộng sự [22] đã phân lập hai
chủng xạ khuẩn chịu nhiệt có hoạt tính thủy phân keratin cao là Streptomyces flavis
2BG và Microbispora aerata IMBAS-11A. Các loài chịu nhiệt như Streptomyces
23
Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20
Luận văn Thạc sĩ khoa học
gulbarguensis [47], Streptomyces thermoviolaceus [14] và Streptomyces
thermonitrificans [38] cũng đã được phân lập từ đất. Ngoài những chủng ưa nhiệt,
một số Streptomyces kém bền nhiệt đã được phân lập như Streptomyces pactum
DSM 40.530 [52], Streptomyces graminofaciens [48] và Streptomyces albidoflavus
K1-02 [43].
Ngoài các chủng thuộc Bacillus spp. và Actinomycetes, một số chủng vi
khuẩn có khả năng thủy phân keratin diễn ra ở nhiệt độ cao, pH và kiềm nhiệt hóa

đã được công bố. Fervidobacterium pennavorans [20], Fervidobacterium
islandicum [41], Meiothermus ruber H328 [38], Clostridium sporogenes [30] và các
chủng Thermoanaerobacter sp. [49] được phân lập từ các môi trường khắc nghiệt
như suối nước nóng, lỗ thông hơi nhiệt, và khu vực núi lửa. Một số vi sinh vật hoạt
động ở môi trường kiềm như Nesternkonia sp. [21] và Nocardiopsis sp. TOA-1 [39]
cũng có khả năng thuỷ phân keratin. Ngoài ra, các loài khác nhau của cùng một chi
(chẳng hạn, Bacillus) có thể tạo ra các keratinase khác nhau [53]. Chính vì vậy, khai
thác đa dạng vi sinh vật sẽ cung cấp sản phẩm keratinase phù hợp với từng công
việc cụ thể.
Hiện nay trên thế giới, các kết quả nghiên cứu về keratinase cho thấy nhiều
nhóm vi sinh vật khác nhau có khả năng thủy phân lông vũ, chẳng hạn các chủng
thuộc các nhóm Bacillus, Chryseobacterium, Actinomycetes, Vibrio [34] [36][37,
39][70, 72][70, 72][70, 72][70, 72] [70, 72][70, 72][70, 72][70, 72][70, 72][70, 72]
[70, 72][71, 73][72, 74][72, 74][72, 74][72, 74][73, 75][73, 75][73, 75][74, 76][74,
76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76]
[74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][74, 76][73, 75][73, 75][73, 75][73,
75][75][75][74][74][75][74][73][74][73] và nấm [17][19, 20] [18] [19]. [18, 19,
20]. Sử dụng vi sinh vật và keratinase nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm dinh
dưỡng từ bột lông vũ đã và đang được quan tâm. Bột lông vũ thủy phân bằng
Bacillus licheniformis có bổ sung axit amin làm thức ăn cho gà đã tạo ra sự tăng
trưởng của gà tương tự như gà sử dụng nguồn thức ăn ở đậu tương [22]. Sử dụng
24
Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20
Luận văn Thạc sĩ khoa học
keratinase thô từ chủng Bacillus licheniformis làm tăng khả năng phân giải nguồn
lông vũ thô cũng như là bột lông vũ. Enzyme thủy phân này sẽ làm tăng khả năng
tiêu hóa lông vũ tới 82% và có thể thay thế tới 7% protein ăn cho gà [21].
Một số nghiên cứu đã chứng minh được rằng vi sinh vật thủy phân keratin có
thể tồn tại trong lông, móng, guốc Chính sự xuất hiện của vi sinh vật này đã làm
tăng khả năng xử lý chất thải, giảm thiểu gây ô nhiễm môi trường. Đặc biệt

keratinase của chủng vi sinh vật là thành phần quan trọng trong công nghệ sinh học
liên quan tới nguồn chất thải công nghiệp lông vũ và trong chăn nuôi [24].
Đối với phân bón, keratin sau khi bị thủy phân thành các axit amin, các peptide
hòa tan sẽ cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng. Các dạng phân hữu cơ này có thể
được bón qua lá với một lượng nhỏ nhưng có tác dụng làm tăng quá trình phát triển
của cây, giảm được lượng phân bón hoá học vào đất và có khả năng tăng chất lượng
cho sản phẩm. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng đã chỉ ra rằng phun qua lá tăng
hiệu quả hơn bón qua gốc từ 8-10 lần.
Ngoài ra, do nhu cầu sử dụng keratinase ngày càng cao nên các nghiên cứu tập
trung chủ yếu vào phân lập gen và biểu hiện keratinase tái tổ hợp. Một số nghiên
cứu đã được phân lập và biểu hiện gen keratinase từ vi khuẩn Gram dương
(Bacillus sp.) và xạ khuẩn (Nocardiopsis sp.) [3] hay phân lập gen và biểu hiện gen
từ P.aeruginosa trong một hệ thống biểu hiện E. coli. [54]. Gần đây nhất, một số
nghiên cứu trên thế giới đã tiến hành biểu hiện gen từ vi khuẩn Bacillus
licheniformis trong hệ biểu hiện E. coli, B. subtilis và P. pastoris để khám phá một
hệ thống biểu hiện tốt hơn để sản xuất keratinase , gen từ vi khuẩn Bacillus
licheniformis được thể hiện trong Escherichia coli , Bacillus subtilis , và Pichia
pastoris[35].
Như vậy, Keratinase keratinase đã được sản xuất và bán trên thị trường với
nhiều mục đích khác nhau. Sinh tổng hợp keratinase thường được cảm ứng bởi
keratin [15], [7], [14], [23]. Do đó, cơ chất keratin (lông gà, bột lông, tóc) thường
25
Hoàng Thị Thu Hiền – Di truyền học K20