Tinh sạch và nghiên cứu tính chất của enzyme

TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME
AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE
Mục lục
I, Tóm tắt.
II, mở đầu.
1, giới thiệu.
2, phương pháp,
III, kết quả.và thảo luận
IV, Tài liệu tham khảo.
I, TÓM TẮT .
Enzyme amylase là loại enzyme có khả năng chuyển hóa nguồn cơ chất
có liên kết 1-4 Glucozo thành glucozo, dextrin, enzyme amylase có
trongnước bọt, dịch tiêu hóa của người động vật, trong hạt nảy mầm
nấm sợi xạ khuẩn nấm men và vi khuẩn..
Trên thế giới và ở Việt Nam đã có rất nhiều đề tài nghiên cứu về việc
sản xuất amylase từ chủng nấm Aspergillus oryzae .Tuy nhiên những
nghiên về tính chất động học và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của
amylase lại chưa thật cụ thể.
Trong bài báo này ta chỉ sử dụng enzyme amylase được tách chiết từ
chủng nấm mốc aspergillus oryzae ở Việt Nam.
+cách thu enzyme từ chủng nấm aspergillus oryzae
+các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ xúc tác của enzyme
+các biện pháp tinh sạch sơ bộ enzyme amylase
II, MỞ ĐẦU
1, GIỚI THIỆU
Tinh bột cùng với protein và chất béo là một thành phần quan trọng bậc
nhất trong thành phần dinh dưỡng của loài người cũng như các loài động
vật khác. Trong quá trình tiêu hóa chúng bị thủy phân thành đường
glucose là chất tạo nên nguồn năng lượng chính trong thực phẩm. Tinh
bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng có nhiều ứng dụng trong kỹ thuật và
trong đời sống con người. Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tinh

bột từ khoai tây , lúa mì , ngô... còn ở nước ta thì sử dụng chủ yếu là lúa
khoai mì là nguồn tinh bột chủ yếu.
Page 1


TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME
AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE
Trong chế biến tinh bột và đường công đoạn quan trọng nhất là thủy
phân tinh bột về các đường đơn giản. Sau đó , chủ yếu trên cơ sở đường
đơn nhờ lên men người ta sẽ thu được nhiều sản phẩm quan trọng như
rượu cồn, rượu vang, bia ... các loại acid hữu cơ , các amino acid. Trước
đây người ta hay dung acid hoặc H2SO4 để thủy phân tinh bột nhưng
kết quả cho thấy thủy phân bằng acid rất khó kiểm soát thường tạo nhiều
sản phẩm không mong muốn. Nên hiện nay để thủy phân tinh bột người
ta sử dụng enzyme amylase thu nhận từ thực vật hoặc các vi sinh vật .
Enzyme amylase đã được tìm ra góp phần quan trọng cho nhiều ngành
công nghiệp chế biến thực phẩm. Ezyme amylase có thể tìm thấy ở
nhiều nguồn khác nhau như amylase từ thực vật, động vật, và vi sinh
vật. Amylase ngày càng được thay thế acid trong quy mô công nghiệp .
Nguồn amylase có thể lấy từ mầm thóc mầm đại mạch (matl), hạt bắp
nảy mầm hay từ nấm mốc .
Nguyên liệu cho sản xuất enzyme amylase thường là gạo, bắp khoai mì,
đây là nguồn nguyên liệu rẻ tiền dễ tìm ở nước ta đây là một lợi thế và
là hướng phát triển mạnh có thể làm cơ sở cho nhiều ngành khác phát
triển. Ví dụ như trong sản xuất rượu , bia , nước giải khát .....
2,PHƯƠNG PHÁP :
Chủng giống và môi trường nuôi cấy, môi trường thu enzyme:
Chủng nấm Asgersillus oryze được phân lập từ nguồn mốc cơm (meo
sử dụng làm tương) trên môi trường PDA: 20% khoai tây, 2% glucozo,
2% agar.

Đặc điểm chủng Aspergillus oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ
Plectascales lớp ascomycetes cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi
bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5-7 µm, phân nhánh rất nhiều
và
có vách ngang , chia sợi thành nhiều bao tế bào ( nấm đa bào )
Chủng Asp.oryzae: giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào
(amylase, protease, pectinasa,…), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên
liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo… đã hết nhưng không được rửa
sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát
triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen ,vàng… Màu do các bào tử
Page 2


TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME
AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE
già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và phát tán khắp
nơi, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới.
-Hình ảnh về chủng nấm aspergillus oryzae

Hóa chất:
Page 3


TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME
AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE
Dùng các hóa chất có trong phòng thí nghiêm khoa Khoa học Sự Sống
đươc cung cấp từ nhiều hang khác nhau: K2HPO4, MgSO4.7H2O,
NaNO3, KCl, FeSO4.7H2O, peptone, cao nấm men, NaOH, DNS…
Sinh tổng hợp amylase
Chủng Asgersillus oryze được nuôi cấy trên môi trường khoáng

Czapek có bổ sung 1% tinh bột, 0.4% peptone, 0,2% cao nấm men,
pH=6.0, sau 5 ngày nuôi trong máy lắc thì thu dịch nhận enzyme để xác
định hoạt tính của amylase.
Xác đinh hoạt tính của amylase
Hoạt tính của amylase được xác đinh bằng phương pháp quang phổ
theo Miler(1959), với cơ chất tinh bột 1% trong đệm acetate pH 5,6.
Thuốc thử là dung dịch DNS 1% pha trong NaOH và muối kép. Phản
ứng được tiến hành theo các Miler 1959 rồi đo ở bước sóng 540nm. Độ
hấp phụ được đối chiếu với đường chuẩn glucozo để tính lượng đường
giải phóng tương đương. Một đơn vị hoạt độ amylase được xác định à
lượng enzyme xúc tác thủy phân giải phóng 1 mol tinh bột trong vòng 1
phút ở điều kiên thí nghiệm.
Xác định hoạt độ enzyme amylase theo phương pháp phân tích
lượng đường khử tạo thành:
1, Dựng đường chuẩn.
2, Tiến hành xác định hoạt độ.
- Chuẩn bị cơ chất CMC 1% (ư/v) pha trong đệm acetate 100mM, pH
5,0.

Ống thí nghiệm

Ống kiểm tra

0,25 ml enzyme

0,25 ml enzyme

0,5 ml tinh bột 1%

0,75 ml DNS 1%

Page 4


TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME
AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE
- Đảo đều.
- Ủ ở 50oC trong 10 phút
0,75 ml DNS 1%
-

0,5 ml tinh bột 1%

Đảo đều.
Đun sôi cách thủy 5- 10 phút.
Làm nguội đến nhiệt độ phòng.
Đo độ hấp phụ ở bước sóng 540 nm.
ΔOD1

0.707

ΔOD2

0.720

Từ giá trị OD ta tính theo đường chuẩn ra lượng đường trong ống thí
nghiệm và ống kiểm tra.
Vậy hoạt độ enzyme tính ra được là:
Áp dụng công thức tính hoạt độ :HĐ (U/ml) = (a – b)* HSPL/(V*t)
(a1 –b1) = (0,707 – 0,0048)/0,6475 = 1.084.

HD1 = (1,084*8)/(0,25*10) = 3.4688.
(a2 –b2) = (0,720 – 0,0048)/0,6475 =1.104.
HD2 = (1.104*8)/(0,25*10) =3.528.
Tinh sạch sơ bộ protein:
Enzyme khi mới được trích ly còn chứa nhiều các protein tạp, để loại
bớt chúng ta tiến hành tủa dịch enzyme bằng các dung môi hữu cơ:
acetone, ethanol, methanol. Các dung môi hữu cơ khi được hòa vào
dung dịch sẽ làm thay đổi hằng số điện môi dẫn đến các protein có xu
hướng liên kết với nhau (kết tủa). Ta tủa dịch enzyme với các dung môi
ở nồng độ khác nhau từ 40%-90%, lưu ý khi tủa phải tiến hành ở nhiệt
độ thấp và thời gian tủa là thích hợp không quá dài, trong nghiên cứu
này là 30 phút. Sau đó, tiến hành ly tâm thu tủa, bổ sung dung dịch đệm
và kiểm tra hoạt tính.
Page 5


TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME
AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE
Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký lọc Gel.
Phương pháp sắc ký lọc gel là phương pháp tinh sạch enzyme dựa vào
kích thước của enzyme. Để thực hiện phương pháp này ta cần làm các
bước sau:
Chuẩn bị cột sắc ký
* Ngâm gel.
- Cân 2g sephadex G-100 cho vào cốc đong 500 ml, bổ sung nước cất
khử trùng hoặc nước khử ion khuấy đều.
- Ngâm trong 48h, thỉnh thoảng khuấy nhẹ.
* Nhồi cột.
- Kẹp cột sắc ký vào giá treo phương thẳng đứng, lắp khóa vào cột sắc
ký, nhồi mội ít bông thủy tinh vào đáy cột.

- Gạn bớt nước trong cốc ngâm gel, khuấy đều, cho gel chạy từ từ theo
thành cột sắc ký bằng đũa thủy tinh.
- Mở khóa cho nước chảy ra để gel được nhồi và nén vào trong cột.
Tiếp tục quá trình trên cho đến khi lên cột toàn bộ lượng gel.
- Rửa cột bằng 150 – 200 ml nước cất khử trùng.
*Cân bằng cột .
- Cho 150 -200 ml đệm acetate 0,05 M, pH 5,6 chảy từ từ qua cột.
Tiến hành sắc ký
- Cho mẫu lên cột: dùng pipet nhỏ từ từ theo thành cột từ 5 – 10 ml
mẫu protein.
- Mở khóa điều chỉnh tốc độ dòng chảy khoảng 30 ml/h.
- Khi lượng mẫu thấm hết vào gel: bổ sung từ từ đệm acetate 0,05 M,
pH 5,6 lên cột và tiến hành thu 20 phân đoạn vào các ống nghiệm nhỏ
(mỗi phân đoạn 2 ml).
Đánh giá độ sạch bằng phương pháp điện di protein

Đánh giá độ sạch bằng phương pháp điện di protein ( SDS – PAGE).
Page 6


TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME
AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE
Đổ bản gel.
Seperating gel (Gel tách).
Sol A: 2,5 ml
Sol C: 3,3 ml
Sol D: 0,1 ml
ASP 10%: 50 µl
TEMED: 5 µl
H2O cất khử ion: 4,045 ml

Stacking gel (Gel cô)
Sol B: 1 ml
Sol C: 0.67 ml
Sol D: 0,04 ml
ASP 10%: 30 µl
TEMED: 5 µl
H2O cất khử ion: 2,33 ml

Đổ gel tách trước khoảng 30 phút sau đó tiếp tục đổ gel cô, để đông
trong 30 phút.
- Lắp bản gel vào bể điện di.
- Đổ đầy đệm chạy vào bể điện di ngập bản gel.
- Làm sạch các giếng.
Chuẩn bị mẫu.
- 25 µl dịch enzyme + 5 µl Loading 5x.
- Biến tính ở 95oC trong 10 phút, làm lạnh.
- Tra từ từ mẫu vào các giếng bản gel.
Chạy điện di.
- Chạy ở cường độ dòng điện 80V với gel cô và 100-120V với gel tách.
- Sau khi chạy xong, tách bản gel ra khỏi bản kính.
Nhuộm gel.
Để bản gel ngập trong dung dịch nhuộm khoảng 1-2 giờ hoặc qua đêm
trong điều kiện lắc nhẹ.
Tẩy gel và phân tích.
- Ngâm trong dung dịch tẩy trong điều kiện lắc nhẹ đến khi có màu
trắng.
- Bảo quản gel trong nước cất.
Phân tích kết quả.

Page 7


TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME
AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE
III, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Phương trình đường chuẩn glucozo theo miler 1959

HĐ (U/ml)= (a-b)*HSPL/(V*t
*Các yếu tố ảnh hưởng đến họa độ xúc tác của enzyme
-Ảnh hưởng của cơ chất đến hoạt tính của amylase
-

ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzyme amylase

Cơ chất chính là thành chính của phản ứng enzyme cơ chất. Tốc độ
phản ứng của amylase trong 1 giới hạn nào đó có phụ thuộc vào nồng độ
của cơ chất tinh bột trong môi trường. Chừng nào enzyme chưa bị bão
hòa bởi cơ chất thì tốc độ phản ứng vẫn tỷ lệ thuận với nồng độ cơ chất.
Và ở mỗi nồng độ cơ chất khác nhau thì hoạt tính hay vận tốc phản ứng
của amylase là khác nhau.

Page 8


TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME
AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE
Hình đồ thì biểu diễn sự biến đổi của vận tốc phụ thuộc vào vận tôc
phản ứng.
Từ mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất với vận tốc phản ứng của

enzyme ta tìm đước các thông số động học của amylase: Vmax và Km.
Các thông số động học của enzyme amylase chúng tôi tính toán dựa vào
phương trình của Lineweaver-Burk
Kết quả thu nhận như sau:
Bảng kết quả thủy phân tinh bột của amylase
[S]
(%)
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6

[ V ]
(%/phút)
0.209
0.308
0.564
0.567
0.575
0.601
0.694
0.72
0.723

1/[S]

10
5
2.5
1.667
1.25
1
0.833
0.714
0.625

1/[V]
4.785
3.247
1.773
1.764
1.739
1.664
1.441
1.389
1.383

Page 9


TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME
AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE
Đồ thị biểu điển sự phụ thuộc giữa 1/V và 1/S của amylase
Bảng các thông số động học của amylase từ chủng Aspersillus oryze.
Vmax
Km

amylase
0.856
0.342
-ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme amylase
Để xác định nhiệt độ thích hợp nhất (opt), nhiệt độ mà enzyme
có khả năng thủy phân cơ chất mạnh nhất. Ta tiến hành cho
enzyme amylase thủy phân cơ chất tinh bột 1% ở các nhiệt độ
khác nhau: 30; 40; 50;60; 70.
Nhiệt độ

ΔOD

Hoạt tính

30oC

1.118

2.7507

40oC

1.271

3.1362

50oC

1.385

3.4106

60oC

1.380

3.3982

70oC

0.632

1.5498

Hoạt tính của enzyme amylase tăng dần từ nhiệt độ 30 oC đến 60oC, ổn
định ở khoảng nhiệt độ 50oC – 60oC, sau đó hoạt tính của enzyme giảm
xuống nhanh chóng
Theo 1 số tài liệu đã công bố thì Enzyme amylase có khả năng xúc tác
mạnh nhất ở khoảng nhiêt độ 50-600C và khi nhiệt độ tăng lên tiếp thì
hoạt tính của enzyme sẽ giảm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng có
chung kết luận với các nghiên cứu đã công bố, khoảng nhiệt độ thích
hợp đã enzyme amylase thủy phân cơ chất tinh bột là 50-60 0C và cao
nhất là 600C.

Page 10


TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME
AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE

Hình: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng xúc tác của enzyme amylase
-

ảnh hưởng của PH đến hoạt tính enzyme amylas

Mỗi enzyme có 1 khoảng pH thích hợp (opt), đó chính là khoảng pH
mà enzyme thể hiện hoạt tính mạnh nhất. Để xác đinh khoảng pH opt
của amylase, ta cho enzyme thủy phân cơ chất tinh bột 1% trong đệm
acetate từ pH= (3; 4; 5) và trong đệm photphat từ (6; 7; 8)
pH
ΔOD
Hoạt tính

acetate

phosphat
e

3

0.374

0.8056

4

0.582

1.4262

5

1.425

3.5094

6

1.305

3.2128

7

0.872

2.1428

8

0.756

1.8562
Page 11


TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME
AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE
hoạt tính của enzyme cao nhất nằm trong khoảng PH từ 5-6
Theo 1 số nghiên cứu thì amylase cho hoạt tính mạnh ở khoảng pH 5-6.

Như vậy có thế đề xuất pHopt của amylase là 5.

Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính của amylase

-ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến hoạt độ của enzyme amylase
Dung môi hữu cơ có thể àm thay đổi cấu trúc của enzyme từ đó ảnh
hưởng đến hoạt tính của enzyme. Để kiểm tra sự ảnh hưởng này ta cho
enzyme ủ với các loại dung môi hữu cơ khác nhau:
acetone, ethanol,methanol. Với lượng enzyme ử với 10% dung môi
trong 30 phút, rồi tiến hành thí nghiệm.
Dung môi hưu cơ

ΔOD

Hoạt tính

Ethanol

1.102

2.7112

Methanol

1.257

3.0941
Page 12

TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME
AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE
Acetone

1.415

3.4846

Nước

1.124

2.7656

Dung môi hưu cơ acetone ảnh hưởng hoạt tính của enzyme amylase cao
nhất, làm tăng hoạt tính của enzyme
Dung môi và nồng độ thích hợp để tủa enzyme
Tủa bằng dung môi hữu cơ là trong những phương pháp tinh sạch sơ bộ
amylase. Phương pháp này tốn ít thời gian và rất dễ làm. Khi tủa
amylase bằng dung môi ở các nồng khác nhau thì sẽ thu được enzyme
amylase có hoạt tính khác nhau dẫn đến hiệu suất tủa cũng khác nhau
Nồng độ 50%
60%
70%
80%
90%
E thô
∆OD
0.797
1.089

1.521
1.578
0.545
0.7
Hspl
6
6
8
8
8
4
Hoạttính
2.936
4.018
7.493
7.774 2.66922
1.718
Hiệusuấ
t
58.5
42.76
22.9
22.1
64.36
Bảng ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hoạt tính enzyme.
Từ số liệu trên ta cũng thấy khi tủa enzyme bằng acetone ở khoảng
nồng độ 70-80% sẽ cho hiệu quả tốt nhất, và tối đa là ở 80% khi đó, hoạt
tính enzyme là 7.774 U/ml.
Xác định các phân đoạn có enzyme từ phương pháp sắc ký lọc gel:
Sắc ký lọc gel là phương pháp tinh sạch enzyme dựa vào kích thước

phân tử của enzyme. Đây là phương pháp cho hiêu quả rất cao. Chúng
tôi tiến hành sắc ký enzyme amylase thu 20 phân đoạn, sau khi kiểm tra
hoạt tính cho kết quả như sau:
Page 13


TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME
AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE

Phân đoạn
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17

∆OD
x
x
x

x
0,872
1,131
1,205
1,624
1,649
0,98
0,67
0,48
x
x
x

Hoạt độ
0
0
0
0
2,143
2,873
2,965
4,001
4,063
2,41
1,644
1,174
x
x
x

Kết quả này cho thấy enzyme amylase xuất hiên ở các phân đoạn từ (512)
Sau đó chúng tôi lấy mẫu ở các phân đoạn từ 5-13 đi điện di thì cho hình
ảnh như sau:

Page 14


TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME
AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE

Hình ảnh kết quả điện di
*Kết luận
Từ những kết quả thu được qua các thí nghiệm của bài báo, chúng tôi rút
ra những kết luận về quá trình tinh sạch và nghiên cứu tính chất của
enzyme amylase từ chủng nấm aspergillus oryzae như sau :
- Chủng Aspergillus oryzae được nuôi cấy trên môi trường khoáng
Czapek có bổ sung 1% tinh bột, 0.4% peptone, 0,2% cao nấm men,
pH=6.0, sau 5 ngày nuôi trong máy lắc thì thu dịch nhận enzyme
để xác định hoạt tính của amylase.
- Hoạt tính của amylase được xác đinh bằng phương pháp quang phổ
theo Miler(1959), với cơ chất tinh bột 1% trong đệm acetate pH 5,6.
Thuốc thử là dung dịch DNS 1% pha trong NaOH và muối kép.
- Từ khoảng pH 5-6 enzyme amylase có hoạt tính mạnh nhất
- Nồng độ acetone 80% là nồng độ tủa enzyme tối đa nhất với hoạt tính
là 7.774U/ml.
Page 15


TINH SẠCH VÀ NGHÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENZYME
AMYLASE TỪ CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE

- Khoảng nhiệt độ thích hợp để amylase thủy phân tinh bột cao nhất là
60oC.
IV TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bài giảng thực hành công nghệ protein –Ths Trịnh Đình Khá
2. Bài giảng thực hành công nghệ enzyme-Ths Trịnh Đình Khá
3. Giáo trình công nghệ sinh hoc tập 3 enzyme và ứng dụng
Phạm Thị Trân Châu-Phan Tuấn Nghĩa.
4. Các từ khóa enzyme amylase; aspergillus oryzae
5.
6.

Page 16